CN104593270B - 一株裂殖壶菌及粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株裂殖壶菌及粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，属于微生物技术领域。所述的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)6961Y01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9043。该菌株为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)WZU6961经紫外诱变获得，与Schizochytrium sp.WZU6961比较，棕榈酸含量提高50％而DHA降低30％，不仅能以生物柴油副产品粗甘油为碳源快速生长和积累油脂，而且其油脂组成更适宜用于生产生物柴油。

Description

一株裂殖壶菌及粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株裂殖壶菌及粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法。
背景技术
随着人口的与日俱增和工业的急剧发展，导致能源过度消耗，由此引起的环境的污染、资源的过度消耗等都不得不迫使人类开始寻求可以替代石油的可再生清洁能源，于是生物柴油(脂肪酸甲酯)因其环保性、可再生性、良好的可燃性吸引了人们的目光。为了阻止全球变暖、减排温室气体，欧盟、巴西、加拿大等纷纷出台政策鼓励生产可再生、碳中性的生物柴油。因此，近年来生物柴油迅猛发展，2010年就超过130.3亿升。我国生物柴油生产虽然起步较晚，但依中石化、中石油和中海油《中长期可再生能源发展规划》，至2020年发展到22.7亿升。
生物柴油最主要的生产方法是用甲醇将脂肪酸三甘酯转酯化，即脂肪酸三甘酯+3甲醇＝脂肪酸甲酯(生物柴油)+甘油。生物柴油与甘油的产出比约10∶1，副产物含有80％～88％的甘油以及甲醇、皂等，须精制才能应用于化妆品、食品和医药等工业。但精制成本很高，而且生物柴油生产快速发展所产出的粗甘油远远超过精甘油的市场需求，造成精甘油价格急剧下跌，粗甘油则几乎成了工业垃圾，从而推高生物柴油的生产成本，且造成严重的环境问题。推广应用生物柴油的最大阻碍是高昂的成本，因而当前关于生物柴油研究的2个重要方面即为：(1)寻求更易得、更经济的新原料，(2)开发甘油的新用途。
裂殖壶菌(Schizochytrium)是一类缺乏叶绿体故而不行光合作用的专性海生藻状真菌，因其生长速率快，每天可以倍增7.3～9.4次，富含长链多不饱和脂肪酸，一直来被认为工业化生产DHA的最适合菌种。Baily等高密度培养S.ATCC20888，在细胞增殖阶段维持溶氧水平在4％–8％、油脂积累阶段低于1％，流加玉米糖浆以维持葡萄糖浓度低于7g·L-1，用氨水进行补氮和控制pH值，发酵90～100h，生物量达到200g·L-1，生物量中总脂肪酸和DHA含量分别为50％和20％，是已有报道中的极致(Baily R B,et al,US Patent US6607900B2,2003-08-19)。赵肖为等报道通过流加葡萄糖高密度培养裂殖壶菌WZU6961生产DHA，得到的发酵液中生物量浓度92.4～103.2g·L-1，生物量中DHA含量20.9％～21.9％，DHA生产率达到7.2～8.5g·L-1d-1(赵肖为等，中国专利，申请号：201210338013.0)。
最近的研究表明，生物柴油副产品粗甘油是裂殖壶菌生长和积累油脂的理想碳源；且因裂殖壶菌生长速率快和油脂含量高，新近又成为生物柴油生产原料的开发目标。
Chi等首先研究了以粗甘油为碳源培养S.limacinum生产DHA的可能性，结果表明，粗甘油可以获得与葡萄糖相似的生长速率和细胞密度，通过优化培养基和培养条件，可以获得22.1g·L-1的生物量和4.91g·L-1的DHA(Chi Z Y,et al,Process Biochemistry,2007,42:1537～1545)。Pyle等研究了生物柴油副产物粗甘油所含杂质对S.limacinum的细胞组分和DHA积累的影响，粗甘油来自不同的生产商，但都含有甲醇、皂和许多元素(包括钙、磷、钾、硅、钠和锌)，甲醇和皂对DHA积累有负作用，但高压灭菌可以使甲醇蒸发，调节pH值可使皂沉淀，所获得的生物量中含有45％～50％的脂肪、14％～20％的蛋白质、25％的碳水化合物和8％～13％的灰分(Pyle D,et al,Journal of Agricultural and FoodChemistry,2008,56(11):3933～3939)。