CN102899254B - 裂殖壶菌及其高密度发酵生产dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株裂殖壶菌,该菌株为裂殖壶菌(Shizochytriumsp.)WZU6961,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.6369。本发明还公开了上述裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法。以裂殖壶菌WZU6961高密度发酵生产DHA,得到的发酵液中生物量浓度92.4~103.2g/L,生物量中DHA含量20.9%~21.9%,DHA生产率达到7.2~8.5g/(L·d),高于现有技术,有利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法,属于微生物应用技术领域。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA,C22:6-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)是大脑、视网膜的重要结构物质,还能够调节中枢神经系统功能、预防和治疗心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。长期以来,DHA的主要来源是从鲱鱼、鲭鱼、鲑鱼和鳁鱼等富含油脂的鱼类中提取出来的鱼油。鱼油带着浓烈的、难闻的、特征性的海腥味,其品质因提取鱼油所用的鱼种及捕捞季节和地点的不同而差异很大,还因环境污染而降低,在食品和医药中的应用因而受到严重限制。鱼油所含的脂肪酸很复杂,其链长和饱和度各不相同,从中提取和纯化DHA的成本很高。人们因此需要寻找替代来源(Sijtsma L, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64: 146 – 153)。裂殖壶菌(Schizochytrium)无论在实验中还是商业上都是DHA的卓越生产者(Bailey R B, et al. US Patent 6607900, 2003)。它不致病、不产毒,人类通过食物链中的贻贝和蛤直接摄食之,美国FDA将其列为公认安全级(GRAS,Generally Recognized as Safe)。自上个世纪90年代FAO和WHO等机构推荐在婴、幼儿食品配方中添加DHA以来,裂殖壶菌发酵生产DHA受到更加广泛的关注,技术水平不断提高。
S. limacinum SR21培养5 d,DHA生产率0.8 g/(L·d)(Yokochi T, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 72 – 76)。S. mangrovei Raghu Kumar培养107 hr,DHA生产率0.5 g/(L·d)(Bowles R D, et al. J Biotechnol, 1999, 70: 193 – 202)。一株S. mangrovei培养52 hr,DHA生产率1.27 g/(L·d)(Fan K W, et al. J Ind Microbiol Biotechnol, 2001, 70: 199 – 202)。S. aggregatum ATCC 28209培养96 hr,DHA生产率3.42 g/(L·d)(姜悦, 等. 中国专利1218035C, 2005)。S. limacinum OUC88培养5 d,DHA生产率1.65 g/(L·d)(张学成, 等. 中国专利1264967C, 2006)。S. limacinum G13/2S培养110 hr(葡萄糖初始浓度150 g/L,60 hr后再添加65 g/L),DHA生产率3 g/(L·d)(Ganuza E, et al. Biotechnol Lett, 2008, 30: 1559 – 1564)。S. WZU4771培养5 d,DHA生产率2.76 g/(L·d)(赵肖为, 等. 中国专利100503811C, 2009)。一株裂殖壶菌培养5 d(葡萄糖初始浓度125 g/L,降至10 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在10 ~ 20 g/L),DHA生产率1.66 g/(L·d)(陈丽珠, 等. 厦门大学学报: 自然科学版, 2009, 48(1): 84 – 88)。S. CCTCC M209059在5000 L发酵罐中培养5 d(葡萄糖初始浓度100 g/L,降至10 ~ 20 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在50 ~ 100 g/L),DHA生产率2.59 g/(L·d)(黄和, 等. 中国专利101575584B, 2010);在1000 L发酵罐中培养132 hr(葡萄糖初始浓度40 g/L,降至15 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在15 ~ 40 g/L),DHA生产率2.86 g/(L·d)(Ren L J, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010)。S. limacinum ATCC 20888在500 L发酵罐中培养90 hr(葡萄糖初始浓度45 g/L,降至35 g/L时流加葡萄糖),DHA生产率4.86 g/(L·d)(徐从英, 等. 中国专利101519676B, 2011)。一株裂殖壶菌在8000 L发酵罐中培养5 d(葡萄糖初始浓度120 g/L,然后流加葡萄糖以维持其浓度在8 ~ 10 g/L),DHA生产率6 g/(L·d)(钟惠昌, 等. 中国专利101812484B, 2012)。
上述现有技术的DHA生产率虽然不断攀升,但还不够高,因此,DHA由裂殖壶菌发酵生产替代从鱼油中提取的关键在于进一步提高DHA生产率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中DHA生产率过低。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法,进一步提高DHA生产率,以利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
本发明提供一株裂殖壶菌,所述菌株为裂殖壶菌(Shizochytrium sp.)WZU6961,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO. 6369。
上述裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法,包括如下步骤:
1)种子活化:a、将所述裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板,加人工海水封盖,活化,得封盖海水;b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基,培养;c、取步骤b得到的菌种液,转接入活化培养基,培养;d、取步骤c得到的菌种液,转接入活化培养基,培养,得活化菌种;
2)种子培养:将步骤1)得到的活化菌种转接入种子培养基,通入无菌空气,培养,得种子培养物;
3)发酵生产:将步骤2)得到的种子培养物转接入发酵培养基,通入无菌空气,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%,发酵60 ~ 64 hr放罐,即得。
