CN110133124A - 疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供了一种疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，所述18种氨基酸包括：苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ‑氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸；所述方法包括：建立18种氨基酸的标准曲线；获得供试品溶液的提取离子流色谱图；确定供试品中18种氨基酸的含量。本发明实施例提供的疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，采用高效液相色谱‑质谱联用(HPLC‑MS/MS)的方法，同时检测疏血通注射液中18种氨基酸的含量，操作简单、灵敏度高、稳定性强、精密度高、重现性好，为疏血通注射液的质量控制提供依据。

Description

疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法
技术领域
本发明涉及氨基酸含量测定技术领域，特别是涉及疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法。
背景技术
疏血通注射液中18种氨基酸的含量是疏血通注射液质量控制标准的指标之一；氨基酸属于小分子有机酸，易水解，传统的氨基酸分析法多采用衍生化，使其生成具有紫外或荧光基团的衍生物后进行检测，操作较为繁琐且影响结果的因素较多，因此需要一种更加方便的检测方法，为疏血通注射液的质量控制提供依据。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，具体技术方案如下：
本发明提供了一种疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，采用HPLC-MS/MS法，同时测定疏血通注射液中18种氨基酸的含量；所述18种氨基酸包括：苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ-氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸；所述方法包括：
(1)建立18种氨基酸的标准曲线；
分别精密称取苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ-氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸对照品，用超纯水溶解，制成具有已知浓度的各对照品储备液；
由各对照品储备液配制成具有已知浓度的18种氨基酸的混合对照品储备液；
用超纯水将所述混合对照品储备液稀释成一系列分别具有不同已知浓度的18种氨基酸的混合对照品溶液；
在相同的预设色谱条件和质谱条件下，将体积V1的各浓度的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，获得各浓度混合对照品溶液的提取离子流色谱图；
以各混合对照品溶液的提取离子流色谱图中各氨基酸的色谱峰峰面积为纵坐标，以各氨基酸的浓度为横坐标，分别建立各氨基酸的标准曲线；
(2)获得供试品溶液的提取离子流色谱图；
取疏血通注射液供试品体积V2，用超纯水稀释至体积为V3，过滤后制得供试品溶液；
在与以上(1)步骤中相同的预设色谱条件和质谱条件下，取体积V1供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的提取离子流色谱图；
(3)确定供试品中18种氨基酸的含量；
根据供试品溶液提取离子流色谱图中18种氨基酸各自的色谱峰峰面积，和已建立的各氨基酸的标准曲线，分别读出18种氨基酸各自的浓度C1，并按照下列公式分别计算出供试品中18种氨基酸的含量C；
C＝C1×V3/V2。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(1)中，用超纯水将所述混合对照品储备液稀释成5～10个具有不同已知浓度的18种氨基酸的混合对照品溶液，在所得的各混合对照品溶液中，天冬氨酸、甘氨酸的浓度分别为100-20000ng/mL；亮氨酸、缬氨酸的浓度分别为40-8000ng/mL；苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸的浓度分别为20-4000ng/mL；丝氨酸、苏氨酸的浓度分别为10-2000ng/mL；脯氨酸的浓度为7.5-1500ng/mL；甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸的浓度分别为5-1000ng/mL；色氨酸、精氨酸、组氨酸的浓度分别为2.5-500ng/mL。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，V2与V3的比值为1：(50～150)；优选为1：100。
在本发明的一些实施方式中，所述预设的色谱条件包括：
色谱柱：采用C18反向硅胶色谱柱；流动相：A相为0.01％-1％甲酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱；柱温：35～45℃；流速：0.1～1mL/分钟；进样量：2.5～7.5μL。
在本发明的一些实施方式中，流动相中A相为0.05％～0.5％甲酸-水；优选为，流动相中A相为0.1％甲酸-水。
在本发明的一些实施方式中，所述柱温：40℃；流速：0.5mL/分钟；进样量：5μL。
