CN113075324A - 一种用hplc测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法，该方法将枇杷果实研磨成粉后，置于超纯水中进行超声辅助提取，离心后进行提取上清液，将上清液用滤膜过滤作为检测样品；然后将所得样品用HPLC进行糖组分和有机酸检测。本发明一次性提取枇杷果实中糖组分和有机酸，并用HPLC精准且快速定量测定枇杷果实中的3种糖组分(果糖、葡萄糖和蔗糖)和6种有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸)，提取方法简单，无需繁琐的提取步骤，同时检测时间短，检测限、精密度和回收率方面的效果优良，具有明显的技术进步。

Description

一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法
技术领域
本发明属于生物农业技术领域，具体涉及一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法，可以实现果实品质的快速定量分析和鉴定。
背景技术
枇杷(Eriobotryajaponica Lindl.)是蔷薇科、枇杷属植物，是多年生木本常绿小乔木，高可达10米；小枝粗壮，黄褐色，密生锈色或灰棕色绒毛。枇杷起源于我国，已有上千年的栽培历史。它的果实成熟于春末夏初的水果淡季，是我国重要的经济果树。
糖和有机酸是枇杷果实食用品质的核心，不同糖组分不仅决定枇杷果实甜度，也是色素、氨基酸、维生素和芳香物质等其他营养成分合成的基础原料。枇杷果实有机酸常被用作抗氧化和防腐的添加剂，也会影响枇杷果实其他有机成分的性质和含量。在枇杷果实的糖和有机酸含量测定中，高效液相色谱(HPLC)法因为分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高的优点而被广泛使用。然而，现有技术中使用HPLC法测定枇杷果实中糖和有机酸含量时存在样品提取步骤繁琐、溶剂耗费量大、分离时间长、分离物质种类少等缺陷。比如，《4个枇杷品种果实糖组分含量及其分布研究》中需要将糖和有机酸分开提取，且在提取中需经过研磨、溶解、真空抽滤、再溶解等步骤，操作较繁琐且耗费试剂。又比如《OrganicAcidsand Sugar Compositions ofSome Loquat Cultivars(EriobotryajaponicaL.)GrowninTurkey》，提取方法较简单，可提取枇杷果实中5种有机酸，但需要分两次提取。即使是其他水果，对糖和有机酸的提取同样存在操作繁琐且耗费试剂的情形，比如《Determinationofsugars,organic acids,aroma components and carotenoids in grapefruitpulps》，虽然能一次性提取葡萄柚果实中的糖和有机酸，但需先用酒精溶解，经过真空蒸发酒精后，再用超纯水溶解，最后离心提取上清液用于检测。
综上，现有技术在单独测定枇杷果实的糖组分和有机酸方面已比较成熟，但对不同糖组分和有机酸的同时测定上还存在以下问题：检测物质种类少、样品处理繁琐、难以同步定量分析等。本领域亟需一种简单高效的提取枇杷果肉中不同糖组分和有机酸并用HPLC检测的方法。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法，该方法样品制备简单，不需要进行真空抽滤、再溶解或者长时间震荡提取等步骤，且一次性提取制备的样品既可以用于枇杷果实中糖组分(果糖、葡萄糖和蔗糖)的测定，也可以用于枇杷果实中有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸)的测定，而且检测过程时间短，具有明显的技术进步。
本发明采用如下技术方案：
一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法，包括待测样品的制备、糖组分的测定、有机酸组分的测定和结果计算步骤，其特征在于：所述待测样品的制备步骤为：将枇杷果肉研磨成粉，置于超纯水中进行超声辅助提取，枇杷果肉与提取液的重量体积比(g/ml)为1：25-30；超声功率为250-280W，超声频率为40-60kHz，超声辅助提取时间为15-20min；然后在4-6℃、8000-10000rpm离心条件下离心12-15min，取上清液用微孔滤膜过滤既得待测样品；所述糖组分为果糖、葡萄糖和蔗糖；所述有机酸为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸。