Chi等又以实验室级(laboratory-grade)甘油研究了S.limacinum的细胞生长和油脂积累规律，高溶氧有利于细胞生长，不利于油脂积累，低溶氧是油脂积累的必需条件，因此不论生产油脂还是DHA，以甘油为碳源培养S.limacinum应在细胞增殖阶段和油脂积累阶段维持不同的溶氧水平，结果获得37.9g·L-1的生物量和6.56g·L-1的DHA(Chi Z Y,et al,Applied Microbiology and Biotechnology,2009,81:1141～1148)。Ethier等通过连续发酵研究了S.limacinum以生物柴油副产物粗甘油为碳源的细胞生长动力学、底物利用效率和DHA积累情况，结果表明，细胞生长服从Monod方程，其最大比生长速率和半饱和系数分别为0.692·d-1和25.87g·L-1，生长得率系数为0.283，维持系数为0.222·d-1；产物中主要脂肪酸是棕榈酸和DHA，还有肉豆蔻酸、硬脂酸和DPA；进料中粗甘油浓度低于90g·L-1时，总脂肪酸和DHA含量与其成正比关系；高于90g·L-1时成反比关系，生物量和DHA生产率与间歇发酵相仿而低于流加发酵(Ethier S,et al,Bioresource Technology,2011,102:88～93)。
Johnson等分别采用先提取油脂后转酯化的二步法和直接转酯化的一步法探索了用S.limacinum生产生物柴油的可能性，干的生物量采用一步法所制备的生物柴油，其诸如游离甘油、总甘油、酸值、皂含量、铜片腐蚀、闪点、粘度和悬浮微粒之类的指标符合美国ASTM标准，但水分、沉淀物含量和硫含量等不合格，总体而言，S.limacinum适合于通过直接转酯化生产生物柴油(Johnson M B,et al,Energy and Fuels,2009,23:5179～5183)。Vicente等进一步将湿的生物量通过酸催化直接转化为生物柴油，省略了油脂提取这一步骤，从而使生产成本得以降低；而且油脂利用率提高，结构性油脂也能转化为脂肪酸甲酯(Vicente G,et al,Energy Fuels,2010,24(5):3173～3178)。Dang Diem Hongd等报道将自S.mangrovei PQ6中提取的脂肪酸甲酯分离为饱和脂肪酸甲酯(SFAME)和不饱和脂肪酸甲酯(UFAME)两部分，其含量分别为70％和30％，其中饱和脂肪酸甲酯诸如15℃下比重、沸点、水分、沉渣和40℃下动态黏度等指标符合越南生物柴油B100标准(Dang Diem Hongd,etal,Journal of Bioscience and Bioengineering,2013,116(2):180～185)。
油脂含量固然是微藻生产生物柴油的决定因素，其脂肪种类和脂肪酸组成甚至更重要，因为直接关系到产品品质的长链饱和与不饱和脂肪酸在室温下分别是固体和液体，不饱和脂肪酸甲酯的流动性使之适合于用作生物柴油，然而，多不饱和脂肪酸容易被氧化，形成粘滞的聚合物和/或生成含有诸如环氧基、醛基之类的含氧脂肪酸(释放的氧自由基会腐蚀发动机内部结构)。因此，调控脂肪酸组成对于保证微藻油生产的生物柴油的品质非常重要。如Chang等分离得到几株裂殖壶菌和“橙黄壶菌”，其油脂富含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，是生产具有更高氧化稳定性和热稳定性的生物柴油的适合原料(Chang K J L,etal,Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93:2215～2231)。
我国生产生物柴油的原料主要为餐厨废油和废弃动物脂，与欧美主要以植物油为原料相比，其副产物粗甘油因色泽、气味以及其它微量组分的原因更加难以精制，以之为碳源培养裂殖壶菌生产油脂，无论从环境保护还是生产成本来讲，更具有现实意义；而且因粗甘油杂质更复杂，所以其积累的油脂更适宜于用于生产生物柴油。Liang等发现S.limacinum SR21以这种粗甘油为碳源进行间歇发酵时生长快速，由于底物抑制作用以及所含甲醇，高浓度致使细胞生长减缓；未处理和已处理粗甘油的最适浓度分别为25和35g·L-1，所获得的生物量分别为8.3和13.3g·L-1；由35g·L-1的已处理粗甘油获得的生物量中含有73.3％的油脂(Liang Y,et al,Bioresource Technology,2010,101:6745～6750)。该方面研究目前刚刚起步，而国内鲜有报道。
