CN1982892A - 建立疏血通注射液或其中间体指纹图谱的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以水蛭和地龙的水提取物作为活性成分的制剂的HPLC指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱，尤其是疏血通注射液或其中间体的指纹图谱建立方法以及疏血通注射液或其中间体的鉴别方法。包括制备供试品溶液、制备参照物溶液和高效液相色谱测定，其特征在于，参照物为次黄嘌呤，高效液相色谱的条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸二氢钾－水－甲醇梯度洗脱液，紫外检测。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握。
Description
技术领域
本发明涉及一种疏血通注射液或其中间体指纹图谱的建立方法和疏血通注射液或其中间体的鉴别方法，具体来说，是采用高效液相色谱法(HPLC)来建立疏血通注射液或其中间体指纹图谱以及用指纹图谱来鉴别疏血通注射液或其中间体。
背景技术
疏血通注射液，是由水蛭、地龙两味药材的水提取物作为药物活性成分的中药注射剂是一种高效速效的治疗心脑血管疾病的注射剂。中国专利申请03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7分别公开了疏血通注射液及其制备过程，前述申请的全部内容，引入本申请作为参考。
水蛭作为经典的破血逐淤药物，为中国药典所收载。中国药典收载的水蛭药材品种有三种，其中作为药用主要品种为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。水蛭的主药成分为蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖类以及微量元素等。对水蛭中蛋白质、氨基酸、糖类及微量元素等成分的定性、定量研究已多有报道，主药方法为薄层色谱法、高效液相色谱法、电泳法等。其中小分子成分主要为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷等，嘧啶和嘌呤均为含有N原子的不饱和的杂环化合物。
地龙作为传统中药，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，为中国药典所收载。中国药典收载的地龙药材品种有四种，其中作为药用主要品种为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，习称广地龙。地龙的主药成分为蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等。对地龙中蛋白质、氨基酸等成分的定性、定量研究已有报道。其中小分子成分主要为次黄嘌呤及含氮化合物。
水蛭和地龙的化学成分复杂，因此，其制剂的质量控制，如果单用其中个别活性成分来说明药物质量，具有一定的片面性。要控制其质量，最好采用它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industry：BotanicalDrug(Draft).2000 August)。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。
发明内容
关于水蛭、地龙成分测定、药材鉴别以及其制剂质量控制的方法有许多报道，但对它们指纹图谱的建立方法却未见报道。本发明在水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分制剂质量控制研究的基础上，对其指纹图谱的建立方法进行了研究。
本发明的目的是通过对水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分的制剂的HPLC指纹图谱研究，摸索出一种水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分制剂质量控制的方法，建立水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分制剂、尤其是疏血通注射液或其中间体的标准指纹图谱的方法，借此可将其作为质量控制及真伪鉴别的指标之一。本发明还同时提供了相应的标准指纹图谱。
本发明通过下列步骤实施：
一种药物指纹图谱的建立方法，其中所述药物是以水蛭和地龙的水提取物作为活性成分，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液；
(2)制备参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定指纹图谱；
其特征在于，参照物为次黄嘌呤，高效液相色谱的条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐(优选磷酸二氢钾)-水-甲醇梯度洗脱液，检测波长为220nm～300nm。
其中，上述所述的药物为注射剂，尤其是溶液型注射剂、注射用无菌粉末、注射用浓溶液、混悬型注射剂或乳剂型注射剂。
其中，上述所述的水蛭和地龙的水提取物是通过包含如下步骤的方法进行制备：
(1)水蛭、地龙用注射用水或生理盐水洗净，破碎形成匀浆，经反复冷冻和解冻(解融)，离心分离，取上清夜；
(2)上清液进行超滤，得到透过液或滤液；
(3)将透过液或滤液用离子交换柱层析处理；
(4)将步骤(3)所得到的洗脱液进行脱盐处理，得到水蛭和地龙的提取物。
或者，上述所述的水蛭和地龙的水提取物是通过包含如下步骤的方法进行制备：
