CN111386350A - 从发酵液中纯化唾液酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明记载了从发酵液中分离唾液酸的有效方式。发酵液中包含的唾液酸是通过细菌发酵产生的。本发明的方法包括从发酵液中除去生物质的步骤，对所得溶液进行阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理中的至少一种处理的步骤，以及在离子交换剂处理后除去盐的步骤。该方法可以提供喷雾干燥形式以及唾液酸晶体形式的唾液酸。

Description

从发酵液中纯化唾液酸的方法

本发明描述了从发酵液中分离唾液酸的有效方法。发酵液中包含的唾液酸是通过细菌发酵产生的。本发明的方法包括从发酵液中除去生物质的步骤，对所得溶液进行阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理中的至少一种的步骤，以及在离子交换剂处理后除去盐的步骤。该方法可以提供喷雾干燥形式以及唾液酸晶体形式的唾液酸。

唾液酸是神经氨酸的N-或O-取代的衍生物的通称，神经氨酸是一种具有九个碳的主链并具有羧酸功能的单糖。羧酸基团可以在适当的pH下为糖赋予负电荷。所有已知的唾液酸结构都衍生自四个主要核心结构(a)2-酮基-3-脱氧壬酸(Kdn)、(b)神经氨酸(Neu)、(c)N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和(d)N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，可能在C-4、C-7、C-8和C-9的羟基处具有取代(O-乙酰基、O-甲基、O-硫酸盐、O-乳酸基或磷酸基)。内酯可以出现在Neu的C-2与C-7、C-4或C-8氨基之间，或者内酰胺可以出现在C-2和C-5氨基之间。另外，还已知天然存在的脱氢唾液酸，如2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(Neu2en5Ac，也称为DANA)。诸如DANA的脱氢唾液酸可具有对唾液酸酶的抑制特性，因此具有对某些病毒(例如流感病毒)的潜在抑制特性。

唾液酸通常以α-糖苷的形式存在，它占据了糖缀合物(例如糖脂和糖蛋白)中杂低聚糖的非还原性末端，并在结构和功能上提供了聚糖多样性的极端例子。唾液酸家族由九个碳的神经氨酸的40多种衍生物组成，包括N-和O-取代的衍生物。所述家族成员的结构特征是特有的，这是由于在第5位的氨基和在第1位的羧基，其在生理条件下使所有唾液酸成为带有负电荷的强有机酸。

唾液酸作为脊椎动物和高等无脊椎动物的细胞表面糖缀合物(糖蛋白和糖脂)中存在的聚糖的末端糖类而存在。唾液酸也是致病性细菌的脂多糖和荚膜多糖的组分，包括大肠杆菌(Escherichia coli)K1、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。在哺乳动物中，唾液酸被发现主要是作为细胞表面上的糖缀合物的末端残基。Neu的两种衍生物是在哺乳动物细胞上发现的最常见的唾液酸结构：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)及其羟基化衍生物、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在哺乳动物中，人类是已知的例外，他们缺乏Neu5Gc，这是由于羟化酶(其将CMP-Neu5Ac修饰为CMP-Neu5Gc)的失活突变。

在自然界中没有发现未取代形式的神经氨酸，最广泛发现的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(也缩写为“Neu5Ac”或“NANA”)。Neu5Ac是氨基的N-原子被乙酰化的唾液酸。在文献中，术语“唾液酸”有时被用作特定唾液酸Neu5Ac的同义词，但在下文中，术语“唾液酸”应被理解为所有唾液酸的家族，而Neu5Ac应被理解为所述家族的特定成员，即N-乙酰神经氨酸。

Neu5Ac通过充当微生物、病毒、毒素和激素的受体来执行各种生物学功能。Neu5Ac是对细胞间的相互作用来说重要的氨基糖的特征性组分。

另一个重要的自然存在的变异是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，它是通过用羟基取代乙酰基的甲基部分中的一个氢原子而形成的。Neu5Gc存在于大量动物物种中，特别是在猪组织中，但是除了在患有特定类型癌症的个体中，尚未在人类组织中检测到。

此外，Neu5Ac用于保护蛋白质免受蛋白酶降解。由于存在于神经细胞的膜中的神经节苷脂中的Neu5Ac的浓度很高，因此Neu5Ac在神经元发育以及神经系统的功能中起着重要作用。另外，已知许多病毒病原体，例如人类流感病毒或禽流感病毒，在人类有机体的感染中利用唾液酸化的化合物。Neu5Ac、包含Neu5Ac的化合物和衍生自Neu5Ac的化合物已经用于抗病毒感染的活性物质中。进一步的研究集中在这些化合物用于确保最佳的神经元发育或预防退行性脑疾病的用途上。

细胞表面分子的Neu5Ac修饰在许多生物学现象中起作用，例如蛋白质结构稳定性、细胞粘附的调节和信号转导。Neu5Ac缺乏症，例如GNE肌病，其也被称为遗传性包涵体肌病(HIBM)、有边缘液泡的远端肌病(DMRV)或Nonaka肌病，是由于唾液酸产生减少而引起的临床疾病。Neu5Ac的产生是突变导致该疾病的关键原因。从理论上讲，在该途径中的遗传阻断后替换代谢物可以缓解Neu5Ac缺乏症的症状。(Jay et al.,Gene Reg.和Sys.,2009Biology 3:181-190)。然而，在体内Neu5Ac生物合成途径中给予一种或多种化合物是一项重大挑战。这些化合物具有超快的清除率，并在其可被代谢之前在尿液中排出。

在人体内，可以发现大脑中Neu5Ac的浓度最高，其中Neu5Ac作为神经节苷脂结构的主要部分参与突触形成和神经传递(Wang et al.,Eur J Clin Nutr.2003Nov；57(ll):1351-69)。特别是在生命的第一年，Neu5Ac似乎在大脑发育中起着重要作用。婴儿大脑的快速生长对饮食的营养供应提出了异常高的需求，特别是对于早产儿来说。Neu5Ac是大脑神经节苷脂和多聚唾液酸(polySia)链的基本组分，它们修饰神经细胞粘附分子(NCAM)。人乳中的唾液酸水平很高，主要是特定唾液酸Neu5Ac的水平。相反，婴儿配方物含有低水平的Neu5Ac和Neu5Gc(Wang,Annu Rev Nutr.2009；29:177-222)。因此，Neu5Ac显示出用于婴儿配方物以支持婴儿大脑发育的巨大潜力。

唾液酸在许多生理和病理生理过程中起着重要作用，包括胚胎神经系统的发育、转移、免疫应答的调节以及细菌或病毒的感染。唾液酸是大脑神经节苷脂和多聚唾液酸链的基本组分，它们修饰神经细胞粘附分子(NCAM)，促进细胞间相互作用、神经元向外生长、突触连接性的修饰和记忆形成。在仔猪中，富含唾液酸的饮食增加大脑唾液酸的水平，并增加两个学习相关基因的表达。因此，所述饮食还增强学习和记忆力。

婴儿，特别是早产儿，由于在这个发育阶段脑的快速生长和他们的免疫系统的发育，对包括唾液酸的营养物质有很高的需求。母乳中也存在高水平的唾液酸，尤其是Neu5Ac(约0.5g/L)。相比之下，迄今为止的婴儿配方物均包含很少量或者甚至可以忽略量的Neu5Ac。除游离的Neu5Ac外，人乳还含有多种酸性即唾液酸化的低聚糖，其属于人乳低聚糖(HMOs)家族(Urashima T.et al.,(2011)Nutrition and diet research progress:Milkoligosaccharides,Nova Sciences Publishers Inc,New York,ISBN-978-1-61122-831-1)，最值得注意的是3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖和乳-N-四糖(LNT)的唾液酸化衍生物，例如LST-a、LST-b、LST-c和二唾液酸化-LNT。虽然来自某些哺乳动物如啮齿动物的乳尤其富含唾液酸化的乳低聚糖，但人乳尤其富含中性低聚糖，例如2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-岩藻戊糖I。

在药物开发中很重要的另一个方面是，活性物质应具有稳定的可能的晶体形态，以用于药品质量药物制剂。药学领域的技术人员理解，活性药物成分的结晶为控制重要的物理化学性质(例如稳定性、溶解度、生物利用度、粒度、堆积密度、流动性质、多态含量和其他性质)提供了最佳方法。因此，需要唾液酸如Neu5Ac的结晶形式，以及生产这些形式的方法。这些结晶形式应适合于制药用途。

Neu5Ac衍生物的另一个用途是用作神经氨酸酶抑制剂来治疗病毒感染，例如流感。例如，Neu5Ac是合成扎那米韦的潜在原料，扎那米韦可用于预防和治疗甲型流感和乙型流感的感染，例如禽流感病毒H5N1(Kawei et al.,Clin Infect Dis 2009,48:996-997)。此外，Neu5Ac具有广泛的医学应用，例如抗癌、抗粘附和抗炎活性(Varki et al.,LabInvest 2007,87:851-857)。

Neu5Ac的高成本是由于其不足的可得性和供应。有几种制备Neu5Ac的策略。传统上，Neu5Ac提取自如卵黄、乳清和可食用鸟巢的天然物质。但是，天然来源中的Neu5Ac含量相对较低，因此分离和纯化过程相对复杂、耗时且繁琐，尤其是考虑到复杂的纯化过程、不纯的原料和低的收率(Tao et al.,Appl Microbiol Biotechnol 2010,87:1281-1289)。因此，对于大规模生产Neu5Ac而言，常规方法不具成本效益。

如前所述，Neu5Ac可以从可食用鸟巢中分离。可食用鸟巢是Neu5Ac含量最高的天然来源。可食用鸟巢中Neu5Ac的含量高达100g/kg，而卵黄中为2g/kg(Koketsu et al.,Glycoconj J.1992Apr；9(2):70-4.)。在大多数情况下，Neu5Ac并未被完全纯化，而仅被强化。然后该产品以鸟巢提取物形式出售。这种鸟巢提取物仅含有1.5％的唾液酸(鸟巢提取物，ORYZA OIL&FAT CHEMICAL CO.,LTD)。

CN 104072533 A公开了一种从鸟巢中分离Neu5Ac的方法。将该材料用水孵育，加热至最高121℃，然后冷冻干燥。通过添加乙醇从如此处理的巢中除去Neu5Ac。过滤乙醇以除去不溶物，并与乙酸乙酯一起孵育以沉淀Neu5Ac。这得到纯度为约79％的Neu5Ac，纯化产率为55至60％。

Neu5Ac的工业生产的一种可能方法是化学合成。例如，可以在碱性条件下将N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)和草酰乙酸酯缩合，然后脱羧(记载于Cornforth et al.,Biochem J195868:57-61)。另一种方法是由D-甘露糖和非糖前体如1,2-顺-二氢-邻苯二酚通过不对称合成制备(Danishefsky et al.,J Am Soc 1988,110:3929-3940)。但是，在大多数情况下，Neu5Ac的化学合成包含或需要进行繁琐重复的按次序的保护和脱保护步骤，并且可能导致形成许多反应中间体和异构体。这些事实可能导致高度复杂、困难和高成本的分离过程。

Neu5Ac的工业生产的第三种选择是通过生物催化过程进行的生产。所述生物催化方法包括酶催化、全细胞生物催化和发酵。生物催化和发酵方法已成为生产不同物质的重要工具。这些技术用于大规模生产或合成大量化学品、农用化学品中间体、活性药物和食品成分。生物催化和发酵提供了不同物质的容易而低成本生产的可能性。大多数方法采用在温和条件下进行的环保操作。

为了生产Neu5Ac，描述了两种不同的可用于生物催化的或基于酶的生产的酶。这些酶是Neu5Ac合酶(EC 4.1.3.19)和Neu5Ac醛缩酶(NAL，先前称为Neu5Ac裂合酶，EC4.1.3.3)。Neu5Ac醛缩酶比Neu5Ac合酶更优选，因为它的底物丙酮酸比Neu5Ac合酶的底物磷酸烯醇丙酮酸更容易获得(Tao et al.,Appl Microbiol Biotechnol 2010,87:1281-1289)。NAL在1960年首次用于Neu5Ac生产，以N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸为原料(Comb et al.,J Biol Chem 160235:2529-2537)。用这种方法大规模生产Neu5Ac的一个关键点是N-乙酰基-D-甘露糖胺的成本非常高。此外，迄今为止尚无法大量获得N-乙酰基-D-甘露糖胺。

DE 3937891 A1公开了通过生物催化方法生产Neu5Ac，该过程可以转移到更大的规模。由N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)催化的N-乙酰葡糖胺异构化为N-乙酰甘露糖胺，以及随后在存在N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂合酶(EC4.1.3.3)和丙酮酸的情况下合成Neu5Ac的反应可以在生物反应器中成功进行。

WO 94/29476 A1公开了一种从N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG，GlcNAc)制备N-乙酰基-D-神经氨酸的体外方法。在制备中，通过碱催化的差向异构化将NAG转化为N-乙酰基-D-甘露糖胺(NAM，ManNAc)。随后，NAM在由Neu5Ac-醛缩酶催化的反应中与丙酮酸反应，生成Neu5Ac。Neu5Ac-醛缩酶由表达所述Neu5Ac-醛缩酶的重组大肠杆菌细胞制备。通过将

