CN102251002A

CN102251002A - 固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法

Info

Publication number: CN102251002A
Application number: CN2011101719206A
Authority: CN
Inventors: 房耀维; 刘姝; 王淑军; 吕明生; 焦豫良
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2011-06-23
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明公开了一种利用米曲霉固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法，属于水产品加工及微生物生物技术交叉领域。本发明以矛尾刺虾虎鱼肌肉为原料，采用匀浆机将新鲜鱼肌肉匀浆，80℃水浴保温20min，10℃，8000g离心20min，除去上层油脂，80℃烘干。干燥样品与蛭石混合均匀，调整好水分含量、pH，接种米曲霉进行固态发酵。发酵结束后，加蒸馏水浸泡、搅拌、过滤，滤液浓缩后可得肌肉多肽。本发明提供的矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白多肽有良好的抗氧化功能，本发明方法工艺参数设计合理，可操作性强，无需使用成品蛋白酶，成本低，能够充分利用矛尾刺虾虎鱼资源，具有良好的潜在经济效应。

Description

固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法

技术领域

本发明涉及一种固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法，属于水产品加工及微生物生物技术交叉领域。

背景技术

我国是水产大国，鱼类资源丰富，但加工和综合利用还比较落后，大多以冷冻冷藏、罐头食品及饲料鱼粉等传统加工为主，加工程度低，加工方式传统，深加工生产高附加值的产品鲜有报道。蛋白质水解后产生易于吸收、溶解性好、乳化性好，并具有多种生理活性的多肽，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值。蛋白来源不同，蛋白水解多肽的结构和功能各有差异。已经进行研究的蛋白质有酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、鱼蛋白、玉米蛋白和鸡蛋蛋白。鱼蛋白营养丰富、原料充足，是进行蛋白质水解多肽制备的首选蛋白质。目前国内外已对包括泥鳅、狗鳕、沙丁鱼、太平洋牙鳕、大西洋鲑鱼等多种鱼的蛋白质的酶解特性进行了研究。将鱼蛋白水解，可以产生具有包括降血压、抗菌、清除体内自由基、抗氧化、降低胆固醇等多种生理活性的活性多肽。目前报道的包括鱼类蛋白水解基本上都是直接添加成品碱性蛋白酶对蛋白质进行水解。成品碱性蛋白酶价格较昂贵，增加了生产成本。

矛尾刺虾虎鱼(Acanthogobius hasta)又名长身鲨，属虾虎鱼科，矛尾刺虾虎鱼种，为海水产大型虾虎鱼，分布于太平洋西北部、中国、日本和韩国。目前国内外尚无利用安全菌株米曲霉Aspergillus oryzae固态发酵制备鱼蛋白水解多肽的研究，更没有关于利用矛尾刺虾虎鱼固态发酵制备鱼蛋白水解多肽的文献报导。

发明内容

本发明的目的在于克服目前鱼蛋白水解多肽制备过程中的不足，提供一种新的工艺简单、可操作性强的通过米曲霉Aspergillus oryzae固态发酵的方式制备矛尾刺虾虎鱼蛋白水解抗氧化多肽的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种微生物固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法，其特点是，它采用固态发酵形式，其具体步骤如下：

(1)矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白的制备：取新鲜矛尾刺虾虎鱼，除去鱼鳞、鱼皮、内脏，清洗干净，匀浆机匀浆，匀浆液80℃水浴保温20min，使内源酶失活；10℃，8000g离心20min，除去上层油脂后，置80℃烘干，得干燥肌肉蛋白；

(2)制备发酵基质：将干燥肌肉蛋白和直径为1.0-1.5mm蛭石按照重量比60∶40混合搅拌混匀，用pH 7.5，0.2M的磷酸缓冲液调节含水率至55％，得发酵基质，按V/V 50％将发酵基质装于三角瓶中115℃灭菌20min备用；

(3)微生物固态发酵：将米曲霉Aspergillus oryzae菌种在PDA斜面培养基上活化，从活化后的菌种斜面上挑取孢子接种至PDA液体培养基，30℃、120rpm培养至菌体浓度达到10⁷CFU/ml，得种子液；按V/W 5％(发酵基质干重计算)接种量将种子液接种于灭菌过的发酵基质，30℃，发酵4d；

(4)分离：发酵结束后，加蒸馏水浸泡、搅拌、过滤，滤清液即为抗氧化多肽，或者将滤清液浓缩干燥制粉，得抗氧化多肽粉。

马铃薯培养基(PDA)可以按以下方法配置：马铃薯200g(切片水煮30min，过滤取汁)、蔗糖20.0g、蒸馏水1000mL，pH值自然。固体培养基另加1.5～2g/100mL的琼脂。

米曲霉Aspergillus oryzae为美国食品药品监督局FDA1989年公布了公认为Generally Recognized as Safe菌株，或GRAS菌株，是公认的安全微生物菌种。本发明所述的可以选用购自中科院微生物所的米曲霉Aspergillus oryzae(菌株号AS3.951)。

