CN114878705B - 一种测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值的方法，属于稳定同位素分析技术领域。所述方法包括：1)对燕窝制品进行匀浆处理，得匀浆样品；2)向匀浆样品中加水、活性干酵母，发酵，得去糖发酵液；3)向上述去糖发酵液中添加硫酸，使发酵液酸度为pH＝1，60℃～80℃水浴加热，冷却至室温，离心，收集水解后的上清液，加入氢氧化钠溶液调至pH呈中性；4)将上述游离态唾液酸，浓缩，加入有机试剂，离心；5)重复步骤4)，至液面不再产生白色沉淀为止，得去蛋白上清液；6)对步骤5)所得去蛋白上清液浓缩干燥后，复溶，使用液相色谱‑稳定同位素比值质谱测定唾液酸的稳定碳同位素比值。本方法操作简单、快速，对唾液酸δ13C的分析具有高效率。
Description
技术领域
本发明属于稳定同位素分析技术领域，具体涉及测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值(记作δ13C)的方法。
背景技术
燕窝是传统的高档滋补品，是由金丝雀靠喉部的腺体用唾液或唾液与其绒羽混合凝结而成的巢穴，主产于马来西亚、泰国、印度尼西亚、缅甸等东南亚国家及我国的福建、广东沿海地带，具有较高的食用和药用价值，具养阴润燥、补中益气、入胃补脾、止咳化痰等功能。相关研究表明，燕窝的主要营养成分包括蛋白质、碳水化合物、对人体起作用的必需氨基酸以及微量元素，其中唾液酸为燕窝中主要的生物活性成分。
唾液酸(sialic acid)是含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，是 C-乙酰神经氨酸的俗称，又称燕窝酸，系统命名为5-氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D- 半乳壬酮糖，主要的天然来源是奶制品、蛋类、肉类食品，但含量较低，自然界中唾液酸含量最高的物质是燕窝(含量为5～12％)，故唾液酸又称燕窝酸。
在燕窝及燕窝制品的标准中，唾液酸是燕窝分级中唯一明示的营养成分，也是燕窝分级标准的主要指标。由于燕窝制品是以燕窝为原料，添加或不添加其他辅料加工而成的产品，难免会存在添加市售唾液酸冒充天然唾液酸的情况存在，继而出现行业内“劣币驱逐良币”的问题。
稳定同位素技术在食品掺假检测领域具有重要应用，如蜂蜜、果汁中掺糖检测，葡萄酒中掺水、掺酒精检测等，根据唾液酸的稳定碳同位素特征可辨别当前市售唾液酸与天然唾液酸，进而可鉴别燕窝制品的真伪。但目前尚未有唾液酸稳定碳同位素比值分析的自动快速测定方法。
发明内容
本发明建立了一种稳定可靠、自动化程度高的分析测试方法，为唾液酸δ13C 的分析及其在燕窝制品掺假检测领域的应用奠定了基础。
本发明提出一种测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值(δ13C)的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对燕窝制品进行匀浆处理，得匀浆样品；
2)向匀浆样品中加水、活性干酵母，发酵，得去糖发酵液；
3)向上述去糖发酵液中添加硫酸，使发酵液酸度为pH＝1，60℃～80℃水浴加热，冷却至室温，离心，收集水解后的上清液，加入氢氧化钠溶液调至pH为中性；
4)将步骤3)所得中性上清液浓缩，加入有机试剂，离心；
5)重复步骤4)，至液面不再产生白色沉淀为止，得去蛋白上清液；
6)对上述去蛋白上清液浓缩干燥后，复溶，使用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定唾液酸的稳定碳同位素比值(δ13C)。
本发明基于燕窝制品具有极高糖分含量的成分特征和液相色谱仪-稳定同位素比值质谱仪的先进性、选择性，根据唾液酸稳定碳同位素比值的分析要求，建立了测定燕窝制品中唾液酸δ13C值的方法，为产品中唾液酸的来源分析提供技术支持。
本发明一实施例中，步骤1)中，所述燕窝制品为含有天然唾液酸的产品。所述含有天然唾液酸的产品包括干燕窝、燕角或以燕窝为原料制得的燕窝产品。例如，所述含有天然唾液酸的产品包括冰糖燕窝、鲜炖燕窝等。
本发明一实施例中，步骤2)中，水、匀浆样品的比例为90～100mL：30g，活性干酵母占体系总质量的0.5％。
本发明一实施例中，步骤2)中，所述活性干酵母包括酿酒酵母等。
