CN111607551A - 一种基于嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的方法 - Google Patents

一种基于嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

传统上将重组大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌用于生产各种氨基酸产品。本发明通过在抗染菌的嗜盐菌中构建生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的代谢路径，实现重组嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物(包括天冬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和四氢嘧啶等)和谷氨酸。本发明主要通过代谢工程的方法，增强目标产物的合成代谢途径流量，减弱或阻断支路及分解代谢来实现。上述重组嗜盐菌可以通过开放无灭菌批次或者连续发酵生产上述产品。

Description

一种基于嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程和发酵工程领域。更具体地说，本发明通过在嗜盐菌里构建天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的合成途径，增强目标产物的代谢流，从而实现利用抗染菌嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的目的。
背景技术
天冬氨酸是一种必需氨基酸，也可作为前体物质合成多种氨基酸及小分子化合物，如苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、四氢嘧啶等。其中苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸占据氨基酸全球市场的百分之五十以上，广泛用于食物，动物饲料、药用等行业，而谷氨酸作为味精，需求量也很大[Leuchtenberger et al.(2005)Biotechnologicalproduction of amino acids and derivatives:current status andprospects.Applied Microbiology and Biotechnology]。四氢嘧啶(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid，也叫ectoine)是一种在耐盐及嗜盐微生物中最为广泛存在的渗透压调节物。经研究表明，它可以在高渗透压、辐射、高温及冷冻等逆境条件下保护蛋白质等生物大分子和细胞膜活性的作用，被称为“化学分子伴侣”。这种化合物在化妆品、生物制剂和制药方面有很好的应用前景[Bownik et al.(2016)Ectoine as a promising protective agent in humans andanimals.Arh.Hig.Rada.Toksikol]。
目前，氨基酸的生产方法主要包括提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法4种。提取法虽然工艺简单，但由于原料不足，无法进行大规模生产；化学合成法产品安全性得不到较好的保障，存在一定的环境污染问题。酶的稳定性比较差，且会产生副产物，导致生产效率低。发酵法通过对微生物进行改造，使其产生氨基酸和小分子产物，原料来源广泛，工艺简单易行，是目前常用的生产方法[Shu et al.(2009)Current status of productionfor amino acids and derivatives.CHINA CONDIMENT]。目前生产以上氨基酸最常用的微生物为大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌，二者都需要无菌条件下进行发酵生产，操作比较复杂且成本较高。
目前四氢嘧啶的主要生产方法也为发酵法，分为直接利用嗜盐菌进行发酵和利用改造后的传统菌株进行发酵。通过“细菌挤奶法”进行高密度发酵，即在高渗透压下培养细菌，再使用低渗透压溶质冲洗，不断重复上述过程，最后获得四氢嘧啶[Sauer et al.(1998)Bacterial milking:a novel bioprocess for production of compatiblesolutes.Biotechnology and Bioengineering]。朱皖宜(中国专利：201310416404.4)等使用Halomonas sp.HS-2255及其突变株(保藏号为CGMCC No.6248)进行发酵生产，在72h得到了19.9g/L的产量。然而这些天然嗜盐菌产量比较低，工业生产成本较高。
发明内容
本发明的目的是通过构建高产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的重组型嗜盐菌，实现无灭菌、开放和连续发酵生产上述胞外产品。
因此，本发明提供以下各项：
1.重组嗜盐菌(Halobacteriaceae)，其包含生产天冬氨酸或生产谷氨酸的代谢路径(代谢途径)。
2.根据以上1所述的重组嗜盐菌，其还包含：生产天冬氨酸的衍生物的代谢途径，所述天冬氨酸的衍生物选自赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和四氢嘧啶中的一种或多种(一种，两种，三种，四种或五种)。
3.根据以上1或2所述的重组嗜盐菌，其中所述代谢路径是通过在野生型嗜盐菌中表达(过表达)负责该代谢途径的(外源)基因或(外源)基因的组合和/或减弱或阻断或敲除所述代谢路径的支路和/或分解代谢路径的(内源)基因或(内源)基因的组合(使其为该基因缺陷型)来构建的，优选地基因的减弱或阻断可以通过表达(过表达)所述基因的抑制剂基因来实现的，并且优选所述重组嗜盐菌还表达用于分泌天冬氨酸或其衍生物或谷氨酸到胞外的分泌蛋白。优选地，所述(外源)基因或(外源)基因的组合或抑制剂基因或编码所述分泌蛋白的基因来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。微生物中基因的敲除方法是本领域技术人员公知的。优选地，通过CRISPR-Cas9方法进行基因向嗜盐菌基因组中的整合和/或基因敲除。在本发明中，表达(过表达)基因可以通过本领域公知的基因表达方法/体系进行，并且表达(过表达)基因中所用的启动子优选利用porin启动子库中的启动子[Shen et al.(2018)Promoter engineering for enhanced p(3hb-co-4hb)production by Halomonasbluephagenesis.ACS Synthetic Biology]。
4.根据以上1-3中任一项所述的重组嗜盐菌，其特征在于以下中的一个或多个(优选包括以下特征(1)并且包括以下特征(2)-(6)中任一个，例如特征(1)+(2)的组合，特征(1)+(3)的组合，特征(1)+(4)的组合，特征(1)+(5)的组合或特征(1)+(6)的组合)：
(1)所述重组嗜盐菌通过过表达天冬氨酸合成基因来生产天冬氨酸，优选所述天冬氨酸合成基因为pyc(丙酮酸羧化酶)基因、ppc基因(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)和aspC基因(天冬氨酸转氨酶)，更优选为谷氨酸棒杆菌的(丙酮酸羧化酶)pyc基因、大肠杆菌的ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因和aspC(天冬氨酸转氨酶)基因，最优选pyc基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:46所示序列；ppc基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:35所示序列；和/或aspC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:36所示序列；
(2)所述重组嗜盐菌通过过表达赖氨酸合成基因来生产赖氨酸，优选所述赖氨酸合成基因为lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)基因、dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因、lysE(赖氨酸分泌蛋白)基因和zwf(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为thrB(高丝氨酸激酶)基因和metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因缺陷型，还更优选所述赖氨酸合成基因为大肠杆菌的lysC*基因和asd基因，谷氨酸棒杆菌的dapA基因、lysE基因和zwf基因，最优选lysC*基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:37所示序列；asd基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:38所示序列；dapA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:47所示序列；lysE基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:48所示序列；zwf基因的核苷酸序列为SEQID NO:49所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2或19所示序列；和/或metX基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3或20所示序列；
(3)所述重组嗜盐菌通过过表达蛋氨酸合成基因来生产蛋氨酸，优选所述蛋氨酸合成基因为metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因、yjeH(蛋氨酸分泌蛋白)基因、lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因和malY(胱硫醚裂解酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为thrB(高丝氨酸激酶)基因、metN(蛋氨酸吸收相关的ATP结合蛋白)基因和dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因缺陷型，还更优选所述蛋氨酸合成基因为谷氨酸棒杆菌的metX基因，大肠杆菌的yjeH基因、lysC*基因和malY基因，最优选metX基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:50所示序列；yjeH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:39所示序列；lysC*基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:37所示序列；malY基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:40所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQID NO:2或19所示序列；metN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5或22所示序列；和/或dapA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6或23所示序列；
(4)所述重组嗜盐菌通过过表达苏氨酸合成基因来生产苏氨酸，优选所述苏氨酸合成基因为thrA*BC基因簇[thrA*(天冬氨酸激酶突变体)基因、thrB(高丝氨酸激酶)基因和thrC(苏氨酸合成酶)基因]、lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因、rhtC(苏氨酸分泌蛋白)基因，更优选所述重组嗜盐菌为sstT(苏氨酸吸收蛋白)基因和tdh(苏氨酸脱氢酶)基因缺陷型，还更优选所述蛋氨酸合成基因为大肠杆菌的thrA*BC基因簇[thrA*基因、thrB基因和thrC基因]、大肠杆菌的lysC*基因和rhtC基因，最优选thrA*基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:41所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:42所示序列；thrC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:43所示序列；lysC*基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:37所示序列；rhtC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:44所示序列；sstT基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:8或25所示序列；和/或tdh基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:9或26所示序列；
(5)所述重组嗜盐菌通过过表达异亮氨酸合成基因来生产异亮氨酸，优选所述异亮氨酸合成基因为ilvA(苏氨酸脱水酶)基因、brnFE(氨基酸转运蛋白)基因、thrB(高丝氨酸激酶)基因和ilvBN(乙酰羟基氨酸合酶)基因和tdcB(苏氨酸脱水酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因和dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因缺陷型，还更优选所述异亮氨酸合成基因为谷氨酸棒状杆菌的ilvA基因、brnFE基因、thrB基因和ilvBN基因和大肠杆菌的tdcB基因，最优选ilvA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:62所示序列；brnF基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:51所示序列；brnE基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:52所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:53所示序列；ilvB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:54所示序列；ilvN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:55所示序列；tdcB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:45所示序列；metX基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3或20所示序列；和/或dapA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6或23所示序列；
(6)所述重组嗜盐菌通过过表达四氢嘧啶合成基因来生产四氢嘧啶，优选所述四氢嘧啶合成基因为ectABC基因簇[ectA(氨基丁酸乙酰基转移酶)基因、ectB(二氨基丁酸氨基转移酶)基因、ectC(四氢嘧啶合成酶)基因]、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)基因和lysC(天冬氨酸激酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为doeA(四氢嘧啶水解酶)基因和ectD(四氢嘧啶羟化酶)基因缺陷型，还更优选所述四氢嘧啶合成基因为Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesis TD01的ectABC基因簇[ectA基因、ectB基因、ectC基因]、asd基因和谷氨酸棒杆菌的lysC基因，最优选ectA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:10或27所示序列；ectB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:11或28所示序列；ectC基因的核苷酸序列为SEQID NO:12或29所示序列；asd基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:13或30所示序列；lysC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:56所示序列；doeA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:14或31所示序列；和/或ectD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:15或32所示序列；和/或
(7)所述重组嗜盐菌通过过表达谷氨酸合成基因来生产谷氨酸，优选所述谷氨酸合成基因为ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因、pyc(丙酮酸羧化酶)基因、icd(异柠檬酸脱氢酶)基因、gdh(谷氨酸脱氢酶)基因、odhI(酮戊二酸脱氢酶抑制剂)基因和NCgl1221(谷氨酸输出蛋白)基因，更优选所述重组嗜盐菌为proB(谷氨酸激酶)基因和argJ(精氨酸生物合成双功能蛋白)基因缺陷型，还更优选所述谷氨酸合成基因为谷氨酸棒杆菌的ppc基因、pyc基因、icd基因、gdh基因、odhI基因和NCgl1221基因，最优选ppc基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:57所示序列；pyc基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:46所示序列；icd基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:59所示序列；gdh基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:58所示序列；odhI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:60所示序列；NCgl1221基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:61所示序列；proB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:16或33所示序列；和/或argJ基因的核苷酸序列为SEQID NO:17或34所示序列。
