CN118147248A - 一种l-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法 - Google Patents
一种l-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种L‑胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，包括：S1、将L‑丝氨酸发酵液进行分离，得到L‑丝氨酸清液A；S2、将L‑丝氨酸清液A进行脱色处理，得到脱色液B；S3、将脱色液B与L‑半胱氨酸合成酶、巯基供体、辅酶和表面活性剂混合，经酶促催化反应得到含L‑半胱氨酸的料液C。本发明公开了一种L‑胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，在无需增加酶用量和巯基底物用量等增加原料用量的情况下，仅需增加一步脱色处理工艺，即可显著提高酶促反应收率，最高可>98％。
Description
技术领域
本发明涉及L-胱氨酸的制备领域，尤其涉及一种L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法。
背景技术
L-胱氨酸，简称L-Cystine，是一种分子式为C6H12N2O4S2的有机物，外观呈白色六角形板状结晶体或白色结晶性粉末状，溶于稀酸和碱溶液，极难溶于水，不溶于乙醇。L-胱氨酸是人体必需的氨基酸之一，其在作为氨基酸类药物、食品添加剂、化工原料等方面用途广泛。当前，L-胱氨酸的生产工艺主要有蛋白质水解法、化学合成法、发酵法以及酶法。而酶法因其反应条件温和，立体选择性好，产品质量好，对环境友好等优点而日益重视，并成为现今研究的热点。
现有的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线，以菌种发酵分别制备L-丝氨酸发酵液与L-半胱氨酸合成酶，经过预浓缩添加巯基底物进行酶促催化反应，然后经氧化脱氢反应得到L-胱氨酸粗品，经过一系列过滤、除杂、结晶步骤得到L-胱氨酸成品。
一般情况下，酶促催化反应的摩尔收率低于90％，通过添加酶用量和巯基底物用量可以适当提高收率，但缺乏经济性。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，在无需增加酶用量和巯基底物用量等增加原料用量的情况下，仅需增加一步脱色处理工艺，即可显著提高酶促反应收率，最高可>98％。
具体技术方案如下：
一种L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将L-丝氨酸发酵液进行分离，得到L-丝氨酸清液A；
S2、将所述L-丝氨酸清液A进行脱色处理，得到脱色液B；
S3、将所述脱色液B与L-半胱氨酸合成酶、巯基供体、辅酶和表面活性剂混合，经酶促催化反应得到含L-半胱氨酸的料液C。
本发明公开了一种L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，该方法是本发明的发明人经过分析验证了L-丝氨酸染菌降解、酶菌代谢、杂质影响、标目暗活性剂因素对酶促氧化反应和收率的影响后，发现L-丝氨酸发酵液中的色素对酶促氧化反应有较大的影响的结论，从而提出了本发明。本发明在无需增加原料用量的情况下，仅需对L-丝氨酸清液增加一步脱色处理工艺，即可显著提高酶促反应收率。
步骤S1中：
所述L-丝氨酸发酵液由底物经菌种发酵后制备得到；
所述底物选自能生产L-丝氨酸的物质，如葡萄糖等。所述分离，选自本领域的常规技术手段，包括但不限于离心、陶瓷膜、溢流中的一种或多种；
得到的L-丝氨酸清液A，澄清透明、无明显固形物，湿固含量小于0.01wt％。
步骤S2中：
所述脱色处理，包括但不限于活性炭脱色和/或阴离子交换树脂脱色；
当所述脱色处理选自活性炭脱色时，活性炭的牌号选自ZX-766、ZX-767、ZX-768、ZX-769、ZX-772、ZX-878中的一种或多种；
优选的牌号为ZX-767和/或ZX-772。
活性炭的用量为L-丝氨酸清液A的0.1～1.0wt％；
当所述脱色处理选自活性炭脱色时，应在10℃及以上温度下搅拌不少于10min；优选为在10～60℃下搅拌10min以上，进一步优选为不少于30min。
当所述脱色处理选自活性炭脱色时，在搅拌结束后过滤除去活性炭得到所述脱色液B。
