CN105112466A - 添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵，特别是指一种添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法。包括将高山被孢霉(Mortierella？alpina)接种于含有碳源、氮源、无机盐的无菌发酵培养基中进行通气培养，培养结束后收集菌体并从其中提取含有花生四烯酸的油脂；每升无菌发酵培养基中包含产物促进剂，产物促进剂的原料组成及在发酵液中的浓度为：生物素1-5mg/l，谷氨酸0.5-2g/l，柠檬酸1-3g/l，双氧水1-5μmol/l，体积比为1-5％的正十二烷。本发明解决了现有技术中存在的产量低、发酵培养基成本较高等技术问题，具有产量高，发酵工艺简单，易于操作，工业化前景好等优点。

Description

添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵，特别是指一种添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法。

背景技术

花生四烯酸(ArachidonicAcid，简称：ARA)中文全称为5,8,11,14-二十碳四烯酸，是属于ω-6(或n-6)系列长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)，简记为C20:4(n-6)。

花生四烯酸是生物体内各种组织细胞膜的重要组成成分，并且是人体内合成前列腺素的前体物质，在人体生理代谢方面发挥着重要的作用。ARA在人体内合成了多种生理活性物质，如前列腺素、环前列腺素、白三烯和血栓烷等，这些活性物质在维持血管弹性、调节血细胞功能、调节血脂血糖、抑制肿瘤预防癌变以及调节神经系统等方面具有重要作用。此外，ARA对婴幼儿的视网膜、神经系统和脑部等生长发育意义重大，具有促进脑部生长发育功能，提高青少年记忆力等功效。因此，花生四烯酸作为人体的一种必需的多不饱和脂肪酸，对于人类的健康和婴幼儿发育等有着重要意义，目前在生物食品、医药保健品和化妆品等行业领域都有着广泛的市场前景。

ARA传统生产方法是从动物肾上腺、肝脏和深海鱼油中提取制备的，产量低、成本高，难以满足日益扩大的市场需求。高山被孢霉丝状真菌中ARA含量较高，并且可以采用微生物发酵法对其进行培养，具有油脂含量高、生长快速、不受季节和气候等条件影响，易于工业化生产等优点，其本身无毒害作用，采用该菌种生产制备的花生四烯酸油脂也被欧洲食品安全局(EFSA)证实是安全无毒性的，可作为食品配料广泛应用于食品工业中。因此采用被孢霉属丝状真菌发酵培养积累花生四烯酸油脂是近年来ARA生产制备的新技术新途径。高山被孢霉是目前产花生四烯酸真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种。

在现有技术中，周蓬蓬等在<华中科技大学学报>2002年V.30，No.9中报道了谷氨酸对高山被孢霉合成花生四烯酸的影响，通过添加0.8g/L的谷氨酸ARA的产量为1.41g/L，相比对照组提高了70％，并在<华中科技大学学报>2003年V.31，No.5中研究了表面活性剂对ARA产量的影响，发现添加0.3％的Tween20，ARA的产量提高了30.9％达到1.61g/L，目前还未有对多种产物促进剂的组合研究，使发酵产量进一步提高的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，在不明显增加培养成本的条件下，通过添加产物促进剂调节花生四烯酸的生物合成过程，促进产物的积累，为工业化生产奠定基础。

本发明的整体技术构思是：

添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，包括将高山被孢霉(Mortierellaalpina)接种于含有碳源、氮源、无机盐的无菌发酵培养基中进行通气培养，培养结束后收集菌体并从其中提取含有花生四烯酸的油脂；所述的每升无菌发酵培养基中包含产物促进剂：

产物促进剂的原料组成及在发酵液中的浓度为：生物素1-5mg/l，谷氨酸0.5-2g/l，柠檬酸1-3g/l，双氧水1-5μmol/l，体积比为1-5％的正十二烷。