小珠与所述重组大肠杆菌细胞的粗提取物混合来固定所述醛缩酶。通过将所述固定的酶珠添加到NAM和丙酮酸的混合物中开始NAM向Neu5Ac的转化。从反应混合物中获得Neu5Ac，其中通过过滤除去酶，并将滤液与冰乙酸和少量种子混合，以获得“湿饼”。对湿饼进行丙酮去溶剂化或菱形结晶。

EP 0578825 A1公开了一种通过在碱性条件下用N-乙酰神经氨酸裂合酶处理N-乙酰葡糖胺和丙酮酸的混合物来生产Neu5Ac的体外方法。通过使用Dowex 1(Dow ChemicalCompany)的离子交换柱色谱法分离反应产物，并通过结晶浓缩分离物。

为了避免将N-乙酰基-D-甘露糖胺用于反应混合物，已知一种酶促方法，其中将N-乙酰基-D-葡糖胺用作底物。在第一步中，通过N-酰基-D-葡糖胺-2-差向异构酶将N-乙酰基-D-葡糖胺转化为N-乙酰基-D-甘露糖胺，转化率为77％。在第二步中，将如此产生的N-乙酰基-D-甘露糖胺和丙酮酸用作N-乙酰神经氨酸裂合酶的底物以产生Neu5Ac(Maru etal.,Carbohydrate Research,1998；306:575-578)。通过这种方法，可以由27kg的N-乙酰基-D-葡糖胺生产29kg的Neu5Ac。通过直接结晶回收产生的Neu5Ac。将该溶液加热5min至80℃以沉淀出所含的酶。通过过滤除去不溶部分。为了从反应混合物中回收Neu5Ac，将5体积的冰乙酸加入到所述溶液中。结晶后，通过过滤回收Neu5Ac，并用乙醇洗涤以除去残留的乙酸。将材料在40℃下干燥直至获得恒重。使用高效液相色谱法(HPLC)和红外(IR)光谱法，由此生产和分离出的Neu5Ac与天然的Neu5Ac没有区别。

还可从另一种用于大规模生产的方法中获知这种生产Neu5Ac的方法。在所述方法中，使用获自大肠杆菌K12衍生物的修饰菌株的醛缩酶制剂[N-乙酰神经氨酸裂合酶；CAS：9027-60-5；E.C.：4.1.3.3.醛缩酶]合成Neu5Ac。该酶催化N-乙酰基甘露糖胺和丙酮酸钠的偶联以产生N-乙酰基神经氨酸。(Gras Notice 602,GRAS Exemption Claim for/V-Acetyl-D-neuraminic acid(NANA),Glycom A/S)。然后，将以这种方式生产的Neu5Ac分几个步骤进行纯化。第一步是通过过滤从催化生产步骤中除去蛋白质。过滤后，通过结晶从反应混合物中除去无水Neu5Ac。在第一结晶步骤之后，再次溶解该材料，用炭处理以除去颜色和杂质，并再次结晶以接收结晶二水合物形式的Neu5Ac。然而，唾液酸的生物催化生产仅在数百千克规模上是技术可行的，而不是提供应用于食品(例如婴儿和幼儿营养产品)的数吨规模的唾液酸(例如Neu5Ac)的现实选择。在婴儿营养产品中包含自然浓度为约0.5g/l的Neu5Ac将需要每1千克婴儿食品配方物中约3.75g Neu5Ac的量。因此，即使对于“小的”婴儿食品配方物产品，也需要数吨的材料。另外，唾液酸的生物催化生产对于当今的食品应用而言太过昂贵。

除了体外生物催化生产方法外，还可以在微生物的帮助下通过体内发酵生产Neu5Ac。在这种情况下，所使用的酶将在微生物体内产生，但不会如上所述被分离。相反，将整个细胞用作反应杯，在细胞内部产生Neu5Ac，并且在生产过程中，Neu5Ac分泌到周围的培养基中。发酵后，从培养液中分离Neu5Ac。为了生产Neu5Ac，在文献中特别描述了诸如大肠杆菌和酵母的细菌。

EP 1484406 A1描述了使用微生物生产Neu5Ac的方法，该微生物具有生产Neu5Ac的能力，但与野生型菌株相比具有有限的分解Neu5Ac的能力或没有分解Neu5Ac的能力，使得Neu5Ac积累在培养基中并且可以从中回收。为了能够进行Neu5Ac生产，该微生物具有强的N-乙酰神经氨酸合酶活性和/或N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性。

CN 106929461 A公开了一种使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞生产Neu5Ac的方法，该细胞表达编码葡糖胺-果糖-6-磷酸转氨酶、葡糖胺-6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的基因。所述细胞的ptsG基因已缺失，该基因编码磷酸转移酶系统EIICBA的葡萄糖特异性组分。通过在含葡萄糖的培养基中培养这些细胞获得0.66g·L^-1Neu5Ac的产量。

Zhu,D.及其同事(Zhu,D.et al.(2017)Biotechnol.Lett.39:227-234)报告说，在大肠杆菌中使用高拷贝数共表达载体过表达PEP合成相关基因pck和ppsA增强Neu5Ac生产。更具体地，对大肠杆菌细胞进行随机诱变，并用编码N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶的表达质粒转化在含葡萄糖的培养基上有利地生长但在含Neu5Ac的培养基上显示有限生长或无生长的细胞系。培养一段时间后，通过离心沉淀细胞，将其作为所谓的“湿细胞”储存在-20℃下，并在解冻后根据需要使用。为了生产Neu5Ac，提供了反应混合物(30mL)，其包含90g·L^-1N-乙酰葡糖胺、50g·L^-1葡萄糖、10mL·L^-1二甲苯和200g·L^-1所述湿细胞(通过存在4g·L^-1洗涤剂而被透化)。体外反应完成后，通过HPLC评估Neu5Ac的形成。

US 2003/0109007 A1公开了通过利用经透化的微生物生产Neu5Ac的方法。该方法包括制备包含以下物质的混合物：(i)具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物培养物，或源自所述培养物的处理物；(ii)能够产生丙酮酸的微生物培养物(或源自所述培养物的处理物)，或能够产生磷酸烯醇丙酮酸的微生物培养物(或源自所述培养物的处理物)；(iii)N-乙酰甘露糖胺；和(iv)形成丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸必需的能源。在含有螯合剂或表面活性剂的水性介质中制备混合物，从而允许Neu5Ac在水性介质中形成和积累。使用碳水化合物分析系统对反应产物进行定量。上述方法的缺点是只能进行小规模生产，并且需要过量的丙酮酸才能将反应平衡推向Neu5Ac。此外，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺和磷酸烯醇丙酮酸是这些反应的昂贵底物。

WO 2008/040717 A2公开了一种生产Neu5Ac的方法，其包括在培养基中培养微生物，其中所述微生物携带编码唾液酸合酶(NeuB)和UDP-GIcNAc差向异构酶(NeuC)的异源基因，其中所述微生物缺少编码CMP-Neu5Ac合酶(NeuA)的基因，或其中任何编码CMP-Neu5Ac合酶(NeuA)的基因已失活或缺失，并且其中编码唾液酸醛缩酶(NanA)、编码唾液酸转运蛋白(NanT)且任选地编码ManNAc激酶(NanK)的内源基因已缺失或失活。通过使用冰乙酸进行的沉淀从培养物上清液(2升)中纯化Neu5Ac。

WO 2008/097366 A2涉及产生Neu5Ac的经代谢工程改造的大肠杆菌细胞。在所述细胞中，nanT(唾液酸转运蛋白)和nanA(唾液酸醛缩酶)基因失活，并且在所述nanT-nanA大肠杆菌细胞中使用表达质粒引入和过表达了促进脑膜炎奈瑟球菌B组中Neu5Ac生物合成的neuC和neuB基因。另外，大肠杆菌葡糖胺合酶基因(glmS)与neuB和neuC共过表达。通过离子交换色谱法从培养液中纯化Neu5Ac。

CN 106929461 A涉及提高Neu5Ac生产的枯草芽孢杆菌的经基因工程改造的菌株。通过HPLC确定发酵培养物中Neu5Ac的量。因此，一个目的是提供能够在工业规模上更有效地产生Neu5Ac并且使用廉价的碳源作为唯一碳源的微生物。

WO 2012/083329 A1公开了通过木霉属(Trichoderma)的经基因工程改造的真菌细胞生产Neu5Ac的方法和试剂，所述经基因工程改造的真菌细胞组成性地表达N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶。在存在GlcNAc的情况下培养这种木霉属细胞。通过HPLC-MS分析了这种木霉属菌株的菌丝体中Neu5Ac的存在情况。

EP 0474410 A2公开了一种通过水解脱脂的卵黄来生产Neu5Ac的方法。该方法包括以下步骤：将可通过水解脱脂的卵黄获得的含有Neu5Ac的溶液脱盐，将Neu5Ac吸附到阴离子交换树脂上，然后洗脱Neu5Ac。可以通过使用反渗透膜、电渗析膜或渗析膜来实现脱盐。吸附过程可包括使脱盐的水解产物通过阳离子交换树脂，并使其进一步通过阴离子交换树脂。将最终的洗脱液在减压下干燥以获得固体。

JP 08-119986 A描述了一种用于纯化Neu5Ac或其类似物的方法，该方法包括在存在唾液酸缩醛酶的情况下通过将N-乙酰甘露糖胺与丙酮酸缩合来合成Neu5Ac。使用蒸发器浓缩含有Neu5Ac或其类似物的溶液。将浓缩溶液与含有两个或三个碳原子的有机酸混合。随后，将混合物加热至50℃并使其在4℃下静置以沉淀Neu5Ac的白色晶体。

提供纯化的唾液酸的现有尝试仅涉及小规模的示范，但是迄今为止尚未获得从大规模发酵液中纯化唾液酸至食品级纯度和食品级质量的方法。

本发明的一个目的是提供一种以高纯度大规模(工业规模)纯化唾液酸(例如Neu5Ac)的方法。具体而言，该方法应适合于以食品级质量提供千克至吨规模的唾液酸，并且应适合于以连续方式运行。

该目的是通过以下方式实现：根据权利要求1所述的方法、根据权利要求19所述的组合物、根据权利要求22所述的食品组合物、根据权利要求29所述的液体即食婴儿或幼儿营养产品、根据权利要求30所述的喷雾干燥的婴儿配方产品、根据权利要求31所述的饮食补充剂、根据权利要求32所述的预混合物以及根据权利要求34所述的组合物的用途。从属权利要求说明了有利的实施方案。

根据本发明，提供了一种从发酵液中纯化唾液酸的方法。该方法包括以下步骤：

从包含唾液酸的发酵液中除去生物质，其中提供了澄清溶液，

通过对澄清溶液进行以下处理来提供纯化溶液：

用阳离子交换材料进行的阳离子交换剂处理，其中所述阳离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阳离子交换材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和

用阴离子交换材料进行的阴离子交换剂处理，其中所述阴离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阴离子交换材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和

通过电渗析从纯化溶液中除去盐。

本发明的方法适合于以高纯度(食品级质量)和大规模(每次运行千克到数吨的工业规模，)提供所需的唾液酸。另外，本发明的方法可以非常快速且以廉价的方式进行。因此，它可以非常经济地运行。此外，该方法可以以分批方式或连续方式进行。后者甚至进一步提高了单位时间内可获得的产量(obtainable yield per time)。在该方法结束时，唾液酸的纯度可以为＞80％，优选地＞90％，更优选地＞95％，最优选地至少98％。

所提出的唾液酸的纯化方法也是有利的，因为唾液酸制品中不含源自用于生产所需唾液酸的重组微生物发酵菌株的重组DNA和重组蛋白。

尽管设想了本发明的方法用于从发酵液中纯化特定唾液酸(例如Neu5Ac)，但是所述方法也可以用于纯化通过体外酶促反应(所谓的体外生物催化反应)，或通过使用透化的全细胞生物催化方法产生的特定唾液酸。应当理解，从体外生物催化反应的反应混合物中纯化唾液酸不需要从反应混合物中除去生物质。体外生物催化反应的反应混合物因此对应于澄清的工艺流(process stream)。

定义

根据本发明，术语“纯度”是指化学纯度，并且指定了诸如特定的单个唾液酸的物质未用外来物质稀释或未与外来物质混合的程度。因此，化学纯度是单一物质与副产物/杂质之间关系的指标。化学纯度以百分数(％)表示且使用以下公式计算：