发明内容
为了解决上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一株裂殖壶菌，该菌株为从采自浙江温州乐清湾的红树林腐败落叶上分离获得的裂殖壶菌WZU6961，经紫外诱变育种而获得的，编为Schizochytrium sp.6961Y01。其特点为能以生物柴油副产品粗甘油为碳源快速生长和积累油脂，且其油脂组成更适宜用于生产生物柴油。
本发明的另一目的在于提供一种粗甘油培养上述裂殖壶菌产油脂的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株裂殖壶菌，该菌株为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)6961Y01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9043，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏起始日期为2014年04月14日。
一种粗甘油培养上述裂殖壶菌产油脂的方法，包括如下步骤：
1)将上述保藏菌株6961Y01接种于种子培养基中活化获得活化菌，然后活化菌转接于种子培养基培养得到种子；
2)将步骤1)所得种子转接于发酵培养基中进行发酵培养，离心得富含油脂的裂殖壶菌菌体。
作为优选技术方案，步骤1)中所述种子培养基的组成为粗甘油，玉米浆，矿物质；步骤2)中所述发酵培养基的组成为：粗甘油，玉米浆，矿物质，复合维生素。
优选地，步骤1)和2)中所述种子培养基和发酵培养基的组成中粗甘油30g·L-1、玉米浆10g·L-1；
优选地，步骤1)和2)中所述种子培养基和发酵培养基的组成中矿物质的构成为：NaCl 15g·L-1、KCl 0.5g·L-1、MgSO4·7H2O 2.0g·L-1、K2SO40.65g·L-1、KH2PO41.0g·L-1、(NH4)2SO41.0g·L-1、CaCl2·2H2O 0.17g·L-1、MnCl2·4H2O 3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 3mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.04mg·L-1、Na2MoO4·2H2O0.04mg·L-1、CuSO4·5H2O 2mg·L-1、NiSO4·6H2O 2mg·L-1、FeSO4·7H2O 10mg·L-1；
优选地，步骤2)中所述发酵培养基的组成中复合维生素的构成为：硫胺素10mg·L-1、核黄素20mg·L-1、维生素B660mg·L-1、钴胺素14mg·L-1、硫辛酸30mg·L-1、维生素K20mg·L-1、烟酸10mg·L-1、叶酸30mg·L-1；
优选地，步骤1)和2)中所述种子培养基和发酵培养基的pH 6.0～7.0；
优选地，步骤1)和2)中所述种子培养基和发酵培养基组成中的粗甘油，为将生物柴油副产品粗甘油与水按体积比1:4混合后，调pH至6.0～7.0，经离心去除脂肪酸盐(皂)而得。
作为优选技术方案，步骤1)所述的活化的步骤为：将保藏菌株6961Y01接种于种子培养基中，于20～30℃，150～160rpm的条件下活化65～75h，获得活化菌；
优选地，步骤1)中所述的活化菌转接的步骤为：所得活化菌按4～6％体积百分比接种于种子培养基中，于20～30℃、150～160rpm的条件下培养45～50h；然后再按8～12％体积百分比转接于种子培养基，于20～30℃、60～100％氧饱和度下培养45～50h得种子。
作为优选技术方案，步骤2)中种子转接于发酵培养基中，在20～30℃、分段控制溶氧的条件下培养；
优选地，所述分段控制溶氧，控制氧饱和度60～100％培养55～65h后，控制氧饱和度0～30％培养35～45h；
优选地，步骤2)中所述的转接为种子以8～12％体积百分比接种于发酵培养基中。
作为优选技术方案，步骤2)中所述的发酵培养过程中，分批流加粗甘油和玉米浆；
优选地，步骤2)中所述分批流加甘油为每隔16～20h一次性加30g·L-1粗甘油，总量120g·L-1；
优选地，步骤2)中所述分批流加玉米浆为培养55～65h后一次性加10g·L-1玉米浆。
