CN101200427B - 一种化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化合物及其制备方法。该化合物为6，9-十七碳二烯酸-3-亚油酸甘油酯。该化合物可由保藏编号为CCTCC NO：M 207137的夏瀚多节孢霉(Nodulisporium Xiahanensisnov.Xia)发酵制备得到。本发明所公开的制备方法成本低，获得的目标化合物纯度较高。

Description

一种化合物及其制备方法 

技术领域

本发明涉及一种化合物，还涉及该化合物的制备方法。 

背景技术

脂类化合物在生理上具有非常重要的意义，如脂肪在体内氧化时放出大量热量，作为能源的储备物；它在脏器周围能保护内脏免受外力撞伤；在皮下有保温作用。脂肪还是维生素A，D，E和K等许多活性物质的良好溶剂。类脂是组织细胞的重要成分，它们在细胞内和蛋白质结合在一起形成脂蛋白，构成细胞的各种膜，如细胞膜和线粒体膜等。脂类化合物主要来源于动植物，不能在人体内合成，必须由食物供给，从微生物代谢产物中获取甚少，特别是多节孢霉菌(Nodulisporium)发酵途径获取亚多节孢酯天然化合物也未见过报道。 

发明内容

本发明的目的提供一种化合物，可采用小型真菌多节孢霉菌(夏瀚多节孢霉，Nodulisporium Xiahanensis nov.Xia)经液态发酵纯培养制备方法获得。 

本发明另一个目的是提供该化合物的制备方法。 

本发明的目的是通过下列技术措施实现的： 

一种化合物，其名称为6，9-十七碳二烯酸-3-亚油酸甘油酯(6，9-heptadecadienoyl3-linoleoyl glycerin ester)，命名为亚多节孢酯(linodulisporate)。亚多节孢酯为新的化合物，属于人体必需脂肪酸脂类物质。亚多节孢酯是一个脂类化合物，其由2条碳链(17碳2烯酸)构成的多不饱和亚油酸连接一个甘油酯而形成。 

分子式：C₃₈H₆₆O₅，分子量：M＝602。 

结构式为： 

该化合物为黄色，油状粘稠物，带有香味或特殊的气味。相对密度在0.9-0.95之间。难溶于水，易溶于有机溶剂，如热乙醇，乙醚、石油醚、氯仿、四氯化碳和苯等。该化合物也 具有水解、皂化及酸败反应的特性。 

用于制备所述化合物的菌株属小型真菌多节孢霉(Nodulisporium)，该菌分离自中国浙江省西南庆元县百山祖自然保护区的土壤中，菌株编号ZJX-0508，根据形态观察、培养特征和分子生物学分析，可视为一个新种，命名为夏瀚多节孢霉(Nodulisporium Xiahanensis nov.Xia)，已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏编号为CCTCC No M 207137，保藏日期为2007年9月3日。 

本发明所述的化合物的制备方法，包括下列步骤： 

a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCC M207137的菌株； 

b.菌株培养：将发酵菌株接种在固体培养基上，单菌落涂布，25～32℃培养4～10天；收集菌株的孢子；将菌株的孢子接种于种子培养基，100～250rpm，25～32℃发酵培养24～32小时，得种子液；将种子液按发酵培养基体积3～10％的接种量接种于发酵培养基，200～300rpm，25～32℃发酵培养40～72小时，收集发酵液； 

c.发酵产物提取：将发酵液与低极性溶剂在提取罐中搅拌30～120min后静置分层，弃下层水相及中层乳浊相，上层有机相在浓缩罐中，浓缩至无法浓缩为止，即得粗品； 

d.目标产物纯化：发酵提取物上柱层析，用石油醚、乙酸丁酯与无水乙醇混合溶液或石油醚与乙酸乙酯混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，即得。 

其中所述的培养基各组分在培养基中按重量体积比(g/ml)计，碳源2～10％，氮源2～5％，无机盐0～1％，其中固体培养基需加入1.5～3％的琼脂，其余为水。优选为碳源4～7％，氮源3～4％，其中固体培养基需加入2～2.5％的琼脂，其余为水。 

其中所述的碳源选自淀粉水解糖、糊精、甘油、糖蜜、葡萄糖、蔗糖、淀粉类、土豆汁、麦芽汁、豆汁、土豆浸出粉、燕麦中的一种或几种，优选蔗糖。所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨、鱼胨、蚕蛹水解液、尿素、铵盐、酵母浸出物、黄豆粉、棉籽粉、氨水、硝酸盐中的一种或几种，优选黄豆饼粉。所述的无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰中的一种或多种，优选硫酸镁。经过试验，确定本发明化合物为胞外产物，经分析其可能结构为亲酯性化合物，根据低成本、易浓缩、方便后处理的原则，选择了石油醚、乙酯、乙醇、己烷、庚烷等低极性溶剂进行试验，最终优选石油醚为最佳萃取溶剂，其加入量与发酵液体积比为0.8∶1。萃取粗提物颜色相对较浅、单位富集，且易浓缩，溶剂用量少、成本低。 