5.根据以上1-4中任一项所述的重组嗜盐菌，其中所述嗜盐菌为嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.)，更优选为Halomonas bluephagenesis或Halomonas aydingkolgenesis，最优选为Halomonas bluephagenesis TD01(菌种保藏编号CGMCC No.4353)或Halomonasaydingkolgenesis M1(菌种保藏编号CGMCC No.19880)。
6.一种制备天冬氨酸或其衍生物的方法，所述天冬氨酸的衍生物选自赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和四氢嘧啶中的一种或多种(一种，两种，三种，四种或五种)，所述方法包括使用根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产天冬氨酸或其衍生物。
7.一种制备谷氨酸的方法，所述方法包括使用根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产谷氨酸。
8.根据以上6或7所述的方法，其中所述方法可以在开放无灭菌和/或批次或连续发酵的条件下进行。
9.一种制备根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌的方法，所述方法包括构建具有以上4中所述特征中一个或多个(优选包括所述特征(1)并且包括所述特征(2)-(6)中任一个，例如特征(1)+(2)的组合，特征(1)+(3)的组合，特征(1)+(4)的组合，特征(1)+(5)的组合或特征(1)+(6)的组合)的重组嗜盐菌。
10.根据以上9所述的方法，其中所述表达(过表达)是通过将所表达的基因在一个或多个质粒上表达或者被整合到所述嗜盐菌的基因组中表达来实现的，和/或所述基因缺陷型是通过从所述嗜盐菌中敲除所述基因来实现的。
发明详述
针对现有生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的技术的不足，本发明的发明人经过反复的研究和实验验证，发明了一种重组嗜盐菌以及使用该嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的方法。
1.发明内容之一，利用嗜盐菌，比如Halomonas aydingkolgenesis M1、Halomonasbluephagenesis TD01等作为天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸生产的底盘细胞。Halomonasbluephagenesis TD01是申请人2012年10月10日公告授权的中国专利CN 102120973B中要求保护的盐单胞菌。Halomonas aydingkolgenesis M1是本发明人从新疆盐湖艾丁湖中筛选、分离和鉴定的嗜盐菌，该菌株已于2020年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.19880。菌株名称为Halomonasaydingkolgenesis M1。
2.发明内容之二，发展高产天冬氨酸及其衍生物的重组嗜盐菌构建方法。并以上述嗜盐菌，但不限于上述嗜盐菌为底盘，发酵生产天冬氨酸及其衍生物，包括天冬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、四氢嘧啶等。
高产天冬氨酸的嗜盐菌构建可以通过但不限于下面方法：
(1)通过porin226启动子过表达大肠杆菌MG1655编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，增强从磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化，促进生成天冬氨酸前体物质[嗜盐菌中CRISPR-Cas9敲除方法来自Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering]。
(2)通过porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，增强从丙酮酸向草酰乙酸的转化，进一步加强前体物草酰乙酸的合成。
(3)通过porin140启动子过表达来自大肠杆菌MG1655的天冬氨酸合成通路上编码天冬氨酸转氨酶的aspC基因，增强从草酰乙酸到天冬氨酸的代谢途径，促进天冬氨酸的生成。
(4)通过(1-3)操作，成功构建高产天冬氨酸的重组嗜盐菌株Halomonasaydingkolgenesis MN和Halomonas bluephagenesis TDN。
涉及的主要反应通路参见图1。具体参见实施例1。
3.发明内容之三，以高产天冬氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesisMN、Halomonas bluephagenesis TDN为底盘菌生产天冬氨酸衍生物。生产天冬氨酸衍生物的嗜盐菌构建可以通过但不限于下面方法(涉及的主要反应通路/代谢途径参见图1)：
(1)构建高产四氢嘧啶的嗜盐菌，主要通过强化①通路，减弱②③④⑤代谢路径，同时降低胞内四氢嘧啶的消耗和对胞外四氢嘧啶的吸收，具体参见实施例2。
(2)构建高产赖氨酸的嗜盐菌，主要通过强化②通路，减弱①③④⑤代谢路径，同时减少赖氨酸的消耗并促进赖氨酸的分泌，具体参见实施例3。
(3)构建高产蛋氨酸的合成途径，主要通过强化③通路，减弱①②④⑤代谢途径，同时减少蛋氨酸的胞内消耗并促进蛋氨酸分泌，具体参见实施例4。
(4)构建高产苏氨酸的合成途径，主要通过强化④通路，减弱①②③⑤代谢途径，同时减少苏氨酸的胞内消耗并促进苏氨酸的分泌，具体参见实施例5。
(5)构建高产异亮氨酸的合成途径，主要通过强化⑤通路，减弱①②③④代谢途径，同时减少对胞外异亮氨酸的吸收作用，并促进异亮氨酸的分泌，具体参见实施例6。
4.发明内容之四，发展高产谷氨酸的重组嗜盐菌构建方法。并以上述嗜盐菌，但不限于上述嗜盐菌为底盘，发酵生产谷氨酸(涉及的主要反应通路/代谢途径参见图1)。高产谷氨酸的嗜盐菌构建可以通过但不限于下面方法：
(1)通过porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因和编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，增强谷氨酸前体物草酰乙酸的合成。
(2)通过porin58启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因和编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因，增强草酰乙酸向谷氨酸的代谢途径。
(3)通过porin140启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032编码酮戊二酸脱氢酶抑制剂的odhI基因和编码谷氨酸输出蛋白的NCgl1221基因，抑制α-酮戊二酸脱氢酶的活性，促使三羧酸循环的碳流量流向谷氨酸,同时促进谷氨酸向胞外的分泌作用。
(4)敲除嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesisTD01中编码谷氨酸激酶的proB基因和编码精氨酸生物合成双功能蛋白的argJ基因，抑制谷氨酸向脯氨酸和精氨酸的转化，阻断谷氨酸的胞内消耗途径。
(5)通过(1-4)操作，得到高产谷氨酸的嗜盐菌株Halomonas aydingkolgenesisM-GO和Halomonas bluephagenesis TD-GO，具体参见实施例7。
上述基因与编码蛋白的对应关系如下：ppc:磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、pyc:丙酮酸羧化酶、icd:异柠檬酸脱氢酶、gdh:谷氨酸脱氢酶、odhI:酮戊二酸脱氢酶抑制剂、NCgl1221:谷氨酸分泌蛋白、proB：谷氨酸激酶、argJ:精氨酸生物合成双功能蛋白。
5.发明内容之五，提供基于上述嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的发酵方法。
培养基：
60LB培养基：60g/L氯化钠,5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨。
基础培养基：20-40g/L葡萄糖,55-70g/L氯化钠，1-10g/L酵母提取物，3-5g/L尿素，1.5-5.2g/L磷酸二氢钾，0.2-0.4g/L硫酸镁，10-15g/L水8.5-10g/L磷酸氢二钠，7-15ml/L的微量元素III，1-5ml/L微量元素IV。
微量元素III：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L二水氯化钙，浓盐酸(12mol/L)41.7ml，加水定容至1000ml。
微量元素IV：100mg/L七水硫酸锌，30mg/L四水氯化锰，300mg/L硼酸，200mg/L六水氯化钴，10mg/L无水硫酸铜，20mg/L六水氯化镍，30mg/L二水钼酸钠。
发酵第一阶段喂养液溶液：150-200g葡萄糖、5-10g酵母和25-35克尿素
发酵第二阶段喂养液为150-200g葡萄糖、3-5g酵母和10-25克尿素
以上培养基均可以采用标准配制方法制得。
发酵罐培养方法：
(1)种子摇瓶培养：
取单克隆于20毫升于60LB中培养，在37℃，200rpm培养12-16小时。取1-5vol％的一级种子培养物，将接种到新鲜的20毫升60LB培养基中，在37℃，200rpm培养10-12小时。最后，将5-10vol％二级种子液接种于50ml 60LB中，在500ml摇瓶中培养，需要时加上抗生素，37℃，200rpm培养48h。
(2)发酵培养：
使用300毫升二级种子培养物作为7升生物反应器(Biolo III/USA)的接种物，该反应器包含3升基础培养基，并根据需要加上特殊组分(每种产物不同，后面有注明)。通过以1vvm(空气体积/培养体积/分钟)的流速注入空气使溶解氧(DO)保持在空气饱和的30％左右。搅拌与溶氧同时进行达到最大转速800rpm。用5M NaOH溶液将pH值调节到8.5。分别在两个阶段加入相应的培养液。
氨基酸及其衍生物检测方法：
取5mL发酵液，用水稀释至50mL，使用高压均质机破碎，12000rpm高速离心10min后取上清，使用高效液相色谱法(日本岛津，LC-20)测定氨基酸及其衍生物含量；检测条件为：TSK-GEL C18色谱柱(4.6×250毫米，Agilent Technologies，美国)，流动相为70％乙腈溶液，柱温40℃，流速1mL/min，进样量5μl，紫外检测波长210nm。
四氢嘧啶检测方法：
为测定四氢嘧啶含量，培养后菌体以6000rpm离心10min，用50Mm Kpi缓冲液(1L50mM的Kpi溶液含有KH2PO4 6.805g，使用KOH调节pH至7)等速洗涤两次至培养基中，悬浮于80％(V/V)乙醇中，静置12小时以提取细胞内四氢嘧啶。将含有四氢嘧啶的细胞提取物过滤并在50℃下蒸发18h。将沉淀物重新悬浮在水/氯仿(1:1v/v)混合物中并剧烈混合；将氯仿层倾析，收集上层透明层并再次离心。用高效液相色谱法采用C18柱和乙腈与水(8：2)组成的流动相(流速为1ml/min)测定四氢嘧啶。
附图说明
图1.天冬氨酸(及其衍生物)和谷氨酸的合成代谢路径(其中：①四氢嘧啶合成代谢途径(深绿色)、②赖氨酸合成代谢途径(浅绿色)、③蛋氨酸合成代谢途径(浅蓝色)、④苏氨酸合成代谢途径(深蓝色)、⑤异亮氨酸合成代谢途径(红色)、⑥谷氨酸合成代谢途径(黄色)图中基因与编码蛋白的对应关系如下：ppc：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、pckA：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、pyc：丙酮酸羧化酶、aspC：天冬氨酸转氨酶、thrA：天冬氨酸激酶I，也有高丝氨酸激酶的活性、metL:天冬氨酸激酶II，也有高丝氨酸激酶的活性、lysC：天冬氨酸激酶III、asd：天冬氨酸半醛脱氢酶、ectA：氨基丁酸乙酰基转移酶、ectB：二氨基丁酸氨基转移酶、ectC：四氢嘧啶合成酶、ectD：四氢嘧啶羟化酶、doeA：四氢嘧啶水解酶、dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶、dapB:二氢甲基嘧啶酸还原酶、dapC：N-琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、dapD：四氢嘧啶琥珀酰酶、dapE：N-琥珀酰-L-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、dapF：二氨基庚二酸差向异构酶、murE：内消旋二氨基庚二酸连接酶、lysA：二氨基庚二酸脱羧酶、metX：高丝氨酸乙酰转移酶、metB：胱硫醚合成酶、metC：胱硫醚裂解酶、metE：高半胱氨酸甲基转移酶、metH：蛋氨酸合成酶、metK:S-腺苷蛋氨酸合成酶、thrB:高丝氨酸激酶、thrC:苏氨酸合成酶、ilvA:苏氨酸脱水酶、ilvBN:乙酰羟基酸合成酶、ilvC:乙酰羟基酸还原异构酶、ilvD:二羟基酸脱水酶、ilvE:支链氨基酸转氨酶、tdh:苏氨酸脱氢酶、icd:异柠檬酸脱氢酶、gdh:谷氨酸脱氢酶、proB:谷氨酸激酶、argJ:精氨酸生物合成双功能蛋白)；
图2.四氢嘧啶发酵液的液相色谱峰图；
图3.氨基酸发酵液的液相色谱峰图及出峰时间与氨基酸的对应关系；
图4.本发明中(实施例)使用的Halomonas aydingkolgenesis M1中的相关基因序列；
图5.本发明中(实施例)使用的Halomonas bluephagenesis TD01中的相关基因序列；
图6.本发明中(实施例)使用的外源表达基因序列；
图7.本发明中的实施例中所用引物序列；和
图8.Halomonas aydingkolgenesis M1(菌种保藏编号CGMCC No.19880)的保藏证明和存活证明。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
改造嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1、Halomonas bluephagenesis TD01生产天冬氨酸
目的是构建高产天冬氨酸的重组型嗜盐菌，并发展基于上述重组型嗜盐菌生产天冬氨酸的发酵方法。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产天冬氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN，包括porin226启动子过表达大肠杆菌MG1655的ppc基因；porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的pyc基因；porin140启动子过表达大肠杆菌MG1655的aspC基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：ppc：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、pyc：丙酮酸羧化酶、aspC：天冬氨酸转氨酶
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN，主要通过下述方法构建得到：
(1)通过porin226启动子过表达大肠杆菌MG1655的ppc基因，通过CRISPR-Cas9的方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组的G3位点和Halomonasbluephagenesis TD01基因组G53位点，增强从磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化，促进生成天冬氨酸前体物质。
(2)通过porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的pyc基因，通过CRISPR-Cas9的方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组的G4位点和Halomonas bluephagenesis TD01基因组G4位点，增强从丙酮酸向草酰乙酸的转化，进一步加强前体物草酰乙酸的合成。
(3)通过porin140启动子过表达来自大肠杆菌MG1655的aspC基因，通过CRISPR-Cas9的方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G2位点和Halomonasbluephagenesis TD01基因组G7位点，增强从草酰乙酸到天冬氨酸的代谢途径，促进天冬氨酸的生成，得到高效生产天冬氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN生产天冬氨酸的发酵方法如下：
培养基组配方和检测方法同前述发明内容之五。
改造高产天冬氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN生产四氢嘧啶
目的是构建高产四氢嘧啶的重组型嗜盐菌，并发展基于上述重组型嗜盐菌生产四氢嘧啶的发酵方法。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产四氢嘧啶的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-ADE、Halomonas bluephagenesis TDN-ADE，包括porin140启动子过表达ectABC基因簇；敲除doeA和ectD形成doeA和ectD基因缺陷型；porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysC和porin58启动子过表达Halomonas aydingkolgenesis MN和Halomonasbluephagenesis TDN的asd基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：ectA：氨基丁酸乙酰基转移酶、ectB：二氨基丁酸氨基转移酶、ectC：四氢嘧啶合成酶、doeA：四氢嘧啶水解酶、ectD：四氢嘧啶羟化酶、lysC：天冬氨酸激酶、asd：天冬氨酸半醛脱氢酶。
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-ADE、Halomonasbluephagenesis TDN-ADE，主要通过下述方法构建得到：
(1)将Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN的ectABC基因簇前分别加入porin140启动子，使用CRISPR-Cas9的方法整合到Halomonasaydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN的基因组G4位置。加强L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径，提升四氢嘧啶产量。