上述方法中，所述枇杷选自红肉枇杷(华金无核)或白肉枇杷(Q11)。
优选的，上述方法中，研磨前将枇杷果肉置于-80℃冰箱中保存，使用时取出枇杷果肉研磨成粉。
优选的，上述方法中，枇杷果肉与提取液的重量体积比(g/ml)为1：30。
优选的，上述方法中，超声辅助提取时超声功率为250W，超声频率为40kHz，超声辅助提取时间为15min。
优选的，上述方法中，微孔滤膜采用0.22μm微孔水系滤膜。
上述方法中，所述糖组分的测定为将待测样品用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：RID示差检测器；NH2色谱柱：5μm,4.6mm×150mm(GL Science Co.,Japan)；流动相为乙腈：水＝7:3,v/v；流速：0.8mL/min；柱温40℃；RID检测器池温40℃；等度洗脱；进样量10μL。
上述方法中，所述有机酸的测定为将待测样品用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：SPD二极管阵列检测器；C18柱：5μm,4.6mm×150mm(Shim-pack GIST Shimadzu Co.,Japan)；流动相为0.02mol/L KH2PO4水溶液(以H2PO4调节pH为2.52)：甲醇＝90:10,v/v；流速：0.8mL/min；柱温30℃；等度洗脱；进样量10μL。
上述方法中，有机酸的检测波长为210nm。
优选的，上述方法中，所用高效液相色谱仪为岛津LC—20AD(Shimadzu Co.,Japan)。
上述方法中，糖组分结果计算：
果糖的结果计算公式为：y＝74981x-2022.9，其中，x为果糖质量浓度，单位为mg/ml，y为果糖利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
葡萄糖的结果计算公式为：y＝112587x+24716，其中，x为葡萄糖质量浓度，单位为mg/ml，y为葡萄糖利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
蔗糖的结果计算公式为：y＝70534x-6191.6，其中，x为蔗糖质量浓度，单位为mg/ml，y为蔗糖利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积。
上述方法中，有机酸结果计算：
草酸的结果计算公式为：y＝2000000x+4417.4，其中，x为草酸质量浓度，单位为mg/ml，y为草酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
酒石酸的结果计算公式为：y＝7000000x+37989，其中，x为酒石酸质量浓度，单位为mg/ml，y为酒石酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
苹果酸的结果计算公式为：y＝2000000x+2079.6，其中，x为苹果酸质量浓度，单位为mg/ml，y为苹果酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
柠檬酸的结果计算公式为：y＝476450x+173.24，其中，x为柠檬酸质量浓度，单位为mg/ml，y为柠檬酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
琥珀酸的结果计算公式为：y＝649953x-320.12，其中，x为琥珀酸质量浓度，单位为mg/ml，y为琥珀酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
富马酸的结果计算公式为：y＝90000000x+9836.1，其中，x为富马酸质量浓度，单位为mg/ml，y为富马酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积。
有益效果：
本发明提供一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法，该方法样品制备简单，不需要繁琐的提取步骤，且一次性提取制备的样品既可以用于同时测定枇杷果实中的3种糖组分(果糖、葡萄糖和蔗糖)，也可以用于同时测定枇杷果实中的6种有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸)，样品制备时间短。
