CN109628419A

CN109628419A - 一种双功能融合蛋白及其生产d-苯乳酸的方法

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Publication number: CN109628419A
Application number: CN201811631087.7A
Authority: CN
Inventors: 王丹; 陈朋; 吕欣怡; 熊小超; 周桢; 周小华
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种D‑乳酸脱氢酶和和甘油脱氢酶融合蛋白，同时涉及含有该融合蛋白的工程菌全细胞催化生成D‑苯乳酸的方法。本发明利用基因融合策略，首次将D‑乳酸脱氢酶(D‑LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)进行融合表达并引入到D‑苯乳酸合成代谢途径中，在以苯丙酮酸为底物不对称合成D‑苯乳酸(D‑PLA)的反应中，实现辅酶因子的再生和高产量的D‑苯乳酸的生产。成本低廉，安全性高，并且甘油转化为二羟基丙酮，可以作为重要的医药、化学合成中间体，广泛应用于精细化工、食品工业和化妆品工业，附加值高。

Description

一种双功能融合蛋白及其生产D-苯乳酸的方法

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种D-乳酸脱氢酶和和甘油脱氢酶融合蛋白，同时涉及含有该融合蛋白的工程菌全细胞催化生成D-苯乳酸的方法。

背景技术：

苯乳酸(PLA,Phenyllactic acid)即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种天然的有机酸，被广泛发现存在于蜂蜜和乳酸菌发酵产物中。其分子式为C₉H₁₀O₃，相对分子质量166，熔点121～125℃。苯乳酸略带特殊气味，易溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醚和甲醇等有机溶剂，微溶于水，能均匀的溶解于水性溶剂中，在水中溶解度随温度升高而增大。苯乳酸的第二个碳原子为手性碳原子，因此PLA具有旋光性，有D-、L-型两种对映异构体，分别为D-苯乳酸和L-苯乳酸。苯乳酸(PLA)是一种广谱抗菌化合物，具有抗细菌和真菌的活性，同时D-PLA显示出比L-PLA更高的抗菌活性。作为良好的抗菌剂，PLA广泛用于食品工业，特别是在乳品工业和烘焙工业。此外，PLA可用作合成丹参素(3,4-二羟基苯基乳酸)、恩格列酮、蛋白酶抑制剂和抗HIV试剂等手性药物的前体。

目前生产苯乳酸的方法主要有化学合成法和生物合成法两种，生物合成法主要分微生物发酵法、全细胞转化法。化学合成法主要有(1)吖内酯(Azlactone)锌汞齐还原法；(2)β-苯基丙烯酸锌汞齐还原法；(3)苯甲醛经缩合、开环、水解、还原4步反应制得，合成路线中用Clemensen还原法将α-酮酸还原为α-羟基酸。然而这些化学法在不同的程度上存在着技术复杂，操作繁琐，需要高温高压等条件；环境污染严重，大量的工业废物需要处理；产物为D型和L型混合产物，分离困难等问题。

在产苯乳酸菌株中，苯丙氨酸通过转氨基作用生成苯丙酮酸，苯丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下进一步还原得到苯乳酸，此过程需要辅酶NADH的参与。目前苯乳酸的研究主要集中在微生物发酵法，但是微生物发酵法合成苯基乳酸，其产物浓度低、分离难度大、效率低，尚不能工业化，并且目前的研究多集中在发现新的原始菌株进行发酵，如专利CN1940078A、CN102604858A、CN106497824A等。而全细胞转化法，生物催化剂更容易制备、成本低，稳定性更高、受环境温度影响更小，有望实现低能耗、高效率、低成本、无污染的苯乳酸工业化生产。

乳酸脱氢酶是NADH依赖型氧还原酶。全细胞转化法生产苯乳酸过程中需要不断消耗体系中的还原型辅酶(NADH)，还原型辅酶的额外添加会使成本显著增加。因此开发系统中还原型辅酶再生的方法亦是研究的关键。酶耦联法是常用的辅酶再生的方法，在反应体系中共表达底物催化酶和辅酶循环酶两种酶，如专利CN104130967A报道了L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达辅酶再生生产L-苯乳酸的方法。酶耦联法的辅酶在两个酶分子间传递，有可能造成辅酶利用效率不高，因此利用基因融合策略构建双功能酶有可能使两个酶的活性位点接近，使辅酶在分子内高效传递从而提高催化效率。蒋卓越等以D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶构建了融合蛋白D-LDH^Y52V-E-FDH(E代表刚性Linker EAAAK)，以甲酸为原料辅酶再生生产D-苯乳酸经发酵和催化条件优化后单批次产量达6.72g/L。但是以甲酸为辅酶再生原料，在工业生产中需要配备防爆设备，存在投资费用高和安全隐患的缺陷。