(2)敲除Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN的doeA和ectD基因，减少四氢嘧啶的消耗。
(3)将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC基因用porin226启动子控制表达，整合到Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点和Halomonas bluephagenesis TDN的G7位点；将上述嗜盐菌的asd基因用porin58控制表达，整合到Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1位点和Halomonas bluephagenesis TDN的G43位点，增强四氢嘧啶前体的合成，得到高效生产四氢嘧啶的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-ADE、Halomonasbluephagenesis TDN-ADE。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-ADE、Halomonasbluephagenesis TDN-ADE生产四氢嘧啶的发酵方法如下：
基础培养基ECT：在基础培养基中加入4-10g/L氯化钾，用于四氢嘧啶的生产。
其余培养基组配方和检测方法同前述发明内容之五。
改造高产天冬氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN生产赖氨酸
目的是构建高产赖氨酸的嗜盐菌，并发展基于上述嗜盐菌生产赖氨酸的发酵方法。
为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产赖氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-LAM、Halomonas bluephagenesis TDN-LAM，其中包括porin140启动子过表达大肠杆菌MG1655的lysC*和asd基因，porin68启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的dapA和lysE基因，porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的zwf基因，以及敲除thrB基因和metX基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：
lysC*:：天冬氨酸激酶Ⅲ，引入三处突变T344M,S345L,T352I阻断赖氨酸的变构抑制作用。[Kotaka et al.(2006)Structures of R-and T-state Escherichia coliaspartokinase III.Mechanisms of the allosteric transition and inhibition bylysine.The Journal of Biological Chemistry]
asd：天冬氨酸半醛脱氢酶、dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶、lysE：赖氨酸分泌蛋白、zwf：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、pyc：丙酮酸羧化酶、thrB：高丝氨酸激酶、metX：高丝氨酸乙酰转移酶
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-LAM、Halomonasbluephagenesis TDN-LAM，主要通过下述方法构建得到：
(1)过表达来自大肠杆菌MG 1655的lysC*和asd基因，用porin140启动子表达，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN基因组G4位点上。通过在嗜盐菌中过表达lysC*和asd基因簇，增强了从天冬氨酸到天冬氨酸-β-半醛的代谢途径。
(2)过表达来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的dapA和lysE基因，用porin68启动子表达，整合到Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点和Halomonas bluephagenesisTDN嗜盐菌的G7位点上。通过过表达dapA和lysE，增强从天冬氨酸磷酸到赖氨酸的代谢同时促进赖氨酸的分泌。
(3)过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的zwf基因，用porin226启动子表达，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1位点和Halomonas bluephagenesis TDN基因组G43位点上。通过过表达zwf基因，增强了磷酸戊糖途径，为生产赖氨酸提供大量所需的NADPH，促进赖氨酸高产。
(4)通过CRISPR-Cas9方法敲除thrB基因和metX基因，减少支路代谢的碳流量，促使碳流量流向赖氨酸合成途径。
通过上述操作，成功构建高效生产赖氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesisMN-LAM、Halomonas bluephagenesis TDN-LAM。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-LAM、Halomonasbluephagenesis TDN-LAM生产赖氨酸的发酵方法如下：
培养基配方，培养方法，检测方法同前述发明内容之五。
改造高产天冬氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN生产蛋氨酸
目的是构建高产蛋氨酸的嗜盐菌，并发展基于上述嗜盐菌生产蛋氨酸的发酵方法。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产蛋氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-MMY、Halomonas bluephagenesis TDN-MMY，其中包括用porin141启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的metX和大肠杆菌MG1655的malY基因；用porin226启动子过表达大肠杆菌MG1655的yjeH和lysC*基因；敲除thrB、metN基因和dapA基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：
lysC*：天冬氨酸激酶，引入三处突变T344M,S345L,T352I阻断赖氨酸的变构抑制作用[Kotaka et al.(2006)Structures of R-and T-state Escherichia coliaspartokinase III.Mechanisms of the allosteric transition and inhibition bylysine.The Journal of Biological Chemistry]
metX：高丝氨酸乙酰转移酶、malY：胱硫醚裂解酶(来自大肠杆菌MG1655，在蛋氨酸合成通路中，将胱硫醚转变为高半胱氨酸)、thrB：高丝氨酸激酶、metN：蛋氨酸吸收相关的ATP结合蛋白、yjeH：蛋氨酸输出蛋白、dapA二氢吡啶二羧酸合成酶
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-MMY、Halomonasbluephagenesis TDN-MMY，主要通过下述方法构建得到：
(1)过表达来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的metX和大肠杆菌MG1655的malY基因，用porin141启动子表达，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入嗜盐菌Halomonasaydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点上。通过在嗜盐菌中过表达metX和malY基因，增强了从高丝氨酸到蛋氨酸的代谢途径。
(2)通过CRISPR-Cas9基因编辑方法过表达来自大肠杆菌MG1655的yjeH和lysC*基因，用porin226启动子表达，整合到Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点和Halomonas bluephagenesis TDN的G7位点上。通过过表达lysC*和yjeH，进一步增强蛋氨酸合成代谢途径，同时增强蛋氨酸的分泌的功能。
(3)通过CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesisMN、Halomonas bluephagenesis TDN中thrB、metN和dapA基因，形成苏氨酸、赖氨酸缺陷型菌株，使高丝氨酸的碳流量偏向蛋氨酸合成通路，同时敲除蛋氨酸吸收蛋白基因，抑制蛋氨酸进入细胞，从而提高胞外蛋氨酸产量。
通过上述操作，成功构建高效生产蛋氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesisMN-MMY、Halomonas bluephagenesis TDN-MMY。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-MMY、Halomonasbluephagenesis TDN-MMY生产蛋氨酸的发酵方法如下：
基础培养基MET：在基础培养基中加入2-17g/L硫代硫酸钠用于蛋氨酸的生产。
其余培养基组配方、发酵过程、检测方法同前述发明内容之五。
改造高产天冬氨酸嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN生产苏氨酸
目的是构建高产苏氨酸的嗜盐菌，并发展基于上述嗜盐菌生产苏氨酸的发酵方法。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产苏氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3、Halomonas bluephagenesis TDN-HR3，其中包括porin68启动子过表达大肠杆菌MG1655的thrA*BC基因簇；porin226启动子表达大肠杆菌MG1655的lysC*和rhtC基因；敲除sstT和tdh基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：
thrA*：天冬氨酸激酶Ⅰ，是双功能酶，也有高丝氨酸激酶的活性[Yuzbashev etal.(2013)Directed Modification of Escherichia coli Metabolism for the Designof Threonine-Producing Strains.Applied Biochemistry&Microbiology]
lysC*：天冬氨酸激酶Ⅲ，引入三处突变T344M,S345L,T352I阻断赖氨酸的变构抑制作用[Kotaka et al.(2006)Structures of R-and T-state Escherichia coliaspartokinase III.Mechanisms of the allosteric transition and inhibition bylysine.The Journal of Biological Chemistry]
thrB：高丝氨酸激酶、thrC：苏氨酸合成酶、rhtC:苏氨酸分泌蛋白、sstT:苏氨酸吸收蛋白、tdh:苏氨酸脱氢酶。
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3、Halomonasbluephagenesis TDN-HR3，主要通过下述方法构建得到：
(1)将来自大肠杆菌MG1655的thrA*BC基因簇前加入porin68启动子，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN基因组G4位点上。通过在thrA*中引入突变而降低苏氨酸对其的变构抑制作用；通过在嗜盐菌中过表达thrA*BC基因簇，增强了从天冬氨酸到苏氨酸的代谢流，提升苏氨酸产量。
(2)用porin226启动子控制表达来自大肠杆菌MG1655的rhtC和lysC*基因，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组的G43、G49和G4位点和Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1、G2、G5位点上。通过增加基因拷贝数来增强rhtC和lysC*在嗜盐菌中的表达强度，从而增强从天冬氨酸到苏氨酸的代谢途径，同时促进苏氨酸的分泌作用。
(3)敲除嗜盐菌中的sstT和tdh基因。通过CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除Halomonas bluephagenesis TDN、Halomonas aydingkolgenesis MN中的sstT和tdh基因，减少胞内苏氨酸的消耗以及对胞外苏氨酸的摄取，从而构建得到高效生产苏氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3、Halomonas bluephagenesis TDN-HR3。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3、Halomonasbluephagenesis TDN-HR3生产苏氨酸的发酵方法如下：
培养基配方，培养方法，检测方法同前述发明内容之五。
改造高产天冬氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonasbluephagenesis TDN生产异亮氨酸。
目的是构建高产异亮氨酸的嗜盐菌，并发展基于上述嗜盐菌生产异亮氨酸的发酵方法。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产异亮氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-IIB、Halomonas bluephagenesis TDN-IIB，其中包括用porin141启动子过表达谷氨酸棒状杆菌JHI3-156的ilvA基因和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的thrB基因和ilvBN基因；用porin226启动子过表达来自大肠杆菌MG1655的tdcB基因；用porin58启动子表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032的brnFE基因；敲除metX、dapA基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：
ilvA：苏氨酸脱水酶[来自谷氨酸棒状杆菌JHI3-156.Yin et al.(2012)Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acidsynthase increase l-isoleucine production in Corynebacteriumglutamicum.Metabolic Engineering]
ilvBN：乙酰羟基氨酸合酶、tdcB：苏氨酸脱水酶(来自大肠杆菌MG1655)、dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶、brnFE：异亮氨酸输出蛋白、thrB：高丝氨酸激酶、metX：高丝氨酸乙酰转移酶
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-IIB、Halomonasbluephagenesis TDN-IIB，主要通过下述方法构建得到：
(1)过表达来自谷氨酸棒状杆菌JHI3-156的ilvA基因和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的thrB基因和ilvBN基因，用porin141启动子表达，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点上，增强了从高丝氨酸到异亮氨酸的代谢途径。其中谷氨酸棒状杆菌JHI3-156中的ilvA基因对异亮氨酸变构抑制效应有很好的抵抗作用[Yin et al.(2012)Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acid synthase increase l-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum.Metabolic Engineering]。
(2)过表达来自大肠杆菌MG1655的tdcB基因，用porin226启动子表达，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1位点和Halomonas bluephagenesis TDN基因组G43位点上，增强了从苏氨酸到异亮氨酸的代谢流通量。
(3)过表达来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的brnFE基因，用porin58启动子表达，通过CRISPR-Cas9基因编辑方法插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点和Halomonas bluephagenesis TDN基因组G7位点上，增强异亮氨酸的分泌作用。
(4)通过CRISPR-Cas9方法敲除嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TDN、Halomonas aydingkolgenesis MN中metX、dapA的基因，形成蛋氨酸、赖氨酸缺陷型菌株。减弱支路代谢途径的碳流量，使代谢流通量偏向苏氨酸和亮氨酸途径。
通过上述操作，成功构建高效生产异亮氨酸的嗜盐菌Halomonasaydingkolgenesis MN-IIB、Halomonas bluephagenesis TDN-IIB。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-IIB、Halomonasbluephagenesis TDN-IIB生产异亮氨酸的发酵方法如下：
