CN106868087B - 一种杠柳苷元的生物转化制备方法 - Google Patents

一种杠柳苷元的生物转化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杠柳苷元的生物转化制备方法，所述方法是以黑曲霉HC306发酵培养获得的发酵液经抽滤后的滤液为催化剂，以香加皮为原料构成转化体系，在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液过滤，滤饼干燥后分离纯化，获得杠柳苷元。本发明方法发酵培养基成分简单，发酵成本低；黑曲霉HC306生长迅速、抗杂菌污染能力强、容易培养，批次稳定；以香加皮干粉为原料，投入黑曲霉HC306粗酶体系转化，既免去杠柳毒苷分离提取操作，也免去了酶的分离纯化步骤，工艺简单，易于工业化应用；杠柳苷元含量最高可达7mg/g以上，是提取杠柳苷元的较佳原料。

Description

一种杠柳苷元的生物转化制备方法
(一)技术领域
本发明涉及一种利用微生物酶生物转化法制备杠柳苷元的方法。
(二)背景技术
杠柳苷元(periplogenin)是一种存在于中药材香加皮(Periplocae Cortex)中的强心苷(CAS号为514-39-6，化学结构式见图1)，有强心、抗炎和抗肿瘤等药理作用，对体外培养的多种肿瘤细胞，如对小鼠S180肉瘤细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞等肿瘤细胞株均具有毒性作用[韩宇博，赵爱国.杠柳苷元的抗肿瘤作用研究.中国小儿血液与肿瘤杂志，2008,13(1):1-5]；杠柳苷元对人皮肤异常增殖细胞的增殖具有抑制作用，而且对心得安诱导的豚鼠银屑病模型具有较好的治疗作用，但对皮下结缔组织细胞A9则无抑制作用，因而可以治疗皮肤增生性疾病[鲍永利，李玉新，张文静，等.一种杠柳苷元及其衍生物用于防治皮肤增生性疾病的应用：中国，201510811907.0，2016-02-24]。杠柳苷元对体外培养的肥大细胞、致敏大鼠肥大细胞的组胺释放有显著的抑制作用，口服给药杠柳苷元可使小鼠显著减少肥大细胞的组胺释放，具有显著的抗炎作用[顾卫，赵力建，赵爱国.杠柳苷元对肥大细胞脱颗粒及释放组胺影响的研究.中国药房，2008,19(3):166-168]。由此可见，杠柳苷元作为药物应用于临床疾病治疗的前景广阔。
杠柳苷元天然存在于香加皮中，但含量极低，几乎不可能用天然提取法生产杠柳苷元，目前尚未见化学合成法的研究报道。在香加皮中，杠柳苷元的糖苷—杠柳毒苷(periplocin，CAS号13137-64-9，化学结构式见图1)的含量却较高。不同产地的香加皮中，杠柳毒苷的含量差别较大，在0.060～12.15mg/g之间，其中以产自天津蓟县的香加皮中杠柳毒苷含量最高[田俊生，李天祥，刘虹，等.HPLC法测定不同产地香加皮中杠柳毒苷的含量.中药材，2006,29(8):799-800]。所以，以杠柳毒苷为原料水解制备杠柳苷元是一种较佳的生产方法。
目前已有水解杠柳毒苷制备杠柳苷元专利申请，如专利“一种杠柳苷元的制备方法(申请号200610013621.9)”公开的方法是用酸处理香加皮提取物、香加皮药材等，再经萃取和柱层析分离得到杠柳苷元，该方法具有工艺简单，成本低的优点，但大量使用酸和有机溶剂，不利于环境保护；专利“一种酶法水解制备杠柳苷元的方法(申请号201110210631.2)”公开的方法是采用蜗牛酶、纤维素酶或苦杏仁酶酶解香加皮甲醇提取物，虽然该方法具有得率高的优点，但是酶的成本势必影响该技术的应用。
为了提高杠柳苷元的生产效率，克服现有杠柳苷元生产方法的不足，本发明采用生物转化法制备杠柳苷元(反应式见图1)。筛选获得一株转化能力高的微生物菌株，利用该菌株发酵制备的粗酶液，直接处理香加皮，在粗酶液中糖苷酶的作用下，其中杠柳毒苷转化为杠柳苷元，再经分离获得产品杠柳苷元。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种利用黑曲霉(Aspergillus niger)HC306菌株发酵制备粗酶液处理香加皮，转化其中的杠柳毒苷为杠柳苷元的方法，较好地克服现有酸水解法的污染问题，也较好地克服了酶水解法的酶成本较高的问题，本工艺具有流程简单、转化得率高和副产物少等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种生物转化法制备杠柳苷元的方法，所述的方法是以黑曲霉HC306发酵培养获得的发酵液经抽滤后的滤液为催化剂，以香加皮为原料构成转化体系，在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液过滤，滤饼干燥后经分离纯化，获得杠柳苷元。