本发明采用基因融合策略，首次将D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)进行融合表达，构建D-LDH-Linker-GlDH双功能融合蛋白，在以苯丙酮酸为底物不对称合成D-苯乳酸(D-PLA)的反应中，实现辅酶因子的原位再生，使转化反应能够继续进行，获得高产量的D-苯乳酸。

发明内容：

本发明的目的就是针对现有技术存在的问题，提供一种D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶融合蛋白及其基因工程菌和构建方法，同时提供以甘油和苯丙酮酸为底物大肠杆菌全细胞催化生产D-苯乳酸的方法。

本发明的思路：通过酶耦合催化辅酶再生法提高微生物细胞生物转化苯丙酮酸生产D-苯乳酸的效率和降低生产成本。酶耦合催化辅酶再生法是D-乳酸脱氢酶基因d-ldh表达的D-乳酸脱氢酶在辅酶NADH(还原型辅酶I)存在下，催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸和辅酶NAD+(氧化型辅酶I)；甘油脱氢酶基因gldh表达的甘油脱氢酶消耗辅酶NAD+(氧化型辅酶I)，催化甘油生成二羟基丙酮和NADH(还原型辅酶I)，从而继续为苯丙酮酸生成D-苯乳酸过程提供辅酶NADH(还原型辅酶I)。其次通过D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶融合蛋白的构建，使辅酶在分子内高效传递从而提高催化效率。辅酶再生法催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸的反应示意图参见图1。

本发明一方面提供一种生产D-苯乳酸的基因工程菌株，所述基因工程菌能够表达D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)的融合蛋白；

进一步地，所述融合蛋白中D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)采用连接肽Linker进行连接；

优选地，所述连接肽Linker，可以选择连接肽L1、L2、L3或L4；

其中，L1为GGGGS；L2为GGGGSGGGGS；L3为GGGGSGGGGSGGGGS；L4为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，连接肽基因序列见表1；

进一步地，所述基因工程菌采用pET28a质粒作为表达载体；

进一步地，所述基因工程菌以大肠杆菌作为宿主细胞；

优选地，所述大肠杆菌选自BL21、JM109、TOP10、HB101或者BLR之一；

优选地，所述D-乳酸脱氢酶在NCBI中的参考序列号(NCBI Reference Sequence)为WP_015638753.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；编码基因d-ldh如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述甘油脱氢酶GlDH的编码基因gldh如SEQ ID NO.2所示；

本发明涉及到的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将纯化后的D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶基因片段通过Overlap extensionPCR(重叠延伸PCR)技术以不同的连接肽(Linker)相连，从而得到融合基因d-ldh-Linker-gldh；

(2)构建成功的融合基因克隆至pET28a载体，并转入大肠杆菌。

本发明涉及到的基因工程菌全细胞生产D-苯基乳酸的方法，包括以下步骤：

(1)发酵培养：将培养好的基因工程菌种子液接种至发酵培养基中，接种量为1～10％(v/v)，转速为100-300r/min，温度为25-40℃，调节pH在6.0～7.0，当菌体密度至0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，25-35℃下，诱导发酵培养8-12h；

(2)发酵结束后，低温离心收集菌体，用pH 7.0-9.0的缓冲液洗涤2次，重悬于含有5-20％(V:V)甘油和10-25g/L苯丙酮酸的pH 7.0-9.0的缓冲液转化体系中，25-45℃，100-250r/min反应1-6h；D-苯乳酸的产量可以达到5.76-14.46g/L；

优选地，所述转化体系中还含有0.6％(V:V)的Tween 80；

优选地，转化底物时，菌体浓度OD₆₀₀为50-80；

优选地，所述缓冲液为pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液；

优选地，所述的发酵培养基组成如下：蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 5～10g/L。

有益效果：

(1)本发明首次将甘油脱氢酶体系引入到D-苯乳酸合成代谢途径中，实现了辅酶再生，并构建双功能融合蛋白D-LDH-Linker-GlDH，提高了辅酶在细胞内的再生速率，极大地促进了D-苯乳酸的合成，节约辅酶的使用，降低生产成本。通过对比实验证明，构建出来的工程菌相对于原始菌来说，不用添加辅酶就能得到5.76-14.46g/L高产量的苯乳酸。

