CN103705592A - 一种枇杷叶的乙醇提取物及其制备、检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及枇杷叶提取物、方法和应用，具体涉及一种枇杷叶的乙醇提取物及其制备、检测方法和用途，其有效成分是三萜类和酚类。本发明首次提供了枇杷叶提取物在制备抗肿瘤的药物中的应用，并提供了应用超高液相色谱-质谱联机分析技术及结果构建枇杷叶提取物指纹图谱分析方法。该方法包括枇杷叶提取物的超高液相色谱-质谱分析条件、色谱峰的特征。色谱组分的质谱提供的化合物结构信息等。本发明公开的指纹图谱及其技术可用于枇杷叶的品种鉴别及枇杷叶提取物的质量监控。

Description

一种枇杷叶的乙醇提取物及其制备、检测方法和用途

[技术领域]

本发明涉及枇杷叶提取物、方法和应用，具体涉及一种枇杷叶的乙醇提取物及其制备、检测方法和用途。

[背景技术]

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的干燥叶。具有清肺止咳，降逆止呕的功效,临床用于治疗肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴。其主要分布于我国中南及江西、福建、江苏、浙江、陕西、甘肃等地。化学成分主要有黄酮类、多酚类、倍半萜及其苷类等，具有镇咳、祛痰、平喘、抗菌等作用。

国内发明申请CN1939443A公开了一种枇杷叶提取物的制备方法和用途，该提取物主要采用极性有机溶剂提取，如甲醇、乙醇、丙醇等，得到的提取物能制作成药剂，并具有化痰、止咳、平喘、消炎、抗病毒和降血糖。

[发明内容]

为了提取一种能够治疗肿瘤的枇杷叶有效成分，本发明提供了一种枇杷叶的乙醇提取物及其制备、检测方法和用途。

为实现上述目的，设计一种枇杷叶的乙醇提取方法，包括以下步骤：

a.枇杷叶用石油醚浸泡18～36h，每100g枇杷叶需要300～800ml的石油醚，然后渗滤回收残渣；

b.所述的残渣用70～90%的乙醇提取浓缩，浓缩后的浓缩液相对于于乙醇的密度为1.15～1.20，即为枇杷叶乙醇提取物.

上述制备方法还具有如下优化方案：

所述的步骤（b）中，乙醇提取的次数为2次，每次提取时间为2小时，合并2次提取液进行所述的浓缩。

所述的步骤（b）中，乙醇的浓度为80%。

步骤（a）中，所述的枇杷叶先经过粉碎，粉碎后的粒径为250～850μm。

步骤（a）中，所述的浸泡，需要的时间为24h。

一种用上述方法提取得到的枇杷叶乙醇提取物，其特征在于所述的枇杷叶乙醇提取物主要成分为三萜类和酚类。具体为酒石酸、金丝桃苷、5,5’-二羟基-3’-甲氧基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基联苯、山香二烯酸、正十三烷酸、2α-羟基熊果酸、苹果酸、熊果酸、齐墩果酸、表儿茶素、儿茶素和正二十一烷醇。

一种药物制剂，由上述的姜黄的乙醇提取物和药学上可接受的载体组成。

所述的制剂为片剂、散剂、片剂、胶囊或口服液。

一种检测上述枇杷叶的乙醇提取物的方法，用超高效液相色谱-电喷雾串联质仪对所述枇杷叶提取物进行分析，以获得枇杷叶乙醇提取物的UPLC-Q-TOF-MS图谱，

a.质谱条件为：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N2压力为50psi；干燥气N2流速为15L/min；质量扫描范围50～1200；自动3级质谱；

b.色谱分析条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^TM BEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)；二元梯度洗脱，A相为0.1%甲酸水溶液；B相为乙腈，流速为0.3mL/min，梯度洗脱的程序如下：90%A相，逐渐减少A相比例，至14min时A相比例为0，保持2min，流速：0.3mL/min；进样量3μL。

本发明首次提供了枇杷叶提取物在制备肿瘤的药物中的应用，并且提供了应用超高效液相色谱-质谱联机分析技术及结果构建枇杷叶提取物指纹图谱的方法。该方法包括枇杷叶提取物的UPLC-MS分析条件。色谱峰的特征、色谱组分的质谱提供的化合物结果信息等。本发明公开的指纹图谱及其技术可用于枇杷叶的品种鉴别及枇杷叶提取物的质量监控。

[附图说明]

枇杷叶UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下总离子流图。

[具体实施方式]

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合附图对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