在包含唾液酸的组合物中，唾液酸的纯度可以通过本领域技术人员已知的任何合适方法来确定，例如通过使用HPLC来确定。合适的检测器可以是选自以下的检测器：电化学检测器、折射率(RI)检测器、质谱仪(MS)、二极管阵列检测器(DAD)和NMR检测器。例如，在HPLC中，在同一色谱图中代表特定唾液酸(例如Neu5Ac)的量的峰下面积与代表特定唾液酸的量和不同于该特定唾液酸的化合物的量的峰下面积总和的比率。但是，这意味着可以通过所选的HPLC方法分析所有杂质。否则，必须采取质量平衡方法，即对所需产物(例如Neu5Ac)进行绝对定量。在所述方法中，纯物质用作定量纯度的参照，然后根据从产物(所需产物加所有杂质)获得的干物质来判断纯度。所述质量平衡方法还可以用于根据本发明确定纯度。

根据本发明，术语“唾液酸”是指所有唾液酸的家族成员内的唾液酸。因此，根据本发明，待纯化的唾液酸优选地为神经氨酸的N-或O-取代的衍生物，更优选地为神经氨酸的N-取代的衍生物，甚至更优选地为N-乙酰神经氨酸(2-酮基-5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-丙三醇-D-半乳糖壬酮糖吡喃糖-1-糖酸(2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-1-onic acid)，缩写为“Neu5Ac”或“NANA”)、N-羟乙酰神经氨酸(缩写为“Neu5Gc”)或2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(缩写为“Neu2en5Ac”或“DANA”)。在本发明特别优选的实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(“Neu5Ac”或“NANA”)。

根据本发明，“培养液”是指发酵后包含待纯化的唾液酸的任何液体。术语“培养液”、“发酵液”和“培养基”在本文中用作同义词。培养液包含待纯化的唾液酸以及生物质(例如生物细胞和细胞碎片)、培养基组分、盐和污染物(如其他酸和有色化合物)。在培养液中待纯化的唾液酸的纯度可以＜80％。培养液中包含的生物细胞是在细胞内产生所需的唾液酸(例如Neu5Ac)并将所产生的唾液酸分泌到液体培养基中的生物细胞。生物细胞可以包含经遗传修饰的生物细胞或由其组成，例如经遗传修饰的大肠杆菌细胞。遗传修饰可以包括产生单一(所需的)唾液酸(例如Neu5Ac)(特别是在所述生物细胞的生长阶段)的修饰或由其组成。

如本文所用，术语“生物质”是指在发酵步骤结束时存在于发酵液中的全部生物细胞。生物质包括产生所需的唾液酸(例如Neu5Ac)的微生物的细胞、在发酵步骤中可能已丧失了其产生所需的唾液酸(例如Neu5Ac)的能力的微生物的后代细胞以及在发酵步骤结束时无意中存在于发酵液中的任何其他细胞。因此，将发酵步骤结束时存在于发酵液中的基本上所有生物细胞均从发酵液中分离，以使澄清的发酵液(即工艺流)基本上不含细胞。

术语“工艺流(process stream)”是指包含待纯化的特定唾液酸的任何溶液。

术语“流穿液”是指包含待纯化的唾液酸的溶液，其刚刚通过离子交换剂材料(即阳离子和/或阴离子交换剂材料)，即是在接触固相离子交换剂之后包含唾液酸的流动相。换言之，存在于流穿液中的唾液酸尚未吸附固定相或尚未被固定相吸附。

根据本发明，弱阳离子交换剂材料和强阳离子交换剂材料之间的区别在于，适合于前者的离子交换的化学基团的pKa至少为1(例如pKa为2至5，如羧酸基团的pKa)，而后者的pKa小于1(例如pKa为-4至0，如磺酸基团的pKa)。

产生澄清溶液

可以通过离心和/或过滤从发酵液中除去生物质。

在用于从培养液中除去生物质的合适的离心方法中，获得沉淀(pellet)形式的生物质，获得的上清液作为进行进一步处理的澄清的工艺流。在用于从培养液中除去生物质的合适的过滤方法中，滤液成为澄清的工艺流。用于除去生物质的优选过滤方法是微滤和/或超滤。相比微滤，在超滤中可以除去甚至更小的颗粒。任选地，超滤是错流超滤。

微滤是一种物理分离方法，其中使含颗粒的流体通过介质，所述介质包含含有曲折的通道以保留颗粒的多孔物质(深度过滤)和/或具有特定孔径的膜，所述孔径允许小于所述孔径的颗粒/分子通过(膜过滤或死端过滤)。如本文所用，术语“微滤”是指物理分离方法，其中从发酵液中除去生物细胞(和细胞碎片)，留下(澄清的)工艺流。

超滤是一种形式的膜过滤，与死端微滤没有本质区别。在超滤中，由压力和浓度梯度产生的力通过通过以下方式除去颗粒和大的可溶性分子：使包含这些颗粒和大的可溶性分子的液体通过半透膜，导致所述颗粒和大的可溶性分子被保留在所谓的渗余物中，而水和低分子量溶质(如待纯化的唾液酸)则通过所述膜进入渗透液(滤出液)。用于超滤的膜由其分子量截留值(MWCO)定义，该值描述了可通过膜进入渗透液的可溶性分子的最大分子量。任何无法通过膜的颗粒以及大于MWCO的分子都将保留在渗余物中。超滤可以在其中液体的流动平行于膜表面的错流模式下应用，也可以在其液体的流动垂直于膜表面的死端模式下应用。

用于微滤和/或超滤以从发酵液中除去生物质的合适的滤器的非限制性实例包括

DS MP005 4333，其是包含聚醚砜膜的组件，该组件螺旋缠绕以提供紧凑的设计和更好的性能，用于超滤应用的标称孔径为0.05pm。用于通过微滤除去生物质的合适的膜的孔径可以为至少0.2μm。替代地，可以通过使用MWCO为100至1000KDa，优选地为150kDa至500kDa的膜进行的微滤来进行生物质移除，以除去生物质和额外的细胞碎片，例如较大的蛋白质。例如，FS10-FC FUS1582(Microdyn-Nadir GmbH,Wiesbaden,DE)可以用作替代，其为一种中空纤维超滤组件，其使用MWCO为150,000道尔顿(150kDa)的聚醚砜膜(5m²)。

在额外的和/或替代的实施方案中，通过错流超滤从澄清的工艺流中除去较小的颗粒和大的可溶性分子。在本文中，可以使用MWCO为10kDa的滤器，例如SpiraCel DSUP010(Microdyn-Nadir GmbH,Wiesbaden,DE)对澄清的工艺流进行超滤步骤，所述SpiraCelDSUP010为使用聚醚砜膜(5.7m²)的螺旋缠绕超滤组件，所述聚醚砜膜的MWCO为10,000道尔顿(10kDa)。

总之，在本发明中可以采用以下可能的方式从发酵液中除去生物质：

1)通过离心收集。一步将不溶部分从培养液中除去。优势：快速除去不溶部分；

2)通过微滤收集。一步将不溶部分和一定大小以上的大分子从培养液中除去。螺旋缠绕膜或中空纤维错流滤器可用于微滤。可以使用截留分子量≥500kDa，更优选地≥150KDa的微滤膜。优点：快速除去不溶部分和一定大小以上的大分子；

3)通过超滤收集。一步从培养液中除去不溶部分、一定大小以上的大分子和小分子。螺旋缠绕膜或中空纤维错流滤器可用于超滤。可以使用截留分子量≤100kDa，更优选地≤10KDa的超滤膜。优点：快速除去不溶部分、一定大小以上的大分子和小分子；

4)通过离心结合微滤收集：分两步从培养液中除去不溶部分和一定大小以上的大分子。螺旋缠绕膜或中空纤维错流滤器可用于微滤。可以使用截留分子量≥500kDa，更优选地≥150KDa的微滤膜。优点：快速除去不溶部分和一定大小以上的大分子，而不会阻塞微滤中使用的膜或滤器；

5)通过离心结合超滤收集：分两步从培养液中除去不溶部分、一定大小以上的大分子和小分子。螺旋缠绕膜或中空纤维错流滤器可用于超滤。可以使用截留分子量≤100kDa，更优选地≤10KDa的超滤膜。优点：快速除去不溶部分、一定大小以上的大分子和小分子，而不会堵塞超滤中使用的膜或滤器；

6)通过微滤结合超滤步骤收集：分两步从培养液中除去不溶部分、一定大小以上的大分子和小分子。螺旋缠绕膜或中空纤维错流滤器可用于微滤和/或超滤。可以使用截留分子量≥500kDa，更优选地≥150KDa的微滤膜。可以使用截留分子量≤100kDa，更优选地≤10KDa的超滤膜。优点：最快除去不溶部分、一定大小以上的大分子和小分子，从而降低了堵塞超滤中使用的膜或滤器的风险。

包含唾液酸的澄清的工艺流通常可含有大量不想要的杂质，包括(但不限于)一价离子、二价离子、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、核酸、单糖和/或低聚糖。

优选地在本发明的方法中不存在的步骤

本发明的方法的特征在于该方法不包括色谱分离。优点在于，该方法可以更快、更便宜地进行，因为省去了制备洗脱液并将其用于从固相上洗脱唾液酸的时间和费用。

此外，本发明的方法的特征在于其不包括使用乙醇和/或乙酸乙酯，任选地不包括使用有机溶剂。优点在于可以确保最终产物、最终唾液酸或包含唾液酸的组合物不含乙醇和/或乙酸乙酯，任选地不含任何有机溶剂。另外，该方法变得更便宜且对于工人而言变得更安全。

而且，本发明的方法的特征在于它不包括用包含有机溶剂的溶液从固定相上洗脱唾液酸的步骤。优点在于可以使纯化的唾液酸保持不含任何有机溶剂。另外，该方法变得更便宜且对于工人而言变得更安全。

此外，本发明的方法的特征在于它不包括使用重金属。优点在于可以确保纯化的唾液酸不含重金属。

另外，本发明的方法的特征在于其不包括将发酵液、澄清溶液和/或纯化溶液加热至高于45℃的温度的步骤。优点在于，与采用这种热处理步骤的现有技术方法相比，节省了用于加热各个溶液的能量，这使得该方法更加经济和更加生态。

阳离子交换剂处理

除其他杂质外，可通过本发明的方法的阳离子交换剂处理步骤，即通过对澄清的工艺流进行至少一种阳离子交换处理，从澄清的工艺流中除去阳离子。具体地，在将澄清的工艺流施加到阳离子交换剂处理步骤之前，将阳离子交换成结合到阳离子交换剂材料(固定相)上的其他阳离子。重要的是，已经发现阳离子交换剂处理从澄清的工艺流中除去氨和一部分污染蛋白。

在阳离子交换剂处理步骤中，带正电荷的物质与树脂结合后，可以将其从无细胞培养液中除去。以任何合适的方式接触唾液酸的水溶液，所述方式使得带正电荷的材料被吸附到阳离子交换材料上，而唾液酸则通过。与阳离子交换树脂接触后，所得液体含有水、确定的阳离子(在此步骤之前固定在阳离子交换剂材料上的那些阳离子)、阴离子、着色物质和所需的唾液酸。

阳离子交换剂处理可以用弱阳离子交换材料或强阳离子交换材料进行，优选地，它用强阳离子交换材料进行。

在本发明的方法的阳离子交换剂处理中，可以使用强阳离子交换剂。用于除去带正电荷的化合物的合适的阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂，例如包含附着于固体骨架(例如聚苯乙烯骨架)的羧酸基团(弱阳离子交换剂)或磺酸基团(强阳离子交换剂)的树脂。合适的树脂包括(但不限于)

S2568(H⁺)(Lanxess AG,Cologne,DE)、

50WX2(Merck KGaA,Darmstadt,DE)、

IR-116(Japan Organo Co.,Ltd.)和Diaion^TM SK-102(三菱化学工业有限公司)。

阳离子交换剂处理步骤可以是从培养基中除去生物质之后的第一步，即对澄清的培养基进行处理的第一步。

非特异性阳离子优选地被特异性阳离子H⁺或Na⁺替代。如果非特异性阳离子被H⁺替代，则优选地在进行进一步的处理步骤(例如阴离子交换剂处理)之前，将流穿液的pH调节至pH 6至8，最优选地通过将NaOH加至流穿液中。

在优选的实施方案中，阳离子交换材料以H⁺的形式存在，即在将澄清的工艺流施加到阳离子交换剂之前，使阳离子交换材料的离子交换配体质子化。这实现了在阳离子交换期间，澄清的工艺流中的阳离子被H⁺替代。因此，所述步骤(流穿)之后的溶液的pH比所述步骤之前的溶液的pH酸性更高。优选地，在随后的纯化步骤之前，将流穿液的pH提高至中性或几乎中性的pH值(例如≥pH 6.5且≤pH 7.5)。可以通过向工艺流中添加NaOH来实现pH的提高。通过该措施，质子化形式(H⁺形式)的唾液酸被转化为唾液酸盐。在添加NaOH的情况下，获得了唾液酸的钠盐形式(Na⁺形式)。