(2)本发明以D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)进行辅酶再生，以甘油为辅酶再生原料，成本低廉，安全性高，并且甘油转化为二羟基丙酮，其可以作为重要的医药、化学合成中间体，广泛应用于精细化工、食品工业和化妆品工业，是一种高附加值的化学品，因此本发明可以充分利用生物柴油行业的副产物甘油，促进生物柴油行业的发展；

利用廉价的甘油进行辅酶NADH(还原型辅酶I)的再生，一方面能充分利用大量的生物柴油行业的副产物甘油，以防止资源的浪费，同时，可以节约辅酶的添加，减少生产的成本；另一方面可以调节甘油价格，保障企业利益和促进生物柴油行业的发展；

利用甘油脱氢酶辅酶再生生产D-苯乳酸，可以降低生产成本，在缓解化学合成D-苯乳酸的石化资源紧张问题的同时，对环境友好，可废弃物的利用，也是走可持续发展道路的必然选择。

附图说明：

图1为苯丙酮酸辅酶再生生成D-苯乳酸的反应示意图；

图2为重组质粒pET28a-d-ldh、pET28a-gldh PCR验证图其中，M-Marker；1-d-ldh；2-gldh；

图3为重组质粒pET28a-d-ldh-L₁-gldh PCR验证图；

其中，M-Marker；1-pET28a载体酶切；2-d-ldh-L₁-gldh；

图4为反应产物HPLC鉴定图其中，图A为D-苯乳酸标准品；图B为样品图。

具体实施方式：

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明通过酶耦合催化辅酶再生法提高微生物细胞生物转化苯丙酮酸生产D-苯乳酸的效率和降低生产成本。酶耦合催化辅酶再生法是D-乳酸脱氢酶基因d-ldh表达的D-乳酸脱氢酶在辅酶NADH(还原型辅酶I)存在下，催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸和辅酶NAD+(氧化型辅酶I)；甘油脱氢酶基因gldh表达的甘油脱氢酶消耗辅酶NAD+(氧化型辅酶I)，催化甘油生成二羟基丙酮和NADH(还原型辅酶I)，从而继续为苯丙酮酸生成D-苯乳酸过程提供辅酶NADH(还原型辅酶I)。其次通过D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶融合蛋白的构建，使辅酶在分子内高效传递从而提高催化效率。辅酶再生法催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸的反应示意图参见图1。

本发明实施例提供一种生产D-苯乳酸的基因工程菌株，该基因工程菌能够表达D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)的融合蛋白，其中乳酸脱氢酶(D-LDH)和甘油脱氢酶(GlDH)采用连接肽Linker进行连接；

在进一步的实施例中，连接肽Linker，可以选自GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS中的一种；

在又一实施例中，该基因工程菌采用pET28a质粒作为表达载体；

在又一实施例中，该基因工程菌以大肠杆菌作为宿主细胞；所述大肠杆菌可以选自BL21，JM109，TOP10，HB101或者BLR之一；

在又一实施例中，采用SEQ ID NO.1所示的D-乳酸脱氢酶的编码基因d-ldh，该D-乳酸脱氢酶在NCBI中的参考序列号(NCBI Reference Sequence)为WP_015638753.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，来自发酵乳杆菌；但本发明的D-乳酸脱氢酶基因包括但不限于发酵乳杆菌的D-乳酸脱氢酶编码基因，根据本发明的指导，结合现有技术，本技术领域的人员可获得来源于其他菌种(如戊糖片球菌Pediococcus acidilactici，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus)的D-乳酸脱氢酶基因(d-ldh)，用以构建融合蛋白；

在又一实施例中，采用SEQ ID NO.2所示的甘油脱氢酶GlDH的编码基因gldh，该序列来源于大肠杆菌K12；但本发明的甘油脱氢酶基因包括但不仅限于大肠杆菌的GlDH脱氢酶编码基因，根据本发明的指导，结合现有的技术，本技术领域的人员可获得来源于其他菌种(如弱氧化醋杆菌Acetobacter suboxydans,木醋杆菌Acetobacter xylinum,克雷伯氏菌肺炎杆菌Klebsiella pneumonia)的甘油脱氢酶基因(gldh)，用以构建融合蛋白；