其中纯化步骤中所述的柱层析采用硅胶柱，石油醚、乙酸丁酯与无水乙醇混合溶液中石油醚、乙酸丁酯与无水乙醇按体积比为20-40∶0.1-0.3∶0.1-0.2；石油醚与乙酸乙酯混合溶液中石油醚与乙酸乙酯按体积比为20-40∶1。 

根据浓缩液性质，发现混合的各物质物理性质基本一致，简单的分离手段无法纯化，又因目的物常温下为油状物，无法结晶，再分析其大致结构，无特殊基团，采用吸附层析法进行分离比较合适。经过选择正相系统的硅胶、氧化铝以及反相的大孔吸附树脂等进行初筛。过程中发现该物质有极强的疏水性，不适宜反相系统，最终选择适宜工业生产的200～300目硅胶。通过TLC确定基础展开条件为石油醚、乙酸丁酯、无水乙醇按一定比例构成，在500ml小柱经多次小试，确定最佳层析条件为石油醚、乙酸丁酯与无水乙醇混合溶液，按体积比为30∶0.2∶0.1为最佳。确定了上述条件后，经过上柱量、流速等规模小试，最终确定流速控制为0.5～1BV/hr(倍柱床体积)。 

本发明还公开了一种药物组合物，该药物组合物由治疗有效量的所述化合物6，9-十七碳二烯酸-3-亚油酸甘油酯与辅料组成。 

本发明可制备获得促使高密度脂蛋白胆固醇量增加，降低甘油三脂，预防人类体重增加等疾病具有特殊功效和安全低毒的天然药用成分。其他更进一步的药理作用尚未明确。 

在制备方法中，本发明采用了石油醚、乙酸丁酯、乙酸乙酯、无水乙醇等溶媒，价格低廉，又方便后续的浓缩，并采用普通硅胶与层析柱，这都有助于放大及工业化生产，并具有操作简单的优势，获得的目标化合物纯度较高，HPLC测定纯度＞97％。 

通过紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁C谱和H谱等分析，确定所得化合物的分子式为C₃₈H₆₆O₅，分子量：M＝602，结构式为6，9-十七碳二烯酸-3-亚油酸甘油酯(6，9-heptadecadienoyl3-linoleoyl glycerin ester)。 

本发明化合物的鉴定： 

1.高效液相色谱(HPLC)检测：样品10μl溶于1ml溶液(乙腈∶正丙醇＝1∶1)，液相柱：C18柱；流动相∶乙腈∶水＝75∶25(体积比)，流速：1ml/min，柱温为室温，检测波长：280nm，进样量：5μl，目的峰保留时间：4.24min，结果见图1； 

2.紫外扫描结果见图2； 

3.红外扫描：适量样品KBr压片，红外光谱仪测定，扫描范围400cm^-1～4000cm^-1。红外扫描结果见图3； 

4.质谱：图谱见图4； 

5.核磁C谱和H谱：氢谱和碳谱数据见表5及图6。 

保藏编号为CCTCC M 207137的发酵菌株的分类鉴定： 

1.固体培养基特征： 

①将保藏编号为CCTCC M 207137的菌株(以下称CCTCC M 207137菌株)PDA培养基 28℃培养3-5天，菌落直径47mm，6-8天蔓延。菌落圆形，灰褐色，中央稍带黄色，绒絮状，后期有粉状，致密较厚，边缘整齐，有隆起。背面呈黑褐色。 

②麦芽汁培养基28℃培养3-5天，菌落直径38mm，6-8天49mm，9-12天蔓延。菌落圆形，灰白色，带少量黑色颗粒，绒粉状，边缘不整齐，扁平较紧密。背面呈黑色。 

③察贝克培养基28℃培养3-5天，菌落直径38mm，6-8天54mm，9-12天蔓延。菌落近圆形，边缘不整齐，灰褐色，绒絮状，紧密。背面呈褐色。 

2、液体培养特征： 

PDA培养基30℃±2℃培养温度下，该菌摇瓶培养第1天，菌种有零星的白色菌丝点；培养第2天，长满白色菌丝；培养第3天，发酵液菌丝体密集，菌丝体呈淡褐色；培养第4天，长满深黑褐色菌丝体，发酵液粘稠，培养第5-6天，发酵液菌丝体密集成块状，黑褐色菌丝体。 