可使用阳离子交换剂，并以任何碱金属(Li⁺、Na⁺、K⁺)、碱土金属(例如Ca²⁺、Mg²⁺)、铵离子或碳酸根离子作为抗衡离子。优选地，钠(Na⁺)是阳离子交换剂的抗衡离子。更优选地，氢(H⁺)是抗衡离子。氢作为抗衡离子的优点在于，在与阳离子交换剂接触时，会产生唾液酸的质子化形式，其存在于流穿液中，即在通过阳离子交换材料的溶液中。随后，可以通过向产物流中加入碱(例如NaOH)来中和唾液酸的质子化形式，所述碱将唾液酸转化为其盐形式(例如钠形式)。唾液酸的钠形式是有益的，因为钠离子是相对小的阳离子，并且与较大的阳离子相比，可以更容易地通过纳滤和/或电渗析除去。

优选地，阳离子交换剂处理步骤是在阴离子交换剂处理步骤之前进行。该顺序的优点在于，已通过阴离子交换剂材料并包含所需唾液酸的工艺流的盐浓度低，因为唾液酸不与阳离子交换剂材料结合(即，在流穿液中)。然后可以对所述流穿液进行阴离子交换剂处理而无需脱盐步骤。然而，原则上，阳离子交换剂处理也可以在阴离子交换剂处理步骤之后进行。

阳离子交换树脂的粒度优选地为0.1至1mm。该粒度范围允许所用的无细胞培养液有效流动，而荷电材料仍被阳离子交换树脂有效地除去。为了确保可以进行有效的离子交换，流速应优选地为床体积的>0.5至<2.5倍，更优选地为床体积的>1.0至<2.0倍。离子交换处理可以以常规方式进行，例如分批进行或连续进行，优选地连续进行。

可以通过调节澄清溶液的pH和/或盐浓度来建立唾液酸通过阳离子交换材料的条件，优选地通过调节澄清溶液的pH至pH 6至8，和/或如果需要的话，调节盐浓度。

在阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理之后，纯化的溶液可包含唾液酸、着色物质和盐，其中盐优选地为NaCl。根据本发明的优选实施方案，在阴离子交换剂处理中，使用氯化物形式的阴离子交换材料。

根据本发明的另一优选实施方案，在阳离子交换剂处理中，使用氢形式的阳离子交换材料。已经发现，使用氢形式(H⁺抗衡离子)的阳离子交换剂是有益的，因为与任何其他形式的阳离子交换剂(抗衡离子≠H⁺)相比，盐和污染蛋白的结合要好得多。氢形式的使用使流穿液具有比用于阳离子交换剂处理的溶液更酸的pH。然而，通过添加碱(优选NaOH)可以容易地将所述pH提高至中性pH，优选地pH 6至8。用NaOH进行的中和是有利的，因为引入的钠离子相对较小并且可以容易地通过纳滤和/或电渗析除去。

应选择阳离子交换树脂的粒度以允许所用的无细胞培养液有效流动，而荷电材料仍可被阳离子交换树脂有效除去。为了确保能够进行有效的离子交换，流速应优选地为床体积的>0.2至<2.0倍，更优选地为床体积的>0.5至<1.5倍。离子交换处理可以以常规方式进行，例如分批进行或连续进行，优选地连续进行。

澄清溶液可以首先进行阳离子交换剂处理，然后进行阴离子交换剂处理。该方法顺序的优点在于，阳离子交换剂材料可以呈H⁺形式，以获得污染蛋白的强结合，并且在用碱(例如NaOH)中和后，阴离子交换剂材料可以用包含唾液酸的确定盐形式(例如唾液酸的Na⁺形式)的溶液运行。

阴离子交换剂处理

优选地，阴离子交换剂处理步骤在阳离子交换剂处理步骤之后进行。然而，原则上，它也可以在阳离子交换剂处理步骤之前，即在用阳离子交换剂处理工艺流之后进行。

进行阴离子交换剂步骤以除去非特异性阴离子并用特异性阴离子替代它们，优选地用特异性阴离子Cl^-或OH^-。如果非特异性阴离子被Cl^-替代，则在实施进一步的处理步骤(例如，通过电渗析从纯化溶液中除去盐)之前，优选地将流穿液的pH调整为pH 6至8，最优选的是通过向流穿液中加入NaOH。

可以通过本发明的方法的阴离子交换剂处理步骤，即通过将至少一种阴离子交换剂处理应用于澄清的工艺流，从澄清的工艺流中除去阴离子。阴离子交换剂处理步骤可以是从培养基中除去生物质之后的第一步，即对澄清的培养基进行处理的第一步。优选地，在阳离子交换剂处理步骤之后的步骤中进行阴离子交换剂处理。

当带负电荷的材料与阴离子交换树脂结合时，可以将其从工艺流中除去。以任何合适的方式接触包含所需唾液酸的水溶液，所述方式使得带负电荷的材料被吸附到阴离子交换材料上，而唾液酸则通过。与阴离子交换树脂接触后，所得液体含有水、确定的阳离子、确定的阴离子、着色物质和所需的唾液酸。阴离子交换剂步骤的条件是使唾液酸不与阴离子交换剂材料结合，即，在与所述材料接触后就存在于流穿液中。

在阴离子交换剂处理开始时，优选地将产物流的pH调节至pH 6至8(最优选地pH7)。流穿液(已经通过阴离子交换剂材料的产物流)可以具有较低的pH，例如pH 4.5至6。在该pH下，唾液酸以钠形式存在。可以通过添加碱，例如NaOH来提高流穿液的pH。

在阴离子交换过程中，澄清的工艺流中的阴离子可用Cl^-替代。因此，工艺流的pH变得稍微更酸性。优选地，在后续的纯化步骤之前将pH升高，优选地达到工艺流的中性或几乎中性的pH值(即≥pH 6.5和≤pH 7.5)。更优选地，通过向工艺流中添加NaOH来实现工艺流的pH升高。

阴离子交换剂可以是弱阴离子交换剂或强阴离子交换剂，优选强阴离子交换剂。

合适的强碱性阴离子交换树脂是包含附着于固体骨架(例如聚苯乙烯骨架)的三甲基铵基或羟乙基的树脂。合适的树脂包括(但不限于)

S6368 A、

S4268、

S5528、

S6368A(Lanxess AG,Cologne,DE)、

AG 1×2(200-400目)、

1×8(100-200目)、

Chromalite CGA100×4(PuroliteGmbH，Ratingen，DE)、

FPA51(Dow Chemicals，M1，USA)。优选地，阴离子交换树脂以氯化物形式存在。合适的弱阴离子交换树脂是包含附着于固体骨架(例如聚苯乙烯骨架)上的氨基的树脂。

可使用阴离子交换剂，并以任何碱作为抗衡离子，例如HCO₃ ^-、I^-、Br^-、NO₃ ^-。优选地，抗衡离子是氢氧根(OH^-)。更优选地，抗衡离子是氯化物(Cl^-)。使用氯化物作为抗衡离子的优点是，Cl^-阴离子比发酵液中最初存在的许多其他阴离子小。这实现了可以更容易地通过电渗析从工艺流中除去氯化物阴离子。使用OH^-阴离子作为抗衡离子的优点是，在阴离子交换剂处理后的步骤中，用HCl中和pH时，与其他阴离子相比更容易被除去的小阴离子氯化物被引入到工艺流中。

阴离子交换树脂的粒度优选地为0.1至1mm，以允许所使用的工艺流的有效流动，同时仍通过阴离子交换树脂有效地除去荷电材料。为了确保可以进行有效的离子交换，流速应优选地为床体积的>0.5至<2.5倍，更优选地为床体积的>1.0至<2.0倍。离子交换处理可以以常规方式进行，例如分批进行或连续进行，优选地连续进行。

如果需要的话，可以通过调节澄清溶液的pH和/或盐浓度来建立唾液酸通过阴离子交换剂材料的条件，优选地通过将澄清溶液的pH调节到6-8和/或通过调节盐浓度来建立。例如，已经观察到，如果对包含唾液酸的溶液进行阴离子交换剂处理(该溶液源自以H+作为抗衡离子的阳离子交换剂处理的流穿液且已通过添加NaOH将其调节至pH 6至8)，则流穿液的盐浓度足够高，以避免唾液酸与阴离子交换树脂的结合。然而，已经观察到在所述条件下，污染物(例如某些蛋白质、DNA分子和有色物质)仍然结合到阴离子交换剂树脂上。

在优选的实施方案中，纯化方法包括用氢(H⁺)形式的阳离子交换剂树脂和氯化物(Cl^-)形式的阴离子交换剂树脂进行的处理。阳离子交换剂树脂优选地为强阳离子交换剂。阴离子交换剂可以是弱或强阴离子交换剂，优选地其是强阴离子交换剂。另外，阴离子交换剂材料也可以是吸收剂材料。使用阳离子交换剂树脂和阴离子交换剂树脂进行的处理均允许从产物流中除去所有非特异性离子。因此，非特异性离子可以被特异性阴离子替代，优选钠阳离子(例如，在与以H⁺作为抗衡离子的阳离子交换剂材料接触之后，通过用NaOH中和产物流而引入)和氯阴离子。钠阳离子和氯阴离子都是相对较小的离子，并且与较大离子相比可以通过电渗析以更快、更经济的方式除去。

纯化的溶液的浓度

在优选的实施方案中，浓缩包含所需唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸)的离子交换剂处理后的溶液(流穿液)，优选地通过纳滤、反渗透和/或真空蒸发(例如通过使用降膜蒸发器、旋转蒸发器或平板蒸发器)浓缩。反渗透和/或纳滤是优选的方法(例如，使用尺寸排阻极限≥

的纳滤膜的纳滤)。特别优选的是纳滤。纳滤优于反渗透的优势在于，纳滤实现了更快的浓缩，并且还实现了部分除去盐离子。相对于真空蒸发，纳滤的优势在于不会与唾液酸发生焦糖化反应，即浓缩过程中不会产生有色的焦糖体。

最优选地通过纳滤浓缩纯化溶液，其中最优选地使用截留分子量为100至200kDa的纳滤膜。该截留分子量的优点是截留了待纯化的唾液酸，而盐离子可以通过所述膜，即除浓缩以外还实现了脱盐。

在浓缩溶液之前，溶液中的唾液酸的浓度可为≤20％(w/w)、≤10％(w/w)或≤5％(w/w)。

在该方法中，可以将澄清溶液和/或纯化溶液浓缩至唾液酸的浓度最高达≥100g/L，优选地≥200g/L，更优选地≥300g/L。

此外，澄清溶液和/或纯化溶液可以在＜80℃的温度下通过纳滤来浓缩，优选地＜50℃，更优选地4℃至45℃，更优选地10℃至40℃，甚至更优选地15至30℃，最优选地15至20℃。

此外，澄清溶液和/或纯化溶液可以通过反渗透在20℃至50℃的温度下浓缩，更优选地30℃至45℃，最优选地35℃至45℃。

此外，澄清溶液和/或纯化溶液可以在＞5巴至＜50巴的压力下浓缩，优选地在＞10巴至＜40巴的压力下，更优选地在＞15至＜30巴的压力下。

反渗透是一种膜过滤方法，可从溶液(工艺流)中除去大于0.1nm的颗粒。只从工艺流中除去水，而所有其他分子(如离子、糖等)将被浓缩在渗余物中。通过使用反渗透，只能实现提高唾液酸浓度，而不能使其脱盐。

在额外的和/或替代的实施方案中，浓缩步骤包括以下参数中的至少一个，任选地所有以下参数：

i)进行浓缩至唾液酸的浓度最高达≥100g/L，优选地≥200g/L，更优选地≥300g/L；

ii)在＜80℃的温度下进行浓缩，优选地≤50℃，更优选地4℃至45℃；如果通过纳滤进行浓缩，则最优选地为4℃至40℃。

iii)在<50℃的温度下进行浓缩，优选地20℃至45℃；如果通过反渗透和/或真空蒸发进行浓缩，则最优选地为30℃至45℃，更优选地为35℃至45℃；和

iv)浓缩在＞5巴至＜50巴的压力下进行，优选地在＞10巴至＜40巴的压力下，更优选地在＞15至＜30巴的压力下。

在本发明的另一个优选的实施方案中，在电渗析步骤之后，使用真空蒸发(例如通过使用降膜蒸发器或平板蒸发器)、反渗透或纳滤(例如使用尺寸排阻极限≥

的纳滤膜的纳滤)对包含唾液酸的溶液进行浓缩，优选地使用纳滤或反渗透，更优选地使用纳滤。

除去盐

纯化唾液酸的方法包括从溶液中除去盐的步骤，优选地从澄清溶液和/或纯化溶液中除去盐。可以通过对待脱盐的溶液进行纳滤和/或电渗析来除去盐。

纳滤是一种膜过滤方法，其中膜含有纳米尺寸的孔。纳滤膜的孔径为1至10纳米。纳滤膜的孔径小于微滤膜的孔径，甚至小于超滤膜的孔径，但实际上大于用于反渗透的膜的孔径。用于纳滤的膜主要由聚合物薄膜制成。常用的材料包括聚对苯二甲酸乙酯或诸如铝的金属。孔密度可以为1至10⁶个孔/cm²。在该方法中使用了纳滤来纯化所需的唾液酸，以增加溶液中(如澄清溶液和/或纯化溶液中)的唾液酸的浓度。此外，还会发生溶液(工艺流)的脱盐。