在又一实施例中，本发明涉及到的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

设计引物时，在d-ldh的下游引物和gldh的上游引物区设计一端重叠互补区域，这段重叠互补区域经过退火可以结合在一起，从而将D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶连接在一起；为了两段蛋白的正确折叠和维持各自的生物活性，本发明在设计引物的时候在两段基因之间插入了四种不同的蛋白Linker的DNA序列，四种Linker分别为GGGGS，GGGGSGGGGS,GGGGSGGGGSGGGGS，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGS，从而得到四种融合基因d-ldh-Linker-gldh；

(2)构建成功的融合基因克隆至pET28a载体，获得重组载体pET28a-d-ldh-l-gldh，将pET28a-d-ldh-l-gldh转入BL21，JM109，TOP10，HB101或者BLR之一后，得到基因工程菌BL21/d-ldh-l-gld，JM109/d-ldh-l-gldh，TOP10/d-ldh-l-gldh，HB101/d-ldh-l-gldh或者BLR/d-ldh-l-gldh。

在又一实施例中，本发明涉及到的基因工程菌全细胞生产D-苯基乳酸的方法，包括以下步骤：

(1)种子液培养：以上述基因工程菌为出发菌，在摇瓶中进行，摇床转速100-300r/min，温度25℃-40℃，培养时间6-12h；

(2)发酵培养：将培养好的大肠杆菌基因工程菌种子液接种至发酵培养基中，接种量为1～10％(v/v)，转速为100-300r/min，温度为25℃-40℃，调节pH在6.0～7.0，当菌体密度至0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，25-35℃下，诱导发酵培养8h-12h；

(3)发酵结束后，低温离心，收集菌体用pH 7.0-9.0的缓冲液洗涤2次，重悬于含有5-20％甘油和10-25g/L苯丙酮酸的pH 7.0-9.0的缓冲液转化体系中(转化体系中还含有0.6％的Tween 80)，菌体浓度OD₆₀₀为50-80，25-45℃，100-250r/min反应1-6h；D-苯基乳酸的产量可以达到5.76-14.46g/L；

在又一实施例中，所述缓冲液为pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液；

种子培养基组成如下：蛋白陈10～20g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 5～10g/L。

发酵培养基组成如下：蛋白陈10～20g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 5～10g/L。

在本发明中，产物分析方法如下：

样品处理：转化液在室温下12000rpm，离心10min，取上清，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)检测转化液中D-苯乳酸浓度。

D-苯乳酸测定：转化液中的D-苯乳酸的浓度由HPLC检测，检测器为紫外检测器(Agilent Technologies,G1315D)，分析柱为C18column(300mm×4.6mm，Bio-Rad)，柱温为30℃，检测波长210nm，流动相为1mM H₂SO₄：乙腈(85:15)，流速为0.7mL/min，进样量为20μL。

生物量测定：生物量采用上海精密科学仪器公司生产的723N型可见光分光光度计测定，使用波长为600nm。样品先用0.2M HCI进行处理，溶解所含的MgCO₃，12000RPM离心10min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。

以下将结合具体实施例对本发明做进一步解释说明。

实施例1工程菌构建

(1)基因d-ldh的克隆和表达载体的构建

根据NCBI中NCBI Reference Sequence：WP_015638753.1公布的氨基酸序列对编码该D-乳酸脱氢酶的基因序列进行全基因合成，SEQ ID NO.1所示；

本实施例根据D-乳酸脱氢酶基因序列设计扩增d-ldh基因的PCR引物如下：

d-ldh-1:5’-CGGGATCCATGGCAAAAATTTACGCA-3’(SEQ ID NO.3)

d-ldh-2:5’-CCGCTCGAGTTAACCAACCTTAACTGGG-3’(SEQ ID NO.4)

为了便于与表达载体连接，在引物d-ldh-1上引入BamHI酶切位点，引物d-ldh-2上引入XboI酶切位点。以全基因合成获得的质粒为模板完成以下PCR程序：95℃5min；95℃50s，55℃30s，72℃90s完成30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过琼脂糖电泳检测，回收999kb的片段，将回收片段经BamHI、XboI酶切，与同样经过BamHI、XboI酶切的pET28a载体用T4连接酶进行连接，得到重组质粒pET28a-d-ldh，PCR验证和测序符合预期序列，如图2。

(2)基因gldh的克隆和表达载体的构建

可根据实验条件进行全基因合成或PCR获得gldh基因。

本实施例根据甘油脱氢酶基因序列设计扩增gldh基因的PCR引物如下：

gldh-1:5’-CCCGGCATATGGACCGCATTATTCAATCAC-3’(SEQ ID NO.5)

gldh-2:5’-GCATTCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGG-3’(SEQ ID NO.6)