在本发明的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：B相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加，0–8分钟，6％–50％；8–9分钟，50％–95％；9-10分钟，95-95％。
在本发明的一些实施方式中，所述质谱条件包括：离子化方式：电喷雾离子化；检测模式：多反应离子监测，正离子全扫描模式；毛细管电压：4000V；Delta EMV(+)(增益电压)：400V；干燥气体温度：300-350℃；干燥气体流速：5-15L/min；喷雾气压力：50-60psi。
在本发明的一些实施方式中，所述质谱条件包括：离子化方式：电喷雾离子化；检测模式：多反应离子监测，正离子全扫描模式；毛细管电压：4000V；Delta EMV(+)(增益电压)：400V；干燥气体温度：320℃；干燥气体流速：10L/min；喷雾气压力：55psi。
在本发明的一些实施方式中，质谱参数如下：
本发明实施例提供的疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)的方法，同时检测疏血通注射液中18种氨基酸的含量，操作简单、灵敏度高、稳定性强、精密度高、重现性好，为疏血通注射液的质量控制提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为混合对照品溶液(标4)与供试品溶液(批号171106)的MRM色谱图，其中A图为混合对照品溶液(标4)的MRM色谱图；B图为供试品溶液(批号171106)的MRM色谱图；
其中，1.色氨酸；2.精氨酸；3.苯丙氨酸；4.组氨酸；5.甲硫氨酸；6.谷氨酸；7.赖氨酸；8.天冬氨酸；9.鸟氨酸；10.亮氨酸；11.异亮氨酸；12.苏氨酸；13.缬氨酸；14.脯氨酸；15.丝氨酸；16.γ-氨基丁酸；17.丙氨酸；18.甘氨酸。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
首先，需要说明的是，本发明中所提及的术语“精密称定”：精密称定系指称定重量应准确至所取重量的千分之一。“精密吸取”：系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。
本发明所述超纯水指电阻率大于18.2MΩ·cm的水，所述超纯水可通过Milli-Q超纯水制备仪制备。
由于本发明中的质谱条件采用多反应离子监测(MRM)，因此获得的提取离子流色谱图也可称为MRM色谱图。
1仪器与试剂
1.1仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent 6430三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；Agilent Mass Hunter分析软件(美国Agilent公司)；AX205型十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q超纯水制备仪(Millipore公司)；3K15型高速离心机(美国Sigma公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)；SB-1000YDTD超声清洗槽(宁波新芝生物科技有限公司)。
1.2试剂
苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸(批号：140624-200805)购自中国药品生物制品检定所；γ-氨基丁酸(批号：ZO8A8H33553)，色氨酸(批号：W12O9E71781)购自上海源叶生物科技有限公司；疏血通注射液购自牡丹江友搏药业有限责任公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；甲酸(色谱纯)购自美国ROE公司。
2色谱条件及质谱条件
2.1色谱条件
色谱柱：Agient ZORBAX SB-C18柱(4.6×150mm,5μm)；流动相：A相0.1％甲酸水，B相乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为：0-8min，6％-50％B；8-9min，50％-95％B；9-10min，95％-95％B；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。
2.2质谱条件
电喷雾离子源(ESI)，检测模式为多反应离子监测(MRM)，正离子全扫描模式；毛细管电压：4000V；Delta EMV(+)(增益电压)：400V；Gas Temp(干燥气体温度)：320℃；GasFlow(干燥气体流速)：10L/min；Nebulizer(喷雾气压力)：55psi；定量分析离子对，质谱参数及离子模式见表1。
表1 18种氨基酸的离子对及质谱参数信息
发明人在研究中意外地发现，采用ZORBAX SB-C18(二异丁基-C18)系列色谱柱，其专有的键合技术，为键合相提供了空间保护作用，故抗氨基酸水解能力较强；且它对于等电点差异较大的不同氨基酸保留行为相近，便于快速分析。采用本发明提供的梯度洗脱方法，样品出峰时间短，10min之前完成出峰。另外，发明人在研究中意外地发现，样品中的氨基酸在乙腈中的分离度更高，且水相中加入0.01％-1％的甲酸，尤其是加入0.1％的甲酸，可以改善各氨基酸的峰形且可以增加各氨基酸的质谱响应，从而提高实验结果的准确度。
2.3溶液的配制
2.3.1对照品储备液的配制
分别精密称取苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸对照品各10mg，置于5mL量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成2mg/mL的对照品储备液。精密称取甘氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸、色氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、组氨酸对照品各5mg，置于5mL量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成1mg/mL的对照品储备液，均于4℃保存待用。