3、显微形态特征 

①无性世代 

菌丝无色有隔膜。分生孢子梗粗糙，表面形成突起或小刺状，无色或显色素。孢子梗呈树枝状分枝，轮状分枝通常为细长的造孢结构；分生孢子无色光滑，单孢，长圆形，单个着生分生孢子梗分枝顶部的瘤状齿上，形成疏散的串簇。5.0～6.5×2.5～4.0微米。菌株菌丝体及分生孢子梗形态(Olympus显微镜，200X)见图7，菌株分生孢子形态(Olympus显微镜，200X)见图8。 

②有性世代未发现。 

4、分子生物学特征： 

CCTCC M 207137菌株核糖体基因转录间隔区ITS系列由572个碱基组成，其碱基排列顺序参见SEQ ID NO.1。 

结合ITS序列分析，PCR扩增引物采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1和ITS4(ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’(SEQ ID NO.2)；ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO.3))，CCTCC M207137菌株的ITS序列共测得572个碱基。以ITS序列同源性为基础，构建包括菌株CCTCC M207137在内的9株相关真菌的系统发育树，从ITS序列聚类分析结果可以看出，CCTCC M207137菌株与Nodulisporium JP3655形成一个分支，二者在比对的572个碱基中，发现有15个位点碱基发生变化，差异性为2.6％。因此可以认为该菌为一个新种，现命名为夏瀚多节孢霉(Nodulisporium Xiahanensis nov.Xia)。 

附图说明

图1是本发明化合物的HPLC图； 

图2是本发明化合物的紫外扫描图； 

图3是本发明化合物的红外扫描图； 

图4是本发明化合物的质谱图； 

图5是本发明化合物的核磁共振13C图谱； 

图6是本发明化合物的核磁共振1H图谱； 

图7是本发明菌株菌丝体及分生孢子梗光学显微镜照片； 

图8是本发明菌株分生孢子光学显微镜照片。 

具体实施方式

生物材料保藏信息：夏瀚多节孢霉Xia(Nodulisporium Xiahanensis nov.Xia)，已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏编号为CCTCC No M 207137，保藏日期为2007年9月3日。 

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。 

实施例1 

1、菌株：发酵菌株采用CCTCC M 207137的菌株； 

2、培养基： 

固体培养基：土豆(新鲜)90g，葡萄糖10g，硝酸铵20g，琼脂20g，加自来水至1000ml，自然pH值； 

种子培养基：葡萄糖10g，糊精20g，黄豆粉30g，加蒸馏水至1000ml，采用10％NaOH溶液调节pH至5.5； 

发酵培养基：蔗糖60g，甘油5g，黄豆粉30g，硝酸铵、氯化钾各0.5g，加自来水，采用10％NaOH溶液调节pH至6.5，定容至1000ml； 

培养基均采用121℃灭菌30min。 

3、培养方法： 

固体培养：将发酵菌株接种在斜面培养基上，单菌落涂布，25℃培养8天； 

种子培养：每支斜面用约10ml无菌水振荡打碎，得到的孢悬液，接入种子培养基，200rpm，28±1℃发酵培养30小时，得种子液；将种子液按发酵培养基体积5％的接种量接种于发酵培养基，240rpm，28±1℃发酵培养48小时，收集发酵液； 

4、提取及纯化： 

有机溶媒萃取： 

将发酵液与石油醚(石油醚与发酵液体积比为0.8∶1)在提取罐中搅拌30min后静置分层，弃下层水相及中层乳浊相，上层有机相在浓缩罐中55℃浓缩至无法浓缩为止，即得粗品。粗品黄色，油状粘稠。 

提取分离： 

填柱材料：硅胶250～300目 

填柱方法：干法装柱 

上柱量：30g浓缩液/1L柱床体积 

洗脱液∶石油醚∶乙酸丁酯∶无水乙醇＝30∶0.2∶0.1(休积比) 

流速：0.5～1(倍柱床体积)/hr 

收集：根据HPLC收集纯组分，交叉与粗品混合，重新上柱。纯组份即为目的产物6，9-十七碳二烯酸-3-亚油酸甘油酯，HPLC测定纯度＞98％。 

实施例2： 

1、菌株：发酵菌株采用CCTCC M207137的菌株； 

2、培养基： 

固体培养基：葡萄糖80g，硫酸铵20g，琼脂15g，加自来水至1000ml，自然pH值； 

种子培养基：葡萄糖80g，硫酸铵20g，加蒸馏水至1000ml，采用10％NaOH溶液调节pH至5.5； 

发酵培养基：蔗糖80g，固形物含量为40％的玉米浆5g，蛋白胨20g，氯化钠8g，加自来水，采用10％NaOH溶液调节pH至6.5，定容至1000ml； 

培养基均采用121℃灭菌30min。 

3、培养方法： 

固体培养：将发酵菌株接种在固体培养基上，单菌落涂布，30℃培养5天； 

将菌株的孢子接种于种子培养基，100rpm，25℃发酵培养32小时，得种子液；将种子液按发酵培养基体积3％的接种量接种于发酵培养基，200rpm，32℃发酵培养72小时，收集发酵液； 

