CN110031557A

CN110031557A - 一种盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法

Info

Publication number: CN110031557A
Application number: CN201910111305.2A
Authority: CN
Inventors: 巩丽萍; 郭常川; 邢晟; 杭宝建; 张迅杰; 赵艳霞
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2019-02-12
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2039-02-12
Also published as: CN110031557B

Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种LC‑MSMS法测定盐酸法舒地尔中5‑异喹啉磺酸甲酯、5‑异喹啉磺酸乙酯的含量。HPLC解决了单一液相条件上不能同时测定5‑异喹啉磺酸甲酯、5‑异喹啉磺酸乙酯，且流动相对色谱柱的损伤大，色谱柱不耐用，导致方法重现性差。LC‑MS检测灵敏度高，同时检测两种成分，方法耐用性好，准确度高，分析时间缩短，提高检测效率。

Description

一种盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体而言，涉及盐酸法舒地尔中的部分杂质的检测。

背景技术

盐酸法舒地尔，已公开的测定方法为HPLC法(见中国药典2015年版二部)，具体如下：有关物质取本品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.3mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取lml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取对照溶液5ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以1.0％(v/v)三乙胺水溶液(用磷酸调节pH值至7.0)-甲醇(50:50)(v/v)为流动相；检测波长为275nm。理论板数按盐酸法舒地尔峰计算不低于3000。盐酸法舒地尔峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

取灵敏度溶液20μl，注入液相色谱仪，使主成分色谱峰的信噪比应不小于10。精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的5倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)(w/w)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0％)(w/w)。供试品溶液色谱图中小于灵敏度溶液主峰面积的色谱峰忽略不计(0.05％)(w/w)。

但是以上方法在实际检测生产中仍然存在部分问题，首先盐酸法舒地尔的具体生产工艺如下：

具体的杂质主要为5-异喹啉磺酸、高哌嗪、中间体、二聚体和盐酸法舒地尔氧化物。但是通过过量的5-异喹啉磺酸，能使高哌嗪完全反应；控制合成终点和提纯的pH，能有效减少中间体II的残留；避光生产和保存，能避免盐酸法舒地尔的氧化物的产生。

所以目前的杂质主要为5-异喹啉磺酸和二聚体。其中5-异喹啉磺酸为主，合成过程中过量添加，而且盐酸法舒地尔水解也会产生5-异喹啉磺酸。

目前过程中，主要问题也在于5-异喹啉磺酸的鉴别上，主要原因为使用常规的HPLC，二聚体可以通过液相分离，然后紫外鉴别，但是合格药中盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸要求很低，HPLC的检测限不能满足对盐酸法舒地尔的检测需求。

发明内容

针对盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸含量难以鉴别的问题，本发明提供一种盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸已酯的鉴别方法。

一种盐酸法舒地尔中杂质的检测方法，通过LC-MSMS检测盐酸法舒地尔中的5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯。

其中，所述的LC-MSMS的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50mm，1.7µm）。

其中，所述的LC-MSMS流动相为0.1%甲酸水：0.1%甲酸甲醇=60:40，柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：1µL。

其中，所述的5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的质谱检测，选择质荷比224.1→129.0（m/z）和质荷比224.1→102.1（m/z）作为5-异喹啉磺酸甲酯的检测离子对，选择质荷比238.0→210.0（m/z）和质荷比238.0→129.0（m/z）作为5-异喹啉磺酸乙酯的检测离子对。

其中，所述的检测的具体方法为外标法：取样品约12.5mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液，检测出峰面积，与标准曲线比对。

上述的标准曲线为：

（1）精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各10.38mg和9.56mg于同一容量瓶，用甲醇定量稀释成每1mL中约含200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、2ng的一系列溶液，作为对照溶液的4000%、2000%、1000%、400%、200%、100%、40%浓度线性溶液；

（2）精密量取各线性溶液1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得标准线。

上述方法中，所述的5-异喹啉磺酸甲酯的定量限为2.05ng/mL（1.64ppm），检测限为0.51ng/mL（0.41ppm）；5-异喹啉磺酸乙酯的定量限为1.90ng/mL（1.52ppm），检测限为0.48μg/mL（0.38ppm）。

在生产过程中，需要用到甲醇和乙醇作为有机溶剂，在最后提纯过程中，虽然甲醇和乙醇可以旋蒸除去，但是盐酸法舒地尔中的杂质5-异喹啉磺和甲醇和乙醇分别反应，杂质转化为5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯。而现有的HPLC方法测定5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯在一个液相条件上不能同时测定，流动相对色谱柱的损伤大，色谱柱不耐用，导致方法重现性差，检测灵敏度相比较LC-MS低。LC-MSMS检测灵敏度高，同时检测两种成分，方法耐用性好，准确度高，分析时间缩短，提高检测效率。