为了便于与表达载体连接，在引物gldh-1上引入NdeI酶切位点，引物gldh-2上引入XhoI酶切位点。以大肠杆菌K12总DNA为模板完成以下PCR程序：95℃5min；95℃50s；55℃30s，72℃90s完成30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过琼脂糖电泳检测，回收1104kb的片段，将回收片段经NdeI、XhoI酶切，与同样经过NdeI、XhoI酶切的pET28a载体用T4连接酶进行连接，得到重组质粒pET28a-gldh，PCR验证和测序符合预期序列，如图2。

(3)基因d-ldh-L₁-gldh(L₁代表Linker(GGGGS))的克隆和表达载体的构建

根据质粒pET28a-d-ldh和pET28a-gldh内的d-ldh，gldh以及pET28a载体序列，用重叠延伸PCR原理设计了引物P_1F、P_2R-1、P_3F-1、P_4R。其中P_1F为pET28a-d-ldh的前引物，并加入了SacI酶切位点(划线部分)和保护碱基；P_2-1R与P_3F-1的一段序列重叠互补；P_3F包含用于连接两段基因的Linker的基因序列(划线部分)；P_1F，P_2R-1用于扩增出目的片段d-ldh，P_3F-1，P_4R用于扩增目的片段gldh，并在引物P_4R中插入XhoI限制性酶切位点(划线部分)，以回收的d-ldh、gldh为共同的模板，P_1F和P_4R为引物，PCR扩增得到d-ldh-L₁-gldh，反应体系(50μL)。

P_1F(5’-3’):CGAGCTC ATGGCAAAAATTTAC(SacI)(SEQ ID NO.7)

P_2R-1(5’-3’):GATTGAATAATGCGGTCCATGGAGCCACCACCGCCACCAACCTTA ACTGG(SEQID NO.8)

P_3F-1(5’-3’):ACCCCAGTTAAGGTTGGTGGCGGTGGTGGCTCCATGGACCGCATTATTCA A(GGGGS)(SEQ ID NO.9)

P_4R:CCGCCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAG(XhoI)(SEQ ID NO.10)

PCR过程：94℃5min；94℃50s，55℃30s，72℃120s完成30个循环，最后72℃延伸7min。

PCR产物经1％的琼脂糖电泳检测，回收约2100bp的片段，将回收片段经过SacI、XhoI酶切，与同样经SacI、XhoI酶切的pET28a载体连接，得到重组质粒pET28a-d-ldh-L₁-gldh，PCR验证和测序符合预期，如图3。

(4)转化

将上述获得的质粒按常规质粒转入感受态方法转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株BL21/pET28a-d-ldh-L₁-gldh。

实施例2工程菌表达产物的鉴定

(1)将实施案例1得到的工程菌BL21/pET28a-d-ldh-L₁-gldh接种入LB培养基，37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养12h。离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清，用His-Tag亲和层析柱纯化得到纯化的融合蛋白，SDS-PAGE电泳跑胶验证，在约70KDa处得到清晰条带，与预期融合蛋白大小相符合。

(2)将得到的纯化蛋白液加入反应液(2ml反应体系)中进行催化反应，反应液中含有10mM苯丙酮酸，20mM甘油，0.02mol/L磷酸钾缓冲液1.8mL，150rpm下反应30min，产物经HPLC方法鉴定为D-苯乳酸(如图4)，表明BL21/pET28a-d-ldh-L₁-gldh表达的D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶融合蛋白可以催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸。

实施案例3利用BL21/pET28a-d-ldh-L₁-gldh全细胞催化生产D-苯乳酸

(1)菌种：实施例1获得的BL21/pET28a-d-ldh-L₁-gldh。

(2)将工程菌接入种子培养基中，在摇床中37℃、200r/min培养10h，按5％的接种量接入发酵培养基(含40μg/mL卡那霉素)中，调节pH在6.0～7.0，置于摇床中37℃、200r/min，恒温振荡培养菌体密度至OD₆₀₀为1.0，加入0.5mmol/L IPTG，25℃发酵12h。

(3)4℃、6000r/min离心10min，收集菌体，用pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液洗涤2次，重悬于10ml含有5％甘油和10g/L苯丙酮酸及0.6％Tween 80的磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.02M)转化体系中，使菌体浓度OD₆₀₀达到50，35℃、100r/min反应1h后取样用高效液相色谱检测转化产物，得到苯乳酸浓度为5.76g/L，二羟基丙酮浓度为3.08g/L。

