CN103564194B

CN103564194B - 一种蛹虫草多糖组合物、其生产方法及用途

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Publication number: CN103564194B
Application number: CN201310486770.7A
Authority: CN
Inventors: 徐德峰; 李彩虹; 孙力军; 王雅玲; 叶日英; 刘唤明; 江侧燕
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-10-17
Also published as: CN103564194A

Abstract

本发明公开了一种蛹虫草多糖组合物，其制备方法包括步骤：1）将蛹虫草菌株活化后，接入种子培养基中于20～30℃培养5～7d制备种子液；2）往发酵罐中加入发酵培养基，灭菌后冷却至25～35℃，加入2～4%体积的种子液，于20～35℃搅拌发酵3～7d；3）将步骤2）发酵后所得混合物进行打浆、匀浆、离心取清液，得到蛹虫草多糖组合物。本发明还公开了一种蛹虫草多糖组合物的生产方法，以及其在制备提升对虾免疫性状的饲料或药物中的用途，该组合物能增强高密度养殖条件下对虾的自身抗病力。本发明蛹虫草多糖组合物效果明显，生产工艺简单，且成本低廉，安全性和经济效益良好，适于工业化应用。

Description

一种蛹虫草多糖组合物、其生产方法及用途

技术领域

本发明涉及一种经发酵制备的多糖组合物、其生产方法及用途，特别是一种蛹虫草多糖组合物、其生产方法及用途。

背景技术

蛹虫草（Cordyceps militaris）也称北冬虫夏草，是一种传统名贵中药材，富含虫草素、虫草酸、虫草多糖等生物活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗辐射及调节免疫功能等重要作用。在提升机体免疫力方面，其功效成分主要是活性多糖。已有的研究表明，蛹虫草多糖可显著提升小鼠特异性和非特异性免疫指标，且市场上已有以蛹虫草多糖为主要原料的以提升免疫力为主要功效的保健品。目前虫草来源主要靠野生资源，但野生资源日益贫乏，难于满足市场需求。液态发酵作为现代生物技术产业化的关键技术，可以快速、高效、低成本获得高值化的目标产物，目前已在诸多领域广泛应用。基于蛹虫草显著的生物活性和天然资源的日趋枯竭，目前已有大量研究蛹虫草液体发酵制备活性物质的报道，证明在活性物质的种类、含量及药理作用方面，人工发酵的蛹虫草与野生的蛹虫草及冬虫夏草（Cordyceps sinensis）相近，可望成为野生虫草的替代品，这为实现虫草活性成分的低成本工业化应用奠定了技术基础。但目前蛹虫草液体发酵与应用的研究绝大多数集中在实验室摇瓶规模的培养基和培养条件优化方面，5L以上向工业化放大的应用研究较为缺乏，同时在多糖提取方面多是采用传统的离心、烘干、粉碎、浸提、醇沉、干燥等工序，工艺繁琐、成本高昂，缺乏高效低成本的提取方法，而在对虾养殖领域的应用，以及对于养殖对虾免疫性状的影响更未见报道。

对虾作为大宗水产品，具有高蛋白、低脂肪的营养构成和鲜香味美的风味特征，深受消费者喜爱，且随着人们生活水平的提高和饮食结构的调整，其消费数量和质量要求逐年提高。为满足对虾的数量要求，目前主要采用高密度养殖模式，但连续高密度养殖造成水质恶化日趋严重，对虾生长缓慢和患病率增加，养殖效益逐年下降。而广大养殖户为了保证养殖经济效益，在养殖过程中超量使用（甚至滥用）诸多抗生素、杀菌剂等化学药物，从而在养殖源头上埋下了食品安全隐患，并影响了对虾产业的健康发展。因此，在目前养殖模式下，迫切需要一种可在养殖源头通过提升对虾自身抗病力，从而维持养殖户经济效益和促进产业健康发展的免疫调节剂绿色制备方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种利用现代发酵工程方法制备的安全性良好的蛹虫草多糖组合物。