上述方法获得的富含油脂的裂殖壶菌菌体应用于制备生物柴油。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明提供的裂殖壶菌6961Y01，为裂殖壶菌WZU6961经紫外诱变育种而获得的，与原菌株比较，棕榈酸含量提高50％而DHA降低30％，不仅能以生物柴油副产品粗甘油为碳源快速生长和积累油脂，而且其油脂组成更适宜用于生产生物柴油。
2.本发明提供了以生物柴油副产品粗甘油培养裂殖壶菌6961Y01的培养基配方与分段控制溶氧分批补粗甘油和玉米浆的培养技术。
3.本发明提供的裂殖壶菌6961Y01以及培养基配方和培养技术，生物量达101.59～103.75g·L-1，油脂含量达74.75％～77.31％，生物量生产率达1.01～1.03g·L-1h-1，油脂生产率达0.77～0.78g·L-1h-1，与目前报道的以葡萄糖为碳源培养裂殖壶菌的生物量生产率和油脂生产率接近。
附图说明
图1是Schizochytrium sp.6961Y01营养细胞扫描电镜图。
图2是粗甘油培养Schizochytrium sp.6961Y01的分段控制溶氧分批补粗甘油和玉米浆的典型发酵进程。
图3是Schizochytrium sp.6961Y01菌体油脂的脂肪酸组成的典型气相色谱图。
菌株保藏：本发明的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)6961Y01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9043，保藏起始日期为2014年04月14日。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一：生物柴油副产品粗甘油的预处理
生物柴油副产品粗甘油取自生物柴油生产企业，为以餐厨废油为原料生产生物柴油的。
将生物柴油副产品粗甘油与水以1:4(V:V)混合后，调pH至6.5，脂肪酸形成脂肪酸盐(皂)沉淀，4000rpm下离心10min去皂得粗甘油，然后在120℃下高压蒸汽灭菌10min(以后用于配制培养基时待培养基配好后灭菌)以去除甲醇。
将经预处理后的粗甘油进行相关成分分析，结果如表1所示。其中矿物质采用原子吸收分光光度法测定，甘油含量采用高碘酸钾法测定(李素敏，中国输血杂志,1999,12(3):179～179)，脂肪酸和甲醇含量采用气相色谱法测定，蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。
表1粗甘油相关成分分析结果
实施例二：产油脂裂殖壶菌的诱变育种
出发菌株为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)WZU6961(遗传资源来源披露见专利“裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法(申请号：201210338013.0)”)，从采自浙江省乐清湾的红树林的腐败落叶上分离获得。
取保藏菌株(2.0ml融化菌液)接种于50ml液体培养基(培养基配方(g·L-1)：粗甘油30(折算后实际甘油量)、酵母粉10、NaCl 15、KCl 0.5、MgSO4·7H2O2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、(NH4)2SO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、MnCl2·4H2O0.003、ZnSO4·7H2O 0.003、CoCl2·6H2O 0.00004、Na2MoO4·2H2O 0.00004、CuSO4·5H2O 0.002、NiSO4·6H2O 0.002、FeSO4·7H2O 0.01，pH自然)中，于30℃、150～160rpm下培养72h进行菌种活化，然后按5％体积比转接到新的液体培养基中在相同条件下培养至对数期(约24h)，取50ml菌液在5000rpm下离心10min并用无菌人工海水(人工海水配方(g·L-1)：NaCL 15、KCl 0.5、MgSO4·7H2O2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、(NH4)2SO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、MnCl2·4H2O 0.003、ZnSO4·7H2O 0.003、CoCl2·6H2O 0.00004、Na2MoO4·2H2O 0.00004、CuSO4·5H2O0.002、NiSO4·6H2O 0.002、FeSO4·7H2O 0.01)洗涤2次，用无菌人工海水配制成108个·ml-1左右的菌悬液。取15ml于平皿中用于诱变，15瓦紫外灯管，距离20厘米，照射时间20min，诱变前先照射10min，避光操作，磁力搅拌。取2.0ml接种到液体培养基(100ml三角瓶装20ml)中，用黑纸包裹，30℃、150rpm下培养12小时。取培养液经适当稀释后涂布于固体培养基(琼脂18g·L-1，其他同液体培养基)平板上，在30℃下培养，挑取生长快的单菌落进行纯化后接种于固体培养基斜面，在30℃下培养后于4℃下保藏。