用于纳滤的合适的膜包括聚酰胺或聚哌嗪薄膜复合膜材料，提供150至300Da的尺寸排阻，例如Dow FilmtecTM NF270(Dow Chemical Company,USA)。这样的膜允许高通量。特别是分子截留为100至300KDa的纳滤膜有利于提高工艺流中所需唾液酸(例如Neu5Ac)的浓度。具有这种分子截留的膜阻止唾液酸通过膜，并且具有以下优点：它们也实现了脱盐，因为在用离子交换剂材料处理后在工艺流中存在的盐(例如氯化钠)通过膜并与唾液酸分离。用于纳滤的合适的膜的其他实例包括Trisep 4040-XN45-TSF(Microdyn-Nadir GmbH，Wiesbaden，DE)、GE4040F30和GH4040F50(GE Water&Process Technologies，Ratingen，DE)。

发现在对含有唾液酸的溶液进行电渗析处理之前，纳滤有效地除去大量污染物(例如盐离子)。还发现在从发酵液中除去生物质之后(例如通过超滤步骤)，纳滤可有效从澄清的发酵液中除去低分子量污染物。除去低分子量成分有利于在离子交换处理之前对包含唾液酸的溶液进行浓缩和去矿化。由于热暴露减少，使用纳滤来提高唾液酸的浓度实现较低的能源和加工成本，以及更好的产品质量。

电渗析将渗析和电解结合起来，基于溶液中的离子通过半透膜的选择性电迁移，可用于溶液中离子的分离和浓缩。工业电渗析的应用可以追溯到20世纪60年代初，当时该方法用于奶酪乳清的去矿化，以包含在婴儿配方物中。电渗析的其他应用包括调整饮料(例如葡萄酒、葡萄汁、苹果汁和橙汁)的pH值。

对咸淡水进行脱盐以用于饮用水生产以及对乳清去矿化以用于婴儿食品生产是当今电渗析最广泛的应用。电渗析的基本原理由一个电解池组成，该电解池包括一对浸没在电解液中的用于传导离子的电极，该电极与直流发电机相连。连接到直流发电机的正极的电极是阳极，连接到负极的电极是阴极。电解液然后支持电流，该电流是由于负离子和正离子分别朝着阳极和阴极移动而产生的。用于电渗析的膜基本上是具有负或正电荷基团的多孔离子交换树脂片，因此分别描述为阳离子或阴离子膜。离子交换膜通常由带有与二乙烯基苯交联的合适的官能团(例如用于阳离子膜的磺酸或用于阴离子膜的季铵基)的聚苯乙烯基质组成。

电解液可以是例如包含氯化钠、乙酸钠、丙酸钠和/或氨基磺酸的水溶液。电解液围绕阴极和阳极，并用于允许电流在电池内流动。然后以如下方式组装电渗析堆(stack)：使阴离子膜和阳离子膜平行，如同在压滤机中的两个电极块之间一样，以使进行离子耗竭的料流与进行离子富集的料流充分分离(两种溶液也称为稀释液(进行离子耗竭)和浓缩液(进行离子富集))。

电渗析过程的核心是膜堆，其由安装在两个电极之间的由垫片(spacer)隔开的数个阴离子交换膜和阳离子交换膜组成。通过施加直流电，阴离子和阳离子将跨膜向电极迁移，从而产生(脱盐的)稀释液流和浓缩液流。

用于电渗析的离子交换膜的孔径足够小，以防止由于两个料流之间的高浓度差驱动的产物从稀释液流扩散到浓缩液流中。从生物质中分离出来和/或交换阳离子和/或阴离子之后，必须从所需产物中定量除去蛋白质，以及尤其是重组DNA分子(大小从片段到整个基因组)。

电渗析用于从水溶液中除去离子，而唾液酸将保留在工艺流中。电渗析的重要优点是可以从包含待纯化的唾液酸的溶液中完全除去重组DNA分子。此外，还发现电渗析可以显著减少工艺流中的盐的量。实际上，已经发现可以从产物流中完全除去氯化钠。这样的优点是可以提供不含盐如氯化钠的唾液酸，防止在最终产品如婴儿食品中存在盐(例如氯化钠)所产生的任何负面影响。

可以进行电渗析直到达到0.2至10.0mS/cm²的稳定的电导率(mS/cm²)，优选地为0.4至5.0mS/cm²，更优选地为0.5至1.0mS/cm²。此外，可以进行电渗析直至达到盐的量(g/l)＜10.0g/l，优选地＜5.0g/l，更优选地＜1.0g/l，最优选地＜0.5g/l。

电渗析可在中性条件或酸性条件下进行。两种变化之间的差异在于唾液酸的形式。在中性pH下，唾液酸以钠盐形式存在。在这种情况下，必须在电渗析过程中控制pH值。在酸性pH下，唾液酸以游离形式(氢形式)存在。在酸性条件下使用电渗析的优点是对钠形式的唾液酸进行所述电渗析，在电渗析之后存在游离形式(氢形式)的唾液酸。简言之，在酸性条件下的电渗析不仅实现了从唾液酸盐(例如唾液酸的钠盐)中除去污染盐，而且还将唾液酸盐转化为游离形式(氢形式)的唾液酸。

通过在电渗析过程中施加中性条件，待纯化的钠形式的唾液酸表现出不荷电(唾液酸的带负电荷的羧基与带正电荷的钠离子的相互作用)。在开始电渗析之前，可以用酸(优选地用盐酸(HCl))或碱(优选地氢氧化钠(NaOH))调节工艺流的pH，直到达到pH 5.0至9.0，优选地6.0至8.0，更优选地6.5至7.5。

通过在电渗析过程中施加酸性条件，质子化形式的唾液酸表现出不荷电(唾液酸的带负电荷的羧基与带正电荷的质子相互作用)。在开始电渗析之前，用酸(优选地盐酸(HCl))酸化工艺流，直到达到pH 1.0至3.0，优选地1.5至2.5，更优选地1.8至2.2。优选地进行电渗析直至达到稳定的电导率(mS/cm²)和pH。

可以进行电渗析直至达到1.0至10.0mS/cm²的稳定的电导率(mS/cm²)，优选地1.5至10.0mS/cm²，更优选地2.0至8.0mS/cm²。在电渗析过程中，必须使用碱(优选地使用氢氧化钠)控制和调节pH值。在所述中性条件下，可以使用双极膜来进行电渗析。在这种情况下，唾液酸可在单独的电渗析浓缩液回路(circuit)中浓缩。因此，唾液酸可以在电渗析过程中富集。

在该方法中，从纯化溶液中除去盐后，

i)纯化溶液中的盐量可以<10％(w/w)，优选地<5％(w/w)，更优选地<1％(w/w)；和/或

ii)电导率可以为0.2至10.0mS/cm²，优选地为0.4至5.0mS/cm²，更优选地为0.5至1.0mS/cm²。

澄清和/或纯化溶液的脱色

可以对澄清溶液和/或纯化溶液进行脱色步骤，优选地通过用活性炭处理和/或用串联偶联的阳离子交换剂和阴离子交换剂处理。

可以在以下时间进行脱色步骤：

i)在澄清溶液的渗滤和/或浓缩步骤之前或之后；和/或

ii)在澄清溶液的电渗析和/或渗滤步骤之前或之后。

任选地，所述步骤在纳滤步骤之后和/或电渗析步骤之前进行。

与用阳离子交换剂和阴离子交换剂(串联偶联)进行的处理相比，通过用活性炭进行的处理除去着色物质的优点在于，可以除去荷电和不荷电(中性)的着色物质并且可以除去不荷电(中性)的低聚糖。

活性碳(activated carbon，也称为activated charcoal)，是已经经过处理具有小的小体积孔的碳的形式，所述孔增加了可用于吸附的表面积。通常，由于其高的微孔度，仅一克的活性炭就具有大于3000m²的表面积，通过气体吸附确定。

碳水化合物物质(如单糖或低聚糖)倾向于从水溶液结合到木炭颗粒的表面。低聚糖与活性炭的相互作用比单糖的相互作用要强得多。这种行为是由于它们的结构所致，并导致与污染的低聚糖相比唾液酸(例如Neu5Ac)与活性炭的结合力较弱，即以较小的量结合。除低聚糖外，有色物质还吸附在活性炭上。其他水溶性材料(如盐)以较弱的方式结合，并通过用水冲洗活性炭(在孵育后)，与所需的唾液酸一起从活性炭中洗脱出来。用水洗脱后，被吸附的低聚糖和有色物质仍保持与活性炭结合。因此，可以通过用活性炭进行的处理步骤除去污染的低聚糖和有色污染物。总之，活性炭步骤除去了着色剂、其他杂质，并减少了诸如盐的水溶性污染物的量。

用于除去着色化合物、低聚糖或污染物的合适的活性炭为(但不限于)颗粒状活性炭，例如Norit GAC830EN(Carbot Cooperation)和Epibon Y 12x 40spezial(Donaucarbon)，或粉末状活性炭，例如Norit DX1、Norit SA2(Carbot Cooperation)和Carbopal MB 4(Donaucarbon)。

与用活性炭进行的处理相比，通过用阳离子交换剂和阴离子交换剂(串联偶联)处理除去着色物质的优点在于，不仅可以从溶液中除去着色物质，而且溶液中的非特异性盐离子可以交换为特异性盐离子，例如Na⁺和Cl-。所述离子交换的优点在于脱盐过程可以变得更有效(与其他可能的离子相比，Na⁺和Cl-是小离子，因此可以更容易地通过脱盐处理步骤除去)。另一个优点是可以避免某些非特异性盐对唾液酸结晶的不利影响。

进行离子交换剂处理，以使荷电材料和着色物质吸附到各离子交换材料上，而唾液酸则通过各离子交换材料，即位于流穿液中。生成的液体(流穿液)含有水、少量确定的离子、少量的着色物质和唾液酸。

阳离子交换剂可以是弱阳离子交换剂或强阳离子交换剂，优选地是强阳离子交换剂。

合适的阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂，例如(但不限于)

S2568(H⁺)(Lanxess AG,Cologne,DE)、

50WX2(Merck KGaA,Darmstadt,DE)、

IR-116(Japan Organo Co.,Ltd.)和Diaion^TM SK-102(三菱化学工业有限公司)。

可以使用阳离子交换剂，并以任何碱金属(Li⁺、Na⁺、K⁺)、碱土金属(例如Ca²⁺、Mg^{2 +})、铵离子或碳酸根离子作为抗衡离子。优选地，钠离子(Na⁺)是抗衡离子。

阴离子交换剂可以是弱阴离子交换剂或强阴离子交换剂，优选地它是强阴离子交换剂。

合适的阴离子交换树脂是强碱性(I型)阴离子交换树脂，例如(但不限于)

S6368A、

S4268、

S5528、

S6368A(Lanxess AG,Cologne,DE)、

AG 1×2(200-400目)、

1×8(100-200目)、

Chromalite CGA100×4(Purolite GmbH，Ratingen，DE)、

FPA51(DowChemicals，M1，USA)。优选地，阴离子交换树脂以氯化物形式存在。

可以使用阴离子交换剂，并以任何碱作为抗衡离子，例如HCO₃ ^-、I^-、Br^-、NO₃ ^-。优选地，将氢氧化物(OH^-)用作抗衡离子。更优选地，将氯化物(Cl^-)用作抗衡离子。

在阳离子交换剂和阴离子交换剂的串联偶联中，阴离子交换剂可以位于阳离子交换剂的上游或下游。优选地，所述阴离子交换剂在串联偶联中位于阳离子交换剂的下游。因此，通过该串联的溶液首先通过阳离子交换剂，然后通过阴离子交换剂。

已经通过阳离子交换剂和/或阴离子交换剂的工艺流(即各自的流穿液)的pH优选地为＞2.0和＜10.0，更优选地为＞3.0和9.0，最优选地为＞4.0和＜8.0。

应当选择离子交换树脂的粒度以允许工艺流有效流动，同时仍可以通过离子交换树脂有效除去荷电材料和着色物质。为了确保可以进行有效的离子交换，流动速率应优选地为床体积的＞0.2至＜2.0倍，更优选地为床体积的＞0.5至＜1.5倍，最优选地为床体积的＞0.75至＜1.2倍。离子交换处理可以以常规方式进行，例如，分批进行或连续进行，优选地连续进行。

无菌过滤和/或除去内毒素

在本发明的优选实施方案中，纯化溶液被无菌过滤和/或进行内毒素去除，优选地通过≤10kDa滤器模块过滤纯化溶液。例如，通过3kDa的滤器或通过6kDa的滤器对纯化溶液进行的过滤，对含有唾液酸的纯化溶液进行过滤灭菌和/或进行内毒素除去步骤。如果唾液酸要供人食用，则必须除去内毒素。