(1)水蛭、地龙用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过虑，得到滤液和药渣；
(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解冻，离心分离，取上清夜；
(3)将上清液进行超滤，得到透过液或滤液；
(4)将步骤(3)所得到的透过液或滤液进行热压处理后，再进行超滤，得到水蛭和地龙的提取物。
上述所提及的水蛭、地龙，可以为干品，也可以为鲜品。
上述所述的水蛭、地龙的水提取物的制备方法，其中水蛭、地龙是分别提取或者混合在一起进行提取。
特别是，03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7申请所公开的疏血通注射液制备过程，其全部内容，引入本申请作为本发明的一部分。
作为本发明一具体实施方案，本发明提供一种疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
(1)标准(对照)溶液的制备：取疏血通注射液或其中间体，如果需要，用微孔滤膜(0.45um)滤过，作为标准(对照)溶液；
(2)参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取标准(对照)溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254±1nm。
上述所述的流动相梯度，优选为：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 10 | 99 | 1 |
| 50 | 0 | 100 |
其中，柱温为室温；流速为0.8～1ml/min，优选为0.8ml/min。理论板数按次黄嘌呤计算不低于9000。
其中，标准(对照)溶液的制备中，对于疏血通注射液，取注射液即可以作为标准(对照)溶液；对于疏血通注射液中间体，可以通过微孔滤膜(0.45um)滤过后作为标准(对照)溶液。
其中，所述的疏血通注射液中间体，是指水蛭、地龙经浸渍、捣碎研磨、冷冻解融、分离纯化的注射用水或生理盐水的提取液，按照一定的比例混合后得到的均质溶液，其内在质量特征与成品有高度的一致性。
上述所述的方法，得到的疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱中，共有特征指纹峰有15个，其峰面积总和占总峰面积的95％以上。
其中，所述疏血通注射液标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.325～0.344，相对峰面积0.053～0.064；
2号峰：相对保留时间0.477～0.493，相对峰面积0.031～0.049；
3号峰：相对保留时间0.522～0.554，相对峰面积0.218～0.368；
5号峰：相对保留时间0.728～0.736，相对峰面积0.012～0.032；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.197～1.205，相对峰面积0.083～0.141；
7号峰：相对保留时间1.320～1.424，相对峰面积0.075～0.139；
8号峰：相对保留时间1.449～1.557，相对峰面积0.011～0.036；
9号峰：相对保留时间1.650～1.768，相对峰面积0.059～0.115；
10号峰：相对保留时间1.696～1.814，相对峰面积0.077～0.148；
11号峰：相对保留时间2.015～2.152，相对峰面积0.018～0.026；
12号峰：相对保留时间2.086～2.234，相对峰面积0.029～0.044；
13号峰：相对保留时间2.258～2.429，相对峰面积0.018～0.028；
14号峰：相对保留时间2.385～2.565，相对峰面积0.019～0.026；
15号峰：相对保留时间2.635～2.820，相对峰面积0.007～0.010。
更具体地，其中，所述疏血通注射液标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.336，相对峰面积0.060；
2号峰：相对保留时间0.486，相对峰面积0.041；
3号峰：相对保留时间0.543，相对峰面积0.258～0.362；
5号峰：相对保留时间0.731，相对峰面积0.024；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.201，相对峰面积0.108～0.155；
7号峰：相对保留时间1.372，相对峰面积0.083～0.117；
8号峰：相对保留时间1.506，相对峰面积0.027；
9号峰：相对保留时间1.714，相对峰面积0.102；
10号峰：相对保留时间1.759，相对峰面积0.080～0.136；
11号峰：相对保留时间2.089，相对峰面积0.021；
12号峰：相对保留时间2.166，相对峰面积0.036；
13号峰：相对保留时间2.347，相对峰面积0.023；
14号峰：相对保留时间2.482，相对峰面积0.022；
15号峰：相对保留时间2.734，相对峰面积0.008。
其中，所述疏血通注射液中间体标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.316～0.351，相对峰面积0.055～0.111；
2号峰：相对保留时间0.471～0.495，相对峰面积0.041～0.084；
3号峰：相对保留时间0.525～0.574，相对峰面积0.190～0.318；