本发明中产物促进剂中各原料的作用机理如下：

乙酰CoA羧化酶作为脂肪酸合成的限速步骤和调控步骤的关键酶，严格控制脂肪酸的合成速度，生物素作为乙酰CoA羧化酶的辅基，能够调节脂肪酸的合成。谷氨酸不仅可作为氮源用于菌体的生长，而且谷氨酸的添加利于激活磷酸戊糖途径，为脂肪酸的合成提供还原力。柠檬酸分解过程中生成的乙酰CoA进入细胞脂肪酸合成途径，同时生成大量的NADPH，脂肪酸的合成中所需要的NADPH大约一半来自柠檬酸转运体系，双氧水和正十二烷作为氧载体有助于改变细胞膜的通透性，刺激呼吸作用。

本发明的具体技术构思还有：

因本发明中的菌种采用的均为现有菌种，发酵培养基可以根据菌种的不同进行常规调整，其中较为常见且优选的技术实现方式是，每升无菌发酵培养基中包括如下原料：

葡萄糖60-90g，酵母粉8-15g，KH₂PO₄2-5g，MgSO₄·7H₂O0.5-1g，NaHCO₃0.1-1.0g；CaCl₂·2H₂O0.1g-1g；EDTA0.01g-0.05g；ZnCl₂0.1×10^-3g-1×10^-3g；FeCl₃·6H₂O1×10^-5-1×10^-4g，培养基的pH＝6.0。

较为优选的通气培养的条件如下：

接种量为5％-10％，摇床培养温度为25℃-30℃，转速为200±20r/m，培养时间为7-10天。

为保证菌体活性，保证通气培养的顺利进行以及终产物的获得，优选的技术实现方式是，在接种前进行菌体活化处理，活化处理是将高山被孢霉(Mortierellaalpina)接种到PDA斜面培养基上，在温度为25-30℃条件下活化培养7-10天，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备成孢子悬浮液。

为便于实现工业化生产，常用的技术手段是在通气培养前还包括一扩培步骤，其中较为优选的技术方案是，将制成的高山被孢霉(Mortierellaalpina)孢子悬浮液接种到种子培养基中经通气培养制成种子液，种子培养基包括以下原料：

葡萄糖30g/l，酵母粉5g/l，KH₂PO₄0.6g/l，MgSO₄·7H₂O1.3g/l，pH＝6.0；

接种量为体积比＝10％，扩培的条件是：

摇床培养温度为25℃，转速为200r/m，培养时间为2天。

为保证培养的顺利进行，优选的技术方案是，所述的发酵培养基、种子培养基的装液量均为20％。

本发明中花生四烯酸的提取优选采用如下方法进行：

所述的收集菌体并从其中提取含有花生四烯酸的油脂包括如下步骤：

a、培养结束后对发酵液进行处理，收集湿菌体；

b、干燥处理后得到干菌体；

c、加入有机试剂结合预处理获得含有花生四烯酸的油脂。

高山被孢霉发酵生长过程需要大量的氧，尤其是进入对数生长期对溶氧的需求逐渐增大，而ARA也从菌体生长进入对数期开始积累；另一方面，处在发酵前期的菌体适应培养环境，生长缓慢，发酵促进剂中的双氧水会抑制菌体的生长，导致发酵停滞期延长。所以本发明中产物促进剂添加时间优选的技术方案是，产物促进剂在通气培养开始后发酵进入对数期即36h-48h添加。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

(1)本发明通过对比得到多种原料组成的产物促进剂，通过添加上述产物促进剂有效提高细胞内ARA的大量合成与积累；同时提高了发酵液中的溶氧水平满足高山被孢霉发酵的耗氧需求。

(2)本发明在发酵培培养工序中添加微量的产物促进剂，发酵成本不会明显增加，且发酵工艺简单，易于操作，ARA的发酵水平不低于2.9g/L,最高可达到5.41g/L，较添加前提高45％，具有良好的工业化前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

1、菌种活化：将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC16266)接种到PDA斜面培养基上，25-30℃活化培养7-10天，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约10⁶个/ml的孢子悬浮液。

2、种子液制备：将孢子悬液按体积比为10％接种量接种到装有100ml液体种子培养基、容量为500ml挡板三角瓶中，25℃，200r/m条件下培养2天，制得种子液。所述种子培养基包括如下原料：葡萄糖30g/l，酵母粉5g/l，KH₂PO₄0.6g/l，MgSO4·7H₂O1.3g/l，调节pH＝6.0。

