CN109856306A - 一种uhplc-ms-ms测定水翁花中熊果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种UHPLC‑MS‑MS测定水翁花中熊果酸的方法，其包括以下步骤：取水翁花药材粉末，加入甲醇，超声处理，加甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液加甲醇定容，即得供试品溶液；取熊果酸对照品，加甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；取对照品溶液制成不同浓度的熊果酸标准溶液，注入高效液相色谱‑质谱联用仪中分析，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线，将供试品溶液注入高效液相色谱‑质谱联用仪中，测得供试品溶液的峰面积，计算得出熊果酸的含量。本发明采用UHPLC检测方法，操作简单快速，稳定可靠，灵敏度和重复性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间，便于对水翁花中熊果酸进行定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及化学检测领域，具体涉及一种UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法。
背景技术
水翁花为两广民间习用药材，主要有清热、镇痛、抗炎等功效。目前为止，水翁花的药材标准收载于《广东省药材标准》(第一册)，现行版《中国药典》并未收载。同时，相关标准仅涉及水翁花的形状、鉴别等项目，缺乏对水翁花中熊果酸快速、高效、可量化的质量评价、分析标准。因此，建立一种利用UHPLC-MS-MS对水翁花中熊果酸的测定方法，对于促进熊果酸的开发利用有重要作用。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明公开了一种UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：
一种UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的制备：取水翁花药材粉末，加入甲醇，超声处理，加甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液加甲醇定容，即得供试品溶液；
步骤2，对照品溶液的制备：取熊果酸对照品，加甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；
步骤3，含量的测定：取对照品溶液制成不同浓度的熊果酸标准溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪中分析，以熊果酸标准溶液的进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线，将供试品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪中，测得供试品溶液的峰面积，计算得出熊果酸的含量。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中在步骤3中，高效液相色谱-质谱联用仪的色谱条件：采用Phenomenex-C18柱为色谱柱，色谱柱规格为2.0×50mm、5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，流速为700μL/min，柱温为25℃，进样量为10μL。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中梯度洗脱的条件：0-1min，5-5％A；1.0-1.5min，5-95％A；1.5-2.5min，95-95％A；2.5-3.0min，95-5％A。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中在步骤3中，高效液相色谱-质谱联用仪的质谱条件：ESI离子源，采用质谱正、负离子模式，汽化室温度为350℃，鞘气压力为30psi，辅气压力为10psi，离子传输管温度为300℃；水翁花检测采用SIM模式，质荷比为455.5。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中正离子模式喷雾电压为3500V，负离子模式喷雾电压为3000V。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中在步骤1中，水翁花药材粉末与甲醇的比例为0.5g水翁花药材粉末：25mL甲醇。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中在步骤1中，超声处理30min，采用0.22μm微孔滤膜过滤。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中在步骤3中，取适量对照品溶液，分别加甲醇稀释并定容，制得浓度分别为10、50、100、200、500、1000ng/mL的熊果酸标准溶液。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中在步骤2中，制得的对照品溶液的浓度为115.5μg/mL。
上述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其中标准曲线为y＝1115.4x+4815.8，r2＝0.9996，进样浓度x的取值范围为10-1000ng/mL。
本发明的有益效果为：本发明采用UHPLC检测方法，提取效率高，操作简单快速，稳定可靠，灵敏度和重复性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间，便于对水翁花中熊果酸进行定量检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为对照品溶液和供试品溶液的离子流图，其中A为对照品溶液(浓度为500ng/mL)，B为供试品溶液。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法作进一步说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，而非对本发明进行限制。
实施例：
1.仪器
Thermo Fisher TSQ-Quantum高效液相色谱-质谱联用仪(三重四极杆，ESI离子源，Accela型高压泵，Accela型自动进样器，美国)；Phenomenex-C18柱(2.0×50mm，5μm，美国Phenomenex公司)；XS205DU型1/10万电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；低温高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；涡旋混合仪(美国Thermo Fisher公司)。
2.试剂和材料
熊果酸对照品(批号110742-201622)购自中国食品药品检定研究院，提取和样品前处理用甲醇为分析纯，购自广州化学试剂厂(中国)，UHPLC-MS-MS分析用乙腈为色谱纯，购自Merck公司(德国)，实验用去离子水采用Millipore自动净水机制备(德国Millipore公司)，水翁花药材购自广东康美药业股份有限公司。
3.样品制备
3.1供试品溶液的制备
取水翁花药材粉末，过三号筛，精密称定约0.5g，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称重，超声30min，放冷后称重，加甲醇补足减失重量，所得溶液以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
3.2对照品溶液的制备
取熊果酸对照品适量，精密称定，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得每mL含熊果酸对照品115.5μg的对照品溶液。
4.UHPLC-MS-MS测定条件
质谱条件：ESI离子源，喷雾电压3500V(正离子)和3000V(负离子)，汽化室温度350℃，鞘气(N2)压力30psi，辅气(Ar)压力10psi，离子传输管温度300℃；水翁花检测采用SIM模式，质荷比为455.5。