优选地,步骤1)a中活化条件:20℃ ~ 30℃活化2 ~ 6 d,更优选为25℃活化4 d。
优选地,步骤1)b中:取步骤a得到的封盖海水以体积比5% ~ 10%的接种量转接入活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。更优选地,步骤1)b中:取步骤a得到的封盖海水以体积比5%的接种量转接入活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr。
优选地,步骤1)c中:取步骤b得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。更优选地,取步骤b得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr。
优选地,步骤1)d中:取步骤c得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。更优选地,取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr。
优选地,步骤2)中将步骤1)所得活化菌种以体积比5% ~ 15%的接种量转接入种子培养基,通入无菌空气,培养温度20℃ ~ 30℃,通气量5 ~ 50 L/min,搅拌转速250 ~ 450 rpm,培养时间24 ~ 60 hr,得种子培养物。更优选地,步骤2)中将步骤1)得到的活化菌种以体积比10%的接种量转接入种子培养基,培养温度25℃,通入无菌空气,通气量5 ~ 50 L/min,搅拌转速250 ~ 450 rpm,培养时间48 hr,得种子培养物。
优选地,步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物以体积比5% ~ 15%的接种量转接入发酵培养基,初始搅拌转速50 ~ 450 rpm,通入无菌空气,初始通气量5 ~ 450 L/min,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%,发酵60 ~ 64 hr放罐,即得。更优选地,步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物以体积比10%(v/v)的接种量转接入发酵培养基,发酵温度25℃,初始搅拌转速50 ~ 450 rpm,初始通气量5 ~ 450 L/min。流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 10 g/L;调节通气量和搅拌转速以控制DO值低于4% ~ 10%。发酵60 ~ 64 hr放罐。
优选地,步骤1)中所述活化培养基的配方:10 ~ 30 g/L葡萄糖、2 ~ 8 g/L酵母粉和2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨,用人工海水配制;更优选地,所述活化培养基的配方20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨,用人工海水配制。
优选地,步骤2)中所述种子培养基的配方:20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆,用人工海水配制;更优选地,所述种子培养基的配方:30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆,用人工海水配制。
优选地,步骤3)中所述发酵培养基的配方:20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆,营养液5 ~ 15 mL/L;更优选地,所述发酵培养基的配方:30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆,营养液10 mL/L。其中,所述营养液的配方:1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素,用人工海水配制。
优选地,所述人工海水由如下浓度的成分构成:Na2SO4 24g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KCl 1 g/L、CaCl2·2H2O 0.34 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnCl2·4H2O 6 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 4 mg/L、NiSO4·6H2O 4 mg/L、CoCl2·6H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.08 mg/L。
本发明能够达到以下有益效果:本发明以裂殖壶菌WZU6961高密度培养生产DHA,裂殖壶菌WZU6961经过多次充分活化后,转接入种子培养基培养,然后转接入发酵培养基发酵生产,得到的发酵液中生物量浓度92.4 ~ 103.2 g/L,生物量中DHA含量20.9% ~ 21.9%,DHA生产率达到7.2 ~ 8.5 g/(L·d),高于现有技术,有利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
附图说明
图1是裂殖壶菌种子培养的生长曲线;
图2是不同种龄的裂殖壶菌种子培养物的细胞形态(400 ×);
图3是裂殖壶菌流加发酵的生物量和DHA变化曲线。
菌株的保藏
本发明的裂殖壶菌(Shizochytrium sp.)WZU6961,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO. 6369,保藏日期为2012年7月20日。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明的裂殖壶菌WZU6961高密度发酵生产DHA的方法,包括如下步骤:
1)种子活化:a、将裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板,加人工海水封盖,活化,得封盖海水,活化条件:20℃ ~ 30℃活化2 ~ 6 d。
b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基,培养。具体步骤为,取步骤a得到的封盖海水以体积比5% ~ 10%的接种量转接入新鲜的活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。
c、取步骤b得到的菌种液,转接入活化培养基,培养。具体步骤为,取步骤b得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入新鲜的活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。
d、取步骤c得到的菌种液,转接入活化培养基,培养,得活化菌种。具体步骤为,取步骤c得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入新鲜的活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。
活化培养基的配方:10 ~ 30 g/L葡萄糖、2 ~ 8 g/L酵母粉和2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨,用人工海水配制。