本发明样品制备不需先用酒精溶解，经过真空蒸发酒精后，再用超纯水溶解的步骤，也不需要进行真空抽滤再溶解或者长时间震荡提取等步骤，样品制备过程简单，进一步缩短了样品制备的时间。
本发明样品检测时，三种糖组分用一个检测条件，六种有机酸组分用另一个检测条件，从而大大缩短了检测时间，进一步缩短了整个方法的测定时间，具有明显的技术进步。本发明方法检测限低，果糖线性范围0.25-50mg/ml，葡萄糖线性范围0.1-50mg/ml，蔗糖线性范围0.5-50mg/ml，草酸线性范围0.025-1mg/ml；酒石酸线性范围0.001-1mg/ml；苹果酸线性范围0.001-1mg/ml；柠檬酸线性范围0.0025-2.5mg/ml；琥珀酸线性范围0.001-1mg/ml；富马酸线性范围0.001-1mg/ml。本发明方法精密度良好，回收率高，具有很高的实际应用价值。
附图说明
图1为3种糖组分的混合标准溶液的HPLC色谱图，其中峰1代表果糖，峰2代表葡萄糖，峰3代表蔗糖；
图2为红肉枇杷(华金无核)的样品提取液在RID检测器下的色谱图，其中峰1代表果糖，峰2代表葡萄糖，峰3代表蔗糖；
图3为白肉枇杷(Q11)的样品提取液在RID检测器下的色谱图，其中峰1代表果糖，峰2代表葡萄糖，峰3代表蔗糖；
图4为6种有机酸的混合标准溶液的HPLC色谱图，其中峰1代表草酸，峰2代表酒石酸，峰3代表苹果酸，峰4代表柠檬酸，峰5代表琥珀酸，峰6代表富马酸；
图5为红肉枇杷(华金无核)的样品提取液在SPD检测器下的210nm的色谱图，其中峰1代表草酸，峰2代表酒石酸，峰3代表苹果酸，峰4代表柠檬酸，峰5代表琥珀酸，峰6代表富马酸；
图6为白肉枇杷(Q11)的样品提取液在SPD检测器下的210nm的色谱图，其中峰1代表草酸，峰2代表酒石酸，峰3代表苹果酸，峰4代表柠檬酸，峰5代表琥珀酸，峰6代表富马酸；
图7为不同提取方法下不同糖组分的HPLC检测结果，其中不同字母代表差异显著，含有相同字母代表差异不显著，P<0.05；
图8为不同提取方法下不同有机酸的HPLC检测结果，其中不同字母代表差异显著，含有相同字母代表差异不显著，P<0.05；
图9为不同提取方法下不同糖组分的HPLC色谱图，其中不同提取方法的色谱图中的峰1代表果糖，峰2代表葡萄糖，峰3代表蔗糖；
图10为不同提取方法下不同有机酸的HPLC色谱图，其中M1、M2、M3分别代表不同的提取方法，不同提取方法的色谱图中的峰1代表草酸，峰2代表酒石酸，峰3代表苹果酸，峰4代表柠檬酸，峰5代表琥珀酸，峰6代表富马酸；
图11为不同流动相参数条件下不同有机酸的HPLC色谱图，其中P1、P2、P3、P4分别代表不同的参数条件，不同参数条件的色谱图中的峰1代表草酸，峰2代表酒石酸，峰3代表苹果酸，峰4代表柠檬酸，峰5代表琥珀酸，峰6代表富马酸。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
本发明所用原料及试剂均为市售产品。
试剂与仪器：
标准品：糖组分标准品为果糖(Fructose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(Sucrose)分析纯试剂，购自于Aladdin公司；有机酸标准品为苹果酸(Malic acid)、草酸(Oxalic acid)、柠檬酸(Citric acid)、琥珀酸(Succinic acid)、富马酸(fumaric acid)、酒石酸(tartaric acid)；均购自于Sigma公司，纯度均在98％以上。
流动相所用的甲醇、磷酸、乙腈和KH2PO4均为色谱纯，购自Sigma公司；超纯水采用哇哈哈纯净水。
本试验采用的高效液相为岛津LC—20AD(Shimadzu Co.,Japan)；C18色谱柱：4.6mm×250mm(Shim-pack GIST Shimadzu Co.,Japan)，5μm；NH2色谱柱：4.6mm×250mm，5μm(GLScience Co.,Japan)。
超声波清洗器采用洁力美超声仪器有限公司的KS-250DE型号；离心机和电子天平购自于Thermo公司。
实施例1
(1)不同糖组分的标准曲线绘制：用天平准确称取果糖、葡萄糖、蔗糖1.00g，用超纯水溶解，定容于10mL容量瓶，将上述母液分别用超纯水配置成50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/L的浓度梯度，保存于-20℃以下的环境中。在色谱条件下进行色谱分析，并且计算出各标准品的回归方程和相关系数；
