CN116496330B - 一种唾液酸的提取方法及其提取的唾液酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种唾液酸的提取方法，属于唾液酸制备技术领域，所述方法包括以下步骤：将唾液酸发酵液去除菌体后，加入硫酸镁获得沉淀，将所述沉淀溶解后，依次经过阳离子交换、浓缩、结晶和脱色后得到唾液酸。本发明方法不仅在生产过程中可以实现所有试剂循环、省去活性炭脱色步骤，达到降低生产成本，简化工艺流程的效果，同时可以提高唾液酸收率，收率可达到98%以上，提高唾液酸纯度，纯度可达到99%以上。
Description
技术领域
本发明属于唾液酸制备技术领域，尤其涉及一种唾液酸的提取方法及其提取的唾液酸。
背景技术
唾液酸是9-碳单糖的衍生物，学名为N-乙酰基神经氨酸，是一种天然存在的碳水化合物，唾液酸在大脑和神经系统的产生和发育中发挥非常重要的作用。唾液酸的生产方法主要包括以下几类：化学合成法、酶法合成、天然产物提取、微生物发酵法。微生物发酵法的优势在于原料廉价，反应条件温和，易于放大生产，从而可以大量生产聚唾液酸，聚唾液酸经过水解后分解为唾液酸，再经过进一步的分离纯化后得到唾液酸成品。
然而微生物发酵法生产唾液酸在后处理过程中由于菌体在发酵过程中释放出大量的蛋白质等杂质，会使得后处理工艺较为复杂，生产的综合成本大幅度提高，目前常规提取方法是利用阴离子交换树脂对唾液酸进行吸附，再选用合适的洗脱剂将唾液酸洗脱，浓缩后进行结晶，此方法对树脂要求较高，树脂一般吸附量较小，且容易黏附在树脂上造成唾液酸收率低，而且后期树脂活化产生的污水较难处理。
为此，能够提供一种工艺简单、收率高的唾液酸的提取方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种唾液酸的提取方法，所述方法简单，提高了唾液酸收率，收率可达到98%以上，提高唾液酸纯度，纯度可达到99%以上。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种唾液酸的提取方法，所述方法包括以下步骤：
将唾液酸发酵液去除菌体后，加入硫酸镁获得沉淀，将所述沉淀溶解后，依次经过阳离子交换、浓缩、结晶和脱色后得到唾液酸。
本发明使用沉淀法提取唾液酸，其原理是通过对唾液酸镁Ksp进行计算，其Ksp值为6.37×10-9，由唾液酸镁的Ksp值可以看出唾液酸与镁离子可以形成沉淀，而氢氧化镁Ksp值为1.8×10-11，氢氧化镁Ksp值远小于唾液酸镁，因此可以用氢氧化钠溶液将镁离子置换出来，此方法可以减少树脂使用，减少用水量，降低成本。
优选的，所述去除菌体采用陶瓷膜，所述陶瓷膜的孔径为20-100nm。
本发明采用陶瓷膜除菌体较离心等方法除菌体能耗低，除菌体效果更好。
优选的，所述硫酸镁的加入量为至发酵液pH维持在6-7。
本发明采用镁离子可以与唾液酸形成沉淀，pH为7可以沉淀完全。
优选的，所述沉淀通过离心的方式获得，转速为4000-12000rpm。
沉淀使用离心法可以更容易收集，因有较小的沉淀颗粒，离心法可以比过滤法更有效收集沉淀。
优选的，所述溶解采用强碱。
优选的，所述溶解采用氢氧化钠。
氢氧化钠为强碱可以达到唾液酸置换的pH值，并且氢氧化钠价格较低。
优选的，所述氢氧化钠的加入量为溶解液pH维持在8-12。
本发明因氢氧化镁ksp值远小于唾液酸镁，可以将唾液酸镁沉淀中的镁离子置换出来，所以采用氢氧化钠进行置换。
优选的，所述离子交换采用阳离子交换树脂。
由于唾液酸溶解性远小于唾液酸盐，本发明采用阳离子交换后唾液酸盐还原为唾液酸，更容易结晶。