所述脱色处理选自阴离子交换树脂脱色时，采用的阴离子交换树脂的牌号选自D301、D354、D315、LX360中的一种或多种。
优选的，所述阴离子交换树脂的体积大于L-丝氨酸清液A体积的1/40。
所述阴离子交换树脂脱色，将L-丝氨酸清液A加至已水洗活化的阴离子交换树脂正进正出即可得到所述的脱色液B。
优选的，经过上述脱色处理所得脱色液B，在430nm的吸光度小于3.2Abs；进一步优选为小于2.0Abs；更优选为小于1.5Abs。
随着控制脱色液B在430nm的吸光度的不断优选，最终制备的酶促反应的收率随之增加。
步骤S3中：
所述L-半胱氨酸合成酶选自保藏编号为CGMCC No.21194的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的湿菌体或粗酶液；所述湿菌体和粗酶液的制备参考CN 112813012 A。
所述巯基供体包括但不限于硫氢化钠和/或硫氢化钾；
所述辅酶包括但不限于磷酸吡哆醛；
所述表面活性剂包括但不限于吐温系列和/或曲拉通系列。
巯基供体与L-丝氨酸的摩尔比为1.1～1.3；
以所述湿菌体或粗酶液的质量计，辅酶的用量为湿菌体或粗酶液的0.1～0.5wt％，表面活性剂的用量为湿菌体或粗酶液的0.1～0.5wt％。
所述湿菌体或粗酶液的用量为L-丝氨酸的10～30wt％。
步骤S3中：
所述酶促反应在氮气气氛下进行，反应温度与pH值选自所述L-半胱氨酸合成酶的最优活性条件，例如反应温度为35～39℃，pH值为8～9。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明公开了一种L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，在无需增加原料用量的情况下，仅需对L-丝氨酸清液增加一步脱色处理工艺，即可显著提高酶促反应收率，采用本发明的方法获得的酶促反应收率>92％，最高>98％。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行具体描述，但本发明并不限于这些实施例，该领域技术人员在本发明核心指导思想下做出的非本质改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。
实施例1
将发酵得到的840gL-丝氨酸发酵液(浓度120g/kg)经过20μm陶瓷膜分离浓缩后得到735gL-丝氨酸清液A(密度为1.02g/mL)。加入2gZX-772活性炭，在60℃保温条件下搅拌脱色30min，然后经0.45μm的滤纸过滤，所得过滤液即为脱色液B，430nm吸光度为1.262Abs；将过滤液泵入发酵罐，氮气环境下37℃保温，加130g 47％的硫氢化钠水溶液、25g大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.21194的湿菌体(含水量30wt％)、0.125g磷酸吡哆醛、0.125g吐温20，酶促自控pH＝8～9，反应4h至终点，得到含L-半胱氨酸的料液。
因L-半胱氨酸被氧化有少量的L-胱氨酸产生，计算收率时，取L-半胱氨酸和L-胱氨酸为产物计算摩尔收率。经计算，本实施例中酶促收率为98.42％。
实施例2
制备工艺与实施例1中基本相同，区别在于脱色处理工艺中，将ZX-772活性炭替换为等质量的ZX-767活性炭，并将脱色处理的工艺替换为25℃条件下搅拌脱色30min。本实施例所得结果列于下表1中。
实施例3
制备工艺与实施例1中基本相同，区别仅在于脱色处理工艺中，将2gZX-772活性炭替换为3gZX-878活性炭。本实施例所得结果列于下表1中。
实施例4
制备工艺与实施例1中基本相同，区别仅在于脱色处理工艺中，将2gZX-772活性炭替换为3gZX-769活性炭。本实施例所得结果列于下表1中。
实施例5
制备工艺与实施例1中基本相同，区别仅在于脱色处理工艺中，在60℃保温条件下搅拌脱色10min。
实施例6
将发酵得到的840gL-丝氨酸发酵液(浓度120g/L)经过20μm陶瓷膜分离浓缩后得到735gL-丝氨酸清液A(密度为1.02g/mL)。装填100mL LX-360树脂，进酸碱活化树脂，纯水洗净备用。将L-丝氨酸清液A过树脂，过柱速3BV/h，前1BV前份弃置，过柱所得过滤液即为脱色液B，结束，5BV水顶，水顶样与脱色液合并。脱色液B在430nm吸光度为1.384Abs；将过滤液泵入发酵罐，氮气环境下37℃保温，加60g 37％的硫氢化钠水溶液、25g大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.21194的湿菌体(含水量30wt％)、0.125g磷酸吡哆醛、0.125g吐温20，酶促自控pH＝8～9，反应4h至终点，得到含L-半胱氨酸的料液。