2)种子培养:将步骤1)得到的活化菌种转接入种子培养基,通入无菌空气,培养,得种子培养物。具体步骤为,步骤2)中将步骤1)所得活化菌种以体积比5% ~ 15%的接种量转接入种子培养基,通入无菌空气,培养温度20℃ ~ 30℃,通气量5 ~ 50 L/min,搅拌转速250 ~ 450 rpm,培养时间24 ~ 60 hr,得种子培养物。
种子培养基的配方:20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆,用人工海水配制。
3)发酵生产:将步骤2)得到的种子培养物转接入发酵培养基,通入无菌空气,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%,发酵60 ~ 64 hr放罐,即得。具体步骤为,步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物以体积比5% ~ 15%的接种量转接入发酵培养基,初始搅拌转速50 ~ 450 rpm,通入无菌空气,初始通气量5 ~ 450 L/min,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%,发酵60 ~ 64 hr放罐,即得。
发酵培养基的配方:20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆,营养液5 ~ 15 mL/L,用人工海水配制,其中,营养液的配方:1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素,用人工海水配制。
以下列举优选实施例以进一步对本发明进行说明。
实施例1
a、将保藏于–70℃的裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板,加适量人工海水封盖,25℃活化4 d,得封盖海水。b、取步骤a得到的封盖海水以体积比5%(v/v)的接种量转接入新鲜的活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr;c、取步骤b得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr;d、取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr,得活化菌种。其中,活化培养基的配方:20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨,用人工海水配制。
人工海水由如下浓度的成分构成:Na2SO4 24g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KCl 1 g/L、CaCl2·2H2O 0.34 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnCl2·4H2O 6 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 4 mg/L、NiSO4·6H2O 4 mg/L、CoCl2·6H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.08 mg/L。
本实施例中,裂殖壶菌WZU6961分离自浙江省乐清市雁荡山麓西门岛红树林,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO. 6369。
将活化菌种以体积比10%的接种量转接入5 L种子培养基,培养温度25℃,通入无菌空气,通气量5 L/min,搅拌转速450 rpm,培养,得种子培养物。其中,种子培养基的配方:30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆,用人工海水配制。
裂殖壶菌的种子培养物的生长曲线见图1,不同种龄的种子培养物的细胞形态见图2。由图1可以看出,种龄为24 ~ 32 hr的种子培养物进入对数期末期。但是,将种龄为24或32 hr的种子培养物转接入发酵培养基,发酵过程容易出现不稳定状态,生长情况经常异常。由图2可以看出,种龄为48 hr的种子培养物与种龄为24或32 hr的种子培养物的细胞形态明显不同,而种龄大于48 hr的种子培养物的细胞形态无明显变化。将种龄为48 hr的种子培养物转接入发酵培养基,其发酵过程非常稳定。
因此,本实施例优选的种子培养物的种龄为48 hr。
实施例2
将实施例1得到的种龄为48 hr的种子培养物以体积比10%(v/v)的接种量转接入5 L所述发酵培养基,发酵温度25℃,通入无菌空气,通气量5 L/min,搅拌转速450 rpm。其中,发酵培养基的配方:10、20、30、40和50 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆,营养液10 mL/L,用人工海水配制。其中,营养液的配方:1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素,用人工海水配制。
裂殖壶菌在不同葡萄糖浓度下的比生长速率列于表1。由表1可以看出,葡萄糖浓度对菌体生长具有抑制作用,低浓度葡萄糖更有利于菌体生长。
表1 葡萄糖浓度对裂殖壶菌生长的影响
葡萄糖浓度 / g/L | 比生长速率 / hr-1 |
10 | 0.153 |
20 | 0.149 |
30 | 0.140 |
40 | 0.133 |
50 | 0.126 |
考虑到生产过程中葡萄糖检测的实际问题,优选的葡萄糖维持浓度为5 ~ 10 g/L。
实施例3
将实施例1得到的种龄为48 hr的种子培养物以体积比10%(v/v)的接种量转接入5 L发酵培养基(发酵培养基的配方:30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆,营养液10 mL/L,用人工海水配制),发酵温度25℃,通入无菌空气,初始通气量5 L/min,初始搅拌转速450 rpm。当葡萄糖浓度降至10 g/L以下时,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 10 g/L。调节通气量和搅拌转速以控制DO值分别维持在4% ~ 10%、10% ~ 20%和30% ~ 40%。
裂殖壶菌在不同溶氧水平下的发酵结果列于表2。由表2可以看出,在不同溶氧水平下,发酵终止时生物量比较接近;随着DO值升高,发酵时间缩短,生物量中DHA含量下降,DHA生产率下降,说明高溶氧利于菌体生长而不利于DHA积累。
表2 溶氧水平对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响
DO值 | 4% ~ 10% | 10% ~ 20% | 30% ~ 40% |
发酵时间 / h | 64 | 60 | 57 |
生物量 / g/L | 103.2 | 101.3 | 102.1 |
生物量中DHA含量 / % | 21.9 | 18.2 | 15.0 |
DHA生产率 / g/(L·d) | 8.48 | 7.37 | 6.45 |
优选的DO值维持水平为4% ~ 10%。
实施例4