枇杷叶的乙醇提取物

由以下方法制备：枇杷叶粉碎，过35目筛得到粒径为250μm的枇杷叶颗粒，称取枇杷叶颗粒500g，用2000ml石油醚渗滤，先用石油醚浸泡18h，至渗漉液颜色变浅（渗滤液约为2500ml），回收残渣，挥干残渣中的石油醚，用70%乙醇提取2次，每次乙醇用量为2500ml，每次提取时间为2小时，合并提取液，将其减压浓缩至无醇味，相对密度为1.15-1.20，蒸干后得乙醇提取物。

实施例2

枇杷叶的乙醇提取物

由以下方法制备：取枇杷叶粉碎，过20目筛得到粒径为850μm的枇杷叶颗粒，称取枇杷叶颗粒500g，用1500ml石油醚浸泡24h，得到残渣和渗滤液（渗滤液体积约为2000），将残渣挥干石油醚，浓度为80%的乙醇提取2次，每次乙醇用量为1500ml，每次提取时间为2小时，合并两次提取液，减压浓缩至相对密度1.15-1.20，烘干后得乙醇提取物。

实施例3

枇杷叶的乙醇提取物

由以下方法制备：取枇杷叶粉碎，过30目筛得到粒径为450μm的枇杷叶颗粒，枇杷叶用石油醚渗滤，先用2000ml石油醚浸泡36h，得到残渣和渗滤液（渗滤液体积约为2500ml），挥干残渣中的石油醚，用90%乙醇提取，提取3次，每次乙醇用量为2000ml，提取时间为3小时，合并提取液，然后浓缩至无醇味，相对密度为1.15-1.20，烘干后得乙醇提取物，干燥后所得的枇杷叶提取物为棕黑色。

本发明所得的枇杷叶提取物对肿瘤有预防和治疗作用。可以按照常规制剂工艺，将本发明所述的枇杷叶提取物制备成任何一种适合于临床使用的制剂，例如散剂、片剂。胶囊、口服液等。

实施例4

枇杷叶的乙醇提取物的颗粒剂

组成：枇杷叶的乙醇提取物（实施例3的方法制备）50g，淀粉15g，微晶纤维素20g，硬脂酸镁6g。

实施例5

用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪对枇杷叶的乙醇提取物进行分析以获得提取物的指纹图谱。其色谱分析条件为：Waters ACQUITY UPLC ^TM BEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)柱；二元梯度洗脱，A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈流速0.3mL/min;进样量3μL。

优选的色谱条件：

优选的质谱条件：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N2压力50psi;干燥气N2，流速15L/min;质量扫描范围50--1200；自动3级质谱。

实施例6

实验部分

1.1试剂与样品

乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；超纯水，实验室ELGA PURELABClassic-UVF纯水机，英国；其他试剂均为市售国产分析纯；筛选样品为枇杷叶乙醇提取物。

1.2样品处理

药材样品粉碎成粗粉，取粗粉500克，先用石油醚浸泡1天后渗滤提取至提取液颜色浅（或5倍药材量），回收石油醚，得石油醚提取物；残渣挥去石油醚，用80%乙醇湿润后，再用3倍量80%乙醇回流提取两次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积乙醇萃取2次，合并乙醇萃取液，回收乙醇至干，得乙醇萃取物；母液浓缩至干，得乙醇提取物；

1.3仪器与条件

美国Waters Acquity^TM UPLC/Q-TOF Premier;MassL-ynxV4.1工作站。

色谱条件为：90%A相，逐渐减少A相比例，至14min时A相比例为0，保持2min，流速：0.3mL/min；进样量3μL。

质谱条件：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N2压力50psi；干燥气N2，流速15L/min；质量扫描范围50--1200；自动3级质谱。（自动选择最强离子进行源内诱导裂解）。

结果与分析

UPLC-Q—TOF—MS（﹢）分析结果及其指纹图谱信息色谱组分一级质谱包含的离子及一级质谱中主要离子的二级和三级质谱。

图1的枇杷叶提取物的UPLC-Q-TOF-MS（﹢）分析的总离子流色谱图的峰组分指纹信息如下表所示：

实施例7

活性测定方法

EGFR激酶活性测定方法

采用均相时间分辨荧光(HTRF)法测酶的活性，加入ATP后启动反应，激酶使底物发生磷酸化反应，将磷酸根连接在有生物素标记的底物上。在这个过程中EDTA终止了反应的进行，有铕元素标记抗磷酸化酪氨酸抗体靠近底物的磷酸根上，标记XL665的异藻蓝蛋白结合在底物的生物素标记上，两个荧光基团在互相靠近的过程中发生能量共振转移并在665nm处产生荧光，游离的TKantibody(标记铕离子)在620nm处发生荧光，此信号可作为背景信号，而游离的SA-XL665只产生短暂的荧光，通过延后检测时间即加入终止剂后1小时再进行检测,可将其忽略。最终仪器给出的信号值由下列公式进行计算：Ratio=(665nm/620nm)×10⁴。