有机酸标准曲线的绘制：用超纯水将不同标准品溶解，后定容于10mL棕色容量瓶中。如表1所示，将不同标准品母液依据浓度不同，分别配制成不同浓度梯度，保存于-20℃以下的环境中。在色谱条件下进行色谱分析，并且计算出各标准品的回归方程和相关系数；
表1有机酸标准液不同浓度梯度
Figure BDA0002998930760000061
(2)提取方法：
本试验提取方法(M1)：从-80℃冰箱中称取枇杷果肉至研钵中，研磨成粉，准确称取0.05g枇杷粉末放入2mL离心管中，加入1.5mL超纯水，充分混匀。后将离心管放入超声装置中辅助提取，超声15min后，在4℃、10000rpm离心条件下离心15min。用0.22μm水系微孔滤膜过滤上清液，贮存于-20℃用于糖组分和有机酸的分析。
(3)对样品进行高效液相色谱分析：
色谱条件：使用岛津LC—20AD(Shimadzu Co.,Japan)高效液相色谱仪
糖组分测定条件
RID示差检测器；NH2色谱柱：5μm,4.6mm×250mm(GL Science Co.,Japan)；流动相为乙腈：水＝7:3,v/v；流速：0.8mL/min；柱温40℃；RID检测器池温40℃；等度洗脱；进样量10μL。
有机酸测定条件
SPD二极管阵列检测器；C18柱：5μm,4.6mm×250mm；流动相为0.02mol/L KH2PO4水溶液(以H2PO4调节pH为2.52)：甲醇＝90:10,v/v；流速：0.8mL/min；柱温30℃；等度洗脱；进样量10μL。
所述糖组分为果糖、葡萄糖和蔗糖；所述有机酸为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸。
有机酸的检测波长为210nm。由于实验所用高效液相为岛津LC—20AD(ShimadzuCo.,Japan)检测器，在方法中设置中能自动检测并调整到最适波长进行测定。但对于不能自动检测并调整最适波长的仪器和检测器，需要进行手工设定。
3种糖组分的混合标准溶液的HPLC色谱如图1所示，红肉枇杷(华金无核)的样品提取液在RID检测器下的色谱如图2所示，白肉枇杷(Q11)的样品提取液在RID检测器下的色谱如图3所示。
6种有机酸的混合标准溶液的HPLC色谱如图4所示，红肉枇杷(华金无核)的样品提取液在SPD检测器下的210nm的色谱如图5所示，白肉枇杷(Q11)的样品提取液在SPD检测器下的210nm的色谱如图6所示。
(4)回收率测定
准确称取已知含量的样品6份，根据样品中各糖组分和有机酸物质含量确定各标样的添加量，分别加入0.5倍、1.0倍、1.5倍的混合标准溶液，然后将进行回收率测定，回收率测定公式为(1)
Figure BDA0002998930760000071
(5)将样品溶液的分析结果与标准曲线比较，计算出样品溶液中的不同糖组分和有机酸的含量。不同标准品的出峰时间、曲线线性回归方程、相关系数、最低检测限、相对标准偏差和回收率的结果如表2和表3所示。
表2不同糖组分标准品的出峰时间、曲线线性回归方程、相关系数、最低检测限、相对标准偏差和回收率
Figure BDA0002998930760000072
表3不同有机酸组分标准品的出峰时间、曲线线性回归方程、相关系数、最低检测限、相对标准偏差和回收率
Figure BDA0002998930760000073
结果表明，本发明方法检测限低，精密度良好，回收率高，具有很高的实际应用价值。
(6)不同提取方法对比试验：
参照上述枇杷果实中糖和有机酸含量的测定方法，考察不同提取方法对提取效果的影响。
对照提取方法(M2)：从-80℃冰箱中称取枇杷果肉至研钵中，研磨成粉，准确称取0.05g枇杷果肉粉末放入2mL离心管中，加入1.5mL超纯水，充分混匀。后将离心管放入水浴锅后用95℃水浴15min，再将该溶液放置于超声装置中辅助提取，超声15min后，在4℃、10000rpm离心条件下离心15min。用0.22μm水系微孔滤膜过滤上清液，贮存于-20℃用于糖组分和有机酸的分析。
对照提取方法(M3)：从-80℃冰箱中取2g枇杷果肉用5.0mL预冷80％乙醇研磨，将该溶液在35℃的水浴中静置20min，后将其用10000rpm离心10min，重复三次，将上清液合并，用80％乙醇将总体积定容至25ml。将该混合物在45℃下真空干燥至剩下1mL左右，残渣再用0.5ml蒸馏水提取，用0.22μm水系微孔滤膜过滤上清液，贮存于-20℃用于糖组分和有机酸的分析。