优选的，所述阳离子交换树脂使用后用清水进行冲洗，回收树脂上的唾液酸，然后用硫酸对树脂进行再生。
优选的，所述冲洗至洗水电导率为30-100us/cm。
优选的，所述硫酸浓度为1-10%。
优选的，所述浓缩至唾液酸浓度130-170g/L。
纯唾液酸溶液饱和溶解度大约在100g/L（25℃），当浓缩浓度太低，晶体结晶率较低，浓缩浓度过高料液比较粘稠，收率降低。
优选的，所述结晶采用乙酸。
本发明采用乙酸可以降低唾液酸溶解度，且乙酸容易回收。
优选的，所述乙酸的加入量为浓缩液体积的1-5倍。
由于乙酸加量会影响唾液酸溶解度，直接影响结晶收率，所以本发明采用加入浓缩液体积的1-5倍。
优选的，所述脱色采用乙醇和/或异丙醇。
由于发酵液中含有大量醇溶性色素，使用常规活性炭脱色不能脱除，所以本发明使用有机溶剂可以有效脱除。
优选的，所述乙醇和异丙醇的体积比为1-5：5-9。
唾液酸在乙醇中溶解度较大，可达到15g/L（25℃）左右，唾液酸在异丙醇中溶解度较低，但异丙醇溶解色素能力较差，造成脱色效果不好，因此将两种有机溶剂混合进行脱色处理，效果较好。
优选的，所述沉淀溶解后产生的氢氧化镁沉淀加入硫酸溶解，控制pH为6-7。
如上述所述的提取方法制备得到的唾液酸。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种唾液酸的提取方法，所述方法不仅在生产过程中可以实现所有试剂循环、省去活性炭脱色步骤，达到降低生产成本，简化工艺流程的效果，同时可以提高唾液酸收率，收率可达到98%以上，提高唾液酸纯度，纯度可达到99%以上。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种唾液酸的提取方法，具体步骤如下：
（1）将唾液酸发酵液过陶瓷膜除菌体，陶瓷膜孔径为20-100nm，然后加入硫酸镁将唾液酸进行沉淀，控制pH为6-7，将沉淀离心进行分离，转速为4000-12000r/min；分离后沉淀加入氢氧化钠溶液进行溶解，控制pH为8-12，形成氢氧化镁沉淀后进行过滤，将唾液酸钠溶液过阳离子交换树脂，用清水进行冲洗，冲洗至洗水电导率为30-100us/cm，回收树脂上的唾液酸，出料进行浓缩，浓缩至100-170g/L，浓缩后加入1-5倍体积乙酸结晶，晶体用异丙醇、乙醇或两者比例混合液进行脱色除杂，即得到唾液酸产品；
（2）过滤出的氢氧化镁沉淀加入硫酸溶解，控制pH为6-7，将硫酸镁进行回收；
（3）阳离子交换树脂使用后用浓度为1-10%的硫酸对树脂进行再生。
唾液酸镁Ksp值测定实验
取0.6180g唾液酸，加入少量水溶解，得到唾液酸溶液，再取0.2460g七水硫酸镁，加水溶解后与唾液酸溶液混合，混合后定容到100mL；
液相检测条件：Waters2414示差检测器，BIO RAD Aminex HPX-87H色谱柱，流动相为5mM/L硫酸溶液，柱温60℃，流速0.5mL/min；
Ksp值计算公式为C2 SA - *CMg 2+/CMg(SA) 2，由公式可以计算出唾液酸镁Ksp值为6.3683×10-9。
实施例1
唾液酸沉淀实验：
其中，发酵液唾液酸含量为30g/L（为枯草芽孢杆菌工程菌以葡萄糖为底物发酵所得）；
发酵液制备方法如下：
种子制备：将活化后的产唾液酸的枯草芽孢杆菌（江南大学购得）单菌落接种到LB液体培养基中(装液量30/150ml)，37℃、200rpm摇床振荡培养14h，OD600nm=7.580，其中，所述LB液体培养基的配比为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调节PH＝7.0；