分别将保藏菌株接种于种子培养基(配方同液体培养基)中于30℃、150rpm下活化72h，然后按5％体积比转接于发酵培养基(配方同液体培养基)，在30℃、150rpm下培养72h。然后取10ml发酵液在5000rpm下离心10min得菌体，于100℃下干燥至恒重(约24h)后测定其生物量；其余发酵液于8000rpm下离心10min并用蒸馏水洗涤菌体2次后，进行冷冻干燥，测定菌体油脂含量和脂肪酸组成。结果获得1株较出发菌株的棕榈酸含量提高50％、DHA降低30％而细胞生长速率和油脂含量接近的遗传学稳定的突变株，编为Schizochytriumsp.6961Y01，Schizochytrium sp.6961Y01的形态与出发菌株比较没有明显的改变(见图1)。
油脂提取和含量测定采用酸热法(马建设，温州大学学报，2009,30(6):21～24)，生物量采用干重法测定，脂肪酸组成分析采用气相色谱-质谱联用法。
实施例三：粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的培养条件优化
将保藏菌株(2.0ml融化的菌液)接种于装有50ml种子培养基(配方同实施例二)的250ml锥形瓶中，在30℃、150～160rpm下培养72h进行活化；然后按5％体积比转接于装有100ml种子培养基的500ml锥形瓶中，于30℃、160rpm下培养48h得到种子；接着按5％体积比转接于装有100ml发酵培养基(基础配方同种子培养基)的500ml锥形瓶中，在一定温度、150～160rpm下培养72h，测定生物量、菌体油脂含量，测定方法同实施例二。
主要探讨氮源种类、生长因子、pH、温度对裂殖壶菌生长与积累油脂的影响，结果如表2～表5所示。
1、氮源对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
发酵培养基组成为将基础配方的氮源分别以10g·L-1酵母粉、10g·L-1蛋白胨、10g·L-1玉米浆、5g·L-1酵母粉+5g·L-1玉米浆、5g·L-1酵母粉+2.5g·L-1玉米浆+2.5g·L-1蛋白胨代替，于30℃、150～160rpm下培养72h，测定生物量和菌体油脂含量，结果如表2所示。
由表2看出，酵母粉、玉米浆、酵母粉和玉米浆复合以及酵母粉、玉米浆和蛋白胨复合为氮源时，其生物量和菌体油脂含量接近，且高于蛋白胨为氮源。综合考虑，以玉米浆作为适宜氮源。
表2氮源对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
2、生长因子对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
种子培养基的组成为：玉米浆10g·L-1，其他同实施例二。发酵培养基组成为(g·L-1)：粗甘油30(折算后实际甘油量)、玉米浆10、NaCl 15、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、(NH4)2SO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、MnCl2·4H2O 0.003、ZnSO4·7H2O0.003、CoCl2·6H2O 0.00004、Na2MoO4·2H2O0.00004、CuSO4·5H2O 0.002、NiSO4·6H2O0.002、FeSO4·7H2O 0.01，pH自然；同时分别加入不同生长因子(g·L-1)：(1)复合维生素：硫胺素0.010、核黄素0.020、维生素B60.060、钴胺素0.014、硫辛酸0.030、维生素K 0.020、烟酸0.010、叶酸0.030；(2)复合氨基酸：蛋氨酸2.5～3.0、赖氨酸0.3～0.5、组氨酸0.3～0.5、谷氨酰胺1.0～1.2、苏氨酸1.8～2.0；(3)复合维生素+复合氨基酸；于30℃、150～160rpm下培养72h，测定生物量和菌体油脂含量，结果如表3所示。