2.3.2供试品溶液的制备
分别精密吸取32个批次的疏血通注射液100μL于10mL量瓶中，用超纯水稀释至刻度，经0.22μm微孔滤膜滤过即得，4℃冰箱保存待用。
2.4方法学考察
2.4.1标准曲线、检测限、定量限
精密吸取“2.3.1”项下各对照品储备液适量，分别用超纯水稀释制得天冬氨酸、甘氨酸浓度为400μg/mL，亮氨酸、缬氨酸浓度为160μg/mL，苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸浓度为80μg/mL，苏氨酸、丝氨酸浓度为40μg/mL，脯氨酸浓度为30μg/mL，甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸浓度为20μg/mL，色氨酸、精氨酸、组氨酸浓度为10μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述氨基酸对照品溶液各50μL混合，用超纯水稀释至1mL制备混合对照品储备液。
将上述混合对照品储备液记为标1，其中标1中天冬氨酸、甘氨酸浓度为20000ng/mL，亮氨酸、缬氨酸浓度为8000ng/mL，苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸浓度为4000ng/mL，苏氨酸、丝氨酸浓度为2000ng/mL，脯氨酸浓度为1500ng/mL，甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸浓度为1000ng/mL，色氨酸、精氨酸、组氨酸浓度为500ng/mL。用超纯水将标1依次稀释2、2、2、2.5、2、2.5、2倍得到一系列混合对照品溶液，分别记为标2-标8，取各个浓度上述混合对照品溶液，进样5μL，在2.1和2.2所述的色谱条件和质谱条件下进样分析，得到各混合对照品溶液的MRM色谱图，其中标4的MRM色谱图如图1的A图所示。以各对照品峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，线性加权回归，权重系数为1/X2，得到18种氨基酸的标准曲线回归方程。将混合对照品溶液标8逐步稀释5、10、10、2、5、2、2、2.5、2、2倍数后，分别以S/N＝3和S/N＝10时各对照品的浓度作为最低检测限(LLOD)和最低定量限(LLOQ)，结果见表2。
表2 18种氨基酸标准曲线回归方程、LLOD和LLOQ
2.4.2精密度试验
日内精密度：按“2.3.2”所述的方法制备批号171106的疏血通注射液供试品溶液，根据上文中2.1和2.2所述的色谱条件和质谱条件分析，重复进样6次，记录18种氨基酸的峰面积，计算其RSD值。结果见表3，结果表明该方法日内精密度良好。
表3 18种氨基酸日内精密度结果(n＝6)
日间精密度：按“2.3.2”所述的方法每天制备一份(批号171106)疏血通注射液供试品溶液，根据上文中2.1和2.2所述的色谱条件和质谱条件分析，重复进样2次；连续进样三天，记录18种氨基酸的峰面积，计算其RSD值。结果见表4，结果表明该方法日间精密度良好。
表4 18种氨基酸日间精密度结果(n＝6)
2.4.3重复性试验
按“2.3.2”所述的方法分别制备6份批号171106的疏血通注射液供试品溶液，根据上文中2.1和2.2所述的色谱条件和质谱条件分析，记录18种氨基酸的峰面积，计算其RSD值，结果见表5，结果表明该方法重复性较好。
表5 18种氨基酸重复性结果(n＝6)
2.4.4稳定性试验
按“2.3.2”所述的方法制备批号171106的疏血通注射液供试品溶液，分别于0、2、4、8、12小时，各进样5μL，根据上文中2.1和2.2所述的色谱条件和质谱条件分析，记录18种氨基酸的峰面积，考察样品放置在进样器中的稳定性，计算其RSD值，结果见表6，结果表明样品中18种氨基酸在进样器内放置12小时稳定性良好。
表6 18种氨基酸稳定性结果(n＝5)
2.4.5加样回收率试验
分别精密吸取“2.3.1”项下苯丙氨酸储备液90μL、丙氨酸储备液85μL、脯氨酸储备液32.5μL、甘氨酸储备液60μL、谷氨酸储备液80μL、精氨酸储备液18μL、甲硫氨酸储备液40μL、赖氨酸储备液90μL、亮氨酸储备液200μL、鸟氨酸储备液50μL、γ-氨基丁酸储备液13μL、色氨酸储备液30μL、丝氨酸储备液50μL、苏氨酸储备液40μL、天冬氨酸储备液80μL、缬氨酸储备液130μL、异亮氨酸储备液90μL、组氨酸储备液15μL于2mL量瓶中混合，用超纯水定容，得对照品混合溶液，用于加样回收率实验。
精密吸取疏血通注射液(批号171106)6份，每份50μL，分别加入上述对照品混合溶液100μL，按“2.3.2”项下平行制备，进样5μL，计算加样回收率，结果显示18种成分的加样回收率在95.8％～104.8％之间，其RSD值在0.5％～2.3％之间，见表7。
表7 18种氨基酸加样回收率结果(n＝6)
2.5样品测定
取32份不同批次的疏血通注射液供试品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，并根据上文中2.1和2.2所述的色谱条件和质谱条件进行测定，获得各供试品溶液的MRM色谱图，其中批号171106的疏血通注射液供试品溶液的MRM色谱图如图1的B图所示。根据标准曲线的回归方程计算供试品溶液中18种氨基酸的浓度C1，并根据公式C＝C1×V3/V2，计算疏血通注射液供试品中18种氨基酸的含量，其中V3＝10mL，V2＝100μL，结果见表8.1和表8.2。
表8.1 32批疏血通注射液中18种氨基酸的含量(一)(μg/mL)