有益效果

1.本方法具有专属性，空白溶剂与供试品中其他杂质均不干扰5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的检查；

2.定量限和检测限低，本方法测得5-异喹啉磺酸甲酯的定量限为2.05ng/mL（1.64ppm），检测限为0.51ng/mL（0.41ppm）； 5-异喹啉磺酸乙酯的定量限为1.90ng/mL（1.52ppm），检测限为0.48μg/mL（0.38ppm）；

3.稳定性好，连续进样6次，5-异喹啉磺酸甲酯的定量限峰面积RSD值为1.3%；5-异喹啉磺酸乙酯的定量限峰面积RSD值为1.62%；

4. 准确度良好且线性关系高，纯品5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯连续进样，峰值RSD分别为1.24%、1.57%，线性关系分别为0.9995和0.9996。

附图说明

图1为对照溶液色谱图；

图2为加标供试品色谱图；

图3为5-异喹啉磺酸甲酯浓度的标准线

图4为5-异喹啉磺酸乙酯浓度的标准线。

具体实施方式

实施例1 专属性实验

（1）空白溶液：取甲醇作为空白溶液；

（2）供试品溶液的制备：精密称取盐酸法舒地尔中样品约12.5mg置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得；

（3）对照溶液的制备：精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约10mg，用甲醇定量稀释制成每1mL中含5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约5ng的溶液；

（4）加标供试品溶液的制备：精密称取盐酸法舒地尔中样品约12.5mg置10mL量瓶中，加入标准溶液稀释至刻度即得（各对照品含量约为5ng/mL）。

（5）精密量取空白溶剂、供试品溶液、对照溶液、加标供试品溶液各1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图。

对照溶液色谱图如图1；

加标供试品溶液色谱图如图2.

结论：空白溶剂与供试品溶液中其他杂质均不干扰5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的检测，加标供试品溶液与5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的保留时间一致，说明该方法的专属性良好。

实施例2 精密度实验

对照溶液的制备：精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约10mg（9.81mg和10.23mg），用甲醇定量稀释制成每1mL中含5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约5ng的溶液；

精密量取对照品溶液1µL，注入液质联用仪，记录色谱图，连续进样6次，统计6次保留时间与峰面积的RSD值，用于考察该方法的精密度，试验结果见下表；

表1 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证系统适用性试验结果

验证要求：保留时间与峰面积的RSD不得过5.0%。

结论：由以上试验结果可知，对照品溶液连续进样6次，5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯保留时间的RSD值为0.66%和0.42%，峰面积的RSD值为2.05%和1.59%，符合验证要求，说明该方法的仪器精密度良好。

实施例3 线性关系实验

线性溶液的制备：精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各10.38mg和9.56mg于同一容量瓶，用甲醇定量稀释成每1mL中约含200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、2ng的一系列溶液，作为对照溶液的4000%、2000%、1000%、400%、200%、100%、40%浓度线性溶液。

精密量取各线性溶液1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。试验结果见下表。

表2 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证线性关系试验结果

验证要求：相关系数R不得小于0.99。

结论：5-异喹啉磺酸甲酯在2.05~205.32ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为A= 61714C + 58160，相关系数为0.9997，符合验证要求，说明该方法的线性关系良好；5-异喹啉磺酸乙酯在1.90~190.24ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为A= 86787C+ 74012，相关系数为0.9997，符合验证要求，说明该方法的线性关系良好。线性关系如图3和图4。

实施例4 定量限、检测限

取线性溶液逐级稀释至一定浓度，精密量取各溶液1µL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比。

另精密量取定量限溶液1µL，注入液质联用仪，连续进样6针，记录色谱图，统计峰面积的RSD值，考察定量限溶液的精密度。

表3 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证定量限、检测限试验结果

表4 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证定量限溶液精密度试验结果

验证要求：峰面积的RSD不得过10.0%。

结论：该方法测得5-异喹啉磺酸甲酯的定量限为2.05ng/mL（1.64ppm），检测限为0.51ng/mL（0.41ppm）；定量限溶液连续进样6次，峰面积RSD值为1.3%，均符合验证要求；该方法测得5-异喹啉磺酸乙酯的定量限为1.90g/mL（1.52ppm），检测限为0.48μg/mL（0.38ppm）；定量限溶液连续进样6次，峰面积RSD值为3.0%，均符合验证要求。

实施例5 重复性试验

对照品溶液的制备：精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各9.81mg和10.23mg，用甲醇定量稀释制成每1mL中含5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约5ng的溶液。

重复性试验供试品溶液的制备：本品中未检出5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯，通过向供试品中加入限度浓度的5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯，得到的加标供试品溶液作为重复性试验供试品溶液，同法制备6份。

精密量取对照品溶液与重复性试验供试品溶液各1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算重复性试验供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的含量，统计6次测定结果的RSD值，考察该方法的重复性。