色谱条件：使用Phenomenex-C18柱(2.0×50mm，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱程序为：0-1min，5-5％A；1.0-1.5min，5-95％A；1.5-2.5min，95-95％A；2.5-3.0min，95-5％A；流速700μL/min，柱温25℃，进样量10μL。对照品溶液及供试品溶液中熊果酸分子离子峰的离子流图参见图1。
5.方法学考察
5.1标准曲线和线性
取熊果酸对照品溶液适量，置于不同10mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得每mL含熊果酸对照品分别为10、50、100、200、500、1000ng的溶液。取上述溶液，按“4”项下方法进行分析，分别测定所得峰面积，数据参见表1，将数据导入LC-Quan软件(美国Thermo-Fisher公司)中，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得标准曲线为y＝1115.4x+4815.8，r2＝0.9996，表明方法线性关系良好，能够在10-1000ng/mL浓度范围内对熊果酸进行准确测定。
表1线性关系考察结果
5.2灵敏度试验
取熊果酸对照品溶液适量，置于不同10mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得每mL含熊果酸对照品分别为1、0.5、0.1ng的溶液。取上述溶液，按“4”项下方法进行分析，代入excaliber软件(美国Thermo-Fisher公司)中，计算信噪比。结果显示如表2，所测浓度的信噪比均大于10，表明方法灵敏度良好，可对浓度高于0.1ng/mL的样品进行准确测定。
表2信噪比测定结果
| 浓度(ng/mL) | 0.1 | 0.5 | 1.0 |
| S/N | 861 | 2063 | 479 |
5.3精密度试验
取供试品溶液，按“4”项下方法进行分析，共平行测定6次，记录峰面积，计算RSD，结果显示如表3，RSD为1.27％，表明方法精密度良好。
表3精密度测定结果
| 次数 | 峰面积 |
| 1 | 565123 |
| 2 | 564036 |
| 3 | 564995 |
| 4 | 551572 |
| 5 | 553097 |
| 6 | 551069 |
| RSD(％) | 1.27 |
5.4稳定性试验
取供试品溶液，置于自动进样器中，分别于0、2、4、6、8、12小时按“4”项下方法进行分析，记录峰面积，计算含量和RSD，结果显示如表4，RSD为1.28％，表明方法所制备样品在12小时内稳定性良好。
表4稳定性试验结果
| 时间(小时) | 含量(mg/g) |
| 0 | 24.413 |
| 2 | 24.794 |
| 4 | 24.960 |
| 6 | 25.246 |
| 8 | 25.264 |
| 12 | 25.074 |
| RSD(％) | 1.27 |
5.5重复性试验
取水翁花药材，按“3.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，取上述溶液，按“4”项下方法进行分析，记录峰面积，计算含量和RSD，结果显示如表5，RSD为0.97％，表明方法重复性良好。
表5重复性测定结果
5.6加样回收率试验
取水翁花药材3份，每份取约0.5g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，按表6所述含量精密加入对照品溶液，再自“精密加入甲醇25mL”起按“4”项下方法进行分析，记录峰面积，计算含量、回收率和RSD，结果如表6，方法的平均回收率为101.62％，RSD为2.82％，表明方法准确度良好。
表6加样回收率试验结果
6.含量测定
取10批水翁花药材(批号见表7)，按“4”项下方法进行分析，记录峰面积，计算含量，结果如表7。
表7含量测定结果(n＝2)
本发明采用UHPLC检测方法，提取效率高，操作简单快速，稳定可靠，灵敏度和重复性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间，便于对水翁花中熊果酸进行定量检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术手段和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明之形状、构造及原理所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的制备：取水翁花药材粉末，加入甲醇，超声处理，加甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液加甲醇定容，即得供试品溶液；
步骤2，对照品溶液的制备：取熊果酸对照品，加甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；
步骤3，含量的测定：取对照品溶液制成不同浓度的熊果酸标准溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪中分析，以熊果酸标准溶液的进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线，将供试品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪中，测得供试品溶液的峰面积，计算得出熊果酸的含量。
2.根据权利要求1所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，在步骤3中，高效液相色谱-质谱联用仪的色谱条件：采用Phenomenex-C18柱为色谱柱，色谱柱规格为2.0×50mm、5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，流速为700μL/min，柱温为25℃，进样量为10μL。
3.根据权利要求2所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，梯度洗脱的条件：0-1min，5-5％A；1.0-1.5min，5-95％A；1.5-2.5min，95-95％A；2.5-3.0min，95-5％A。
4.根据权利要求1所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，在步骤3中，高效液相色谱-质谱联用仪的质谱条件：ESI离子源，采用质谱正、负离子模式，汽化室温度为350℃，鞘气压力为30psi，辅气压力为10psi，离子传输管温度为300℃；水翁花检测采用SIM模式，质荷比为455.5。
5.根据权利要求4所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，正离子模式喷雾电压为3500V，负离子模式喷雾电压为3000V。
6.根据权利要求1所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，在步骤1中，水翁花药材粉末与甲醇的比例为0.5g水翁花药材粉末：25mL甲醇。
7.根据权利要求1所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，在步骤1中，超声处理30min，采用0.22μm微孔滤膜过滤。
8.根据权利要求1所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，在步骤3中，取适量对照品溶液，分别加甲醇稀释并定容，制得浓度分别为10、50、100、200、500、1000ng/mL的熊果酸标准溶液。
9.根据权利要求1所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，在步骤2中，制得的对照品溶液的浓度为115.5μg/mL。
10.根据权利要求9所述的UHPLC-MS-MS测定水翁花中熊果酸的方法，其特征在于，标准曲线为y＝1115.4x+4815.8，r2＝0.9996，进样浓度x的取值范围为10-1000ng/mL。
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