培养基配方，培养方法，检测方法同前述发明内容之五。
改造嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1、Halomonas bluephagenesis TD01生产谷氨酸
目的是构建高产谷氨酸的嗜盐菌，并发展基于上述嗜盐菌生产谷氨酸的发酵方法。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产谷氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M-GO、Halomonasbluephagenesis TD-GO，其中包括用porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的ppc基因；porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的pyc基因；用porin58启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的icd基因和gdh基因；用porin140启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的odhI基因和NCgl1221基因；敲除proB、argJ基因。
上述基因和编码蛋白的对应关系如下：
ppc:磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、pyc:丙酮酸羧化酶、icd:异柠檬酸脱氢酶、gdh:谷氨酸脱氢酶、odhI:酮戊二酸脱氢酶抑制剂、NCgl1221:谷氨酸分泌蛋白、proB:谷氨酸激酶、argJ:精氨酸生物合成双功能蛋白。
2.本发明的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M-GO、Halomonasbluephagenesis TD-GO，主要通过下述方法构建得到：
(1)通过porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的ppc基因，通过CRISPR-Cas9的方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G3位点和Halomonas bluephagenesis TD01基因组G53位点；通过porin226启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的pyc基因，插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组和Halomonas bluephagenesis TD01基因组的G4位点，增强谷氨酸前体物草酰乙酸的合成。
(2)通过porin58启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的icd基因和gdh基因，通过CRISPR-Cas9的方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G1位点和Halomonas bluephagenesis TD01基因组G43位点，增强草酰乙酸向谷氨酸的代谢途径。
(3)通过porin140启动子过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的odhI基因和的NCgl1221基因，通过CRISPR-Cas9的方法插入嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G2位点和Halomonas bluephagenesis TD01基因组G7位点，抑制α-酮戊二酸脱氢酶的活性，促使三羧酸循环的碳流量流向谷氨酸,同时促进谷氨酸向胞外的分泌作用。
(4)敲除嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1、Halomonas bluephagenesisTD01的proB基因和argJ基因，抑制谷氨酸向脯氨酸和精氨酸的转化，阻断谷氨酸的胞内消耗途径。
通过上述操作，成功构建高效生产谷氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesisM-GO、Halomonas bluephagenesis TD-GO。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M-GO、Halomonasbluephagenesis TD-GO生产谷氨酸的发酵方法如下：
基础培养基GLU：在基础培养基中加入0.1-1mg/L VB1和4-70ug/L生物素用于谷氨酸的生产。
其余培养基组配方、发酵过程、检测方法同前述发明内容之五。
为了进一步阐述上述具体实施方式，提供以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1生产天冬氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN的构建
1.增强磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸向草酰乙酸的转化，促进生成天冬氨酸前体物质。
(1)将ppc基因和pyc基因分别插入Halomonas bluephagenesis TD01基因组G53和G4位位点。
①以大肠杆菌MG1655[Hayashi et al.(2006)Highly accurate genomesequences of Escherichia coli K-12strains MG1655 and W3110.Mol Syst Biol.]基因组为模板，通过引物ppc-F，ppc-R(具体引物参见附图7，以下同)扩增获取ppc基因片段(具体基因序列参见附图4至6，以下同)。
②利用porin启动子库[Shen et al.(2018)Promoter engineering forenhanced p(3hb-co-4hb)production by Halomonas bluephagenesis.ACS SyntheticBiology]，以启动子porin226为模板，通过引物226-F，226-R扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ143[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering]为模板，通过引物pQ143-F、pQ143-R扩增获取质粒骨架片段，将上述片段通过Gibson的方法[Gibson et al.(2009)Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.NatMethods]组装到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome of extremophile Halomonas spp.MetabolicEngineering]通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TD01中，再将③中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落[接合具体过程来自Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome of extremophile Halomonasspp.Metabolic Engineering]。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过同样的方法将porin226启动子表达的pyc基因插入Halomonasbluephagenesis TD01基因组的G4位点，其中通过引物pyc-F,pyc-R扩增pyc片段，通过226’-F，226’-R扩增获取porin226片段，通过引物pQ41-F、pQ41-R扩增获取质粒骨架片段。
(2)将ppc基因和pyc基因分别插入Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G3、G4位点。
①以pQ41质粒[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering]为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物G3-F，G3-R对pQ41进行环状PCR扩增为线性片段，再进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以Halomonas aydingkolgenesis M1基因组为模板，通过引物ppc’-F,ppc’-R扩增获取ppc基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物226”-F，226”-R扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisM1基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物G3L-F,G3L-R扩增上游同源臂，通过G3R-F,G3R-R扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物pQ3-F、pQ3-R扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis M1中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑨通过相同的方法将pyc基因插入Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G4位点，其中，将gRNA连入pQ41质粒所用引物为G4-F，G4-R，扩增获取pyc基因片段所用引物为pyc‘-F,pyc‘-’R，扩增获取启动子porin226所用引物为226”’-F，226”’-R，扩增获取上游同源臂所用引物为G4L-F,G4L-R，扩增获取下游同源臂所用引物为G4R-F,G4R-R，扩增获取质粒骨架所用引物为pQ4-F,pQ4-R。
2.增强从草酰乙酸到天冬氨酸的代谢途径，促进天冬氨酸的生成。
(1)将aspC基因片段插入Halomonas bluephagenesis TD01基因组G7位点。
①以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物aspC-F，aspC-R扩增获取aspC基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物140-F，140-R扩增获取porin140启动子片段。
③以质粒pQ44[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering]为模板，通过引物pQ44-F、pQ44-R扩增获取质粒骨架片段，将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TD01中，再将③中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将aspC基因片段插入Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G2位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物G2-F，G2-R对pQ41进行环状PCR扩增为线性片段，再进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以Halomonas aydingkolgenesis M1为模板，通过引物aspC-F,aspC-R扩增获取aspC基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物140’-F，140’-R扩增获取porin140启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisM1基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物G2L-F,G2L-R扩增上游同源臂，通过G2R-F,G2R-R扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物pQ2-F、pQ2-R扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis M1中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
通过上述基因操作的组合，增强了天冬氨酸的合成通路，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵36小时，得到天冬氨酸产量如下：Halomonas aydingkolgenesisMN生产天冬氨酸的产量为40.2g/L，Halomonas bluephagenesis TDN生产天冬氨酸的产量为43.8g/L，而野生型嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonasbluephagenesis TD01生产天冬氨酸的产量为0g/L，因此本发明提供了高效生产天冬氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN、Halomonas bluephagenesis TDN。该嗜盐菌培养条件简单，合成天冬氨酸的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。天冬氨酸产物的HPLC鉴定图谱参见图3。
实施例2.产生四氢嘧啶的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-ADE、Halomonas bluephagenesis TDN-ADE的构建
1.过表达L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径。
(1)将ectABC基因簇插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点。
①以Halomonas bluephagenesis TDN基因组为模板，通过引物F1，R1扩增获取ectABC片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物F2，R2扩增获取porin140启动子片段。
③以质粒pQ41为模板，通过引物F3、R3扩增获取质粒骨架片段，将上述三个片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将③中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将ectABC基因簇插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G4位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F1-1,R1-1对pQ41进行环状PCR扩增为线性片段，再进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以Halomonas aydingkolgenesis MN基因组为模板，通过引物F2-1,R2-1扩增获取ectABC片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物F3-1,R3-1扩增获取porin140启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F4-1,R4-1扩增上游同源臂，通过F5-1,R5-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F6-1、R6-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
2.敲除ectD和doeA基因，减少四氢嘧啶的消耗。
(1)在Halomonas bluephagenesis TDN基因组中敲除ectD和doeA基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在ectD位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F4,R4,对pQ41进行环状PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas bluephagenesisTDN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F5,R5扩增上游同源臂，通过F6,R6扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F7,R7扩增为线性片段，以Gibson连接的方法将上述片段组装在一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasbluephagenesis TDN中。再将③中构建得到的质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组的doeA基因，其中pQ41环P自连的引物为F8,R8，扩增上游同源臂引物为F9,R9，扩增下游同源臂的引物为F10,R10，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F11，R11。
(2)在Halomonas aydingkolgenesis MN基因组中敲除ectD和doeA基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在ectD位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F7-1，R7-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F8-1,R8-1扩增上游同源臂，通过F9-1,R9-1扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F10-1，R10-1扩增为线性片段，以Gibson连接的方法将上述片段组装到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasaydingkolgenesis MN中。再将③中构建的质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组的doeA基因，其中pQ41环P自连的引物为F11-1,R11-1，扩增上游同源臂引物为F12-1,R12-1，扩增下游同源臂的引物为F13-1,R13-1，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F14-1，R14-1。