在反应容器中每孔加入EGFR激酶溶液化合物大规模筛选在384孔板中进行,用PP-550MS移液器转移液体,在反应容器中每孔加入EGFR激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。反应1小时。每孔加入TK-Ab5μl，SA-XL6655μl，室温孵育1小时。利用Beckman Coulter检测平台HTRF模块进行检测。EGFR激酶非选择性抑制剂为Staurosporine,以检验方法的可靠性。

2.2.2样品筛选

初筛枇杷叶提取物,计算抑制率后对高活性样品进行复筛。复筛时每个样品依次稀释为5个浓度,实验重复三次，分别为50,5,0.5,0.05,0.005μg·mL^-1。根据测定结果计算IC₅₀。

结果

得到抑制率大于80%的枇杷叶提取物进行复筛，呈阳性，依次稀释5个浓度，计算IC₅₀。从表1中可以看出：枇杷叶四个部位具有不同程度的EGFR激酶抑制活性。其乙醇部位抑制活性最强，在终浓度为50μg·mL^-1时，抑制率分别为19.36%，25.15%，43.81%，26.16%。枇杷叶乙醇部位IC₅₀4.339μg·mL^-1，其它三个部位未检测到。

Claims (10)

1.一种枇杷叶的乙酸乙酯提取方法，其特征在于包括以下步骤：

a.枇杷叶用石油醚浸泡18～36h，每100g枇杷叶需要300～800ml的石油醚，然后渗滤回收残渣；

b.所述的残渣用70～90%的乙醇提取浓缩，浓缩后的浓缩液相对于于乙醇的密度为1.15～1.20，

c.将所述的浓缩液用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层的萃取液。

2.如权利要求1所述的枇杷叶的乙酸乙酯提取方法，其特征在于所述的步骤（b）中，乙醇提取的次数为2次，每次提取时间为2小时，合并2次提取液进行所述的浓缩。

3.如权利要求1所述的枇杷叶的乙酸乙酯提取方法，其特征在于所述的步骤（b）中，乙醇的浓度为80%。

4.如权利要求1所述的枇杷叶的乙酸乙酯提取方法，其特征在于步骤（a）中，所述的枇杷叶先经过粉碎，粉碎后的粒径为250～850μm。

5.如权利要求1所述的枇杷叶的乙酸乙酯提取方法，其特征在于步骤（a）中，所述的浸泡，需要的时间为24h。

6.一种用权利要求1方法提取得到的枇杷叶乙酸乙酯提取物，其特征在于所述的枇杷叶乙酸乙酯提取物主要成分为三萜类和酚类。

7.如权利要求6所述的枇杷叶乙酸乙酯提取物，其特征在于所述的枇杷叶乙酸乙酯提取物的主要成分为酒石酸、金丝桃苷、5,5’-二羟基-3’-甲氧基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基联苯、山香二烯酸、正十三烷酸、2α-羟基熊果酸、苹果酸、熊果酸、齐墩果酸、表儿茶素、儿茶素和正二十一烷醇。

8.一种药物制剂，由权利要求6或7所述的姜黄的乙酸乙酯提取物和药学上可接受的载体组成。

9.如权利要求8所述的药物制剂，其特征在于所述的制剂为片剂、散剂、片剂、胶囊或口服液。

10.一种检测权利要求6所述枇杷叶的乙酸乙酯提取物的方法，用超高效液相色谱-电喷雾串联质仪对所述枇杷叶提取物进行分析，以获得枇杷叶乙酸乙酯提取物的UPLC-Q-TOF-MS图谱，其特征在于：

a.质谱条件为：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N₂压力为50psi；干燥气N₂流速为15L/min；质量扫描范围50～1200；自动3级质谱；

b.色谱分析条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^TM BEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)；二元梯度洗脱，A相为0.1%甲酸水溶液；B相为乙腈，流速为0.3mL/min，梯度洗脱的程序如下：90%A相，逐渐减少A相比例，至14min时A相比例为0，保持2min，流速：0.3mL/min；进样量3μL。