5号峰：相对保留时间0.724～0.736，相对峰面积0.016～0.032；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.196～1.208，相对峰面积0.076～0.140；
7号峰：相对保留时间1.312～1.410，相对峰面积0.017～0.120；
8号峰：相对保留时间1.426～1.548，相对峰面积0.017～0.042；
9号峰：相对保留时间1.582～1.770，相对峰面积0.019～0.116；
10号峰：相对保留时间1.620～1.848，相对峰面积0.012～0.134；
11号峰：相对保留时间1.964～2.146，相对峰面积0.021～0.045；
12号峰：相对保留时间2.044～2.231，相对峰面积0.032～0.056；
13号峰：相对保留时间2.204～2.417，相对峰面积0.021～0.033；
14号峰：相对保留时间2.324～2.559，相对峰面积0.016～0.021；
15号峰：相对保留时间2.499～2.812，相对峰面积0.006～0.014。
更具体地，其中，所述疏血通注射液中间体标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.332，相对峰面积0.072；
2号峰：相对保留时间0.484，相对峰面积0.050；
3号峰：相对保留时间0.543，相对峰面积0.217～0.295；
5号峰：相对保留时间0.730，相对峰面积0.026；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.202，相对峰面积0.089～0.130；
7号峰：相对保留时间1.367，相对峰面积0.089；
8号峰：相对保留时间1.492，相对峰面积0.027；
9号峰：相对保留时间1.689，相对峰面积0.082；
10号峰：相对保留时间1.733，相对峰面积0.096；
11号峰：相对保留时间2.039，相对峰面积0.033；
12号峰：相对保留时间2.123，相对峰面积0.041；
13号峰：相对保留时间2.291，相对峰面积0.029；
14号峰：相对保留时间2.422，相对峰面积0.018；
15号峰：相对保留时间2.664，相对峰面积0.011。
其中，1、2、8、11、13、14、15号峰为水蛭药材特有峰；9、10号峰为地龙药材特有峰；3、5、S、6、7、12号峰为水蛭、地龙药材共有峰；10号峰有时有一肩峰，峰面积合并计算。
作为本发明又一目的，还提供一种疏血通注射液或其中间体的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)测定待测疏血通注射液或其中间体的指纹图谱；
(2)将待测疏血通注射液或其中间体的指纹图谱与疏血通注射液或其中间体标准(对照)指纹图谱对比，筛选符合疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱的疏血通注射液或其中间体；
其中，步骤(1)是按照上述所述的疏血通注射液或其中间体的指纹图谱建立方法测定，步骤(2)的疏血通注射液或其中间体标准(对照)指纹图谱分别为上述所述的疏血通注射液或其中间体标准(对照)指纹图谱。
本发明的优点主要有：
(1)以水蛭、地龙水溶性提取物建立起来的HPLC指纹图谱，代表着以水蛭、地龙大部分药理活性，能有效地表征制剂的质量。水蛭的主要活性成分为水蛭素等水溶性成分，地龙的主要活性成分为蚓激酶等水溶性成分，故用水蛭、地龙的水提取物成分作为监控指标就更具有代表性。
(2)以水蛭、地龙制剂整个指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价以水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分的制剂、特别是疏血通注射液或其中间体的质量提供了新的对照标准，将为提高产品的质量及疗效做出贡献。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
附图说明
图1：参照物次黄嘌呤HPLC图谱
图2：疏血通注射液对照溶液指纹图谱(0～50分钟)
图3：疏血通注射液中间体对照溶液指纹图谱(0～50分钟)
图4：相关性试验：阴性对照——水蛭提取液指纹图谱(0～50分钟)
图5：相关性试验：阴性对照——地龙提取液指纹图谱(0～50分钟)
图6：相关性试验：疏血通注射液指纹图谱(0～50分钟)
图7：相关性试验：疏血通注射液中间体指纹图谱(0～50分钟)
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。
实施例1：水蛭标准指纹图谱的建立方法
1、仪器与试剂
试验中先后在惠普高效液相色谱仪及色谱工作站HP1100、岛津高效液相色谱仪LC2010A进行测试。
甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，磷酸二氢钾为分析纯。
次黄嘌呤对照品为上海生化厂进口分装品，经HPLC归一化法测得纯度为99.6％。
水蛭对照药材为山东省微山湖所产，经黑龙江省药品检验所鉴定为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。
地龙对照药材为广西玉林所产，经黑龙江省药品检验所鉴定为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))。
疏血通注射液以及疏血通注射液中间体：由牡丹江友博制药有限公司提供，分别为10批。