经计算，本实施例中酶促收率为98.38％。
实施例7
制备工艺与实施例5中基本相同，区别在于将100mL LX-360树脂替换为100mLD315阴离子交换树脂，本实施例所得结果列于下表1中。
对比例1
制备工艺与实施例1中基本相同，但不进行脱色处理工艺，即将840g 120g/kg的L-丝氨酸发酵液直接泵入发酵罐中与其它原料混合进行酶促催化反应。本对比例所得结果列于下表1中。
表1
以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，以上应用了具体实例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形、替换或结合。这些推演、变形、替换或结合方案也落入本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将L-丝氨酸发酵液进行分离，得到L-丝氨酸清液A；
S2、将所述L-丝氨酸清液A进行脱色处理，得到脱色液B；
S3、将所述脱色液B与L-半胱氨酸合成酶、巯基供体、辅酶和表面活性剂混合，经酶促催化反应得到含L-半胱氨酸的料液C。
2.根据权利要求1所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S1中：
所述L-丝氨酸发酵液由底物经菌种发酵后制备得到；
所述分离，包括离心、陶瓷膜、溢流中的一种或多种；
得到的L-丝氨酸清液A，澄清透明、无明显固形物，湿固含量小于0.01wt％。
3.根据权利要求1所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S2中：
所述脱色处理，包括活性炭脱色和/或阴离子交换树脂脱色；
所得脱色液B，在430nm的吸光度小于3.2Abs。
4.根据权利要求3所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S2中：
所述脱色处理选自活性炭脱色时，活性炭的牌号选自ZX-766、ZX-767、ZX-768、ZX-769、ZX-772、ZX-878中的一种或多种；
活性炭的用量为L-丝氨酸清液A的0.1～1.0wt％；
所述脱色处理，应在10～60℃下搅拌不少于10min。
5.根据权利要求3所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S2中：
所述脱色处理选自阴离子交换树脂脱色时，所述阴离子交换树脂的牌号选自D301、D354、D315、LX360中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S3中：
所述L-半胱氨酸合成酶选自保藏编号为CGMCC No.21194的大肠埃希氏菌的湿菌体或粗酶液；
所述巯基供体包括硫氢化钠和/或硫氢化钾；
所述辅酶包括但不限于磷酸吡哆醛；
所述表面活性剂包括但不限于吐温系列和/或曲拉通系列。
7.根据权利要求6所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于：
所述巯基供体与L-丝氨酸的摩尔比为1.1～1.3：1；
以所述湿菌体或粗酶液的质量计，辅酶的用量为湿菌体或粗酶液的0.1～0.5wt％，表面活性剂的用量为湿菌体或粗酶液的0.1～0.5wt％；
所述湿菌体或粗酶液的用量为L-丝氨酸的10～30wt％。
8.根据权利要求1所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S3中：
所述酶促反应在氮气气氛下进行，反应温度与pH值选自所述L-半胱氨酸合成酶的最优活性条件。
9.根据权利要求1～8任一项所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，步骤S2中：
所述脱色处理，在10～60℃下搅拌10min以上。
10.根据权利要求9所述的L-胱氨酸生物发酵酶催化路线中提高酶促反应收率的方法，其特征在于，所述脱色处理，在10～60℃下搅拌不少于30min。
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