按这3种不同提取方法提取白肉枇杷Q11进行不同糖组分和有机酸的提取，每种提取方法进行3次重复，依据标曲算出每种提取方法所测得的不同糖组分和有机酸的含量。结果如图7和图8所示，不同提取方法下不同糖组分的HPLC色谱如图9所示，不同提取方法下不同有机酸的HPLC色谱如图10所示。在不同糖组分的检测结果中，M1和另外两种提取方法无明显差异。在不同有机酸的检测结果中，除了琥珀酸M1所测含量显著高于M3，其余每种有机酸M1和另外两种提取方法无明显差异。所以这3种提取方法所测试的结果无显著差异。
参照上述实施例，考察不同提取方法下单个样品所需时间，如表4所示，M1提取过程最为简单，相对于M2省略了高温水浴的步骤；相对于M3省略了真空干燥步骤，大大的提交了试验效率，故本专利选取M1为不同糖组分和有机酸的提取方法。
表4各提取方法单个样品所需时间
Figure BDA0002998930760000081
研究发现，流动相中有机相比例太低会超过岛津液相的仪器承受标准(有机相比例不得低于10％)，本试验对不同有机酸的色谱条件中流动相进行考察，具体如表5所示：
表5不同流动相对比试验
Figure BDA0002998930760000091
流动相考察试验结果如表6和图11所示。在草酸时的各处理出峰时间无明显差异，但随着时间推进，各处理的不同有机酸出峰时间出现显著差异，P1和P2的出峰时间没有显著差异，与P3、P4逐渐出峰时间拉开。其中P1的各个有机酸的出峰时间相较于其余处理更大，如图11所示色谱图中各峰形也更完整，使得系统识别峰面积更加准确，使结果更加准确。故本试验选用P1作为色谱条件中的流动相参数。
表6不同处理出锋面积
Figure BDA0002998930760000092
综上，本发明方法能一次性提取枇杷果实中糖组分和有机酸，并用HPLC精准且快速定量测定枇杷果实中的3种糖组分(果糖、葡萄糖和蔗糖)和6种有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸)，提取方法简单，无需繁琐的提取步骤，同时检测时间短，检测限、精密度和回收率方面的效果优良，具有明显的技术进步。

Claims (10)

1.一种用HPLC测定枇杷果实中糖和有机酸含量的方法，包括待测样品的制备、糖组分的测定、有机酸组分的测定和结果计算步骤，其特征在于：所述待测样品的制备步骤为：将枇杷果肉研磨成粉，置于超纯水中进行超声辅助提取，枇杷果肉与提取液的重量体积比(g/ml)为1：25-30；超声功率为250-280W，超声频率为40-60kHz，超声辅助提取时间为15-20min；然后在4-6℃、8000-10000rpm离心条件下离心12-15min，取上清液用微孔滤膜过滤既得待测样品；所述糖组分为果糖、葡萄糖和蔗糖；所述有机酸为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枇杷选自红肉枇杷或白肉枇杷。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述红肉枇杷为华金无核枇杷；所述白肉枇杷为Q11枇杷。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：研磨前将枇杷果肉置于-80℃冰箱中保存，使用时取出枇杷果肉研磨成粉。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：枇杷果肉与提取液的重量体积比(g/ml)为1：30。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：超声辅助提取时超声功率为250W，超声频率为40kHz，超声辅助提取时间为15min。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述糖组分的测定为将待测样品用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：RID示差检测器；NH2色谱柱：5μm,4.6mm×150mm；流动相为乙腈：水＝7:3,v/v；流速：0.8mL/min；柱温40℃；RID检测器池温40℃；等度洗脱；进样量10μL。