2、色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，B：50％甲醇，梯度为：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 10 | 99 | 1 |
| 50 | 0 | 100 |
检测波长为254nm，柱温为室温；流速为0.8ml/min，理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于9000。
3、指纹图谱测定
(1)疏血通注射液指纹图谱制备
参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品10mg，精密称重，置100ml瓶中，加0.01mol/L磷酸二氢钾溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成参照物溶液；
疏血通注射液对照溶液的制备：取注射液作为疏血通对照品溶液；
分别精密吸取参照物溶液与对照溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录50分钟色谱。以次黄嘌呤色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积比值。
参照物次黄嘌呤HPLC图谱和疏血通注射液指纹图谱(0～50分钟)，分别见图1和2。
(2)共有峰的确定
根据10批疏血通注射液指纹图谱给出的相关参数，疏血通注射液的色谱峰在50分钟内全部出现。比较各批药材的色平台，确定了15个共有特征指纹峰，其峰面积总和占总峰面积的95％以上。
以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的疏血通注射液标准指纹图谱中共有特征指纹峰的保留时间和峰面积见表1和2。
实施例2：疏血通注射液中间体指纹图谱的建立方法
除标准溶液的制备不同外，其余条件和操作均按照实施例1进行。
疏血通注射液中间体标准溶液的制备：取疏血通注射液中间体，用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。
所得到疏血通注射液中间体指纹图谱(0～50分钟)，见图3。
共有峰的确定：
根据10批疏血通注射液中间体指纹图谱给出的相关参数，疏血通注射液中间体的色谱峰在50分钟内全部出现。比较各批药材的色平台，确定了15个共有特征指纹峰，其峰面积总和占总峰面积的95％以上。
以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的疏血通注射液中间体标准指纹图谱中共有特征指纹峰的保留时间和峰面积见表3和4。
实施例3：指纹图谱的稳定性试验
按照指纹图谱稳定性测定方法操作，取疏血通注射液，考察16小时溶液稳定，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积有规定的峰面积进行统计，RSD％不超过3％。供试品常温16小时内稳定，符合指纹图谱的技术要求(见表5和6)。
实施例4：指纹图谱的精密度试验
按照指纹图谱精密度规定方法操作，取疏血通注射液，取1份，连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积有规定的峰面积进行统计，RSD％不超过3％，仪器等整个检测系统的精密度良好，基本符合指纹图谱的技术要求(见表7和8)。
实施例5：指纹图谱的重现性试验
按照指纹图谱重现性规定方法操作，取疏血通注射液，取6份，分别检测指纹图谱，对共有峰的相对保留时间及相对峰面积有规定的峰面积进行统计，RSD％不超过3％，符合指纹图谱的技术要求(见表9和10)。
实施例6：疏血通注射液产品的药材、中间体和注射液指纹图谱的相关性试验
分别对疏血通注射液产品的药材、中间体和成品进行了HPLC分析。结果表明，成品中各特征峰均可在药材及中间体指纹图谱中得到追踪，而且中间体与成品的指纹图谱非常接近。结果见图4～7。
表1疏血通注射液共有峰保留时间和相对保留时间
表2疏血通注射液共有峰及非共有峰面积的比值(1)
表2 疏血通注射液共有峰及非共有峰面积的比值(2)
※非共有峰面积百分比
表3疏血通注射液中间体共有峰保留时间和相对保留时间
表4疏血通注射液中间体共有峰及非共有峰面积的比值(1)
表4疏血通注射液中间体共有峰及非共有峰面积的比值(2)
※非共有峰面积百分比
表4疏血通注射液稳定性试验结果(示保留时间和相对保留时间)
表5疏血通注射液稳定性试验结果(示峰面积和峰面积比值)
表6疏血通注射液精密度试验结果(示保留时间和相对保留时间)
表7疏血通注射液精密度试验结果(示峰面积和峰面积比值)
表8疏血通注射液重现性试验结果(示保留时间和相对保留时间)
表9疏血通注射液重现性试验结果(示峰面积和峰面积比值)
相对保留时间
1号峰：0.336 2号峰：0.486 3号峰：0.543 5号峰：0.731S号峰：1.000 6号峰：1.201 7号峰：1.372 8号峰：1.5069号峰：1.714 10号峰：1.759 11号峰：2.089 12号峰：2.16613号峰：2.347 14号峰：2.482 15号峰：2.734
特征指纹峰峰面积相对比值
1号峰：0.060 2号峰：0.041 3号峰：0.290±25％ 5号峰：0.024S号峰：1.000 6号峰：0.119±30％ 7号峰：0.107±30％ 8号峰：0.0279号峰：0.102 10号峰：0.114±30％ 11号峰：0.021 12号峰：0.03613号峰：0.023 14号峰：0.022 15号峰：0.008
特征指纹峰描述