本发明一实施例中，步骤3)中，使结合态唾液酸水解成游离态唾液酸，得到游离态唾液酸后加入氢氧化钠至上清液呈中性。
本发明一实施例中，步骤3)中，水浴加热的时间为40min。
本发明一实施例中，步骤4)中，所述有机试剂为Sevage试剂。加入Sevage 试剂可有效除去蛋白质类化合物，得含唾液酸的混合物。所述Sevage试剂由三氯甲烷和正丁醇按照体积比4:1配制而成。
本发明一实施例中，步骤4)中，将步骤3)所得中性上清液浓缩至原体积的四分之一，向浓缩液中加入有机试剂，浓缩液与有机试剂体积比为5:1。
本发明一实施例中，步骤6)中，干燥为冷冻干燥或烘干。优选的，干燥为烘干，烘干的温度为105℃。
本发明一实施例中，步骤6)中，复溶采用的溶剂为水。
本发明一实施例中，使用液相色谱-稳定同位素比值质谱，可自动分离唾液酸与其他含碳化合物，并测定唾液酸的稳定碳同位素比值(δ13C)。
本发明一实施例中，确认液相色谱-稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定CO2中δ13C的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。
本发明具有以下优势：
本发明采用样品前处理，基于燕窝制品的产品成分特征和唾液酸稳定碳同位素准确分析的要求，通过除去燕窝制品中大部分糖类化合物、水解结合态唾液酸、除去蛋白质等操作得到含唾液酸的上清液，在线通过液相色谱-稳定同位素比值质谱分离纯化唾液酸并转化测定δ13C值。基于色谱柱的自动、准确分离效果实现了液相色谱-稳定同位素比值质谱仪对燕窝制品中唾液酸δ13C的分析测试，为燕窝制品的掺假检测研究提供了一种新方法。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例LC-IRMS测定燕窝制品样品中唾液酸与糖类化合物的δ13C离子流图；
图2为本发明实施例燕窝制品中掺入市售唾液酸试验测试结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1一种测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值(δ13C)的方法
1.1仪器
液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)、高速分散机、分析天平、恒温培养箱、恒温水浴锅、高速离心机、分液漏斗振荡器。
1.2材料与试剂
唾液酸(分析纯)，葡萄糖(分析纯)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)、酿酒酵母(RW)、三氯甲烷(分析纯)、正丁醇(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)。
1.3色谱条件
流动相为0.005mol/L的硫酸溶液，流速为0.25mL/min；色谱柱温度为 30℃。
1.4样品准备
(1)测试燕窝制品样品：
取100g燕窝制品样品于烧杯中，高速匀浆3min，静置至泡沫消除；
准确称取30g样品，加水定容至100mL，加活性干酵母进行发酵，活性干酵母占体系总质量的0.5％，得去糖发酵液；
发酵完成后，向上述去糖发酵液中加入0.272mL硫酸，使上清液酸浓度为0.05mol/L(pH＝1)；80℃水浴加热40min，冷却至室温；离心，收集上清液，加NaOH中和上清液后，得游离态唾液酸；
将上清液浓缩至原体积的四分之一；向浓缩液中按体积比5:1加入Sevage 试剂，振荡30min，静置后离心，收集上层水相；
重复该步骤至液面不再产生白色沉淀为止；
浓缩干燥(烘干的温度为105℃)上清液，得粉末，使用水复溶后，用LC-IRMS 测定δ13C值，结果见表1。
(2)测试唾液酸(sialic acid)纯品
按照(1)中处理燕窝制品样品的步骤进行唾液酸纯品样品前处理，测定结果见表1。
(3)测试模拟样
根据燕窝制品的成分特征，用唾液酸和葡萄糖(glucose)配制模拟样品：称取 30g葡萄糖和0.15g唾液酸，并用500mL水溶解。然后按照(1)中处理燕窝制品样品的步骤进行样品前处理，测定结果见表1。
1.5样品测定
调整液相色谱-稳定同位素比值质谱仪至工作状态后，测定溶液中唾液酸的δ13C，离子流图谱见附图1。