从表3看出，加入复合维生素与复合维生素+复合氨基酸后生物量分别提高19.58％和16.70％，但油脂含量变化不大；而加入复合氨基酸无论生物量和油脂含量均没有明显变化。因此适宜的方法为加入复合维生素。
表3生长因子对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
3、温度对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
种子培养基组成同实施例三2。发酵培养基组成为(g·L-1)：粗甘油30(折算后实际甘油量)、玉米浆10、NaCl 15、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、(NH4)2SO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、MnCl2·4H2O 0.003、ZnSO4·7H2O0.003、CoCl2·6H2O 0.00004、Na2MoO4·2H2O 0.00004、CuSO4·5H2O 0.002、NiSO4·6H2O 0.002、FeSO4·7H2O 0.01、硫胺素0.010、核黄素0.020、维生素B60.060、钴胺素0.014、硫辛酸0.030、维生素K 0.020、烟酸0.010、叶酸0.030，pH自然；于15～35℃、150～160rpm下培养72h，测定生物量和菌体油脂含量，结果如表4所示。
由表4看出，温度对生物量有较大影响，而对油脂含量影响不大，适宜的温度为20～30℃。
表4温度对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
4、培养基初始pH对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
种子培养基组成同实施例三2。发酵培养基组为(g·L-1)：粗甘油30(折算后实际甘油量)、玉米浆10、NaCl 15、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、(NH4)2SO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、MnCl2·4H2O 0.003、ZnSO4·7H2O0.003、CoCl2·6H2O 0.00004、Na2MoO4·2H2O 0.00004、CuSO4·5H2O 0.002、NiSO4·6H2O 0.002、FeSO4·7H2O 0.01、硫胺素0.010、核黄素0.020、维生素B60.060、钴胺素0.014、硫辛酸0.030、维生素K 0.020、烟酸0.010、叶酸0.030，pH 4.0～8.0；于温度25℃，150～160rpm下培养72h，测定生物量和菌体油脂含量，结果如表5所示。
由表5看出，适宜的培养基初始pH为6.0～7.0。
表5pH对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
pH 生物量/g·L<sup>-1</sup> 油脂含量/％
4.0 13.99±1.07 55.17±3.67
5.0 21.35±2.26 72.03±4.22
6.0 28.16±1.24 71.99±3.82
6.5 29.78±3.09 72.24±3.22
7.0 28.69±1.55 72.51±2.87
8.0 20.65±0.78 65.34±4.22
实施例四溶氧对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
保藏菌株(2.0ml融化的菌液)接种于装有50ml种子培养基(pH 6.5，其他同实施例三2)的250ml锥形瓶中，在30℃、150～160rpm下培养72h进行活化；然后按5％体积比转接于装有100ml种子培养基的500ml锥形瓶中，于30℃、150～160rpm下培养48h得到种子；种子按10％体积比的接种量转接于装有3L发酵培养基(pH 6.5，其他同实施例三4)的5L发酵罐中，控制温度25℃，在线监测pH变化，通过调节通气量和搅拌速度使发酵过程维持不同的溶氧水平，定时取样测定甘油浓度、生物量和油脂含量，直至甘油耗完为止，结果如表6所示。
由表6看出，低氧饱和度(氧饱和度＜60％)有利于油脂积累，而高氧饱和度(氧饱和度＞60％)有利于细胞生长。
表6溶氧对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
实施例五粗甘油浓度对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