以下是发明人所做的关于本发明方法的技术方案或参数的优选试验及其结果。

1、测定样品的制备：发酵一定时间后，1g固态发酵基质加入10ml蒸馏水，30℃，180rpm震荡30min；4℃，20000g离心10min，上清液过0.22μm滤膜后用蒸馏水稀释为10mg/mL的多肽液作为样品进行测定。

2、接种量对蛋白酶和多肽的影响：

按照本发明方法步骤(2)制备好发酵基质后，按照V/W 5％，10％，15％接种量将种子液接种到发酵基质后30℃发酵培养，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取样，测定蛋白酶活性和DPPH清除率(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical(DPPH)α，α-二苯基-β-苦基肼基游离基清除率)。结果如图1，接种量变化对蛋白酶活性和DPPH清除率影响不显著，考虑到成本的原因，接种量选择5％。

3、蛭石含量对蛋白酶和多肽的影响：

直径1.0-1.5mm蛭石和干燥肌肉蛋白样品按照W/W 50∶50，40∶60，30∶70，20∶80混匀，即蛭石含量分别为50％，40％，30％，20％。其它条件同“2”，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取样，测定蛋白酶活性和DPPH清除率。结果如图2，蛭石含量为40％时蛋白酶产量最高，且DPPH清除率最早(84h)达到最大值，因此选定蛭石含量为40％。

4、水分含量对蛋白酶和多肽的影响：

直径1.0-1.5mm蛭石和干燥肌肉蛋白样品混匀，蛭石含量为40％，接种量选择5％。用pH 7.5，0.2M的磷酸缓冲液调节含水率分别为45％，55％和65％。其它条件同(5)，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取样，测定蛋白酶活性和DPPH清除率。结果如图3，水分含量为55％时蛋白酶产量最高，且DPPH清除率最早(84h)达到最大值，因此选定水分含量为55％。

5、发酵起始pH对蛋白酶和多肽的影响：

直径1.0-1.5mm蛭石和干燥肌肉蛋白样品混匀，蛭石含量为40％，接种量选择5％。用pH 6.5，pH 7.0，pH 7.5，pH 8.0，0.2M的磷酸缓冲液调节含水率为55％。其它条件同“2”，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取样，测定蛋白酶活性和DPPH清除率。结果如图4，虽然在pH7.0时蛋白酶的产量最高，但在pH7.5时多肽的 DPPH清除率最高，因此选定pH为7.5。

6、发酵温度对蛋白酶和多肽的影响：

直径1.0-1.5mm蛭石和干燥肌肉蛋白样品混匀，蛭石含量为40％，接种量选择5％。pH 7.5，含水率为55％。分别在26℃、28℃、30℃、32℃进行发酵，其它条件同(5)，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取样，测定蛋白酶活性和DPPH清除率。结果如图5，在温度为30℃发酵时，蛋白酶产量最高，产生的DPPH清除率也最高，因此选定发酵温度为30℃。

7、不同发酵时间对蛋白酶活性、平均肽链长度、蛋白水解度和DPPH清除率的影响：

综合考虑各发酵因素对蛋白酶及多肽的影响，选取最佳发酵条件为：直径1.0-1.5mm蛭石，蛭石含量为40％，接种量选择5％，发酵pH 7.5，含水率为55％，发酵温度为30℃。分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取样，测定蛋白酶活性、水解度(hydrolysis degree，HD)(Taylor et al.，1957)、平均肽链长度(the average peptide length，APL)(Netto et al.，1998)和DPPH清除率，结果如图6。随着发酵时间的延长，蛋白酶产量增加，在72h达到最高；蛋白水解度逐渐增加，平均肽链长度逐渐降低。平均链长对DPPH清除率影响显著，发酵时间为96h时，平均肽链长度为8，此时DPPH清除率最高，达到68.5％。因此选择发酵时间为96h。

本发明利用米曲霉Aspergillus oryzae发酵矛尾刺虾虎鱼蛋白，菌株分泌的蛋白酶将矛尾刺虾虎鱼蛋白水解为蛋白水解液。它避免了直接添加纯化商品蛋白酶，降低了成本；另外，米曲霉Aspergillus oryzae固体发酵不需要大型发酵设备，单位体积的产量较液体发酵高，且产蛋白酶量高，速度快，利于蛋白水解，易于大规模生产。本发明方法工艺参数设计合理，可操作性强，无需使用成品蛋白酶，成本低，能够充分利用矛尾刺虾虎鱼资源，具有良好的潜在经济效应。

附图说明

图1为接种量对蛋白酶和多肽的影响图；图中：■，●，▲分别为接种量为5％，10％，15％时蛋白酶活性；□，○，△分别为接种量为5％，10％，15％时DPPH清除率；