图谱中1、2、8、11、13、14、15号峰为水蛭药材特有峰；9、10号峰为地龙药材特有峰；3、5、S、6、7、12号峰为水蛭、地龙药材共有峰；10号峰有时有一肩峰，峰面积合并计算。
图2：疏血通注射液标准指纹图谱
相对保留时间
1号峰：0.332 2号峰：0.484 3号峰：0.543 5号峰：0.730S号峰：1.000 6号峰：1.202 7号峰：1.367 8号峰：1.4929号峰：1.689 10号峰：1.733 11号峰：2.039 12号峰：2.12313号峰：2.291 14号峰：2.422 15号峰：2.664
特征指纹峰峰面积相对比值
1号峰：0.072 2号峰：0.050 3号峰：0.254±25％ 5号峰：0.026S号峰：1.000 6号峰：0.108±30％ 7号峰：0.089 8号峰：0.0279号峰：0.082 10号峰：0.096 11号峰：0.033 12号峰：0.04113号峰：0.029 14号峰：0.018 15号峰：0.011
图3：疏血通注射液中间体标准指纹图谱
Detector A(254nm)
| Name | Pk# | Retention Time | Area | Area Percent | Theoreticalplates |
| 12345S678111213141516 | 1234567891011121314151617181920212223 | 4.2976.1837.0237.9409.3809.98711.34712.72314.31715.26718.11718.75319.77320.84022.18022.88327.38728.34729.87330.92733.45335.78340.103 | 393515358430689261569922332555557499882470384842085343521458370451212123826250213323677935300372666984150817104277379106422105901 | 4.454.067.800.652.640.631.1353.240.483.895.190.512.400.711.510.883.400.750.471.940.881.201.20 | 3041.391902.688028.166403.395749.135679.236340.098289.1211374.708684.2526696.7252734.5831135.3941636.1484654.4395115.09114835.6478766.9781996.64124835.22127205.9869214.27132211.27 |
| Totals | 8835231 | 100.00 |
图4：相关性试验
阴性对照——水蛭提取液指纹图谱
Detector A(254nm)
| Name | Pk# | Retention Time | Area | Area Percent | Theoreticalplates |
| 345S6791012 | 12345678910111213 | 2.7906.9137.9239.91311.12312.40014.85317.90722.21322.77723.90025.36728.130 | 98953524661156652108513128854526854832688250790168556354449190243156286120525 | 1.146.021.801.241.4860.433.755.837.866.251.041.791.38 | 729.959199.796197.566123.124825.949036.818968.4539466.2795173.9571454.3483794.7257934.4872946.58 |
| Totals | 8718072 | 100.00 |
图5：相关性试验
阴性对照——地龙提取液指纹图谱
Detector A(254nm)
| Name | Pk# | Retention Time | Area | Area Percent | Theoreticalplates |
| 1235S6789101112131415 | 123456789101112131415161718 | 4.4676.5337.3009.86010.72712.02313.52716.30018.52320.10321.12322.79723.42027.67728.73331.02732.81736.213 | 4128553236131822663214861125265232717664446875173282919724006835404671167889988116925328031818598815077853736 | 2.872.2512.651.490.871.6246.135.225.761.672.464.946.251.181.951.291.050.37 | 2388.933151.978374.385942.2510094.0110302.249406.8911341.2161489.1054350.620.00116938.73100358.02121287.9555442.7983972.17143943.5091612.34 |
| Totals | 14403117 | 100.00 |
图6：相关性试验
疏血通注射液指纹图谱
Detector A(254nm)
| Name | Pk# | Retention Time | Area | Area Percent | Theoreticalplates |