保藏菌株(2.0ml融化的菌液)接种于装有50ml种子培养基(配方同实施例四)的250ml锥形瓶中，在30℃、150～160rpm下培养72h进行活化；然后按5％体积比转接于装有100ml种子培养基的500ml锥形瓶中，于30℃、150～160rpm下培养48h得到种子；种子按10％体积比的接种量转接于装有3L发酵培养基(甘油浓度分别为30g·L-1、60g·L-1、120g·L-1，其他同实施例四)的5L发酵罐中，控制温度25℃，在线监测pH变化；定时取样测定甘油浓度、生物量和油脂含量，直至甘油耗完或消耗趋于稳定为止；通过调节通气量和搅拌速度使对数期维持氧饱和度在60％以上，进入对数期末期维持氧饱和度在30％以下。结果如表7所示。
由表7看出，随着甘油浓度增加，甘油生物量产率、甘油油脂产率、生物量生产率、油脂生产率逐渐下降。甘油浓度为30g·L-1和60g·L-1时，生物量生产率和油脂生产率比较接近。
表7甘油浓度对菌株6961Y01生长与积累油脂的影响
实施例六：粗甘油培养裂殖壶菌的分段控制溶氧分批补甘油玉米浆发酵
保藏菌株(2.0ml融化的菌液)接种于装有50ml种子培养基(配方同实施例四)的250ml锥形瓶中，在30℃、150～160rpm下培养72h进行活化；然后按5％体积比转接于装有100ml种子培养基的500ml锥形瓶中，于30℃、150～160rpm下培养48h得到摇瓶种子；摇瓶种子按10％体积比的接种量接种于种子罐，在25℃、60～80％氧饱和度下培养48h得种子；种子按10％体积比的接种量转接于发酵罐中(配方同实施例四)，控制温度25℃，在线监测pH变化；定时取样测定甘油浓度、生物量和油脂含量；至甘油几乎耗完时，一次性流加30g·L-1粗甘油，直至甘油不能消耗为止；在甘油总消耗量超过100g·L-1后，一次性流加10g·L-1玉米浆；通过调节通气量和搅拌速度使氧饱和度在60％以上，当甘油消耗总量超过100g·L-1以后维持氧饱和度在30％以下。典型发酵进程如图2所示。
由图2可知，粗甘油培养裂殖壶菌的分段控制溶氧分批补甘油玉米浆发酵的发酵时间为96～105h；生物量101.59～103.75g·L-1；菌体油脂含量74.75％～77.31％；玉米浆消耗量20g·L-1；甘油消耗量141.43g·L-1～143.14g·L-1；甘油生物量产率0.71～0.73g·g-1,甘油油脂产率0.54～0.56g·g-1；生物量生产率1.01～1.03g·L-1h-1，油脂生产率0.77～0.78g·L-1h-1。
实施例七：裂殖壶菌油脂的组成分析
将裂殖壶菌发酵液在5000rpm下离心后得到菌体，然后进行冷冻干燥。采用酸热法提取油脂(同实施例二)，采用气相色谱-质谱法测定脂肪酸组成和含量，以内标法测定各脂肪酸含量，内标物为花生酸。
油脂提取与脂肪酸甲酯化：精确称取0.030g左右冷冻干燥菌体于干燥的离心管中，加入2ml 4mol·L-1盐酸振荡混匀，静置30min，于沸水浴煮3min后速冷至室温，再加入4ml氯仿：甲醇(2:1)，充分振荡后于4000rpm下离心5min，取氯仿层，再加入等体积的0.1％氯化钠溶液，混匀后于4000rpm下离心5min，取氯仿层至干燥称重后的试管中，于真空干燥箱中40～50℃下真空干燥10h后称重，测定菌体油脂含量(菌体油脂含量(％)＝油脂重量(g)/干菌体重量(g)×100)。采用三氟化硼乙醚催化法进行脂肪酸甲酯化。在真空干燥得到的油脂中，加入0.5mol·L-1KOH-甲醇溶液2ml和内标物(花生酸)1ml(约0.006-0.008g)，65℃水浴酯化10min后加2ml三氟化硼乙醚，煮沸3min，冷却后加入1ml正庚烷混匀，煮沸1min，再加入等体积的饱和氯化钠溶液，静置分层后取上层正庚烷相进行气相色谱-质谱测定。
气相色谱条件：采用程序升温法，初始温度180℃，保持2min，然后按5℃/min升到240℃，保持16min；进样口温度250℃；FID检测器，检测器温度260℃；进样量：1μm。
图3为Schizochytrium sp.6961Y01菌体油脂的脂肪酸组成的典型气相色谱图，经计算，各脂肪酸含量列于表8，表8同时列出原始菌株Schizochytrium sp.WZU6961的各脂肪酸含量，其中花生酸是加入的内标物。
表8裂殖壶菌6961Y01菌体油脂与WZU6961菌体油脂的脂肪酸组成