图2为蛭石含量对蛋白酶和多肽的影响图；图中：■，●，▲，

分别为蛭石量为50％，40％，30％，20％时蛋白酶活性；□，○，△，

分别为蛭石量为50％，40％，30％，20％时DPPH清除率；

图3为水分含量对蛋白酶和多肽的影响图；■，●，▲分别为接种量为45％，55％，65％时蛋白酶活性；□，○，△分别为接种量为45％，55％，65％时DPPH清除率；

图4为发酵起始pH对蛋白酶和多肽的影响图；图中：■，●，▲，分别为pH为6.5，7，7.5，8时蛋白酶活性；□，○，△，

分别为pH为6.5，7，7.5，8时DPPH清除率；

图5为发酵温度对蛋白酶和多肽的影响图；■，●，▲，

分别为发酵温度为26℃、28℃、30℃、32℃时蛋白酶活性；□，○，△，

分别为发酵温度为26℃、28℃、30℃、32℃时DPPH清除率；

图6为发酵时间对蛋白酶活性、水解度、平均肽链长度、DPPH 清除率的影响图；图中：■，蛋白酶活性；●平均肽链长度；▲，水解度；○，DPPH清除率。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种微生物固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法，它采用固态发酵形式，其具体步骤如下：

(3)微生物固态发酵：将米曲霉Aspergillus oryzae菌种在PDA斜面培养基上活化，从活化后的菌种斜面上挑取孢子接种至PDA液体培养基，30℃、120rpm培养至菌体浓度达到10⁷CFU/ml，得种子液；按V/W 5％接种量将种子液接种于灭菌过的发酵基质，30℃，发酵4d；

为了确定实施例方法制得的水解多肽的抗氧化能力，将制得的浓缩至10mg/ml的多肽液分别进行DPPH清除率、亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力和金属络合能力的测定，结果表明10mg/ml的多肽液的DPPH清除率、亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力和金属络合能力分别达到68.5％，71.6％和88.3％。

1、蛋白酶活性的测定：采用国标SB/T 10317-1999进行蛋白酶活性测定，酶活力定义为在测定条件下，每分钟催化产生1μg酪氨酸的酶量(μg/(mL·min))为1个酶活力单位(U)。

2、DPPH测定抗氧化肽的自由基清除能力

取3ml 60μM溶于乙醇的DPPH，加入500μl待测样品，混匀后室温避光静止60min，测定517nm下光吸收值。用500μl 95％的乙醇替代待测样品作为对照。对照和样品的光吸收值分别记为Ac和As。根据公式(1)计算DPPH清除率。

3、亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力

试管中加入1.5ml 0.1M pH7.0磷酸钠缓冲液和1.5mM亚麻酸的乙醇溶液，混合均匀后，加入2.0ml pH7.0待测样品。采用2.0mMBHT(2，6-二叔丁基对甲酚)的甲醇溶液作对照。60℃避光保温48h。硫氰化铁法测定保温前后反应液的过氧化脂质。取100μl保温前后反应液加入4.5ml 75％乙醇，100μl 30％硫氰酸铵水溶液，200μl 1.0N盐酸，100μl溶解于3.5％盐酸中的20mM氯化亚铁溶液。5min后测定500nm光吸收值，保温前后光吸收值分别记为Ac和As。根据公式(2)计算DPPH清除率。

4、金属络合能力测定

采用铁离子络合法测定多肽液的金属络合能力。取800μl待测样品，加入10μl 2mM FeCl₂溶液，20μl 5mM菲洛嗪，混匀后室温下静止10min，测定526nm光吸收值。以去离子水为对照。样品和对照光吸收值分别记为As和Ac。根据公式(3)计算DPPH清除率。

Claims

1.一种微生物固态发酵矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白制备抗氧化多肽的方法，其特征在于，它采用固态发酵形式，其具体步骤如下：

（1）矛尾刺虾虎鱼肌肉蛋白的制备：取新鲜矛尾刺虾虎鱼，除去鱼鳞、鱼皮、内脏，清洗干净，匀浆机匀浆，匀浆液80℃水浴保温20min，使内源酶失活；10℃，8000g 离心20min，除去上层油脂后，置80℃烘干，得干燥肌肉蛋白；

（2）制备发酵基质：将干燥肌肉蛋白和直径为1.0-1.5 mm蛭石按照重量比 60:40混合搅拌混匀，用pH 7.5, 0.2M的磷酸缓冲液调节含水率至55%，得发酵基质，按V/V 50%将发酵基质装于三角瓶中115℃灭菌20min备用；

（3）微生物固态发酵：将米曲霉Aspergillus oryzae菌种在PDA斜面培养基上活化，从活化后的菌种斜面上挑取孢子接种至PDA液体培养基，30℃、120rpm 培养至菌体浓度达到10⁷CFU/ml，得种子液；按V/W 5%接种量将种子液接种于灭菌过的发酵基质，30℃，发酵4d；

（4）分离：发酵结束后，加蒸馏水浸泡、搅拌、过滤，滤清液即为抗氧化多肽，或者将滤清液浓缩干燥制粉，得抗氧化多肽粉。