表8.2 32批疏血通注射液中18种氨基酸的含量(二)(μg/mL)
本发明采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)的方法对疏血通注射液中18种氨基酸进行定量分析，同时检测疏血通注射液中18种氨基酸的含量，操作简单、灵敏度高、稳定性强、精密度高、重现性好，为疏血通注射液的质量控制提供依据。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，其特征在于，采用HPLC-MS/MS法，同时测定疏血通注射液中18种氨基酸的含量；所述18种氨基酸包括：苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ-氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸；所述方法包括：
(1)建立18种氨基酸的标准曲线；
分别精密称取苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ-氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸对照品，用超纯水溶解，制成具有已知浓度的各对照品储备液；
由各对照品储备液配制成具有已知浓度的18种氨基酸的混合对照品储备液；
用超纯水将所述混合对照品储备液稀释成一系列分别具有不同已知浓度的18种氨基酸的混合对照品溶液；
在相同的预设色谱条件和质谱条件下，将体积V1的各浓度的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，获得各浓度混合对照品溶液的提取离子流色谱图；
以各混合对照品溶液的提取离子流色谱图中各氨基酸的色谱峰峰面积为纵坐标，以各氨基酸的浓度为横坐标，分别建立各氨基酸的标准曲线；
(2)获得供试品溶液的提取离子流色谱图；
精密吸取体积V2的疏血通注射液供试品，用超纯水稀释至体积为V3，过滤后制得供试品溶液；
在与以上(1)步骤中相同的预设色谱条件和质谱条件下，取体积V1供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的提取离子流色谱图；
(3)确定供试品中18种氨基酸的含量；
根据供试品溶液提取离子流色谱图中18种氨基酸各自的色谱峰峰面积，和已建立的各氨基酸的标准曲线，分别读出18种氨基酸各自的浓度C1，并按照下列公式分别计算出供试品中18种氨基酸的含量C；
C＝C1×V3/V2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，用超纯水将所述混合对照品储备液稀释成5～10个具有不同已知浓度的18种氨基酸的混合对照品溶液，在所得的各混合对照品溶液中，天冬氨酸、甘氨酸的浓度分别为100-20000ng/mL；亮氨酸、缬氨酸的浓度分别为40-8000ng/mL；苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸的浓度分别为20-4000ng/mL；丝氨酸、苏氨酸的浓度分别为10-2000ng/mL；脯氨酸的浓度为7.5-1500ng/mL；甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸的浓度分别为5-1000ng/mL；色氨酸、精氨酸、组氨酸的浓度分别为2.5-500ng/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，V2与V3的比值为1：(50～150)；优选为1：100。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设的色谱条件包括：
色谱柱：采用C18反向硅胶色谱柱；流动相：A相为0.01％-1％甲酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱；柱温：35～45℃；流速：0.1～1mL/分钟；进样量：2.5～7.5μL。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，流动相中A相为0.05％～0.5％甲酸-水；优选为，流动相中A相为0.1％甲酸-水。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述柱温：40℃；流速：0.5mL/分钟；进样量：5μL。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：B相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加，0–8分钟，6％–50％；8–9分钟，50％–95％；9-10分钟，95-95％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件包括：离子化方式：电喷雾离子化；检测模式：多反应离子监测，正离子全扫描模式；毛细管电压：4000V；Delta EMV(+)(增益电压)：400V；干燥气体温度：300-350℃；干燥气体流速：5-15L/min；喷雾气压力：50-60psi。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述质谱条件包括：离子化方式：电喷雾离子化；检测模式：多反应离子监测，正离子全扫描模式；毛细管电压：4000V；Delta EMV(+)(增益电压)：400V；干燥气体温度：320℃；干燥气体流速：10L/min；喷雾气压力：55psi。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，质谱参数如下：
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