本发明的另一个目的在于提供一种高效低成本、工艺简单、适于工业化的蛹虫草多糖组合物的快速制备方法。

本发明的又一个目的在于提供蛹虫草多糖组合物在提升养殖对虾免疫性状方面的用途。

本发明所采用的技术方案是：

一种蛹虫草多糖组合物，其制备方法包括如下步骤：

1）将蛹虫草菌株活化后，接入种子培养基中于20～30℃培养5～7d制备种子液；

2）往发酵罐中加入发酵培养基，灭菌后冷却至25～35℃，加入2～4%体积的种子液，于20～35℃搅拌发酵3～7d；

3）将步骤2）发酵后所得混合物进行打浆、匀浆、离心取清液，得到蛹虫草多糖组合物。

优选地，发酵培养基采用高压蒸汽灭菌，在115-121℃灭菌15-30min。

本发明还提供了一种蛹虫草多糖组合物的生产方法，包括如下步骤：

本发明可采用本领域常用的打浆机、匀浆机和参数，可用较低速度将混合物中的菌丝体进行初步打浆，然后用匀浆机和较高速度对其进行进一步的打碎，以获得胞内多糖。打浆和匀浆也可进行多次。

优选地，步骤3）中，混合物以5000-8000r/m打浆5-15min、以10000-12000r/m匀浆10-15min，以6000～10000r/m离心10～30min。

优选地，步骤2）所用发酵培养基为：将重量比1～5%豆粕、1～5%玉米粉、0.1～1%胡萝卜汁、0.01～0.1%K₂HPO₄、0.01～0.1%MgSO₄混合后，以质量体积比1∶（5～10）加水搅拌。在此条件下所获得的蛹虫草多糖组合物多糖含量较高，性能较优。采用此发酵培养基不仅能使多糖产量提高30%-40%，而且由于培养基原料价格便宜，从而可以大大降低生产成本，在工业生产中具有显著的经济效益。

优选地，步骤2）中，发酵在罐压0.02～0.08MPa、通气量为0.2～2L/min以及搅拌速度为100～300r/m下进行。

优选地，所用蛹虫草菌株为蛹虫草（Cordyceps militaris）GIM5.269。该菌株可从广东省微生物研究所菌种保藏中心（GIM）购得，编号为5.269。

优选地，蛹虫草菌株的活化方法为：将蛹虫草菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，于25～35℃培养96～144h，转接2次。

优选地，步骤1）中，种子液制备方法为：先将活化后的斜面菌种以无菌水洗涤，得孢子悬液，然后将孢子悬液接入马铃薯葡萄糖液体培养基，于20～30℃下以100～300r/m振荡培养5～7d得种子液。

马铃薯葡萄糖琼脂（斜面）培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基为本领域常用培养基，本领域技术人员可根据实际情况对这两种培养基做适当的调整。

本发明还提供蛹虫草多糖组合物在制备提升对虾免疫性状的饲料或药物中的用途，该组合物能增强高密度养殖环境下对虾的自身抗病力。

优选地，该蛹虫草多糖组合物作为饵料添加剂加入到基础饵料中，其中蛹虫草多糖在整个饲养液中的浓度大于等于0.5g/100mL，连续饲喂7d以上。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、效果明显：基于蛹虫草多糖所具有的显著免疫调节功效，通过发酵工程制备的蛹虫草多糖组合物能够显著提升对虾的免疫性状。

2、工艺简单高效：在多糖提取阶段，本发明方法直接将发酵液与菌丝体混合打浆、匀浆离心后获得胞内外多糖，相比传统的离心、干燥、粉碎、浸提、浓缩工艺缩短了工艺流程。并且本发明方法制备的蛹虫草多糖组合物中多糖含量比传统方法的高30-40%。

3、成本低廉：本发明采用大宗低值豆粕和玉米粉作为主要原料，在原料上降低了成本，同时在多糖提取阶段因减少工序也显著降低了分离成本，从而整体上降低了生产成本。

4、安全性和经济效益良好：本发明通过液态发酵快速大量制备蛹虫草活性多糖，并将其应用于对虾养殖领域，一方面有利于在现有养殖模式下提升对虾自身抗病力，提高养殖经济效益；另一方面也有利于降低养殖源头的化学药物添加，提升对虾食用安全性。