3.发酵培养：将培养好的种子液按5％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml的挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为25℃，转速为200r/m条件下培养时间为7天。所述的发酵培养基包括如下原料：葡萄糖90g，酵母粉15g，KH₂PO₄2.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NaHCO₃0.5g，CaCl₂·2H₂O0.5g，EDTA0.01g，ZnCl₂0.1×10^-3g，FeCl₃·6H₂O1×10^-5g，在发酵培养48小时添加的产物促进剂的原料组成及在发酵液中的浓度为：生物素1mg/l，谷氨酸0.9g/l，柠檬酸1.5g/l，双氧水2μmol/l，体积比为1％的正十二烷.培养基的pH＝6.0。发酵过程中将不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为3.16g/l，产量较对照提高了20.15％。

实施例2

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32223)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按8％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml的挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为30℃，转速为180r/m条件下培养为8天。所述的发酵培养基包括如下原料：葡萄糖70g，酵母粉10g，KH₂PO₄3.6g，MgSO₄·7H₂O1g，NaHCO₃0.7g，CaCl₂·2H₂O1g；EDTA0.05g，ZnCl₂0.5×10^-3g，FeCl₃·6H₂O5×10^-5g，调节pH＝6.0。在发酵培养到36h，添加的产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素1mg/l，谷氨酸1.3g/l，柠檬酸2g/l，双氧水3μmol/l，体积比为2％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为4.05g/l，产量较对照提高了43％。

实施例3

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32221)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按10％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml的挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为28℃，转速为220r/m条件下培养时间10天。所述的发酵培养基包括如下原料：葡萄糖80g/l，酵母粉10g/l，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O1g，NaHCO₃0.5g，CaCl₂·2H₂O0.3g；EDTA0.02g，ZnCl₂0.3×10^-3g，FeCl₃·6H₂O0.3×10^-4g，培养基的pH＝6.0。在发酵培养到40h，添加到发酵培养基中产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素2mg/l，谷氨酸0.5g/l，柠檬酸1.5g/l，双氧水4μmol/l，体积比3％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为4.62g/l，产量较对照提高了38.4％。

实施例4

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32222)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按8％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为30℃，转速为180r/m条件下培养时间9天。所述的发酵培养基成分为：葡萄糖90g/l，酵母粉9g/l，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O1g，NaHCO₃0.5g，CaCl₂·2H₂O0.2g，EDTA0.05g，ZnCl₂1×10^-3g，FeCl₃·6H₂O1×10^-4g，培养基的pH＝6.0。在发酵培养到36h，添加到发酵培养基中产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素5mg/l，谷氨酸1g/l，柠檬酸3g/l，双氧水5μmol/l，体积比为5％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为5.41g/l，产量较对照提高了45.1％。

实施例5

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32221)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按10％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml挡板三角瓶中进行发酵培养，摇床培养温度为25℃，转速为220r/m条件下培养时间为10天。所述的发酵培养基成分为：葡萄糖60g，酵母粉8g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O0.75g，NaHCO₃0.1g，CaCl₂·2H₂O0.1g，EDTA0.03g，ZnCl₂0.5×10^-3g，FeCl₃·6H₂O0.5×10^-4g，调节pH＝6。在发酵培养到42h，将产物促进剂添加到发酵培养基中，产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素3mg/l，谷氨酸0.5g/l，柠檬酸1g/l，双氧水5μmol/l，体积比4％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为3.91g/l，产量较对照提高了31.2％。

实施例6

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC36965)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按5％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml的挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为25℃，转速为200r/m条件下培养时间8天。所述的发酵培养基成分为：葡萄糖70g，酵母粉12g，KH₂PO₄2.5g，MgSO₄·7H₂O0.8g，NaHCO₃0.1g，CaCl₂·2H₂O0.1g，EDTA0.01g，ZnCl₂0.1×10^-3g，FeCl₃·6H₂O1×10^-5g，调节pH＝6。在发酵培养到48h，添加到发酵培养基中产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素1mg/l，谷氨酸0.5g/l，柠檬酸1g/l，双氧水5μmol/l，体积比1％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为2.93g/l，产量较对照提高了15％。