种子培养基组成如下：蛋白陈15g/L，酵母粉8g/L，NaCl 7g/L。

发酵培养基组成如下：蛋白陈10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。

实施例4利用BL21/pET28a-d-ldh-L₂-gldh(L₂代表linker:GGGGSGGGGS)全细胞催化生产D-苯乳酸

(1)菌种：将实施例1中的引物P_2R-1、P_3F-1更换为P_2R-2、P_3F-2，然后按实施例1的方法获得的菌株BL21/pET28a-d-ldh-L₂-gldh，其余构建方法同实施例1；

P_2R-2(5’-3’):TGATTGAATAATGCGGTCCATGGAGCCACCACCACCGGAGCCACCACCGCCACCAACCTTA ACTGG(SEQ ID NO.11)

P_3F-2(5’-3’):GAAACCCCAGTTAAGGTTGGTGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGTGGTGGCTCCATGGACCGCATTATTCAATCACCG(GGGGSGGGGS)(SEQ ID NO.12)

(2)将工程菌接入种子培养基中，在摇床中30℃、300r/min培养12h，按10％的接种量接入发酵培养基(含40μg/mL卡那霉素)中，调节pH在6.0～7.0，置于摇床中37℃、200r/min，恒温振荡培养菌体密度至OD₆₀₀为0.8，加入0.5mmol/L IPTG，30℃发酵10h。

(3)4℃、6000r/min离心10min，收集菌体，用pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液洗涤2次，重悬于10ml含有10％甘油和15g/L苯丙酮酸及0.6％Tween 80的磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.02M)转化体系中，使菌体浓度OD₆₀₀达到60，30℃、150r/min反应2h后取样用高效液相色谱检测转化产物，得到苯乳酸浓度为9.36g/L，二羟基丙酮浓度为5.07g/L。

种子培养基组成如下：蛋白陈10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。

发酵培养基组成如下：蛋白陈15g/L，酵母粉6g/L，NaCl 6g/L。

实施例5利用BL21/pET28a-d-ldh-L₃-gldh(L3代表Linker：GGGGSGGGGSGGGGS)全细胞催化生产D-苯乳酸

(1)菌种：将实施例1中的引物P_2R-1、P_3F-1更换为P_2R-3、P_3F-3，然后按实施例1的方法获得的BL21/pET28a-d-ldh-L₃-gldh，其余构建方法同实施例1；

P_2R-3(5’-3’):TTGAATAATG CGGTCCATAG AACCGCCGCC GCCGGAGCCA CCACCACCGGAGCCACCACCGCCACCAACCTTA ACTGG(SEQ ID NO.13)

P_3F-3(5’-3’):GAAACCCCAGTTAAGGTTGGTGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGTGGTGGCTCCGGCGG CGGCGGTTCTATGGACCGCATTATTCAATCACCG(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO.14)

(2)将工程菌接入种子培养基中，在摇床中25℃、300r/min培养8h，按5％的接种量接入发酵培养基(含40μg/mL卡那霉素)中，调节pH在6.0～7.0，置于摇床中25℃、300r/min，恒温振荡培养菌体密度至OD₆₀₀为1.0，加入0.5mmol/L IPTG，25℃发酵12h。

(3)4℃、6000r/min离心10min，收集菌体，用pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液洗涤2次，重悬于10ml含有15％甘油和20g/L苯丙酮酸及0.6％Tween 80的磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.02M)的转化体系中，使菌体浓度OD₆₀₀达到70，40℃、200r/min反应4h后取样用高效液相色谱检测转化产物，得到苯乳酸浓度为13.16g/L，二羟基丙酮浓度为7.07g/L。

种子培养基组成如下：蛋白陈180g/L，酵母粉8g/L，NaCl 7g/L。

发酵培养基组成如下：蛋白陈18g/L，酵母粉8g/L，NaCl 8g/L。

实施例6利用BL21/pET28a-d-ldh-L₄-gldh(L₄代表Linker：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)全细胞催化生产D-苯乳酸

(1)菌种：将实施例1中的引物P_2R-1、P_3F-1更换为P_2R-4、P_3F-4，然后按实施例1的方法获得的BL21/pET28a-d-ldh-L₄-gldh，其余构建方法同实施例1；。