3.整合lysC和asd基因，增强四氢嘧啶前体的合成。
(1)将lysC和asd基因分别插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G7、G43位点。
①以Halomonas bluephagenesis TDN基因组为模板，通过引物F12,R12扩增获取lysC基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F13,R13扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ44为模板，通过引物F14、R14扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑧通过同样的方法将porin58启动子表达的asd基因插入Halomonasbluephagenesis TDN基因组的G43位点，其中通过引物F15,R15扩增asd片段，通过F16,R16扩增获取porin58片段，通过引物F17、R17扩增获取质粒骨架片段。
(2)将lysC和asd基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2、G1位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F15-1，R15-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以Halomonas aydingkolgenesis MN基因组为模板，通过引物F16-1,R16-1扩增获取lysC片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F17-1,R17-1扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas bluephagenesisTDN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F18-1,R18-1扩增上游同源臂，通过F19-1,R19-1扩增下游同源臂。
⑥以①中得到的质粒为模板，通过引物F20-1、R20-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑦使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑥中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑧验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑨挑选出测序正确的菌株，在无抗(不含抗生素)的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑩通过相同的方法将asd基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1位点，其中，将gRNA连入pQ41质粒所用引物为F21-1,R21-1，扩增获取asd基因片段所用引物为F22-1,R22-1，扩增获取启动子porin58所用引物为F23-1,R23-1，扩增获取上游同源臂所用引物为F24-1,R24-1，扩增获取下游同源臂所用引物为F25-1,R25-1，扩增获取质粒骨架所用引物为F26-1,R26-1。
通过上述基因操作的组合，增强了四氢嘧啶的合成通路，并减弱四氢嘧啶的胞内消耗，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵28小时，得到四氢嘧啶产量如下：Halomonas aydingkolgenesis MN-ADE生产四氢嘧啶的产量为28.7g/L，Halomonasbluephagenesis TDN-ADE生产四氢嘧啶的产量为33.8g/L，而野生型嗜盐菌Halomonasaydingkolgenesis M1生产四氢嘧啶产量为0.6g/L，Halomonas bluephagenesis TD01生产四氢嘧啶的产量为0.8g/L，因此本发明提供了高效生产四氢嘧啶的重组嗜盐菌Halomonasaydingkolgenesis MN-ADE、Halomonas bluephagenesis TDN-ADE。该嗜盐菌培养条件简单，合成四氢嘧啶的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。四氢嘧啶产物的HPLC鉴定图谱参见图2。
实施例3.产生赖氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-LAM、Halomonas bluephagenesis TDN-LAM的构建
1.过表达lysC*和asd基因，增强了从天冬氨酸到天冬氨酸-β-半醛的代谢途径。
(1)将lysC*和asd基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点
①以大肠杆菌MG 1655基因组为模板，通过引物F18，R18扩增获取lysC基因片段，通过变构抑制，得到lysC*基因片段。通过引物F19，R19扩增获取asd基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物F20，R20扩增获取porin140启动子片段。
③以质粒pQ41为模板，通过引物F21、R21扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将lysC*和asd基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G4位点
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F27-1，R27-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以大肠杆菌MG 1655基因组为模板，通过引物F28-1，R28-1扩增获取lysC片段，通过变构抑制，得到lysC*基因片段；通过引物F29-1，R29-1扩增获取asd片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物F30-1,R30-1扩增获取porin140启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F31-1，R31-1扩增上游同源臂，通过F32-1,R32-1扩增下游同源臂。
⑥以①中得到的质粒为模板，通过引物F33-1、R33-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑦使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑥中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑧验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑨挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
2.过表达dapA和lysE基因，增强从天冬氨酸磷酸到赖氨酸的代谢同时促进赖氨酸的分泌。
(1)将dapA和lysE基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G7位点
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032[Ikeda et al.(2003)The Corynebacteriumglutamicum genome:features and impacts on biotechnological processes.ApplMicrobiol Biotechnol.]基因组为模板，通过引物F22,R22扩增获取dapA基因片段。通过引物F23，R23扩增获取lysE基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin68为模板，通过引物F25，R25扩增获取porin68启动子片段。
③以质粒pQ44为模板，通过引物F26、R26扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将dapA和lysE基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F34-1，R34-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F35-1，R35-1扩增获取dapA片段，通过引物F36-1,R36-1扩增获取lysE片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin68为模板，通过引物F37-1,R37-1扩增获取porin68启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F38-1,R38-1扩增上游同源臂，通过F39-1，R39-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F40-1、R40-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
3.过表达zwf基因，增强了磷酸戊糖途径，为生产赖氨酸提供大量所需的NADPH，促进赖氨酸高产。
(1)将zwf基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G43位点
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F26’,R26’扩增获取zwf基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F27，R27扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ133[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering]为模板，通过引物F28、R28扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将zwf基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F41-1，R41-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F42-1，R42-1扩增获取zwf片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F43-1，R43-1扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F44-1，R44-1扩增上游同源臂，通过F45-1,R45-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F46-1、R46-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
4.敲除metX、thrB基因，减少支路代谢的碳流量，促使碳流量流向赖氨酸合成途径,同时降低赖氨酸向肽聚糖的转化，从而减少赖氨酸的消耗。
(1)敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组中的metX、thrB基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在metX位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F29，R29，对pQ41进行环装PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas bluephagenesisTDN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F30，R30扩增上游同源臂，通过F31,R31扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F32，R32扩增为线性片段，以Gibson连接的方法将质粒和两个同源臂连接到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasbluephagenesis TDN中。再将③中质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组的thrB基因，其中pQ41环P自连的引物为F33,R33，扩增上游同源臂引物为F34，R34，扩增下游同源臂的引物为F35，R35，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F36，R36。
(2)敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组中的metX、thrB基因
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在metX位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F47-1，R47-1，对pQ41进行环状PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F48-1，R48-1扩增上游同源臂，通过F49-1,R49-1扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F50-1，R50-1扩增为线性片段，以Gibson连接的方法将质粒和两个同源臂连接到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasaydingkolgenesis MN中。再将③中构建的质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组的thrB基因，其中pQ41环P自连的引物为F51-1，R51-1，扩增上游同源臂引物为F52-1，R52-1，扩增下游同源臂的引物为F53-1，R53-1，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F54-1,R54-1。
通过上述基因操作的组合，成功加强赖氨酸的合成通路，减弱支路代谢的碳流量，降低赖氨酸的胞内消耗，同时促进赖氨酸的分泌作用，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵36小时，得到赖氨酸产量如下：Halomonas aydingkolgenesis MN-LAM生产赖氨酸产量为38.2g/L，Halomonas bluephagenesis TDN-LAM生产赖氨酸产量为40.6g/L，而野生型嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesis TD01生产赖氨酸产量为0g/L。因此本发明提供了高效生产赖氨酸的嗜盐菌Halomonasaydingkolgenesis MN-LAM、Halomonas bluephagenesis TDN-LAM。该嗜盐菌培养条件简单，合成赖氨酸的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。赖氨酸产物的HPLC鉴定图谱参见图3。
实施例4.产生蛋氨酸的重组嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-MMY、Halomonas bluephagenesis TDN-MMY的构建
1.过表达metX和malY基因，增强了从高丝氨酸到蛋氨酸的代谢途径。
(1)将metX和malY基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组的G4位点。
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F41,R41扩增获取metX基因片段；以大肠杆菌MG 1655基因组为模板，通过引物F42,R42扩增获取malY基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin141为模板，通过引物F43，R43扩增获取porin141启动子片段。
③以质粒pQ41为模板，通过引物F44，R44扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将metX和malY基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组的G4位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F59-1，R59-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F60-1,R60-1扩增获取metX基因片段；以大肠杆菌MG 1655基因组为模板，通过引物F61-1，R61-1扩增获取malY基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin141为模板，通过引物F62-1，R62-1扩增获取porin141启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F63-1，R63-1扩增上游同源臂，通过F64-1,R64-1扩增下游同源臂。
⑥以①中得到的质粒为模板，通过引物F65-1、R65-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑦使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑥中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑧验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑨挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
2.过表达yjeH和lysC*基因，进一步增强蛋氨酸合成代谢途径，同时增强蛋氨酸的分泌功能。
(1)将yjeH和lysC*基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组的G7位点。