游离唾液酸(氢形式)转化为其盐形式

为了将游离酸形式的唾液酸或钠盐形式的唾液酸转化为不同的盐形式，可以使用任何碱金属(Li⁺、Na⁺、K⁺)、碱土金属(例如Ca²⁺、Mg²⁺)、铵离子或碳酸根离子的阳离子交换剂以形成相应的盐。盐形式(特别是钠形式)的唾液酸比游离酸形式的唾液酸明显更稳定，因为已发现与游离酸形式不同，在水性介质中不会发生变色反应。

优选地将澄清溶液和/或纯化溶液中包含的唾液酸转化成其钠形式，优选地通过用钠形式的强阳离子交换剂材料处理纯化溶液。钠形式的优点是它是pH中性物质，即当溶于水时，水的pH保持中性。相反，当游离形式(氢形式)的唾液酸溶解在水中时，水的pH变为酸性。已经观察到，在酸性条件下和高于10℃的温度下，唾液酸(特别是Neu5Ac)易于产生变色，即易于形成有色化合物。由于钠形式的唾液酸不表现出降低pH的行为，因此钠形式更稳定，防止形成有色化合物。

钠形式的唾液酸转化为其游离形式(氢形式)

可以通过另一个阳离子交换步骤将唾液酸的钠盐转化为游离唾液酸(质子化形式)。在该步骤中，与唾液酸缔合的钠离子(Na⁺)或在澄清的工艺流中的钠离子(Na⁺)被质子(H⁺)替代。这种交换导致工艺流的pH变得更酸性。

通过用氢(H⁺)形式的阳离子交换剂处理包含唾液酸钠盐的溶液，可以从唾液酸中除去荷正电的钠离子。阳离子交换剂可以是弱阳离子交换剂或强阳离子交换剂，优选地是强阳离子交换剂。在该步骤中，来自唾液酸的荷正电的钠离子可被从去质子化的唾液酸分子中除去，并结合到树脂上，其中H⁺离子从树脂中释放出来，并且可以使去质子化的唾液酸质子化。以任何合适的方式接触唾液酸的水溶液，该方式允许钠离子交换为氢离子并使钠离子吸附到阳离子交换材料上，而唾液酸则通过。与阳离子交换树脂接触后，所得液体含有质子化的唾液酸。

用于从唾液酸溶液中除去荷正电的钠的合适的阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂，例如(但不限于)

S2568(H⁺)(Lanxess AG,Cologne,DE)、

50WX2(Merck KGaA,Darmstadt,DE)、

IR-116(Japan Organo Co.,Ltd.)和Diaion^TM SK-102(三菱化学工业有限公司)。

可以实施电渗析步骤，而不是通过阳离子交换剂处理将唾液酸的盐转化为游离酸或转化为不同的盐形式。电渗析可用于在酸性条件下从工艺流中除去钠，而唾液酸将以质子化形式保留在工艺流中。

通过在电渗析过程中施加酸性条件，可以使唾液酸质子化，使其表现出不荷电(羰基的质子化)。在开始电渗析之前，用酸(优选地盐酸(HCl))酸化工艺流，直到达到pH 1.0至3.0，优选地1.5至2.5，更优选地pH 1.8至2.2。优选地进行电渗析直至达到稳定的电导率(mS/cm²)和pH。

提供喷雾干燥形式的唾液酸

在优选的实施方案中，纯化溶液经喷雾干燥。进行喷雾干燥的纯化溶液优选地包含钠形式的唾液酸。

可以将纯化溶液以5-35％(w/w)，优选地10-30％(w/w)，更优选地15-25％(w/w)的唾液酸浓度进行喷雾干燥。入口温度可以为110-150℃，优选地120-140℃，更优选地125-135℃。出口温度可以为60-80℃，优选地65-70℃。

提供结晶形式的唾液酸

纯化溶液可以进行结晶，优选地通过向纯化溶液中加入乙酸进行结晶。根据该实施方案，优选地以二水合物晶体形式提供唾液酸。

为了遵循本发明的实施方案，本文将描述用于从水溶液中结晶唾液酸的方法。已经发现，可以从使用酶或发酵液(培养液)的生物催化方法中选择性地将唾液酸(例如Neu5Ac)结晶为二水合物形式。

在优选的实施方案中，用于结晶的纯化的唾液酸(水)溶液的碳水化合物含量大于20％(w/w)，优选地大于30％(w/w)，优选地大于40％(w/w)，尤其是大于50％(w/w)。或者，待用于结晶的纯化(水)溶液中的唾液酸浓度为450-600g/l，优选地为500-550g/l。

可以通过从培养液中浓缩含水工艺流以常规方式来实现上述浓度范围和比率，优选地在通过使用前述方法从培养液中除去如细胞、着色物质、盐和/或荷电分子之后。

可以通过真空蒸发(例如通过使用旋转蒸发器或平板蒸发器)或通过纳滤来实现含唾液酸的溶液的浓缩。为了开始结晶，在20℃至50℃的温度下，优选地在25℃下，将晶种加入到所述浓缩的唾液酸溶液中。

包含唾液酸的溶液的碳水化合物浓度可为＞50％(w/w)。结晶方法可以在真空下孵育，优选地在至少一种以下条件下进行：

i)小于200mbar的压力，更优选地在小于100mbar的压力下，尤其是在小于50mbar的压力下；

ii)产物温度为15℃至60℃，优选地为20℃至45℃，更优选地为25℃至40℃，特别是为30℃至35℃；和

iii)孵育时间，直到碳水化合物浓度达到＞60％，优选地＜70％，或出现粘稠的结晶浆。

可以将有机溶剂(优选异丙醇)加入到结晶溶液中。为了增强结晶过程，将1L的结晶材料与0.5至3L的异丙醇混合，优选地0.7至2.0L，更优选地1.0至1.5L。将起始温度为20℃至30℃的所得结晶方法在不搅拌或搅拌下冷却至0至15℃，优选地至2至12℃，更优选地至4至8℃的温度。在达到优选温度之后，将结晶方法在选择的温度下在不搅拌或搅拌下孵育2至48h，优选地6至36h，更优选地12至24h。

可以通过在真空下或不在真空下过滤或通过离心将唾液酸晶体从液相中除去。为了除去剩余的母液，可以用有机溶剂(如乙醇、甲醇和/或异丙醇，优选地异丙醇)洗涤晶体。为了除去剩余的母液，用0.5至3L的异丙醇洗涤1kg结晶的唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸)，优选地0.7至2.0L，更优选地1.0至1.5L。

将所得晶体干燥4至48h，优选地8至36h，更优选地12至24h，或者直至观察不到重量变化。干燥温度可以为10℃至80℃，优选地为20℃至70℃，更优选地为30℃至60℃，特别是为40℃至50℃。

为了从水溶液中将唾液酸(例如Neu5Ac)以二水合物的形式结晶，本文将描述第二种从水溶液中将唾液酸以二水合物的形式结晶的替代方法。

为了开始结晶，在20℃至50℃的温度下(优选地在25℃下)将晶种加入到浓缩的唾液酸中。唾液酸溶液的碳水化合物浓度可为＞50％(w/w)。结晶方法应在搅拌下孵育直到发生结晶，优选地持续0.5至2h，更优选地1至1.5h。

将有机溶剂(优选异丙醇)加入到结晶溶液中。为了增强结晶过程，将1L的结晶材料与0.5至6.0L的异丙醇混合，优选地1.0至4.0L，更优选地1.5至2.5L。将起始温度为20℃至30℃的所得结晶方法在不搅拌或搅拌下冷却至0至15℃，优选地至2至12℃，更优选地至4至8℃的温度。在达到优选的温度之后，将结晶方法在选择的温度下在不搅拌或搅拌下孵育2至48h，优选地6至36h，更优选地12至24h。

通过在真空下或不在真空下过滤或离心，可以从液相中除去唾液酸晶体。为了除去剩余的母液，可以用有机溶剂(如乙醇、甲醇和/或异丙醇，优选异丙醇)洗涤晶体。为了除去剩余的母液，用0.5至3L的异丙醇洗涤1kg结晶的唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸)，优选地0.7至2.0L，更优选地1.0至1.5L。

将所得晶体干燥4至48h，优选地8至36h，更优选地12至24h，或者直到观察不到重量变化为止。干燥温度可以为10℃至80℃，优选地为20℃至70℃，更优选地为30℃至60℃，特别是为40℃至50℃。

本文将描述用于从水溶液中选择性地结晶唾液酸(例如Neu5Ac)的替代方法。已经发现，通过添加冰酸，可以从使用酶或发酵液(培养液)的生物催化方法中选择性地结晶唾液酸。

在优选的实施方案中，待用乙酸处理的唾液酸的纯化(水)溶液的碳水化合物含量大于10％(w/w)，优选地大于20％(w/w)，更优选地大于30％(w/w)，尤其是35至40％(w/w)。或者，在待用乙酸处理的纯化的(水)溶液中的唾液酸浓度为250-350g/l，优选地为290-330g/l。

可以通过从培养液中浓缩含水工艺流以常规方式来实现上述浓度范围和比率，优选地在通过使用前述方法从培养液中除去如细胞、着色物质、盐和/或荷电分子之后。

可以通过真空蒸发(例如通过使用旋转蒸发器或平板蒸发器)或通过纳滤来实现含唾液酸溶液的浓缩。

在20℃至50℃的温度下，优选地在25℃下，向所得的水溶液中加入乙酸。在0.5至2h(优选地1至1.5h)的时间内，一步或分批将乙酸完全加入到水溶液中。优选地，在添加乙酸的同时，在发生结晶的同时，优选地也在所述时间点之后，在相同温度下连续搅拌所述水溶液。

优选地，将约5-25L冰乙酸用于每千克唾液酸水溶液。因此，对于250-350g/L(优选地290-330g/L)的唾液酸水溶液(其碳水化合物含量大于30％(w/w))，每千克唾液酸水溶液使用至少为约5-25L的乙酸，优选地7-20L，更优选地10-18L，特别是12-16L。

在不搅拌或搅拌的情况下，将起始温度为20℃至50℃的所得的结晶方法冷却至0至15℃的温度，优选地至2至12℃，更优选地至4至8℃。在达到优选的温度之后，将结晶方法在选择的温度下在不搅拌或搅拌下孵育2至48h，优选地6至36h，更优选地12至24h。

通过在真空下或不在真空下过滤或离心从液相中除去唾液酸晶体。为了除去剩余的唾液酸，将用有机溶剂(如乙醇、甲醇和/或异丙醇，优选地用异丙醇)洗涤晶体。为了除去剩余的乙酸，将1kg结晶的唾液酸用0.5至3L的异丙醇洗涤，优选地0.7至2.0L，更优选地1.0至1.5L。

将所得晶体干燥4至48h，优选地8至36h，更优选地12至24h，或者直到观察不到重量变化为止。选择干燥温度为10℃至80℃，优选地在为20℃至70℃，更优选地为30℃至60℃，特别是为40℃至50℃。

提供冻干形式的唾液酸

包含唾液酸的纯化溶液也可以被冻干。在所述冻干中，将包含唾液酸的纯化溶液冷冻，然后降低压力，使得冷冻水直接从固相升华到气相。这种方法通常产生吸湿性的唾液酸粉末。

本发明提供的组合物和产品

根据本发明，提供了一种组合物，其包含：

a)至少98重量％的唾液酸；和

b)至多1重量％的有机溶剂；和

c)至多1重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐。

在优选的实施方案中，该组合物包含：

a)98.50至100.00重量％的唾液酸，优选地99.00至100.00重量％的唾液酸，更优选地99.50至100.00重量％的唾液酸，任选地99.70至99.90重量％的唾液酸；和/或

b)0.00至1.00重量％的有机溶剂，优选地0.00至0.50重量％的有机溶剂，更优选地0.00至0.40重量％的有机溶剂，任选地0.10至0.20重量％的有机溶剂；和/或

c)0.00至1.00重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐，优选地0.00至0.50重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐，更优选地0.00至0.40重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐，任选地0.10至0.20重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐。

优选地，该组合物(仅)包含：

a)0.00至0.50重量％的蛋白质，更优选地0.00至0.40重量％的蛋白质，任选地0.10至0.20重量％的蛋白质；和/或

b)0.00至0.50重量％的DNA，更优选地0.00至0.40重量％的DNA，任选地0.10至0.20重量％的DNA。

该组合物的特征在于唾液酸以无定形形式或晶体形式存在，优选地以颗粒形式或晶体形式存在，更优选地以喷雾干燥形式或晶体形式存在。晶体形式优选地为二水合物晶体形式。

本发明提供一种食品组合物，优选地婴儿食品配方物、幼儿食品配方物或医学营养产品，其中该食品组合物包含唾液酸和至少一种人乳低聚糖。

该食品组合物可包含至少一种选自以下的糖：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖和乳-N-新四糖。

食品组合物可为：

i)液体食品组合物，其包含浓度为1mg/l至2g/l的唾液酸，更优选地浓度为5mg/l至1.5g/l，甚至更优选地浓度为20mg/l至1g/l，最优选地浓度为50mg/l至0.7g/l；或

ii)固体食品组合物，其包含浓度为5mg/kg至15g/kg的唾液酸，更优选地浓度为25mg/kg至10g/kg，甚至更优选地浓度为100mg/kg至10g/kg，最优选地浓度为375mg/kg至5.25g/kg。