| 1235S6789101112131415 | 123456789101112131415161718 | 4.3306.3477.1209.52010.35711.57013.00715.65318.33319.94020.91022.55723.15727.23028.32330.63732.39035.600 | 3459652471211340664158392140952184672564140060306263946121865018040165560975324617785021497716323610393060192 | 2.922.0911.331.341.191.5647.695.105.411.851.525.546.371.501.821.380.880.51 | 1733.123255.8510471.747580.4711250.0112664.9412191.7112930.0045977.4348645.02109152.16132855.05116517.88151531.4592889.47118167.55140803.86102460.32 |
| Totals | 11829780 | 100.00 |
图7：相关性试验
疏血通注射液中间体指纹图谱
Claims (14)
1、一种药物指纹图谱的建立方法，其中所述药物是以水蛭和地龙的水提取物作为活性成分，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液；
(2)制备参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定指纹图谱；
其特征在于，参照物为次黄嘌呤，高效液相色谱的条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐(优选磷酸二氢钾)-水-甲醇梯度洗脱液，检测波长为220nm～300nm。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的药物为注射剂，尤其是溶液型注射剂、注射用无菌粉末、注射用浓溶液、混悬型注射剂或乳剂型注射剂。
3、根据权利要求2所述的方法，其中所述的水蛭和地龙的水提取物是通过包含如下步骤的方法进行制备：
(1)水蛭、地龙用注射用水或生理盐水洗净，破碎形成匀浆，经反复冷冻和解融，离心分离，取上清夜；
(2)上清液进行超滤，得到透过液或滤液；
(3)将透过液或滤液用离子交换柱层析处理；
(4)将步骤(3)所得到的洗脱液进行脱盐处理，得到水蛭和地龙的提取物。
4、根据权利要求2所述的方法，其中所述的水蛭和地龙的水提取物是通过包含如下步骤的方法进行制备：
(1)水蛭、地龙用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过虑，得到滤液和药渣；
(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解融，离心分离，取上清夜；
(3)上清液进行超滤，得到透过液或滤液；
(4)将步骤(3)所得到的透过液或滤液进行热压处理后，再进行超滤，得到水蛭和地龙的提取物。
5、根据权利要求3或4所述的方法，其中水蛭、地龙为干品或鲜品。
6、根据权利要求3-5所述的方法，其中水蛭、地龙是分别提取或者混合在一起进行提取。
7、一种疏血通注射液或其中间体的标准(或对照)指纹图谱建立方法，包括如下步骤：
(1)对照溶液的制备：取疏血通注射液或其中间体，如果需要，用微孔滤膜(0.45um)滤过，作为对照溶液；
(2)参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；
(3)测定：分别精密吸取对照溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254±1nm。
8、根据权利要求7所述的方法，其中所述的流动相梯度为：按体积比计算，0分钟时100％的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，5分钟时100％的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，10分钟时99％的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和1％的50％甲醇，50分钟时100％的50％甲醇。
9、根据权利要求7或8所述的方法，其中所述疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱中，共有特征指纹峰有15个，其峰面积总和占总峰面积的95％以上。
10、根据权利要求7-9所述的方法，其中所述疏血通注射液标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.325～0.344，相对峰面积0.053～0.064；
2号峰：相对保留时间0.477～0.493，相对峰面积0.031～0.049；
3号峰：相对保留时间0.522～0.554，相对峰面积0.218～0.368；
5号峰：相对保留时间0.728～0.736，相对峰面积0.012～0.032；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.197～1.205，相对峰面积0.083～0.141；
7号峰：相对保留时间1.320～1.424，相对峰面积0.075～0.139；
8号峰：相对保留时间1.449～1.557，相对峰面积0.011～0.036；
9号峰：相对保留时间1.650～1.768，相对峰面积0.059～0.115；