5、适于工业化应用：目前关于蛹虫草的研究和应用大多集中在实验室阶段，5L以上工业化放大的应用研究鲜见报道。而本发明蛹虫草多糖组合物的生产方法则能够在5L及以上的工业化生产规模中应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所用的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基均为本领域常用的固体/液体培养基。

实施例1 制备本发明蛹虫草多糖组合物

1）将蛹虫草菌株GIM5.269采用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，以无菌水洗涤斜面得孢子悬液，接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，100r/m振荡培养6d得发酵种子液。

2）配制发酵培养基：取重量比1%豆粕与1%玉米粉混合，加入0.5%胡萝卜汁、0.05%K₂HPO₄和0.05%MgSO₄，以质量体积比1:5加水搅拌。在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，罐内121℃灭菌30min，然后用流水冷却至30℃，加入体积比3%的发酵种子液。控制发酵条件为温度28℃、罐压0.05MPa、通气量2L/min、搅拌速度180r/m、培养时间6d。

3）取步骤2）发酵后所得混合物在打浆机中以5000r/m打浆10min，然后在匀浆机中以10000r/m匀浆15min，并于8000r/m离心20min，取上清液。

实施例2 制备本发明蛹虫草多糖组合物

1）将蛹虫草菌株GIM5.269采用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，以无菌水洗涤斜面得孢子悬液，接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，200r/m振荡培养6d得发酵种子液。

2）配制发酵培养基：取重量比1%豆粕与3%玉米粉混合，加入0.1%胡萝卜汁、0.05%K₂HPO₄和0.05%MgSO₄，以质量体积比1:8加水搅拌。在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，罐内121℃灭菌30min，然后用流水冷却至30℃加入体积比3%发酵种子液。控制发酵条件为温度25℃、罐压0.05MPa、通气量2L/min、搅拌速度200r/m、培养时间6d。

3）取步骤2）发酵后所得混合物以8000r/m打浆5min、以12000r/m匀浆10min、8000r/m离心20min，取上清液。

实施例3 制备本发明蛹虫草多糖组合物

1）将蛹虫草GIM5.269采用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，无菌水洗涤斜面得孢子悬液，接入马铃薯葡萄糖液体培养基，300r/m振荡培养6d得发酵种子液。

2）配制发酵培养基：取重量比5%豆粕与2%玉米粉混合，加入0.8%胡萝卜汁、0.05%K₂HPO₄和0.05%MgSO₄，以质量体积比1:10加水搅拌。在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，罐内121℃灭菌30min，流水冷却至30℃加入体积比3%发酵种子液。控制发酵培养条件为温度28℃、罐压0.05MPa、通气量2L/min、搅拌速度200r/m、培养时间7d。

3）取步骤2）发酵后所得混合物以6500r/m打浆15min、以11000r/m匀浆12min、8000r/m离心20min，取上清液。

实施例4-6 用传统工艺制备蛹虫草多糖混合物

按照与实施例1、2、3类似的方法和条件制备蛹虫草多糖混合物，其中发酵培养基为：（实施例4）按重量体积比取蔗糖12%、玉米浆2%、酵母膏2%、硝酸钾0.45%，加水制成；（实施例5）按重量体积比取蔗糖10%、玉米浆2%、酵母膏2%、硝酸钾0.45%，加水制成；（实施例6）按重量体积比取蔗糖11%、玉米浆2%、酵母膏2%、硝酸钾0.45%，加水制成。

发酵后，取发酵混合物以4000r/m离心15min，取沉淀烘干、粉碎，加水提取，离心去除沉淀，滤液浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积95%乙醇沉淀10h，离心取沉淀。

实施例7 本发明方法生产的蛹虫草多糖组合物与传统方法生产的蛹虫草多糖混合物中的多糖含量比较

采用常规硫酸-苯酚法检测实施例1-6中蛹虫草多糖的含量。

结果显示，实施例1-3用本发明方法制备的蛹虫草多糖组合物中多糖提取率分别为2.0g/100mL、1.8g/100mL和2.1g/100mL，实施例4-6使用传统方法所得蛹虫草多糖混合物中多糖含量经折算分别为1.5g/100mL、1.4g/100mL、1.5g/100mL。