由附图1可知，唾液酸的离子流图与葡萄糖、果糖完全不重叠，即本方法测定唾液酸的碳同位素比值时可排除糖类物质的干扰。
1.6结果分析
为验证前处理和测定方法的稳定性，燕窝制品与模拟样品均重复处理得两个试样，每个试样测定两次，同时，唾液酸纯品也分两次溶解得两个试样后重复测定，结果见表1。
表1样品中唾液酸δ13C测定结果(‰)
由表1可知，LC-IRMS测定唾液酸δ13C值的重复性均满足分析要求(极差＜ 0.3‰)，比较两个试样的平均测定结果亦不存在显著性差异，可见，前处理过程的稳定性也符合要求。对比唾液酸纯品和模拟样的δ13C值，二者几乎一致，说明样品前处理过程不会改变样品唾液酸δ13C分布特征。
实施例2一种测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值(δ13C)的方法
2.1仪器
液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)、高速分散机、分析天平、恒温培养箱、恒温水浴锅、高速离心机、分液漏斗振荡器。
2.2材料与试剂
唾液酸(分析纯)，葡萄糖(分析纯)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)、酿酒酵母(RW)、三氯甲烷(分析纯)、正丁醇(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)。
2.3色谱条件
流动相为0.005mol/L的硫酸溶液，流速为0.25mL/min；色谱柱温度为 30℃。
2.5样品准备
根据燕窝制品中唾液酸含量，按照50％、100％和200％的比例向燕窝制品中加入市售唾液酸，然后按照实施例1中1.5(1)的方法处理并测定，以样品中唾液酸δ13C测定值为纵坐标、市售唾液酸添加比例为横坐标作图，结果见图2。
由图2可知，按比例向燕窝制品中加入市售唾液酸，样品中唾液酸的δ13C 测定结果呈现逐渐偏正的趋势，并且与添加量呈显著正相关，相关系数R2为 0.9869。说明本发明能够准确测定燕窝制品中唾液酸δ13C值，基于该发明方法检测燕窝制品中有无外源添加市售唾液酸是可行的。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种测定燕窝制品中唾液酸稳定碳同位素比值的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对燕窝制品进行匀浆处理，得匀浆样品；
2)向匀浆样品中加水、活性干酵母，发酵，得去糖发酵液；
3)向上述去糖发酵液中添加硫酸，使发酵液酸度为pH=1，60℃~80℃水浴加热，冷却至室温，离心，收集水解后的上清液，加入氢氧化钠溶液调至pH呈中性；
4)将上述游离态唾液酸，浓缩，加入有机试剂，离心，其中，所述有机试剂为Sevage试剂，所述Sevage试剂由三氯甲烷和正丁醇按照体积比4:1配制而成；
5)重复步骤4)，至液面不再产生白色沉淀为止，得去蛋白上清液；
6)对步骤5)所得去蛋白上清液浓缩干燥后，复溶，使用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定唾液酸的稳定碳同位素比值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)中，所述燕窝制品为含有天然唾液酸的产品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2)中，水、匀浆样品的比例为90~100mL：30 g，活性干酵母占体系总质量的0.5%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤3)中，水浴加热的温度为80℃；水浴加热的时间为40min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤4)中，将步骤3)所得中性上清液浓缩至原体积的四分之一，向浓缩液中加入有机试剂，浓缩液与有机试剂体积比为5:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 步骤6)中，所述干燥为冷冻干燥或烘干。
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