实施例7

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32223)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按10％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml的挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为28℃，转速为180r/m条件下培养时间7天。所述的发酵培养基成分为：葡萄糖80g，酵母粉9g，KH₂PO₄4g，MgSO₄·7H₂O1g，NaHCO₃1.0g，CaCl₂·2H₂O0.5g，EDTA0.03g，ZnCl₂0.1×10^-3g，FeCl₃·6H₂O1×10^-4g，调节pH＝6.0。在发酵培养到48h，将产物促进剂添加到发酵培养基中，产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素5mg/l，谷氨酸2g/l，柠檬酸1.5g/l，双氧水1μmol/l，体积比为2％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为3.88g/l，产量较对照提高了25％。

实施例8

将高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32222)进行菌种活化,菌种的活化和种子液的制备同实施例1。

发酵培养：将培养好的种子液按5％接种量转接到装有100ml液体发酵培养基、容量为500ml的挡板三角瓶中进行摇床培养，在温度为30℃，转速为200r/m条件下培养时间9天。所述的发酵培养基成分为：葡萄糖90g，酵母粉8g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O1g，NaHCO₃0.1g，CaCl₂·2H₂O0.1g，EDTA0.05g，ZnCl₂1×10^-3g，FeCl₃·6H₂O1×10^-4g，调节pH＝6。在发酵培养到48h，将产物促进剂添加到发酵培养基中，产物促进剂各组分在发酵培养基中的浓度为：生物素4mg/l，谷氨酸2g/l，柠檬酸3g/l，双氧水1.5μmol/l，体积比为1％的正十二烷。发酵过程中不添加产物促进剂的摇瓶培养作为对照。添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为4.72g/L，产量较对照提高了40％。

Claims (8)

1.添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，包括将高山被孢霉(Mortierellaalpina)接种于含有碳源、氮源、无机盐的无菌发酵培养基中进行通气培养，培养结束后收集菌体并从其中提取含有花生四烯酸的油脂；其特征在于所述的每升无菌发酵培养基中包含产物促进剂，产物促进剂的原料组成及在发酵液中的浓度为：生物素1-5mg/l，谷氨酸0.5-2g/l，柠檬酸1-3g/l，双氧水1-5μmol/l，体积比为1-5％的正十二烷。

2.根据权利要求1所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于每升无菌发酵培养基中包括如下原料：

葡萄糖60-90g，酵母粉8-15g，KH₂PO₄2-5g，MgSO₄·7H₂O0.5-1g，NaHCO₃0.1-1.0g，CaCl₂·2H₂00.1g-1g；EDTA0.01g-0.05g，ZnCl₂0.1×10^-3g-1×10^-3g，FeCl₃·6H₂O1×10^-5-1×10^-4g，培养基的pH＝6.0。

3.根据权利要求1所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的通气培养的条件如下：

接种量为5％-10％，摇床培养温度为25℃-30℃，转速为200±20r/m，培养时间为7-10天。

4.根据权利要求1所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于在接种前进行菌体活化处理，活化处理是将高山被孢霉(Mortierellaalpina)接种到PDA斜面培养基上，在温度为25-30℃条件下活化培养7-10天，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备成孢子悬浮液。

5.根据权利要求1所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于在通气培养前还包括一扩培步骤，即将制成的高山被孢霉(Mortierellaalpina)孢子悬浮液接种到种子培养基中经通气培养制成种子液，种子培养基包括以下原料：

葡萄糖30g/l，酵母粉5g/l，KH₂PO₄0.6g/l，MgSO₄·7H₂O1.3g/l，pH＝6.0；

接种量为体积比＝10％，扩培的条件是：

摇床培养温度为25℃，转速为200r/m，培养时间为2天。

6.根据权利要求1或5所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的发酵培养基、种子培养基的装液量均为20％。

7.根据权利要求1所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的收集菌体并从其中提取含有花生四烯酸的油脂包括如下步骤：

a、培养结束后对发酵液进行处理，收集湿菌体；

b、干燥处理后得到干菌体；

c、加入有机试剂结合预处理获得含有花生四烯酸的油脂。

8.根据权利要求1所述的添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的产物促进剂在通气培养开始后36-48小时添加。