CN104263769A - 一种生物法生产氯苯基丙酸甲酯的方法 - Google Patents
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Abstract
一种酿酒酵母细胞生物还原制备光活性(-)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，加入纱布调控底物、产物浓度。用酵母细胞进行生物还原反应，产品收率高，对映体过量率（ee%）高，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到酿酒酵母细胞生物还原制备手性医药中间体(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯的技术。
背景技术
羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯。
发明内容
本发明采用酿酒酵母细胞催化制备(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应式如下：
底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯（1）经酿酒酵母催化还原，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用酿酒酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多酿酒酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用酿酒酵母菌株为ATCC 74128 ，其催化还原效果最佳。
培养介质：
1、 培养液成份：蛋白胨1.5-2 g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L。
2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
酵母细胞制备。酿酒酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将酿酒酵母ATCC 74128种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.5-1V/（V分钟），即每分钟通气量为0.5-1倍发酵液体积，25-26℃培养36-40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
由于底物、产物均对酵母细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用棉纱布吸附底物，反应中，当底物被细胞催化还原，浓度降低时，底物从棉纱布溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被棉纱布吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与棉纱布的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与棉纱布的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与棉纱布的比率为0.4-0.44。具体吸附时，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布。调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.4-0.44。所用棉纱布为普通棉纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用。
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.8，加入吸附底物的棉纱布，使底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯添加量为80-90 g/L，葡萄糖含量为 16-22g/L，木糖11-13 g/L，吐温80含量为20-22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至28-29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为20-25g/L，通气比为0.16-0.2V/（V分钟），即每分钟通气量为0.16-0.2倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为78-85小时；反应结束后，先滤出细胞，再滤出棉纱布，用0.3倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液2次，用3倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布3次，合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。
本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化还原条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），采用固体吸附控制底物产物浓度，从而减少对细胞的抑制，试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树酯等多种固体材料，还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率94-96％，产品收率92-94％时，对映体过量率（ee%）仍然高达97-98％，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。
实施例
1
培养液培养液成份为：蛋白胨1.5g/L，酵母浸膏8g/L，葡萄糖18g/L，麦芽浸膏25g，硫酸铵0.2g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸二氧钾1.8g/L；固体培养基成份： 在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
湿酵母细胞制备过程如下：酿酒酵母ATCC 74128经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液，装料系数为0.6，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25℃，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8％，通气比为0.5V/（V分钟），即每分钟通气量为0.5倍反应液体积，25℃培养36小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的棉纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布，调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.4。所用棉纱布为普通棉纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用，其它实施例棉纱布处理相同。
15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6，pH为6.8，加入吸附底物的棉纱布，使底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯添加量为80-90 g/L，葡萄糖含量为 16-22g/L，木糖11 g/L，吐温80含量为20g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至28℃时，加入湿酵母细胞使浓度为20g/L，通气比为0.16V/（V分钟），即每分钟通气量为0.16倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为78小时；反应结束后，先滤出细胞，再滤出棉纱布，用0.3倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液2次，用3倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布3次，合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率94％，产品收率92％，对映体过量率（ee%）98％。
实施例
2
培养液培养液成份为：蛋白胨1.5g/L，酵母浸膏8g/L，葡萄糖18g/L，麦芽浸膏25g，硫酸铵0.2g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸二氧钾1.8g/L；固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
湿酵母细胞制备过程如下：酿酒酵母ATCC 74128经斜面、摇瓶培养，得到种子液。50L发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至26℃，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10％，通气比为1V/（V分钟），即每分钟通气量为1倍反应液体积， 26℃培养40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的棉纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布，调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.44。
100L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.7，pH为6.8，加入吸附底物的棉纱布，使底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯添加量为90 g/L，葡萄糖含量为22g/L，木糖13 g/L，吐温80含量为22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为25g/L，通气比为0.2V/（V分钟），即每分钟通气量为0.2倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为85小时；反应结束后，先滤出细胞，再滤出棉纱布，用0.3倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液2次，用3倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布3次，合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率96％，产品收率94％，对映体过量率（ee%）97％。
实施例
3
培养液培养液成份为：蛋白胨1.5g/L，酵母浸膏8g/L，葡萄糖18g/L，麦芽浸膏25g，硫酸铵0.2g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸二氧钾1.8g/L；固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
湿酵母细胞制备过程如下：酿酒酵母ATCC 74128经斜面、摇瓶培养，得到种子液。500L发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25.5℃，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9.5％，通气比为1V/（V分钟），即每分钟通气量为1倍反应液体积，25.5℃培养38小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的棉纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布，调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.42。
1000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.7，pH为6.8，加入吸附底物的棉纱布，使底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯添加量为85 g/L，葡萄糖含量为 20g/L，木糖12 g/L，吐温80含量为21g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至28.5℃时，加入湿酵母细胞使浓度为22g/L，通气比为0.18V/（V分钟），即每分钟通气量为0.18倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为80小时；反应结束后，先滤出细胞，再滤出棉纱布，用0.3倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液2次，用3倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布3次，合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率95％，产品收率93％，对映体过量率（ee%）97％。
实施例
4
培养液培养液成份为：蛋白胨1.5g/L，酵母浸膏8g/L，葡萄糖18g/L，麦芽浸膏25g，硫酸铵0.2g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸二氧钾1.8g/L；固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
湿酵母细胞制备过程如下：酿酒酵母ATCC 74128经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1000L发酵罐加入培养液，装料系数为0.65，121℃高压灭菌30分钟，冷却至26℃，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8％，通气比为0.8V/（V分钟），即每分钟通气量为0.8倍反应液体积， 26℃培养40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的棉纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布，调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.42。
5000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.65，pH为6.8，加入吸附底物的棉纱布，使底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯添加量为90 g/L，葡萄糖含量为 21g/L，木糖13 g/L，吐温80含量为21g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为25g/L，通气比为0.2V/（V分钟），即每分钟通气量为0.2倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为85小时；反应结束后，先滤出细胞，再滤出棉纱布，用0.3倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液2次，用3倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布3次，合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率95％，产品收率93％，对映体过量率（ee%）97.5％。
Claims (4)
1.一种酿酒酵母细胞生物还原制备(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.8，加入吸附底物的棉纱布，使底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯添加量为80-90 g/L，葡萄糖含量为 16-22g/L，木糖11-13 g/L，吐温80含量为20-22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至28-29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为20-25g/L，通气比为0.16-0.2V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为78-85小时；反应结束后，分别滤出细胞、棉纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取棉纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2S,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于湿酵母细胞制备过程如下：酿酒酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.5-1V/（V分钟），25-26℃培养36-40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于培养液成份为：蛋白胨1.5-2 g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L；固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述吸附底物的棉纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布，调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.4-0.44。
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Non-Patent Citations (1)
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| MICHEL R.B.等: "Regio- and enantioselective bioreduction of methyleneketoesters using both polymeric resin and cellulose matrix", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
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