8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述有机酸的测定为将待测样品用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：SPD二极管阵列检测器；C18柱：5μm,4.6mm×150mm；流动相为0.02mol/LKH2PO4水溶液：甲醇＝90:10,v/v；流速：0.8mL/min；柱温30℃；等度洗脱；进样量10μL。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：有机酸的检测波长为210nm。
10.如权利要求1所述的方法，包括待测样品的制备、糖组分的测定、有机酸组分的测定和结果计算步骤，其特征在于：
(1)所述待测样品的制备步骤为：将枇杷果肉置于-80℃冰箱中保存，使用时取出枇杷果肉研磨成粉，置于超纯水中进行超声辅助提取，枇杷果肉与提取液的重量体积比(g/ml)为1：30；超声功率为250W，超声频率为40kHz，超声辅助提取时间为15min；然后在4-6℃、8000-10000rpm离心条件下离心12-15min，取上清液用微孔滤膜过滤既得待测样品；所述枇杷选自华金无核枇杷或Q11枇杷；
(2)所述糖组分的测定为：将待测样品用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：RID示差检测器；NH2色谱柱：5μm,4.6mm×150mm；流动相为乙腈：水＝7:3,v/v；流速：0.8mL/min；柱温40℃；RID检测器池温40℃；等度洗脱；进样量10μL；所述糖组分为果糖、葡萄糖和蔗糖；
(3)所述有机酸组分的测定为：将待测样品用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：SPD二极管阵列检测器；C18柱：5μm,4.6mm×150mm；流动相为0.02mol/LKH2PO4水溶液：甲醇＝90:10,v/v；流速：0.8mL/min；柱温30℃；等度洗脱；进样量10μL；所述有机酸为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸；
(4)所述结果计算为按照下式计算糖组分和有机酸组分的含量：
果糖的结果计算公式为：y＝74981x-2022.9，其中，x为果糖质量浓度，单位为mg/ml，y为果糖利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
葡萄糖的结果计算公式为：y＝112587x+24716，其中，x为葡萄糖质量浓度，单位为mg/ml，y为葡萄糖利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
蔗糖的结果计算公式为：y＝70534x-6191.6，其中，x为蔗糖质量浓度，单位为mg/ml，y为蔗糖利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积。
草酸的结果计算公式为：y＝2000000x+4417.4，其中，x为草酸质量浓度，单位为mg/ml，y为草酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
酒石酸的结果计算公式为：y＝7000000x+37989，其中，x为酒石酸质量浓度，单位为mg/ml，y为酒石酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
苹果酸的结果计算公式为：y＝2000000x+2079.6，其中，x为苹果酸质量浓度，单位为mg/ml，y为苹果酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
柠檬酸的结果计算公式为：y＝476450x+173.24，其中，x为柠檬酸质量浓度，单位为mg/ml，y为柠檬酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
琥珀酸的结果计算公式为：y＝649953x-320.12，其中，x为琥珀酸质量浓度，单位为mg/ml，y为琥珀酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积；
富马酸的结果计算公式为：y＝90000000x+9836.1，其中，x为富马酸质量浓度，单位为mg/ml，y为富马酸利用高效液相色谱仪进行检测出的色谱图峰面积。
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