①以大肠杆菌MG 1655基因组为模板，通过引物F45，R45扩增获取yjeH基因片段，通过引物F46，R46扩增获取lysC*基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F47,R47扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ44为模板，通过引物F48,R48扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将yjeH和lysC*基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F66-1，R66-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以大肠杆菌MG 1655基因组为模板，通过引物F67-1，R67-1扩增获取yjeH基因片段，通过引物F68-1,R68-1扩增获取lysC基因片段，通过变构抑制，得到lysC*基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F69-1,R69-1扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F70-1，R70-1扩增上游同源臂，通过F71-1,R71-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F72-1、R72-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑥中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
3.敲除嗜盐菌中的thrB、metN和dapA基因，减少支路代谢的碳流量，同时抑制蛋氨酸进入细胞，从而提高胞外蛋氨酸产量。
(1)敲除嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TDN中的thrB、metN和dapA基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在metN基因位点附近寻找合适的20bp作为guide RNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F49，R49，对pQ41进行环状PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas bluephagenesisTDN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F50，R50扩增上游同源臂，通过F51,R51扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F52，R52扩增为线性片段，以Gibson方法将上述片段连接到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasbluephagenesis TDN中。再将③中质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组的dapA基因，其中pQ41环P自连的引物为F53，R53，扩增上游同源臂引物为F54，R54，扩增下游同源臂的引物为F55,R55，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F56，R56。
⑧thrB敲除方法见实施例3。
(2)敲除嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN中的thrB、metN和dapA基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在metN位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F73-1，R73-1，对pQ41进行环装PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F74-1，R74-1扩增上游同源臂，通过F75-1,R75-1扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F76-1，R76-1扩增为线性片段，以Gibson方法将上述片段连接在一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasaydingkolgenesis MN中。再将③中构建的质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组的dapA基因，其中pQ41环P自连的引物为F77-1，R77-1，扩增上游同源臂引物为F78-1，R78-1，扩增下游同源臂的引物为F79-1，R79-1，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F80-1，R80-1。
⑧thrB敲除方法见实施例3。
通过上述基因操作的组合，成功加强蛋氨酸的合成通路，减弱支路代谢的碳流量，降低蛋氨酸的胞内消耗，同时促进蛋氨酸的分泌作用，减弱对胞外蛋氨酸的吸收作用，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵36小时，得到蛋氨酸产量如下：Halomonasaydingkolgenesis MN-MMY生产蛋氨酸产量为7.9g/L，Halomonas bluephagenesis TDN-MMY生产蛋氨酸产量为8.6g/L。而野生型嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesis TD01生产蛋氨酸产量为0g/L。因此本发明提供了高效生产蛋氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-MMY、Halomonas bluephagenesis TDN-MMY。该嗜盐菌培养条件简单，合成蛋氨酸的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。蛋氨酸产物的HPLC鉴定图谱参见图3。
实施例5.生产苏氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3、Halomonasbluephagenesis TDN-HR3的构建
1.过表达thrA*BC基因簇，分别调控thrA*、thrB、thrC基因表达强度，增强苏氨酸的合成途径。
(1)将thrA*BC基因簇插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点。
①以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物F61，R61扩增获取thrABC基因簇片段，通过变构抑制，得到thrA*BC基因簇[Yuzbashev et al.(2013)Directed Modificationof Escherichia coli Metabolism for the Design of Threonine-ProducingStrains.Applied Biochemistry&Microbiology]。
②利用porin启动子库，以启动子porin68为模板，通过引物F62，R62扩增获取porin68启动子片段。
③以质粒pQ41为模板，通过引物F63，R63扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将thrA*BC基因簇插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G4位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F81-1，R81-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物F82-1，R82-1扩增获取thrABC基因簇片段，通过变构抑制，得到thrA*BC基因簇。
③利用porin启动子库，以启动子porin68为模板，通过引物F83-1,R83-1扩增获取porin68启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F84-1，R84-1扩增上游同源臂，通过F85-1，R85-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F86-1、R86-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
2.过表达rhtC和lysC*基因，进一步增强苏氨酸代谢流，同时促进苏氨酸的分泌。
(1)将rhtC和lysC*基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G43、G49、G4位点。
①以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物F64，R64扩增获取rhtC基因片段，通过引物F64’，R64’扩增获取lysC基因片段，通过变构抑制，得到lysC*基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F65，R65扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ133为模板，通过引物F66、R66扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑧通过同样的方法将rhtC和lysC*基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G49位点，其中，通过引物F67,R67扩增获取rhtC片段，通过引物F67’，R67’扩增获取lysC基因片段，通过变构抑制获得lysC*基因片段；通过引物F68，R68扩增获取porin226启动子片段；以pQ139[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome of extremophileHalomonas spp.Metabolic Engineering]为模板，通过F69，R69扩增获取质粒骨架片段。
⑨通过同样的方法将rhtC和lysC*基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点，其中，通过引物F70，R70扩增获取rhtC片段，通过引物F70’，R70’扩增获取lysC基因片段，通过变构抑制获得lysC*基因片段；通过引物F71，R71扩增获取porin226启动子片段；以pQ41为模板，通过F72，R72扩增获取质粒骨架片段。
(2)将rhtC和lysC*基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1、G2、G5位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F87-1，R87-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G1的质粒。
②以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物F88-1,R88-1扩增获取lysC基因片段，通过变构抑制，得到lysC*基因片段；通过引物F89-1,R89-1扩增获取rhtC基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F90-1，R90-1扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F91-1，R91-1扩增上游同源臂，通过F92-1，R92-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F93-1、R93-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑨通过同样的方法将rhtC和lysC*基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点，其中，通过引物F94-1、R94-1获取含有gRNA-G2的质粒，通过引物F95-1、R95-1扩增获取lysC*基因片段，通过引物F96-1、R96-1扩增获取rhtC基因片段，通过引物F97-1，R97-1扩增获取启动子porin226，通过引物F98-1，R98-1扩增获取上游同源臂，通过引物F99-1，R99-1扩增获取下游同源臂，通过引物F100-1，R100-1扩增获取质粒骨架片段。
⑩通过同样的方法将rhtC和lysC*基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G5位点，其中，通过引物F101-1、R101-1获取含有gRNA-G5的质粒，通过引物F102-1，R102-1扩增获取lysC*基因片段，通过引物F103-1、R103-1扩增获取rhtC基因片段，通过引物F104-1，R104-1扩增获取启动子porin226，通过引物F105-1，R105-1扩增获取上游同源臂，通过引物F106-1，R106-1扩增获取下游同源臂，通过引物F107-1，R107-1扩增获取质粒骨架片段。
3.敲除sstT和tdh基因，降低胞内苏氨酸的消耗和对胞外苏氨酸的摄取。
(1)敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组中的sstT和tdh基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在sstT基因位点附近寻找合适的20bp作为guide RNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F73，R73，对pQ41进行环状PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas bluephagenesisTDN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F74,R74扩增上游同源臂，通过F75,R75扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F76，R76扩增为线性片段，以Gibson连接的方法将质粒和两个同源臂连接到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasbluephagenesis TDN中。再将③中质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组的tdh基因，其中pQ41环P自连的引物为F77,R77，扩增上游同源臂引物为F78,R78，扩增下游同源臂的引物为F79,R79，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F80，R80。
(2)敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组中的sstT和tdh基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在sstT位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F108-1，R108-1，对pQ41进行环装PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F109-1,R109-1扩增上游同源臂，通过F110-1,R110-1扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F111-1，R111-1扩增为线性片段，以Gibson方法将上述片段连接在一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasaydingkolgenesis MN中。再将③中构建的质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组的tdh基因，其中pQ41环P自连的引物为F112-1,R112-1，扩增上游同源臂引物为F113-1,R113-1，扩增下游同源臂的引物为F114-1,R114-1，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F115-1，R115-1。
通过上述基因操作的组合，加强了苏氨酸的合成通路，降低苏氨酸的胞内消耗以及对胞外苏氨酸的吸收作用，同时促进苏氨酸的分泌，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵36小时，得到苏氨酸产量如下：Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3生产苏氨酸产量为35.8g/L，Halomonas bluephagenesis TDN-HR3生产苏氨酸产量为38g/L。而野生型嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesis TD01生产苏氨酸产量为0g/L。因此本发明提供了高产苏氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-HR3、Halomonas bluephagenesis TDN-HR3。该嗜盐菌培养条件简单，合成苏氨酸的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。苏氨酸产物的HPLC鉴定图谱参见图3。
实施例6.生产异亮氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-IIB、Halomonas bluephagenesis TDN-IIB的构建
1.过表达thrB、ilvA和ilvBN基因，增强了从高丝氨酸到异亮氨酸的代谢途径。
(1)将thrB、ilvA和ilvBN基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G4位点。
①以谷氨酸棒状杆菌JHI3-156基因组为模板，通过引物F81,R81扩增获取ilvA基因片段；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F82.R82扩增获取thrB基因片段，通过引物F83,R83扩增获取和ilvBN基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin141为模板，通过引物F84，R84扩增获取porin141启动子片段。