表5 5-异喹啉磺酸甲酯检查方法学验证重复性试验结果

验证要求：测定结果的RSD不得过10.0%。

表6 5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证重复性试验结果

验证要求：测定结果的RSD不得过10.0%。

结论：由以上试验结果可知，重复测定6次，测得5-异喹啉磺酸甲酯含量的RSD值为1.69%，测得5-异喹啉磺酸乙酯含量的RSD值为1.62%，符合验证要求，说明该方法的重复性良好。

实施例6 准确度试验

供试品溶液的制备：精密称量盐酸法舒地尔样品约12.5mg于10mL容量瓶，加入甲醇稀释至刻度。

准确度试验加标供试品溶液的制备：精密称量盐酸法舒地尔样品约12.5mg于10mL容量瓶，加入对照品溶液稀释至刻度，作为准确度试验加标供试品溶液（100%），同法制备6份。

精密量取上述溶液各1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图，供试品溶液、回收率线性溶液中5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的含量按外标法以峰面积计算，以测得量与加入量的比值计算回收率，考察该方法的准确度。试验结果见下表。

表7 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证准确度试验结果

验证要求：回收率限度结果在85%~115%之间，RSD不得过10.0%。

结论：由以上试验结果可知，通过向供试品中加入限度浓度的5-异喹啉磺酸甲酯，测得的回收率在102.84%~105.68%之间，RSD值为1.24%；加入限度浓度的5-异喹啉磺酸乙酯，测得的回收率在103.27%~107.11%之间，RSD值为1.57%，均符合验证要求，说明该方法的准确度良好。

实施例7 稳定性试验

加标供试品溶液的制备：精密称量盐酸法舒地尔样品约12.5mg于10mL容量瓶，加入对照品溶液稀释至刻度。

分别于0、2、4、6、20小时精密量取对照品溶液、供试品溶液1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图，统计5次保留时间与峰面积A的RSD值，用于考察该方法的稳定性。

表8 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查方法学验证对照品溶液稳定性试验结果

验证要求：保留时间与峰面积的RSD不得过5.0%。

表9 加标供试品溶液稳定性试验结果

验证要求：保留时间与峰面积的RSD不得过5.0%。

结论：由以上试验结果可知，对照品溶液分别于0、2、4、6、20小时进样，5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯保留时间的RSD值为0.49%和0.59%，峰面积的RSD值为4.32%和2.73%，加标供试品溶液分别于0小时、2小时、4小时、6小时、20小时进样，5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯保留时间的RSD值为0.59%和0.69%，峰面积的RSD值为2.17%和3.48%，符合验证要求，说明该方法的仪器稳定性良好。

实施例8 真实测量

取本品约12.5mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；另精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约10mg（9.81mg、10.23mg），用甲醇定量稀释制成每1mL中含5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约5ng的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱-质谱法（通则0512和通则0431）试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸水：0.1%甲酸甲醇=60：40为流动相洗脱；流速：0.3mL/min。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI⁺），进行多反应监测（MRM），选择质荷比224.1→129.0（m/z）和质荷比224.1→102.1（m/z）作为5-异喹啉磺酸甲酯的检测离子对，选择质荷比238.0→210.0（m/z）和质荷比238.0→129.0（m/z）作为5-异喹啉磺酸乙酯的检测离子对；柱温40℃；精密量取对照品溶液与各供试品溶液各1µL，分别注入液质联用仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯保留时间一致的色谱峰，按外标法分别以224.1→129.0（m/z）离子峰面积计算5-异喹啉磺酸甲酯，以238.0→210.0（m/z）离子峰面积计算5-异喹啉磺酸乙酯的量，均不得过4ppm。试验结果见下表。

表10 5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯检查样品检查结果

结论：四批供试品中均未检出5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯，均合格。

Claims

1.一种盐酸法舒地尔中杂质的检测方法，其特征在于，通过LC-MSMS检测盐酸法舒地尔中的5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的LC-MSMS的色谱柱为WatersACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50mm，1.7µm）。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的LC-MSMS流动相为0.1%甲酸水：0.1%甲酸甲醇=60:40，柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：1µL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的质谱检测，选择质荷比224.1→129.0（m/z）和质荷比224.1→102.1（m/z）作为5-异喹啉磺酸甲酯的检测离子对，选择质荷比238.0→210.0（m/z）和质荷比238.0→129.0（m/z）作为5-异喹啉磺酸乙酯的检测离子对。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测的具体方法为外标法：取样品约12.5mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液，检测出峰面积，与标准曲线比对。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的标准曲线为：

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的5-异喹啉磺酸甲酯的定量限为2.05ng/mL（1.64ppm），检测限为0.51ng/mL（0.41ppm）；5-异喹啉磺酸乙酯的定量限为1.90ng/mL（1.52ppm），检测限为0.48μg/mL（0.38ppm）。