将保藏于–70℃的裂殖壶菌WZU6961转接于活化培养基的琼脂平板,加适量人工海水封盖,25℃活化4 d。取封盖海水以体积比5%(v/v)的接种量转接入50 mL新鲜的活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr后,得到的菌种液以体积比10%(v/v)的接种量转接入500 mL新鲜的活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr后,得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入1000 mL新鲜的活化培养基,培养温度25℃,摇瓶转速200 rpm,培养时间48 hr。
将活化菌种以体积比10%(v/v)的接种量转接入25 L种子培养基,培养温度25℃,通入无菌空气,通气量22 L/min,搅拌转速350 rpm,培养时间48 hr。
将种子培养物以体积比10%(v/v)的接种量转接入500 L发酵培养基,发酵温度25℃,通入无菌空气,初始通气量450 L/min,初始搅拌转速60 rpm。当葡萄糖浓度降至10 g/L以下时,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 10 g/L。当DO值升至10%时,调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 10%。发酵64 hr放罐。
裂殖壶菌发酵过程的生物量和DHA变化曲线见图3。发酵结束时,培养液中生物量浓度92.4 g/L,气相色谱法测定生物量中DHA含量为20.9%,DHA生产率达到7.24 g/(L·d)。
以上实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.一种裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)种子活化:a、将裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板,加人工海水封盖,活化,得封盖海水;b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基,培养;c、取步骤b得到的菌种液,转接入活化培养基,培养;d、取步骤c得到的菌种液,转接入活化培养基,培养,得活化菌种,其中裂殖壶菌(Shizochytrium sp.)WZU6961保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO. 6369;
2)种子培养:将步骤1)得到的活化菌种转接入种子培养基,通入无菌空气,培养,得种子培养物;
3)发酵生产:将步骤2)得到的种子培养物转接入发酵培养基,通入无菌空气,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%,发酵60 ~ 64 hr放罐,即得;
其中,步骤1)中所述活化培养基的配方:10 ~ 30 g/L葡萄糖、2 ~ 8 g/L酵母粉和2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨,用人工海水配制;步骤2)中所述种子培养基的配方:20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆,用人工海水配制;步骤3)中所述发酵培养基的配方:20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆,营养液5 ~ 15 mL/L,其中,所述营养液的配方:1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素,用人工海水配制;
所述人工海水由如下浓度的成分构成:Na2SO4 24g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KCl 1 g/L、CaCl2·2H2O 0.34 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnCl2·4H2O 6 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 4 mg/L、NiSO4·6H2O 4 mg/L、CoCl2·6H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.08 mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)a中活化条件:20℃ ~ 30℃活化2 ~ 6 d。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)b中:取步骤a得到的封盖海水以体积比5% ~ 10%的接种量转接入活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)c中:取步骤b得到的菌种液体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)d中:取步骤c得到的菌种液体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基,培养温度20℃ ~ 30℃,培养时间24 ~ 48 hr。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中将步骤1)所得活化菌种按体积比5% ~ 15%的接种量转接入种子培养基,通入无菌空气,培养温度20℃ ~ 30℃,通气量5 ~ 50 L/min,搅拌转速250 ~ 450 rpm,培养时间24 ~ 60 hr,得种子培养物。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)中将步骤2)得到的种子培养物按体积比5% ~ 15%的接种量转接入发酵培养基,初始搅拌转速50 ~ 450 rpm,通入无菌空气,初始通气量5 ~ 450 L/min,流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L;调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%,发酵60 ~ 64 hr放罐,即得。
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1株裂殖壶菌( Sch izochytrium sp.) 的分离鉴定;周茂洪 等;《微生物学通报》;20061231;第33卷(第4期);48-51 * |
Schizochytrium sp. 发酵生产DHA培养基的优化;周林 等;《中国油脂》;20071231;第32卷(第6期);32-34 * |
周林 等.Schizochytrium sp. 发酵生产DHA培养基的优化.《中国油脂》.2007,第32卷(第6期),32-34. |
周林.高密度培养裂殖壶菌生产DHA.《厦门大学硕士学位论文》.2008, |
周茂洪 等.1株裂殖壶菌( Sch izochytrium sp.) 的分离鉴定.《微生物学通报》.2006,第33卷(第4期),48-51. |
陈丽珠.高密度培养裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸.《厦门大学硕士学位论文》.2009, |
高密度培养裂殖壶菌生产DHA;周林;《厦门大学硕士学位论文》;20080716;摘要,论文第29页 * |
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