③以质粒pQ41为模板，通过引物F85、R85扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将thrB、ilvA和ilvBN基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G4位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F116-1，R116-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G4的质粒。
②以谷氨酸棒状杆菌JHI3-156[Yin et al.(2012)Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acid synthase increase l-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum.Metabolic Engineering]基因组为模板，通过引物F117-1,R117-1扩增获取ilvA基因片段；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F118-1.R118-1扩增获取thrB基因片段，通过引物F119-1,R119-1扩增获取和ilvBN基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin141为模板，通过引物F120-1,R120-1扩增获取porin141启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F121-1,R121-1扩增上游同源臂，通过F122-1,R122-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F123-1、R123-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
2.过表达tdcB基因，增强从苏氨酸到异亮氨酸的代谢流通量。
(1)将tdcB基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G43位点。
①以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物F86,R86扩增获取tdcB基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F87，R87扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ133为模板，通过引物F88，R88扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将tdcB基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G1位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F124-1，R124-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G1的质粒。
②以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过引物F125-1,R125-1扩增获取tdcB基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F126-1,R126-1扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F127-1,R127-1扩增上游同源臂，通过F128-1,R128-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F129-1、R129-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑥中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
3.过表达brnFE基因，增强异亮氨酸的分泌作用。
(1)将brnFE基因插入Halomonas bluephagenesis TDN基因组G7位点。
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F89,R89扩增获取brnFE基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin58为模板，通过引物F90，R90扩增获取porin58启动子片段。
③以质粒pQ44为模板，通过引物F91、R91扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TDN中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
(2)将brnFE基因插入Halomonas aydingkolgenesis MN基因组G2位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F130-1，R130-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G2的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F131-1,R131-1扩增获取brnFE基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin58为模板，通过引物F132-1,R132-1扩增获取porin58启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisMN基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F133-1,R133-1扩增上游同源臂，通过F134-1,R134-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F135-1、R135-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis MN中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
4.敲除嗜盐菌metX、dapA基因，形成蛋氨酸、赖氨酸缺陷型菌株。减弱支路代谢途径的碳流量，使代谢流通量偏向苏氨酸和亮氨酸途径。
(1)敲除Halomonas bluephagenesis TDN基因组中的metX、dapA基因。
①敲除metX基因的方法及所用引物同实施例3。
②敲除dapA基因的方法及所用引物同实施例4。
(2)敲除Halomonas aydingkolgenesis MN基因组中的metX、dapA基因。
①敲除metX基因的方法及所用引物同实施例3。
②敲除dapA基因的方法及所用引物同实施例4。
通过上述基因操作的组合，成功加强异亮氨酸的合成通路，减弱支路代谢的碳流量，降低异亮氨酸的胞内消耗，同时促进异亮氨酸的分泌作用，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵36小时，得到异亮氨酸产量如下：Halomonas aydingkolgenesis MN-IIB生产异亮氨酸产量为24.2g/L，Halomonas bluephagenesis TDN-IIB生产异亮氨酸产量为25.3g/L。而野生型嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonasbluephagenesis TD01生产异亮氨酸产量为0g/L。因此本发明提供了高效生产异亮氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis MN-IIB、Halomonas bluephagenesis TDN-IIB。该嗜盐菌培养条件简单，合成异亮氨酸的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。异亮氨酸产物的HPLC鉴定图谱参见图3。
实施例7.生产谷氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M-GO、Halomonasbluephagenesis TD-GO的构建方法
1.过表达ppc和pyc基因，增强谷氨酸前体物草酰乙酸的合成。
(1)将ppc和pyc基因分别插入Halomonas bluephagenesis TD01中的G53、G4位点。
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F92,R92扩增获取ppc基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F93，R93扩增获取porin226启动子片段。
③以质粒pQ143[Qin et al.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering]为模板，通过引物F94,R94扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TD01中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑦挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑧通过同样的方法将porin226启动子表达的pyc基因插入Halomonasbluephagenesis TD01基因组的G4位点，其中，通过引物F95,R95扩增获取pyc基因片段，通过引物F96,R96扩增获取porin226启动子，通过引物F97,R97扩增获取质粒骨架片段。
(2)将ppc和pyc基因分别插入Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G3、G4位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F136-1，R136-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G3的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F137-1,R137-1扩增获取ppc基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin226为模板，通过引物F138-1,R138-1扩增获取porin226启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisM1基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F139-1,R139-1扩增上游同源臂，通过F140-1,R140-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F141-1、R141-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis M1中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑨通过同样的方法将porin226启动子表达的pyc基因插入Halomonasaydingkolgenesis M1基因组的G4位点，其中，通过引物F142-1、R142-1将gRNA-G4连入质粒，通过引物F143-1、R143-1扩增获取pyc片段，通过引物F144-1、R144-1扩增获取porin226启动子，通过引物F145-1、R145-1扩增获取上游同源臂，通过引物F146-1、R146-1扩增获取下游同源臂，通过引物F147-1、R147-1扩增获取含有gRNA-G4的质粒骨架片段。
2.过表达icd和gdh基因，增强草酰乙酸向谷氨酸的代谢途径。
(1)将icd和gdh基因插入Halomonas bluephagenesis TD01基因组G43位点。
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F98,R98扩增获取icd基因片段，通过引物F99,R99扩增获取gdh基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin58为模板，通过引物F100，R100扩增获取porin58启动子片段。
③以质粒pQ133为模板，通过引物F101、R101扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TD01中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
(2)将icd和gdh基因插入Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G1位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F148-1，R148-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G1的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F149-1,R149-1扩增获取icd基因片段，通过引物F150-1,R150-1扩增获取gdh基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin58为模板，通过引物F151-1,R151-1扩增获取porin58启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisM1基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F152-1,R152-1扩增上游同源臂，通过F153-1,R153-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F154-1、R154-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis M1中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
3.过表达odhI和NCgl1221基因，抑制α-酮戊二酸脱氢酶的活性，促使三羧酸循环的碳流量流向谷氨酸,同时促进谷氨酸向胞外的分泌作用。
(1)将odhI和NCgl1221基因插入Halomonas bluephagenesis TD01基因组G7位点。
①以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F102,R102扩增获取odhI基因片段，通过引物F103,R103扩增获取NCgl1221基因片段。
②利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物F104，R104扩增获取porin140启动子片段。
③以质粒pQ44为模板，通过引物F105、R105扩增获取质粒骨架片段。
④将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑤使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas bluephagenesis TD01中，再将④中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑥验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
(2)将odhI和NCgl1221基因插入Halomonas aydingkolgenesis M1基因组G2位点。
①以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F155-1，R155-1，对pQ41进行环状PCR，再对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA-G2的质粒。
②以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，通过引物F156-1,R156-1扩增获取odhI基因片段，通过引物F157-1,R157-1扩增获取NCgl1221基因片段。
③利用porin启动子库，以启动子porin140为模板，通过引物F158-1,R158-1扩增获取porin140启动子片段。
④在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisM1基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F159-1,R159-1扩增上游同源臂，通过F160-1,R160-1扩增下游同源臂。
⑤以①中得到的质粒为模板，通过引物F161-1、R161-1扩增获取质粒骨架片段。将上述片段通过Gibson的方法组装到一起，构建质粒。
⑥使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08通过接合方式转到Halomonas aydingkolgenesis M1中，再将⑤中获得的质粒转入该菌中，在氯霉素，壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑦验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑧挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
4.敲除嗜盐菌中proB和argJ基因，抑制谷氨酸向脯氨酸和精氨酸的转化，阻断谷氨酸的胞内消耗途径。
(1)敲除嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01中的proB和argJ基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在proB基因位点附近寻找合适的20bp作为guide RNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F106，R106，对pQ41进行环状PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas bluephagenesisTD01基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F107,R107扩增上游同源臂，通过F108,R108扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F109，R109扩增为线性片段，以Gibson连接的方法将质粒和两个同源臂连接到一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasbluephagenesis TD01中。再将③中质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas bluephagenesis TD01基因组的argJ基因，其中pQ41环P自连的引物为F110,R110，扩增上游同源臂引物为F111,R111，扩增下游同源臂的引物为F112,R112，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F113，R113。