可见，本发明方法的多糖提取率较传统浸提工艺分别提高了35%、32%和40%，且工艺简单省时。

实施例8 本发明蛹虫草多糖组合物对对虾免疫性状的影响

取实施例1-3所得的蛹虫草多糖组合物分别作为试验组饲喂对虾，对照组分别采用实施例4-6对应的蛹虫草多糖混合物饲养对虾。连续饲喂或饲养10d后，检测对虾血清中酚氧化酶活力。

结果显示，与对照组比较，实施例1的蛹虫草多糖组合物将对虾血清中的酚氧化酶活力由156U提高至208U；实施例2的蛹虫草多糖组合物将对虾血清中的酚氧化酶活力由162U提高至213U；实施利3的蛹虫草多糖组合物将对虾血清中的酚氧化酶活力由160U提高至222U，显著提升了对虾的免疫水平。

实施例9 制备本发明蛹虫草多糖组合物

1）将蛹虫草GIM5.269接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，于25℃培养96h，转接2次；无菌水洗涤斜面得孢子悬液，接入马铃薯葡萄糖液体培养基，于20℃以100r/m振荡培养5d得发酵种子液。

2）配制发酵培养基：取重量比1%豆粕与5%玉米粉混合，加入1%胡萝卜汁、0.1%K₂HPO₄和0.1%MgSO₄，以质量体积比1:10加水搅拌。在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，罐内115℃灭菌30min，流水冷却至35℃加入体积比4%发酵种子液。控制发酵培养条件为温度30℃、罐压0.02MPa、通气量2L/min、搅拌速度300r/m、培养时间3d。

3）取步骤2）发酵后所得的混合物以6000r/m打浆15min、以10000r/m匀浆10min、8000r/m离心30min，取上清液。

实施例10 制备本发明蛹虫草多糖组合物

1）将蛹虫草GIM5.269接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，于30℃培养120h，转接2次；无菌水洗涤斜面得孢子悬液，接入马铃薯葡萄糖培养基，于25℃以200r/m振荡培养6d得发酵种子液。

2）配制发酵培养基：取重量比3%豆粕与3%玉米粉混合，加入0.5%胡萝卜汁、0.05%K₂HPO₄和0.05%MgSO₄，以质量体积比1:7加水搅拌。在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，罐内121℃灭菌15min，流水冷却至30℃加入体积比3%发酵种子液。控制发酵培养条件为温度20℃、罐压0.06MPa、通气量1L/min、搅拌速度200r/m、培养时间7d。

3）取步骤2）发酵后所得混合物以7000r/m打浆5min、以12000r/m匀浆15min、8000r/m离心20min，取上清液。

实施例11 制备本发明蛹虫草多糖组合物

1）将蛹虫草GIM5.269接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，于35℃培养144h，转接2次；无菌水洗涤斜面得孢子悬液，接入马铃薯葡萄糖培养基，于30℃以300r/m振荡培养7d得发酵种子液。

2）配制发酵培养基：取重量比5%豆粕与1%玉米粉混合，加入0.1%胡萝卜汁、0.01%K₂HPO₄和0.01%MgSO₄，以质量体积比1:5加水搅拌。在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，罐内121℃灭菌20min，流水冷却至25℃加入体积比2%发酵种子液。控制发酵培养条件为温度35℃、罐压0.08MPa、通气量0.2L/min、搅拌速度100r/m、培养时间5d。

3）取步骤2）发酵后所得混合物以7500r/m打浆10min、以11000匀浆12min、8000r/m离心10min，取上清液。

实施例12-14 用传统提取工艺提取蛹虫草多糖混合物

按照与实施例9-11类似的制备方法与条件制备蛹虫草多糖混合物，其中发酵培养基为：（实施例12）按重量体积比取蔗糖12%、玉米浆1.8%、酵母膏2%、硝酸钾0.45%，加水制成；（实施例13）按重量体积比取蔗糖12%、玉米浆2%、酵母膏1.8%、硝酸钾0.45%，加水制成；（实施例14）按重量体积比取蔗糖11%、玉米浆2.5%、酵母膏2%、硝酸钾0.45%，加水制成。