进一步，所述转化体系中，原料香加皮的终浓度为50～100g/L转化体系，所述香加皮质量符合中国药典(2015版)要求，在加入转化体系前先烘干粉碎过60目筛；所述催化剂用量以抽滤前发酵液中干菌体重量计为6～8g/L转化体系。
进一步，所述的转化反应时间为8～12h。
进一步，所述黑曲霉HC306在发酵培养前，通常需要先经平板培养基活化培养，再经过种子培养基扩大培养，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述黑曲霉HC306发酵培养方法为：
(1)活化培养：将黑曲霉HC306菌种孢子接种于平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3d，获得平板孢子，所述的平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)；PDA培养基组成为：马铃薯100～200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20～30min，4层纱布过滤去渣留汁)，蔗糖10～20g/L，琼脂15～20g/L，pH自然；优选PDA培养基组成：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L、琼脂18g/L，溶剂为自来水，pH自然；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10～20g/L，(NH4)2SO4 3～5g/L，酵母浸出粉2～3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6；优选的种子培养基组成为：蔗糖10g/L，(NH4)2SO43g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6；
(3)发酵培养：将步骤(2)制备的种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，获得发酵液，将发酵液用4层纱布过滤，滤液即为催化剂；所述发酵培养基组成同种子培养基，优选的发酵培养基组成为：蔗糖20g/L，(NH4)2SO4 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl20.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6。
本发明所述分离纯化方法为：将干燥后的滤饼加入体积浓度70％甲醇水溶液，于40℃、40KHz、180W条件下超声提取30min后，布氏漏斗抽滤，获得滤液和滤饼；滤饼用等体积的体积浓度70％甲醇水溶液重复提取3次，合并滤液，于45℃减压蒸干，得膏状物；将膏状物用甲醇溶解后进行硅胶柱层析，用体积比为10:5的石油醚和乙酸乙酯进行等度洗脱，HPLC跟踪监测，收集含杠柳苷元的洗脱液，45℃减压蒸干，得杠柳苷元；第一次提取用体积浓度70％甲醇水溶液体积用量以干燥后的滤饼质量计为5ml/g。
本发明所述的黑曲霉HC306菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，已在专利申请(申请号CN201610234720.3)中公开。
微生物有着非常强大的酶系和分解转化物质的能力，在黑曲霉HC306发酵液中，不仅含有糖苷酶，能将杠柳毒苷转化为杠柳苷元，还有一些其他多糖水解酶，对香加皮中纤维素、木聚糖等的水解，有利于结合态的杠柳毒苷和杠柳苷元释放，从而可以获得较高的杠柳苷元提取收率。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)利用黑曲霉HC306发酵制备粗酶液处理香加皮制备杠柳苷元的方法，发酵培养基成分简单，发酵成本低；(3)黑曲霉HC306生长迅速、抗杂菌污染能力强、容易培养，批次稳定；(4)以香加皮干粉为原料，投入黑曲霉HC306粗酶体系转化，既免去杠柳毒苷分离提取操作，也免去了酶的分离纯化步骤，工艺简单，易于工业化应用；(5)香加皮经生物转化处理后，杠柳苷元含量最高可达7mg/g以上，是提取杠柳苷元的较佳原料。
(四)附图说明
图1杠柳毒苷转化为杠柳苷元的化学反应式；
图2HPLC法分析杠柳苷元浓度的标准曲线；
图3香加皮样品的HPLC分析图谱，A为标准品杠柳毒苷和杠柳苷元的HPLC图谱；B为未经转化处理的香加皮甲醇提取物HPLC图谱；C为经转化处理的香加皮甲醇提取物HPLC图谱(实施例3样品)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1转化菌种的筛选