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株裂殖壶菌，其特征在于：该菌株为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)6961Y01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.9043，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏起始日期为2014年04月14日。
2.一种粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将权利要求1中的所述保藏菌株6961Y01接种于种子培养基中活化获得活化菌，然后活化菌转接于种子培养基培养得到种子；
2)将步骤1)所得种子转接于发酵培养基中进行发酵培养，离心得富含油脂的裂殖壶菌菌体。
3.根据权利要求2所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：步骤1)所述的种子培养基的组成为：粗甘油，玉米浆，矿物质；
步骤2)所述的发酵培养基的组成为：粗甘油，玉米浆，矿物质，复合维生素；
所述的粗甘油30g·L-1，玉米浆10g·L-1；
所述的矿物质的构成为：NaCl 15g·L-1、KCl 0.5g·L-1、MgSO4·7H2O 2.0g·L-1、K2SO40.65g·L-1、KH2PO41.0g·L-1、(NH4)2SO41.0g·L-1、CaCl2·2H2O 0.17g·L-1、MnCl2·4H2O 3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 3mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.04mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.04mg·L-1、CuSO4·5H2O 2mg·L-1、NiSO4·6H2O 2mg·L-1、FeSO4·7H2O 10mg·L-1；
所述的复合维生素的构成为：硫胺素10mg·L-1、核黄素20mg·L-1、维生素B660mg·L-1、钴胺素14mg·L-1、硫辛酸30mg·L-1、维生素K 20mg·L-1、烟酸10mg·L-1、叶酸30mg·L-1。
4.根据权利要求3所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：所述种子培养基和发酵培养基的pH为6.0～7.0。
5.根据权利要求3所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：所述的粗甘油为将生物柴油副产品粗甘油与水按体积比1:4混合后，调pH至6.0～7.0，经离心去除脂肪酸盐而得。
6.根据权利要求3所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：步骤1)所述的活化的步骤为：将保藏菌株6961Y01接种于种子培养基中，于20～30℃，150～160rpm的条件下活化65～75h，获得活化菌；
步骤1)中所述的活化菌转接的步骤为：所得活化菌按4～6％体积百分比接种于种子培养基中，于20～30℃、150～160rpm的条件下培养45～50h；然后再按8～12％体积百分比转接于种子培养基，于20～30℃、60～100％氧饱和度下培养45～50h得种子。
7.根据权利要求3所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：步骤2)中种子转接于发酵培养基中，在20～30℃、分段控制溶氧的条件下培养；
所述分段控制溶氧，控制氧饱和度60～100％培养55～65h后，控制氧饱和度0～30％培养35～45h。
8.根据权利要求3所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：步骤2)中所述的转接为种子以8～12％体积百分比接种于发酵培养基中。
9.根据权利要求3所述的粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：步骤2)中所述的发酵培养过程中，分批流加粗甘油和玉米浆；
所述分批流加甘油为每隔16～20h一次性加30g·L-1粗甘油，总量120g·L-1；
所述分批流加玉米浆为培养55～65h后一次性加10g·L-1玉米浆。
10.权利要求2～9任一项所述方法获得富含油脂的裂殖壶菌菌体应用于制备生物柴油。
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