实施例15 本发明方法所得蛹虫草多糖组合物与传统方法所得蛹虫草多糖混合物的多糖含量比较

采用常规硫酸-苯酚法检测实施例9-14中蛹虫草多糖的含量。结果显示于表1中。

表1 本发明方法与传统方法性能比较

提取方法	多糖得率（g/100mL）	工艺简便性
			本法	2.1±0.41	简略
传统法	1.5±0.39	繁琐

可见，与传统方法相比较，本发明方法的多糖得率具有显著的提高，并且工艺简便省时。

实施例16 本发明蛹虫草多糖组合物对对虾免疫性状的影响

取实施例9-11所得的蛹虫草多糖组合物，将其分别制备成高（2.0g/100mL）、中（1.0g/100mL）、低（0.5g/100mL）三个浓度作为试验浓度。

将对虾分为4组：对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。对照组的对虾在正常的海水中饲养，其余组的对虾分别用低、中、高剂量的蛹虫草多糖组合物饲喂。连续饲养或饲喂10d，每天取对虾血清，检测其中的酚氧化酶活力。结果示于表2中。

表2 蛹虫草多糖组合物对养殖对虾血液酚氧化酶活力的影响

注：（1）同一行中数据有不同大写字母者表示在P<0.05水平上差异显著；

（2）同一列中数据有不同小写字母者表示在P<0.05水平上差异显著。

可见，以0.5g/100mL的蛹虫草多糖组合物饲喂对虾时，连续饲喂7d后，对虾血清中的酚氧化酶活力显著提升。当以2.0g/100mL的蛹虫草多糖组合物饲喂对虾时，连续饲喂5d后，可观察到对虾血清中的酚氧化酶活力显著提升。因此，本发明的蛹虫草多糖组合物能够提升对虾的酚氧化酶活力，从而提高其免疫性状，增强自身抗病力。

以上描述的实施例仅为本发明的优选实施方式，并非对本发明的限制。所有以基本相同的手段实现本发明目的的技术方案都落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种蛹虫草多糖组合物，其制备方法包括如下步骤：

3）将步骤2）发酵后所得混合物进行打浆、匀浆、离心取清液，得到蛹虫草多糖组合物，

其中，步骤3）中，混合物以5000-8000r/m打浆5-15min、以10000-12000r/m匀浆10-15min，以6000～10000r/m离心10～30min。

2.一种蛹虫草多糖组合物的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的蛹虫草多糖组合物的生产方法，其特征在于：步骤2）所用发酵培养基的制备方法为：将重量比1～5%豆粕、1～5%玉米粉、0.1～1%胡萝卜汁、0.01～0.1%K₂HPO₄、0.01～0.1%MgSO₄混合后，以质量体积比1∶（5～10）加水搅拌。

4.根据权利要求2所述的蛹虫草多糖组合物的生产方法，其特征在于：步骤2）中，发酵在罐压0.02～0.08MPa、通气量为0.2～2L/min以及搅拌速度为100～300r/m下进行。

5.根据权利要求2所述的蛹虫草多糖组合物的生产方法，其特征在于：所述蛹虫草菌株为蛹虫草GIM5.269。

6.根据权利要求2所述的蛹虫草多糖组合物的生产方法，其特征在于：步骤1）中，活化方法为：将蛹虫草菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，于25～35℃培养96～144h，转接2次。

7.根据权利要求2所述的蛹虫草多糖组合物的生产方法，其特征在于：步骤1）中，种子液制备方法为：将活化后的斜面菌种以无菌水洗涤，得孢子悬液，然后将孢子悬液接入马铃薯葡萄糖液体培养基，于20～30℃下以100～300r/m振荡培养5～7d得种子液。

8.权利要求1的蛹虫草多糖组合物在制备提升对虾免疫性状的饲料或药物中的用途，该组合物能增强高密度养殖环境下对虾的自身抗病力。

9.根据权利要求8所述的蛹虫草多糖组合物在制备提升对虾免疫性状的饲料或药物中的用途，其特征在于，所述蛹虫草多糖组合物作为饵料添加剂加入到基础饵料中，其中蛹虫草多糖在整体饲养液中的浓度大于等于0.5g/100mL，连续饲喂7d或以上。