P_2R-4(5’-3’):TTGAATAATGCGGTCCATAGAGCCGCCACCACCGGAACCGCCACCGCCGGAACCGCCGCCACCAGAACCGCCGCCGCCGGAGCCACCACCACCGGAGCCACCACCGCCACCAACCTTA ACTGG(SEQ IDNO.15)

P_3F-4(5’-3’):GAAACCCCAGTTAAGGTTGGTGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGTGGTGGCTCCGGCGG CGGCGGTTCTGGTGGCGGCGGTTCCGGCGGTGGCGGTTCCGGTGGTGGCGGCTCTATGGACCGCATTATTCAATCACCG(GGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO.16)

(2)将工程菌接入种子培养基中，在摇床中37℃、200 r/min培养8 h，按3％的接种量接入发酵培养基(含40μg/mL卡那霉素)中，调节pH在6.0～7.0，置于摇床中37℃、200 r/min，恒温振荡培养菌体密度至OD₆₀₀为1.0，加入0.5 mmol/L IPTG，25℃发酵12 h。

(3)4℃、6000 r/min离心10 min，收集菌体，用pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液洗涤2次，重悬于10 ml含有20％甘油和25 g/L苯丙酮酸及0.6％Tween 80的磷酸钾缓冲液(pH7.0，0.02M)的转化体系中，使菌体浓度OD₆₀₀达到80，45℃、250 r/min反应6 h，取样用高效液相色谱检测转化产物，得到苯乳酸浓度为14.46 g/L，二羟基丙酮浓度为7.80 g/L。

种子培养基组成如下：蛋白陈20 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 10 g/L。

发酵培养基组成如下：蛋白陈20 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 10 g/L。

表1连接肽Linker碱基序列

序列表

<110> 重庆大学

<120> 一种双功能融合蛋白及其生产D-苯乳酸的方法

<130> 1

<141> 2018-12-29

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)

<400> 1

atggcaaaaa tttacgcata cggaatccgc aaggacgaag aaccttactt gaacgaatgg 60

gcaaagaacc acgctgacgt gacggtcgac tacacggccg aactgttgac gccggaaacg 120

gccgctcaag cagctggtgc tgatggggta gttgtttacc aacaactcga ctacaccgct 180

gaaacgctcc aagccctcgc cgaccagggc gttactaaga tgtccttgcg taacgtgggg 240

atcgacaaca tcgacatggc caaggctaag gaactgggct ttgaaatcac caacgttccg 300

gtttactctc cgaacgccat cgctgaacac gccgctatcc aaacggcccg catccttcgt 360

caatccaaga agttagacga aaagatcgaa aacggggacc tccgttgggc accaaccatc 420

ggccgcgaag ttcgtgacca agtggttggg gttgttggta cgggtcacat cggtcaagtc 480

ttcatgcaaa tcatggaagg cttcggcgct aaggtgatcg cctacgacgt ctttaaggat 540

ccggaactgg aaaagaaggg ctactacgtt tccttggacg aaatctacgc ccaagctgac 600

gttatttccc tccacgtacc ggccctggaa agcacgatcc acatgatcaa tgacgaaacg 660

atcgccaaga tgaaggacga cgccgtactg gttaacgttt ctcgtggtcc gttggttgac 720

accgacgccg ttatccgtgc cctggactcc ggcaagctgt tcggttttgt catggatact 780

tacgaagacg aagtggggat cttcaacgaa gactggcaag gtaaggaatt ccctgacgcc 840

cgccttaacg acttgatcca ccgcgacaac gtcttggtaa cgcctcacac cgccttctac 900

accacgcacg cagttcgcaa catggtatta aaggccttcg acaacaacct ggccctggtt 960

aagggtgaag aacctgaaac cccagttaag gttggttaa 999

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> 大肠杆菌K12()

<400> 2

atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60

ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120

ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180

attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240

gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300

aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360

gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420

ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480

cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540

gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600

gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660

gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg 720

agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg 780

accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840

acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc 900

catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960

aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020

ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080

cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgggatccat ggcaaaaatt tacgca 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccgctcgagt taaccaacct taactggg 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cccggcatat ggaccgcatt attcaatcac 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gcattctcga gttattccca ctcttgcagg 30

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cgagctcatg gcaaaaattt ac 22

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gattgaataa tgcggtccat ggagccacca ccgccaccaa ccttaactgg 50