该食品组合物可包含：

i)至少一种中性人乳低聚糖，优选地至少一种选自2'-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳-N-新四糖的中性人乳低聚糖，最优选地所有所述中性人乳低聚糖；和

ii)至少一种酸性人乳低聚糖，优选地至少一种选自3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的酸性人乳低聚糖，最优选地所有所述酸性人乳低聚糖；和

iii)L-岩藻糖。

该组合物可以进一步包含至少一种选自以下的物质，任选地所有选自以下的物质：乳糖、乳清蛋白、生物素、脱脂乳、植物油、脱脂奶粉、高山被孢霉(Mortierella alpine)的油、鱼油、碳酸钙、氯化钾、维生素C、氯化钠、维生素E、乙酸亚铁、硫酸锌、烟酸、D-泛酸钙、硫酸铜、维生素A、维生素B1、维生素B6、硫酸镁、碘酸钾、叶酸、维生素K、亚硒酸钠和维生素D。

该食品组合物可包含选自蛋白质源、维生素、油、矿物质、酶、其他碳水化合物和益生菌菌株的至少一种物质。

该食品组合物可以是选自以下的组合物：医疗食品组合物、饮食补充剂、小药囊产品(sachet product)、液体即食婴儿营养产品、液体即食幼儿营养产品、颗粒产品、喷雾干燥的婴儿配方产品及其组合。

本发明还提供一种液体即食婴儿或幼儿营养产品，其包含浓度为1mg/l至2g/l的唾液酸、L-岩藻糖和

i)至少一种选自2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳糖-N-新四糖的中性人乳低聚糖；和/或

ii)至少一种选自3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖的酸性人乳低聚糖。

本发明还提供了一种喷雾干燥的婴儿配方产品，其包含浓度为5mg/kg至15g/kg的唾液酸、L-岩藻糖和

i)至少一种选自2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳糖-N-新四糖的中性人乳低聚糖；和/或

ii)至少一种选自3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的酸性人乳低聚糖。

此外，本发明还提供了一种饮食补充剂，其包含唾液酸和至少一种选自2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳-N-新四糖的中性HMO。

根据本发明，本发明提供了用于食品的预混合物(例如用于婴儿食品配方物的预混合物)，其包含唾液酸(例如Neu5Ac)和至少一种选自以下的物质：蛋白质源、维生素、油、矿物质、酶、其他碳水化合物(例如与预混物中已经存在的唾液酸不同的碳水化合物)和益生菌菌株。更优选地，预混合物包含所有所述物质。

蛋白质源可以选自乳清、玉米大豆混合物(CSB)、蛋白质水解物及其组合。

维生素可以选自维生素A、硫胺素、核黄素、维生素B12、叶酸及其组合。

油可以选自棕榈油、DHA、花生四烯酸及其组合。

矿物质可以选自氯化钾、碘酸钾、氧化锌及其组合。

酶可以选自淀粉酶、淀粉葡糖苷酶及其组合。

碳水化合物可以选自人乳低聚糖(HMO)、低聚半乳糖(GOS)、菊粉(FOS)、L-岩藻糖、其他唾液酸、乳糖及其组合。

益生菌菌株可以选自(有荚膜的)乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌株及其组合。

预混合物可以是喷雾干燥的、颗粒状的或液体(糖浆)产品的形式。

根据本发明，提供了一种药物组合物，优选地用于预防或治疗病毒感染、细菌感染、记忆丧失和菌群失调(dysbiosis)中的至少一种的药物组合物。该药物组合物包含根据本发明的组合物，并且任选地包含至少一种不同于唾液酸的糖和/或至少一种益生菌菌株，其中所述至少一种糖优选地至少一种选自以下的糖：乳糖、乳果糖、菊粉和蔗糖。

唾液酸或其可药用的盐、溶剂合物或酯的释放制剂在现有技术中是已知的，并记载于例如WO 2012/009474和WO 2013/109906中，其内容通过引用纳入本文。

示例性食品组合物

本发明的方法提供了所需的具有足够纯度的唾液酸，其纯度足以使其能够用于食品或饲料应用，特别是用于纳入婴儿和幼儿营养产品。所得到的唾液酸，特别是Neu5Ac，可用于通过将其与婴儿基础配方物的组分混合来制备婴儿配方物。婴儿配方物可以是粉末配方物或即食液体婴儿配方物。

基础配方物可以具有至少一种以下组分，任选地所有以下组分：

基础配方物：代表性的基础配方物的组分：

脱脂乳

植物油(棕榈油、菜籽油、葵花籽油)

脱脂奶粉

高山被孢霉的油

鱼油

碳酸钙

氯化钾

维生素C

氯化钠

维生素E

醋酸亚铁

硫酸锌

烟酸

D-泛酸钙

硫酸铜

维生素A

维生素B1

维生素B6

硫酸镁

碘酸钾

叶酸

维生素K

亚硒酸钠

维生素D

本发明的组合物的用途

本申请建议了本发明的组合物在制备食品组合物和/或药物组合物中的用途。

本申请旨在参考以下附图和实施例更详细地解释本发明的主题，而不希望将所述主题限于本文示出的特定实施方案。

图1示出了用于纯化唾液酸N-乙酰神经氨酸的本发明的方法的实例。发酵后，通过离心和/或过滤使发酵液澄清。对澄清的发酵液进行离子交换剂处理。然后对离子交换剂处理的流穿液进行渗滤和/或浓缩。在所述步骤之后，使包含唾液酸的溶液通过活性炭。然后，对包含唾液酸的溶液进行电渗析和/或渗滤。随后，对包含唾液酸的溶液进行喷雾干燥或结晶。

图2示出了用于纯化唾液酸N-乙酰神经氨酸的第二种本发明的方法的实例。发酵后，通过离心和/或过滤使发酵液澄清。对澄清的发酵液进行离子交换剂处理。然后对离子交换剂处理的流穿液进行电渗析和/或渗滤。在所述步骤之后，使包含唾液酸的溶液通过活性炭。然后，对包含唾液酸的溶液进行渗滤和/或浓缩。随后，对包含唾液酸的溶液进行喷雾干燥或结晶。

图3示出了用于纯化唾液酸N-乙酰神经氨酸的第三种本发明的方法的实例。发酵后，通过离心和/或过滤使发酵液澄清。对澄清的发酵液进行离子交换剂处理。然后使离子交换剂处理的流穿液通过活性炭。在所述步骤之后，对包含唾液酸的溶液进行渗滤和/或浓缩。然后，对包含唾液酸的溶液进行电渗析和/或渗滤。随后，对包含唾液酸的溶液进行喷雾干燥或结晶。

图4示出了用于纯化唾液酸N-乙酰神经氨酸的第四种本发明的方法的实例。发酵后，通过离心和/或过滤使发酵液澄清。对澄清的发酵液进行离子交换剂处理。然后对离子交换剂处理的流穿液进行电渗析和/或渗滤。在所述步骤之后，将包含唾液酸的溶液进行渗滤和/或浓缩。然后，使包含唾液酸的溶液通过活性炭。随后，对包含唾液酸的溶液进行喷雾干燥或结晶。

图5示出了N-乙酰神经氨酸的晶体的显微照片。可以看出，N-乙酰神经氨酸形成长度为2至8μm的小针。

图6示出了记录的已结晶为二水合物的N-乙酰神经氨酸的HPLC图。检测到结晶的N-乙酰神经氨酸的纯度为98.7％。

图7示出了记录的已用乙酸结晶的N-乙酰神经氨酸的HPLC图。与其他糖相比，检测到结晶的N-乙酰神经氨酸的纯度为98.2％。与材料的总质量相比，干燥后乙酸的量为2.8％。

图8示出了记录的已经喷雾干燥的N-乙酰神经氨酸的HPLC图。检测到喷雾干燥的N-乙酰神经氨酸的纯度为99.1％。

实施例1：从细菌发酵中纯化唾液酸N-乙酰神经氨酸

通过细菌发酵产生唾液酸N-乙酰神经氨酸，并通过过滤收集，其中获得澄清的无颗粒的唾液酸溶液(37g/l)。

首先用强阳离子交换剂(质子形式的Lewatit S2568，Lanxess)处理澄清的无颗粒溶液。

用氢氧化钠(NaOH)中和后，用强阴离子交换剂(氯化物形式的Lewatit S 6368A)额外处理溶液。

为了在离子交换剂处理之后对溶液中的N-乙酰神经氨酸进行浓缩和脱盐，通过纳滤步骤进一步处理所述溶液。Emrich EMRO 1.8反渗透系统(Emrich Edelstahlbau)配备了

XN 45纳滤模块。将入口压力设置为30bar，将溶液浓缩直至流速降至100L/h以下。用等量的反渗透水将溶液渗滤三次。为了减少盐的量，用等体积的反渗透水将溶液渗滤三次。

为了除去颜色，用活性炭粉末处理含N-乙酰神经氨酸的溶液。将溶液与Norit SA2活性炭在搅拌下孵育2h。孵育后，通过过滤除去活性炭，并用氢氧化钠将pH调节至pH 7.0。

为了除去残留的颜色和非特异性离子，用强阳离子交换剂(钠形式的LewatitS2568，Lanxess)和强阴离子交换剂(氯化物形式的Lewatit S6368A)再次处理溶液。在所述处理之后，将pH调节至pH 7.0。

为了除去氯化钠，使用配备有PCCell ED 1000A膜堆(membrane stack)的PCCellP15电渗析系统(PCell，Heusweiler，德国)对溶液进行电渗析。所述堆包括以下膜：阳离子交换膜CEM:PC SK和阴离子交换膜CEM:PcAcid60，其尺寸排阻极限为60Da。对溶液进行电渗析直至达到稳定的电导率。在电渗析期间，通过添加NaOH将pH稳定在pH 7.0。

电渗析后，使用配备有CSM RE8040BE反渗透模块的Emrich EMRO 1.8反渗透系统(Emrich Edelstahlbau)，通过反渗透将溶液浓缩至20％(w/v)干物质。

随后，将溶液过滤以除去内毒素，并使溶液通过5kDa超滤膜(Spira-Cell WYUP005 2440C模块)进行无菌过滤。然后将无菌溶液在室温(20℃)下保存，并用作无菌液体浓缩产品或将无菌溶液喷雾干燥。

实施例2：将唾液酸N-乙酰神经氨酸钠盐转化为其游离酸

为了分离游离酸形式的唾液酸，在实施例1中提到的活性炭处理之后，加入30％的盐酸直至pH为1.7至2.3。

调节pH后，用强阳离子交换剂(质子形式的Lewatit S2568，Lanxess)再次处理溶液。在离子交换剂处理之后，使用配备有PCCell ED 1000A膜堆的PCCell P15电渗析系统(PCell,Heusweiler,Germany)再次对溶液进行电渗析。所述堆包括以下膜：阳离子交换膜CEM:PC SK和阴离子交换膜CEM:PcAcid60，其尺寸排阻极限为60Da。将溶液电渗析直至达到稳定的电导率。在电渗析期间，通过添加盐酸将pH稳定在pH 2.0。

实施例3：通过喷雾干燥获得固体形式的唾液酸N-乙酰神经氨酸。

将上述实施例1和2中通过分离过程以钠形式或游离酸形式获得的唾液酸浓缩至20％(w/w)，将溶液过滤以除去内毒素，并通过将溶液通过5kDa超滤膜(Spira-Cell WYUP005 2440C模块，Microdyn Nadir,Wiesbaden,Germany)进行无菌过滤。然后使用NUBILOSA LTC-GMP喷雾干燥器(NUBILOSA，Konstanz,Germany)将如此获得的包含N-乙酰神经氨酸的无菌溶液喷雾干燥。为了对N-乙酰神经氨酸溶液进行喷雾干燥，使所述溶液在3.5巴的压力下通过设定为130℃的喷雾干燥器喷嘴，并调节流量以将排气温度维持在66℃至67℃。使用这些设置，可以获得水分含量低于5％的喷雾干燥粉末。水分含量是通过Karl-Fischer滴定法测定。

实施例4：唾液酸N-乙酰神经氨酸结晶为二水合物形式

使用配备有CSM RE8040BE反渗透模块的Emrich EMRO 1.8反渗透系统(EmrichEdelstahlbau)通过反渗透将游离酸形式的唾液酸N-乙酰基神经氨酸浓缩至20％(w/w)干物质。

为了结晶，通过Hei-VAP工业蒸发器(Heidolph Instruments GmbH，SchwabachGermany)将5升该溶液浓缩至50％(w/w)干物质。将该溶液接种晶种，并在真空下浓缩直至形成晶体(溶液的干物质：约75％w/w)。