(2)敲除嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1中的proB和argJ基因。
①采用CRISPR-Cas9的方法敲除基因，在proB位点附近寻找合适的20bp作为guideRNA，以pQ41质粒为模板，将guide RNA序列设计在引物中，通过引物F162-1，R162-1，对pQ41进行环装PCR，在对质粒进行平末端连接，得到含有gRNA的质粒。
②在gRNA附近选取两段500个碱基作为同源臂。以Halomonas aydingkolgenesisM1基因组为模板，分别使用PCR的方法通过引物F163-1,R163-1扩增上游同源臂，通过F164-1,R164-1扩增下游同源臂。
③将①中含有gRNA的质粒通过引物F165-1，R165-1扩增为线性片段，以Gibson方法将上述片段连接在一起，构建质粒。
④使用接合转化的方法将含有Cas9的氯霉素抗性的质粒pQ08转化到Halomonasaydingkolgenesis M1中。再将③中构建的质粒转入该菌中，在含有氯霉素和壮观霉素双抗的平板中培养一天，直至长出单菌落。
⑤验证。在插入位点上下游处设计一对引物，进行菌落PCR的验证，并通过测序进行进一步验证。
⑥挑选出测序正确的菌株，在无抗的种子培养液中培养，直到嗜盐菌完全丢掉质粒。
⑦通过相同的方法敲除Halomonas aydingkolgenesis M1基因组的argJ基因，其中pQ41环P自连的引物为F166-1,R166-1，扩增上游同源臂引物为F167-1,R167-1，扩增下游同源臂的引物为F168-1,R168-1，将含有gRNA的质粒扩增为线性片段的引物为F169-1，R169-1。
通过上述基因操作的组合，成功加强谷氨酸的合成通路，减弱支路代谢的碳流量，降低谷氨酸的胞内消耗，同时促进谷氨酸的分泌作用，构建的重组嗜盐菌在37℃下，7L反应容器中发酵48小时，得到谷氨酸产量如下：Halomonas aydingkolgenesis M-GO生产谷氨酸产量为65.5g/L，Halomonas bluephagenesis TD-GO生产谷氨酸产量为67g/L。而野生型嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesis TD01生产谷氨酸产量为0g/L。因此本发明提供了高效生产谷氨酸的嗜盐菌Halomonas aydingkolgenesis M-GO、Halomonas bluephagenesis TD-GO。该嗜盐菌培养条件简单，合成谷氨酸的原料便宜易得，生产过程可以在无灭菌条件下进行，从而大大简化了工业流程，降低生产成本。谷氨酸产物的HPLC鉴定图谱参见图3。
本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。
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Claims (10)

1.重组嗜盐菌(Halobacteriaceae)，其包含生产天冬氨酸或生产谷氨酸的代谢路径。
2.根据权利要求1所述的重组嗜盐菌，其还包含：生产天冬氨酸的衍生物的代谢途径，所述天冬氨酸的衍生物选自赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和四氢嘧啶中的一种或多种(一种，两种，三种，四种或五种)。
3.根据权利要求1或2所述的重组嗜盐菌，其中所述代谢路径是通过在野生型嗜盐菌中表达(过表达)负责该代谢途径的(外源)基因或(外源)基因的组合和/或减弱或阻断或敲除所述代谢路径的支路和/或分解代谢路径的(内源)基因或(内源)基因的组合(使其为该基因缺陷型)来构建的，优选地基因的减弱或阻断可以通过表达(过表达)所述基因的抑制剂基因来实现的，和/或优选所述重组嗜盐菌还表达用于分泌天冬氨酸或其衍生物或谷氨酸到胞外的分泌蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组嗜盐菌，其特征在于以下中的一个或多个(优选包括以下特征(1)并且包括以下特征(2)-(6)中任一个)：
(1)所述重组嗜盐菌通过过表达天冬氨酸合成基因来生产天冬氨酸，优选所述天冬氨酸合成基因为pyc(丙酮酸羧化酶)基因、ppc基因(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)和aspC基因(天冬氨酸转氨酶)，更优选为谷氨酸棒杆菌的pyc(丙酮酸羧化酶)基因、大肠杆菌的ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因和aspC(天冬氨酸转氨酶)基因，最优选pyc基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:46所示序列；ppc基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:35所示序列；和/或aspC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:36所示序列；
(2)所述重组嗜盐菌通过过表达赖氨酸合成基因来生产赖氨酸，优选所述赖氨酸合成基因为lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)基因、dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因、lysE(赖氨酸分泌蛋白)基因和zwf(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为thrB(高丝氨酸激酶)基因和metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因缺陷型，还更优选所述赖氨酸合成基因为大肠杆菌的lysC*基因和asd基因，谷氨酸棒杆菌的dapA基因、lysE基因和zwf基因，最优选lysC*基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:37所示序列；asd基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:38所示序列；dapA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:47所示序列；lysE基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:48所示序列；zwf基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:49所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2或19所示序列；和/或metX基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3或20所示序列；
(3)所述重组嗜盐菌通过过表达蛋氨酸合成基因来生产蛋氨酸，优选所述蛋氨酸合成基因为metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因、yjeH(蛋氨酸分泌蛋白)基因、lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因和malY(胱硫醚裂解酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为thrB(高丝氨酸激酶)基因、metN(蛋氨酸吸收相关的ATP结合蛋白)基因和dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因缺陷型，还更优选所述蛋氨酸合成基因为谷氨酸棒杆菌的metX基因，大肠杆菌的yjeH基因、lysC*基因和malY基因，最优选metX基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:50所示序列；yjeH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:39所示序列；lysC*基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:37所示序列；malY基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:40所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:2或19所示序列；metN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5或22所示序列；和/或dapA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6或23所示序列；
(4)所述重组嗜盐菌通过过表达苏氨酸合成基因来生产苏氨酸，优选所述苏氨酸合成基因为thrA*BC基因簇[thrA*(天冬氨酸激酶突变体)基因、thrB(高丝氨酸激酶)基因和thrC(苏氨酸合成酶)基因]、lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因、rhtC(苏氨酸分泌蛋白)基因，更优选所述重组嗜盐菌为sstT(苏氨酸吸收蛋白)基因和tdh(苏氨酸脱氢酶)基因缺陷型，还更优选所述蛋氨酸合成基因为大肠杆菌的thrA*BC基因簇[thrA*基因、thrB基因和thrC基因]、大肠杆菌的lysC*基因和rhtC基因，最优选thrA*基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:41所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:42所示序列；thrC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:43所示序列；lysC*基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:37所示序列；rhtC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:44所示序列；sstT基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:8或25所示序列；和/或tdh基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:9或26所示序列；
(5)所述重组嗜盐菌通过过表达异亮氨酸合成基因来生产异亮氨酸，优选所述异亮氨酸合成基因为ilvA(苏氨酸脱水酶)基因、brnFE(氨基酸转运蛋白)基因、thrB(高丝氨酸激酶)基因和ilvBN(乙酰羟基氨酸合酶)基因和tdcB(苏氨酸脱水酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因和dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因缺陷型，还更优选所述异亮氨酸合成基因为谷氨酸棒状杆菌的ilvA基因、brnFE基因、thrB基因和ilvBN基因和大肠杆菌的tdcB基因，最优选ilvA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:62所示序列；brnF基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:51所示序列；brnE基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:52所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:53所示序列；ilvB基因的核苷酸序列为SEQID NO:54所示序列；ilvN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:55所示序列；tdcB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:45所示序列；metX基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3或20所示序列；和/或dapA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6或23所示序列；
(6)所述重组嗜盐菌通过过表达四氢嘧啶合成基因来生产四氢嘧啶，优选所述四氢嘧啶合成基因为ectABC基因簇[ectA(氨基丁酸乙酰基转移酶)基因、ectB(二氨基丁酸氨基转移酶)基因、ectC(四氢嘧啶合成酶)基因]、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)基因和lysC(天冬氨酸激酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为doeA(四氢嘧啶水解酶)基因和ectD(四氢嘧啶羟化酶)基因缺陷型，还更优选所述四氢嘧啶合成基因为Halomonas aydingkolgenesis M1和Halomonas bluephagenesis TD01的ectABC基因簇[ectA基因、ectB基因、ectC基因]、asd基因和谷氨酸棒杆菌的lysC基因，最优选ectA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:10或27所示序列；ectB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:11或28所示序列；ectC基因的核苷酸序列为SEQID NO:12或29所示序列；asd基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:13或30所示序列；lysC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:56所示序列；doeA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:14或31所示序列；和/或ectD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:15或32所示序列；和/或
(7)所述重组嗜盐菌通过过表达谷氨酸合成基因来生产谷氨酸，优选所述谷氨酸合成基因为ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因、pyc(丙酮酸羧化酶)基因、icd(异柠檬酸脱氢酶)基因、gdh(谷氨酸脱氢酶)基因、odhI(酮戊二酸脱氢酶抑制剂)基因和NCgl1221(谷氨酸输出蛋白)基因，更优选所述重组嗜盐菌为proB(谷氨酸激酶)基因和argJ(精氨酸生物合成双功能蛋白)基因缺陷型，还更优选所述谷氨酸合成基因为谷氨酸棒杆菌的ppc基因、pyc基因、icd基因、gdh基因、odhI基因和NCgl1221基因，最优选ppc基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:57所示序列；pyc基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:46所示序列；icd基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:59所示序列；gdh基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:58所示序列；odhI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:60所示序列；NCgl1221基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:61所示序列；proB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:16或33所示序列；和/或argJ基因的核苷酸序列为SEQID NO:17或34所示序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组嗜盐菌，其中所述嗜盐菌为嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.)，更优选为Halomonas bluephagenesis或Halomonas aydingkolgenesis，最优选为Halomonas bluephagenesis TD01(菌种保藏编号CGMCC No.4353)或Halomonasaydingkolgenesis M1(菌种保藏编号CGMCC No.19880)。
6.一种制备天冬氨酸或其衍生物的方法，所述天冬氨酸的衍生物选自赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和四氢嘧啶中的一种或多种(一种，两种，三种，四种或五种)，所述方法包括使用根据权利要求1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产天冬氨酸或其衍生物。
7.一种制备谷氨酸的方法，所述方法包括使用根据权利要求1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产谷氨酸。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述方法可以在开放无灭菌和/或批次或连续发酵的条件下进行。
9.一种制备根据权利要求1-5中任一项所述的重组嗜盐菌的方法，所述方法包括构建具有权利要求4中所述特征中一个或多个((优选包括所述特征(1)并且包括所述特征(2)-(6)中任一个，例如特征(1)+(2)的组合，特征(1)+(3)的组合，特征(1)+(4)的组合，特征(1)+(5)的组合或特征(1)+(6)的组合))的重组嗜盐菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述表达(过表达)是通过将所表达的基因在一个或多个质粒上表达或者被整合到所述嗜盐菌的基因组中表达来实现的，和/或所述基因缺陷型是通过从所述嗜盐菌中敲除所述基因来实现的。
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