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

accccagtta aggttggtgg cggtggtggc tccatggacc gcattattca a 51

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ccgcctcgag ttattcccac tcttgcag 28

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tgattgaata atgcggtcca tggagccacc accaccggag ccaccaccgc caccaacctt 60

aactgg 66

<210> 12

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gaaaccccag ttaaggttgg tggcggtggt ggctccggtg gtggtggctc catggaccgc 60

attattcaat caccg 75

<210> 13

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ttgaataatg cggtccatag aaccgccgcc gccggagcca ccaccaccgg agccaccacc 60

gccaccaacc ttaactgg 78

<210> 14

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gaaaccccag ttaaggttgg tggcggtggt ggctccggtg gtggtggctc cggcggcggc 60

ggttctatgg accgcattat tcaatcaccg 90

<210> 15

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ttgaataatg cggtccatag agccgccacc accggaaccg ccaccgccgg aaccgccgcc 60

accagaaccg ccgccgccgg agccaccacc accggagcca ccaccgccac caaccttaac 120

tgg 123

<210> 16

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

gaaaccccag ttaaggttgg tggcggtggt ggctccggtg gtggtggctc cggcggcggc 60

ggttctggtg gcggcggttc cggcggtggc ggttccggtg gtggcggctc tatggaccgc 120

attattcaat caccg 135

<210> 17

<211> 332

<212> PRT

<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)

<400> 17

Met Ala Lys Ile Tyr Ala Tyr Gly Ile Arg Lys Asp Glu Glu Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Glu Trp Ala Lys Asn His Ala Asp Val Thr Val Asp Tyr Thr

20 25 30

Ala Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Gln Ala Ala Gly Ala Asp

35 40 45

Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln

50 55 60

Ala Leu Ala Asp Gln Gly Val Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly

65 70 75 80

Ile Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Glu Ile

85 90 95

Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala

100 105 110

Ile Gln Thr Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ser Lys Lys Leu Asp Glu Lys

115 120 125

Ile Glu Asn Gly Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val

130 135 140

Arg Asp Gln Val Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val

145 150 155 160

Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp

165 170 175

Val Phe Lys Asp Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Ser Leu

180 185 190

Asp Glu Ile Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro Ala

195 200 205

Leu Glu Ser Thr Ile His Met Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Lys Met

210 215 220

Lys Asp Asp Ala Val Leu Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val Asp

225 230 235 240

Thr Asp Ala Val Ile Arg Ala Leu Asp Ser Gly Lys Leu Phe Gly Phe

245 250 255

Val Met Asp Thr Tyr Glu Asp Glu Val Gly Ile Phe Asn Glu Asp Trp

260 265 270

Gln Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Asn Asp Leu Ile His Arg

275 280 285

Asp Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His Ala

290 295 300

Val Arg Asn Met Val Leu Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Ala Leu Val

305 310 315 320

Lys Gly Glu Glu Pro Glu Thr Pro Val Lys Val Gly

325 330

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是将D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶通过连接肽Linker进行连接获得。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述D-乳酸脱氢酶的编码基因d-ldh如SEQ ID NO.1所示；

所述甘油脱氢酶的编码基因gldh如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽Linker，可以选择连接肽L1、L2、L3或L4；

其中，L1为GGGGS；L2为GGGGSGGGGS；L3为GGGGSGGGGSGGGGS；L4为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

4.包含权利要求1，和/或2，和/或3的融合蛋白的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用pET28a质粒作为表达载体。

6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株采用pET28a质粒作为表达载体，采用大肠杆菌作为宿主细胞。

7.权利要求4所述重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶基因片段通过重叠延伸PCR技术以不同的连接肽Linker相连，从而得到融合基因d-ldh-Linker-gldh；

(2)构建成功的融合基因克隆至pET28a载体，并转入大肠杆菌。

8.采用权利要求4所述重组菌株全细胞生产D-苯基乳酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵培养：将种子液按1～10％的接种量接种至发酵培养基中，100-300r/min，25-40℃，pH 6.0～7.0条件下进行发酵培养，当菌体密度至0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，25-35℃下，诱导发酵培养8h-12h；

(2)发酵结束后，低温离心收集菌体，用缓冲液洗涤2次，重悬于含有5-20％甘油和10-25g/L苯丙酮酸的pH 7.0-9.0缓冲液转化体系中，25-45℃，100-250r/min反应1-6h。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述转化体系中还含有0.6％的Tween 80；转化体系中的菌体浓度OD₆₀₀为50-80。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基组成如下：蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 5～10g/L。