10号峰：相对保留时间1.696～1.814，相对峰面积0.077～0.148；
11号峰：相对保留时间2.015～2.152，相对峰面积0.018～0.026；
12号峰：相对保留时间2.086～2.234，相对峰面积0.029～0.044；
13号峰：相对保留时间2.258～2.429，相对峰面积0.018～0.028；
14号峰：相对保留时间2.385～2.565，相对峰面积0.019～0.026；
15号峰：相对保留时间2.635～2.820，相对峰面积0.007～0.010。
11、根据权利要求7-10所述的方法，其中所述疏血通注射液标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.336，相对峰面积0.060；
2号峰：相对保留时间0.486，相对峰面积0.041；
3号峰：相对保留时间0.543，相对峰面积0.258～0.362；
5号峰：相对保留时间0.731，相对峰面积0.024：
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.201，相对峰面积0.108～0.155；
7号峰：相对保留时间1.372，相对峰面积0.083～0.117；
8号峰：相对保留时间1.506，相对峰面积0.027；
9号峰：相对保留时间1.714，相对峰面积0.102；
10号峰：相对保留时间1.759，相对峰面积0.080～0.136；
11号峰：相对保留时间2.089，相对峰面积0.021；
12号峰：相对保留时间2.166，相对峰面积0.036；
13号峰：相对保留时间2.347，相对峰面积0.023；
14号峰：相对保留时间2.482，相对峰面积0.022；
15号峰：相对保留时间2.734，相对峰面积0.008。
12、根据权利要求7或8所述的方法，其中所述疏血通注射液中间体对照指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.316～0.351，相对峰面积0.055～0.111；
2号峰：相对保留时间0.471～0.495，相对峰面积0.041～0.084；
3号峰：相对保留时间0.525～0.574，相对峰面积0.190～0.318；
5号峰：相对保留时间0.724～0.736，相对峰面积0.016～0.032；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.196～1.208，相对峰面积0.076～0.140；
7号峰：相对保留时间1.312～1.410，相对峰面积0.017～0.120；
8号峰：相对保留时间1.426～1.548，相对峰面积0.017～0.042；
9号峰：相对保留时间1.582～1.770，相对峰面积0.019～0.116；
10号峰：相对保留时间1.620～1.848，相对峰面积0.012～0.134；
11号峰：相对保留时间1.964～2.146，相对峰面积0.021～0.045；
12号峰：相对保留时间2.044～2.231，相对峰面积0.032～0.056；
13号峰：相对保留时间2.204～2.417，相对峰面积0.021～0.033；
14号峰：相对保留时间2.324～2.559，相对峰面积0.016～0.021；
15号峰：相对保留时间2.499～2.812，相对峰面积0.006～0.014。
13、根据权利要求12所述的方法，其中所述疏血通注射液中间体标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自：
1号峰：相对保留时间0.332，相对峰面积0.072；
2号峰：相对保留时间0.484，相对峰面积0.050；
3号峰：相对保留时间0.543，相对峰面积0.217～0.295；
5号峰：相对保留时间0.730，相对峰面积0.026；
S号峰(参照峰)：相对保留时间1，相对峰面积1；
6号峰：相对保留时间1.202，相对峰面积0.089～0.130；
7号峰：相对保留时间1.367，相对峰面积0.089；
8号峰：相对保留时间1.492，相对峰面积0.027；
9号峰：相对保留时间1.689，相对峰面积0.082；
10号峰：相对保留时间1.733，相对峰面积0.096；
11号峰：相对保留时间2.039，相对峰面积0.033；
12号峰：相对保留时间2.123，相对峰面积0.041；
13号峰：相对保留时间2.291，相对峰面积0.029；
14号峰：相对保留时间2.422，相对峰面积0.018；
15号峰：相对保留时间2.664，相对峰面积0.011。
14、一种疏血通注射液或其中间体的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)测定待测疏血通注射液或其中间体的指纹图谱；
(2)将待测疏血通注射液或其中间体的指纹图谱与疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱
对比，筛选符合疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱的疏血通注射液或其中间体；其中，步骤(1)是按照权利要求7或8所述的方法测定，步骤(2)的疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱分别为权利要求10-13中所述的疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱。
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