接种、发酵：将初始料和种子接入发酵罐，接种量为1%，控制发酵条件为溶氧10-25%，葡萄糖控制在5-8g/L，pH控制为7.0（15%氨水调pH），初始料培养基配比为：酵母粉12g/L，蛋白胨6g/L，三水磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾3g/L，微量元素10mL/L（微量元素配方：七水硫酸亚铁5g/L、五水硫酸锰3g/L、七水硫酸锌0.3g/L），消泡剂（聚醚类消泡剂）0.15mL/L；唾液酸不再增长后下罐（唾液酸含量为28-35g/L之间）；
将发酵液过50nm陶瓷膜进行除菌体，加入硫酸镁，边加边搅拌，监测过程中pH变化，分别调至pH为5、6、7，离心出沉淀，分别测定清液中唾液酸含量及沉淀质量，结果如表1，
表1 唾液酸含量及沉淀质量
由上表数据可知，pH7时唾液酸可以完全沉淀。
唾液酸镁沉淀溶解实验：
称取10g唾液酸镁沉淀，以5%氢氧化钠溶液调pH分别为9、10、11，分离出氢氧化镁沉淀，测定清液中唾液酸含量，结果如下表2，
表2 唾液酸含量
由上表数据可知，pH11时唾液酸置换量最大，pH12与其相近，但会加大氢氧化钠使用量。
最适结晶浓度实验：
将唾液酸钠溶液过S1160阳离子交换树脂后，用清水进行冲洗，冲洗至洗水电导率为30-100us/cm，回收树脂上的唾液酸料液进行浓缩，分别浓缩至120、130、140、150、160、170g/L，加入3倍体积乙酸结晶，使用体积比为2：8（乙醇：异丙醇）的有机溶剂就进行洗涤脱色，55℃烘干12h以上计算晶体收率，结果如下表3：
表3 晶体收率
由上表数据可知，150g/L浓度结晶最适宜，浓度太大容易造成堵塞，后期不好处理。
唾液酸洗涤脱色有机溶剂比例实验
上述将浓缩至150g/L浓度，采用3倍体积乙酸结晶的晶体过滤后，使用等量的体积比（乙醇：异丙醇）分别为1：9、2：8、3：7、4：6、5：5的洗涤液进行清洗，洗涤后晶体55℃烘干12h以上计算晶体收率，测定晶体白度，结果如下表4：
表4 晶体收率
由上表数据可知，最适的洗涤剂比例为2：8，使用此浓度洗涤剂脱色效果较好，且纯度、白度较高。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (3)
1.一种N-乙酰基神经氨酸的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将N-乙酰基神经氨酸发酵液去除菌体后，加入硫酸镁获得沉淀，将所述沉淀溶解后，依次经过阳离子交换、浓缩、结晶和脱色后得到N-乙酰基神经氨酸；
其中，所述硫酸镁的加入量为至所述发酵液pH维持在6-7；
所述沉淀通过离心的方式获得，转速为4000-12000rpm；
所述溶解采用氢氧化钠，所述氢氧化钠的加入量为溶解液pH维持在8-12；
所述阳离子交换采用阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂洗脱采用清水冲洗，冲洗至洗水电导率为30-100us/cm即可；
所述结晶采用乙酸；
所述脱色采用乙醇和/或异丙醇。
2.根据权利要求1所述的一种N-乙酰基神经氨酸的提取方法，其特征在于，所述去除菌体采用陶瓷膜，所述陶瓷膜的孔径为20-100nm。
3.根据权利要求1所述的一种N-乙酰基神经氨酸的提取方法，其特征在于，所述浓缩为至N-乙酰基神经氨酸浓度130-170g/L。
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