4.发酵产物提取：将发酵液与石油醚(其加入量与发酵液体积比为0.8∶1)在提取罐中搅拌120min后静置分层，弃下层水相及中层乳浊相，上层有机相在浓缩罐中，浓缩至无法浓缩为止，即得粗品。 

d.目标产物纯化：发酵提取物上柱层析，洗脱液为石油醚、乙酸乙酯的混合溶液(体积比为：40∶1)进行洗脱，收集洗脱液，即得目的产物6，9-十七碳二烯酸-3-亚油酸甘油酯，HPLC测定纯度≥97％。 

实施例3 

软胶囊 

本发明化合物    100g 

精炼食用植物油    100g 

以常规软胶囊制备方法制备，制得1000粒胶囊。 

序列表 

<110>杭州夏洋生物工程有限公司 

<120>一种化合物及其制备方法 

<160>3 

<210>1 

<211>572 

<212>DNA 

<213>夏瀚多节孢霉(Nodulisporium Xiahanensis nov.Xia)rDNA的ITS碱基系列 

<400>1 

gtagggtgaa cctgcggagg gatccattta ctgagttatc taaactccaa ccctatgtga 60 

acttaccgcc gttgcctcgg cgggccgcgt tcgccttgta gtttactacc tggcggcgcg 120 

ctacaggccc gccggtggac tgctaaactc tgttatatat acgtatctct gaatgcttca 180 

acttaataag ttaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc 240 

agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 300 

cacattgcgc ccattagtat tctagtgggc atgcctgttc gagcgtcatt tcaaccctta 360 

agcccctgtt gcttagcgtt gggaatctag gtctccaggg cctagttccc caaagtcacc 420 

ggcggagtcg gagcgtactc tcagcgtagt aataccattc tcgcttttgc agtagccccg 480 

gcggcttgcc gtaaaacccc tatatcttta gtggttgacc tcgaatcagg taggaatacc 540 

cgctgaactt aagcatatca ataagcggag ga                               572 

<210>2 

<211>19 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物 

<400>2 

tccgtaggtg aacctgcgg 19 

<210>3 

<211>20 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物 

<400>3 

tcctccgctt attgatatgc 20 

Claims (10)

1.一种化合物，其结构式为：

。

2.用于制备权利要求1所述化合物的菌株夏瀚多节孢霉(Nodulisporium Xiahanensis nov.Xia)，已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 207137。

3.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于该制备方法包括下列步骤：

a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCC M 207137的菌株；

b.菌株培养：将发酵菌株接种在固体培养基上，单菌落涂布，25～32℃培养4～10天；收集菌株的孢子；将菌株的孢子接种于种子培养基，100～250rpm，25～32℃发酵培养24～32小时，得种子液；将种子液按发酵培养基体积3～10％的接种量接种于发酵培养基，200～300rpm，25～32℃发酵培养40～72小时，收集发酵液；

c.发酵产物提取：将发酵液与低极性溶剂在提取罐中搅拌30～120min后静置分层，弃下层水相及中层乳浊相，将上层有机相在浓缩罐中浓缩至无法浓缩为止，即得粗品；

d.目标产物纯化：发酵提取物上柱层析，用石油醚、乙酸丁酯与无水乙醇混合溶液或石油醚与乙酸乙酯混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，即得如权利要求1所述的化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤b中的培养基为：培养基各组分在培养基中按重量体积比g/ml计，碳源2～10％，氮源2～5％，无机盐0～1％，其中固体培养基需加入1.5～3％的琼脂，其余为水。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征为培养基各组分在培养基中按重量体积比g/ml计，碳源4～7％，氮源3～4％，其中固体培养基需加入2～2.5％的琼脂，其余为水。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征是所述的碳源选自糊精、甘油、糖蜜、葡萄糖、蔗糖、土豆汁、麦芽汁、豆汁、土豆浸出粉、燕麦中的一种或几种；所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、鱼胨、蚕蛹水解液、尿素、酵母浸出物、黄豆粉、棉子粉、氨水中的一种或几种；所述的无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰中的一种或多种。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤c中所述的低极性溶剂为石油醚，其中石油醚与发酵液体积比为0.8∶1。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤d中柱层析采用硅胶柱。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤d中所述的石油醚、乙酸丁酯与无水乙醇混合溶液中石油醚、乙酸丁酯与无水乙₁醇按体积比为20-40∶0.1-0.3∶0.1-0.2；石油 醚与乙酸乙酯混合溶液中石油醚与乙酸乙酯按体积比为20-40∶1。

10.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物由治疗有效量的权利要求1所述化合物与辅料组成。 

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