将该晶体溶液与异丙醇1:1混合，并搅拌5min。将该溶液在4℃下孵育至少12h。通过真空过滤从母液中移出结晶的唾液酸，并用异丙醇洗涤晶体。

沉淀的N-乙酰神经氨酸的产率为75至85％。

实施例5：用乙酸结晶唾液酸N-乙酰神经氨酸

使用配备有CSM RE8040BE反渗透模块的Emrich EMRO 1.8反渗透系统(EmrichEdelstahlbau)通过反渗透将游离酸形式的唾液酸N-乙酰基神经氨酸浓缩至30％(w/w)干物质。

为了结晶，在搅拌下将5升冰乙酸分批加入1升N-乙酰神经氨酸溶液中。在3h内将溶液从室温(20℃)冷却至4℃。达到最终温度(4.5℃)后，将结晶方法在此温度下温育12至36h。

将该晶体溶液与异丙醇1:1混合，并搅拌5min。通过真空过滤从母液中移出结晶的N-乙酰基神经氨酸，并用等量的异丙醇洗涤晶体两次。

沉淀的N-乙酰神经氨酸的产率为74至81％。

表1中示出了从培养液中示例性纯化的N-乙酰神经氨酸的纯度。

纯化步骤	唾液酸浓度(g/l)	唾液酸(kg)	干物质(kg)	纯度(％)
					收集	37	259	399	64,9
阳离子交换剂	37	256	382	67,02
					阴离子交换剂	36	248	378	65,5
浓缩/渗滤	152	244	316,6	77,06
					活性炭	145	232,3	298,4	77,9
电渗析	135	181	184	98,3
					浓缩	203	180	183	98,3

表1纯度表示为与总质量相比的所需的N-乙酰神经氨酸的质量。

实施例6：代表性婴儿配方产品的组合物

在下文中，给出了代表性婴儿配方产品的组合物(参见下表2)。

该组合物包含唾液酸Neu5Ac与丰富的中性HMO 2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳-N-四糖(LNT)以及任选的乳-N-新四糖(LNnT)和乳-N-岩藻戊糖I(LNFP-I)，酸性HMO(6'-唾液酸乳糖(6'-SL)和3'-唾液酸乳糖(3'-SL))和L-岩藻糖。

产品中可以存在一种或多种益生菌菌株。每种成分的最终浓度是基于在90ml水中的13.5g粉末的制剂计。

表2

实施例7：包含人乳低聚糖、单糖Neu5Ac和单糖L-岩藻糖的婴儿配方产品的代表性预混合物的组合物。

在下文中，给出了婴儿配方产品的代表性预混物的组合物(参见下表3)。

该组合物包含唾液酸Neu5Ac与丰富的中性HMO 2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳-N-四糖(LNT)以及任选的乳-N-新四糖(LNnT)和乳-N-岩藻戊糖I(LNFP-I)、酸性HMO(6'-唾液酸乳糖(6'-SL)和3'-唾液酸乳糖(3'-SL))以及不含单糖的L-岩藻糖。

该预混合物可用于复原婴儿配方物，其是通过将所述预混合物添加到复原婴儿食品配方物所必需的其他营养产品(例如乳清、乳糖、脂质(饱和和不饱和脂肪酸)和矿物质)中进行。表3中所示的预混物旨在用于1kg最终婴儿配方产品。

表3

Claims (34)

1.用于从发酵液中纯化唾液酸的方法，其包括以下步骤：

从包含唾液酸的发酵液中除去生物质，其中提供了澄清溶液，

通过对澄清溶液进行以下处理来提供纯化溶液：

用阳离子交换剂材料进行的阳离子交换剂处理，其中所述阳离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阳离子交换剂材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和

用阴离子交换剂材料进行的阴离子交换剂处理，其中所述阴离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阴离子交换剂材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和

通过电渗析从纯化溶液中除去盐。

2.根据前述权利要求的方法，其特征在于，所述方法不包括：

i)色谱分离；和/或

ii)使用乙醇和/或乙酸乙酯，任选地不包括使用有机溶剂；和/或

iii)用包含有机溶剂的溶液从固定相洗脱唾液酸的步骤；和/或

iv)使用重金属；和/或

v)将发酵液、澄清溶液和/或纯化溶液加热至高于45℃的温度的步骤。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，通过离心和/或过滤从发酵液中除去生物质。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在阳离子交换剂处理中，使用强阳离子交换剂和/或在阴离子交换剂处理中，使用强阴离子交换剂。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，进行所述阳离子交换剂处理以除去非特异性阳离子并用特异性阳离子替代它们，优选地用特异性阳离子H⁺或Na⁺替代它们，其中如果非特异性阳离子被H⁺替代，则优选地在进行进一步的处理步骤之前，将流穿液的pH调节至pH 6至8，最优选地通过向流穿液中加入NaOH进行调节。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，进行所述阴离子交换剂步骤以除去非特异性阴离子，并用特异性阴离子替代它们，优选地用特异性阴离子Cl^-或OH^-替代它们，其中如果非特异性阴离子被Cl^-替代，则优选地在进行进一步的处理步骤之前，将流穿液的pH调节至pH 6至8，最优选地通过向流穿液中加入NaOH进行调节。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，通过调节澄清溶液的pH和/或盐浓度来建立唾液酸通过阴离子交换剂材料和阳离子交换剂材料的条件，优选地通过将澄清溶液的pH值调节至pH 6至8来建立。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理之后，纯化溶液包含唾液酸、着色物质和盐，其中所述盐优选地为NaCl。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在阴离子交换剂处理中，使用氯化物形式的阴离子交换剂材料，和/或在阳离子交换剂处理中，使用氢形式的阳离子交换剂材料。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，首先对澄清溶液进行阳离子交换剂处理，然后进行阴离子交换剂处理。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，浓缩纯化溶液，优选地通过纳滤和/或反渗透，更优选地通过纳滤来进行浓缩，其中最优选地使用截留分子量为100至200kDa的纳滤膜。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，浓缩澄清溶液和/或纯化溶液，

i)直至唾液酸的浓度≥100g/L，优选地≥200g/L，更优选地≥300g/L；和/或

ii)其通过在＜80℃的温度下的纳滤来进行，优选地＜50℃，更优选地4℃至45℃，更优选地10℃至40℃，甚至更优选地15至30℃，最优选地15至20℃；和/或

iii)其通过在20℃至50℃的温度下的反渗透来进行，更优选地30℃至45℃，最优选地35℃至45℃；和/或

iv)其在＞5巴和＜50巴的压力下进行，优选地在＞10巴和＜40巴的压力下，更优选地在＞15巴和＜30巴的压力下。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，电渗析是在中性条件下的电渗析或在酸性条件下的电渗析。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在从纯化溶液中除去盐之后，

i)纯化溶液中盐的量为＜10％(w/w)，优选地＜5％(w/w)，更优选地＜1％(w/w)；和/或

ii)电导率为0.2至10.0mS/cm²，优选地为0.4至5.0mS/cm²，更优选地为0.5至1.0mS/cm²。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，对澄清溶液和/或纯化溶液进行脱色步骤，优选地通过使用活性炭进行的处理来进行脱色，其中所述除去任选地

i)在澄清溶液的渗滤和/或浓缩步骤之前或之后进行；和/或

ii)在澄清溶液的电渗析和/或渗滤步骤之前或之后进行。

16.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将所述澄清溶液和/或纯化溶液中包含的唾液酸转化成其钠形式，优选地通过用钠形式的强阳离子交换剂材料处理纯化溶液来进行转化。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将纯化溶液喷雾干燥，其中所述纯化溶液优选地包含钠形式的唾液酸。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，对所述纯化溶液进行结晶，优选地通过将乙酸添加至纯化溶液中来进行结晶，其中特别优选地，唾液酸是以二水合物晶体的形式提供。

19.组合物，其包含

a)至少98.00重量％的唾液酸；

b)至多1.00重量％的有机溶剂；和

c)至多1.00重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐。

20.根据权利要求19的组合物，其特征在于，所述组合物包含：

a)98.50至100重量％的唾液酸，优选地99.00至100.00重量％的唾液酸，更优选地99.50至100.00重量％的唾液酸，任选地99.70至99.90重量％的唾液酸；和/或

b)0.00至1.00重量％的有机溶剂，优选地0.00至0.50重量％的有机溶剂，更优选地0.00至0.40重量％的有机溶剂，任选地0.10至0.200重量％的有机溶剂；和/或

c)0.00至1.00重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐，优选地0.00至0.50重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐，更优选地0.00至0.40重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐，任选地0.10至0.20重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐。

21.根据权利要求19或20中任一项的组合物，其特征在于，唾液酸以无定形形式或晶体形式存在，优选地以颗粒形式或晶体形式存在，更优选地以喷雾干燥形式或晶体形式存在。

22.食品组合物，优选地婴儿食品配方物、幼儿食品配方物或医学营养产品，其包括唾液酸和至少一种人乳低聚糖。

23.根据权利要求22的食品组合物，其中所述食品组合物包含至少一种选自以下的糖：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖和乳-N-新四糖。

24.根据权利要求22或23中任一项的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物为

i)液体食品组合物，其包含浓度为1mg/l至2g/l的唾液酸，更优选地浓度为5mg/l至1.5g/l，甚至更优选地浓度为20mg/l至1g/l，最优选地浓度为50mg/l至0.7g/l；或

ii)固体食品组合物，其包含浓度为5mg/kg至15g/kg的唾液酸，更优选地浓度为25mg/kg至10g/kg，甚至更优选地浓度为100mg/kg至10g/kg，最优选地浓度为375mg/kg至5.25g/kg。

25.根据权利要求22至24的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物包含

i)至少一种中性人乳低聚糖，优选地至少一种选自2'-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳-N-新四糖的中性人乳低聚糖，最优选地所有所述中性人乳低聚糖；和

ii)至少一种酸性人乳低聚糖，优选地至少一种选自3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的酸性人乳低聚糖，最优选地所有所述酸性人乳低聚糖；和

iii)L-岩藻糖。

26.根据权利要求22至25中任一项的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物包含至少一种选自以下的物质，任选地所有以下物质：乳糖、乳清蛋白、生物素、脱脂乳、植物油、脱脂奶粉、高山被孢霉(Mortierella alpine)的油、鱼油、碳酸钙、氯化钾、维生素C、氯化钠、维生素E、乙酸亚铁、硫酸锌、烟酸、D-泛酸钙、硫酸铜、维生素A、维生素B1、维生素B6、硫酸镁、碘酸钾、叶酸、维生素K、亚硒酸钠和维生素D。

27.根据权利要求22至26中任一项的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物包含至少一种选自以下的物质：蛋白质源、维生素、油、矿物质、酶、其他碳水化合物和益生菌菌株。

28.根据权利要求22至27中任一项的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物是选自以下的组合物：医疗食品组合物、饮食补充剂、小药囊产品、液体即食婴儿营养产品、液体即食幼儿营养产品、颗粒产品、喷雾干燥的婴儿配方产品及其组合。

29.一种液体即食婴儿或幼儿营养产品，其包含浓度为1mg/l至2g/l的唾液酸、L-岩藻糖和

i)至少一种选自以下的中性人乳低聚糖：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳-N-新四糖；和/或

ii)至少一种选自以下的酸性人乳低聚糖：3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖。

30.一种喷雾干燥的婴儿配方产品，其包含浓度为5mg/kg至15g/kg的唾液酸、L-岩藻糖和

i)至少一种选自以下的中性人乳低聚糖：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳-N-新四糖；和/或

ii)至少一种选自以下的酸性人乳低聚糖：3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖。

31.一种饮食补充剂，其包含唾液酸和至少一种选自以下的中性HMO：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖和乳-N-新四糖。

32.一种预混物，优选地以喷雾干燥、颗粒状或液体产品的形式，其包含唾液酸和至少一种选自以下的物质：蛋白质源、维生素、油、矿物质、酶、其他碳水化合物和益生菌菌株，其中优选地

i)蛋白质源选自乳清、玉米大豆混合物、蛋白质水解物及其组合；和/或

ii)维生素选自维生素A、硫胺素、核黄素、维生素B12、叶酸及其组合；和/或

iii)油选自棕榈油、DHA、花生四烯酸及其组合；和/或

iv)矿物质选自氯化钾、碘酸钾、氧化锌及其组合；和/或

v)酶选自淀粉酶、淀粉葡糖苷酶及其组合；和/或

vi)碳水化合物选自人乳低聚糖(HMO)、低聚半乳糖(GOS)、菊粉(FOS)、L-岩藻糖、其他唾液酸、乳糖及其组合；和/或

vii)益生菌菌株选自(有荚膜的)乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌株及其组合。

33.药物组合物，优选地用于预防或治疗病毒感染、细菌感染、记忆丧失和菌群失调中的至少一种的药物组合物，其包含根据权利要求19至21中任一项的组合物，并且任选地包含至少一种不同于唾液酸的糖和/或至少一种益生菌菌株，其中所述至少一种糖优选地是至少一种选自以下的糖：乳糖、乳果糖、菊粉和蔗糖。

34.根据权利要求19至21中任一项的组合物在制备食品组合物和/或药物组合物中的用途。

Images