对实验室保存的6个黑曲霉菌株(编号为HC304～HC309，分离过程已在CN201610234720.3中公开)转化杠柳毒苷为杠柳苷元的能力进行筛选。先从4℃冰箱保存的上述黑曲霉平板菌种挑取1满环孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，平板于28℃生化培养箱中培养3d，得活化的黑曲霉平板。用棉签从活化的菌种平板中蘸取孢子，接种到50mL发酵培养基中，于30℃、200r/min振荡培养3d后(不同菌株培养液的干菌体浓度在4.23g/L～6.45g/L之间不等)，50mL发酵液用4层纱布过滤，收集的滤液即为粗酶液。取其中的40mL粗酶液于150mL三角瓶中，再加入2g香加皮(终浓度为50g/L)于粗酶液中构成反应体系(总体积按40mL计)，于30℃、150r/min恒温振荡水浴中转化12h。转化反应结束后，转化体系用布氏漏斗抽滤，滤饼连同滤纸一起与85℃烘干10h，HPLC法分析经处理的香加皮中杠柳苷元含量。
HPLC分析来自不同菌株发酵制备的粗酶液处理香加皮中杠柳苷元含量，结果见表1，由此比较不同菌株产酶转化杠柳毒苷为杠柳苷元的能力高低。
表1不同黑曲霉菌株来源的粗酶液处理香加皮中杠柳苷元含量
Figure BDA0001256418280000041
由表1可以看出：经黑曲霉HC306发酵制备的粗酶液处理后的香加皮，其中的杠柳苷元含量最高，为3.43mg/g，而未转化的香加皮中杠柳苷元含量仅为0.13mg/g。黑曲霉HC306菌株，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日。
所述的平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，按以下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂18g，pH自然(实测6.5)，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入无菌培养皿，每皿25mL。
所述的发酵培养基按如下组成和方法配制：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为水，pH 6，250mL的三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
所述的香加皮原料质量符合中国药典(2015版)要求，需经过85℃烘干10h，粉碎后过60目筛。
所述HPLC分析方法为：0.5g香加皮粉于三角瓶中，加入体积浓度70％甲醇水溶液10mL，40℃、40KHz、180W条件下超声提取30min，上层清液经0.45μm微孔滤膜过滤备用。HPLC条件为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex LunaC18键合硅胶柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温25℃；流动相为体积比1:3的乙腈和水混合物，流速1.0mL/min，检测波长220nm，进样量20μL。由相同分析条件下，标准品杠柳苷元浓度-峰面积标准曲线(图2)计算出甲醇提取液中杠柳苷元浓度，再计算出香加皮样品中的杠柳苷元含量。
实施例2：黑曲霉HC306转化稳定性验证
以黑曲霉HC306为产酶菌种，在50mL摇瓶发酵规模下，增加了种子扩大培养步骤，发酵制备粗酶液处理香加皮，验证菌种的转化稳定性，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为5.87g/L的种子液。所述种子培养基终浓度组成为：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为水，pH 6，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即2.5mL)的接种量接种至50mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为6.33g/L的发酵液。所述的发酵培养基终浓度组成和配制方法同步骤(2)中的种子培养基。
(4)发酵培养结束后，将步骤(3)获得发酵液50mL用4层纱布过滤，收集的滤液即为粗酶液。取其中的40mL粗酶液于150mL三角瓶中，再加入2g香加皮(终浓度为50g/L)于粗酶液中构成反应体系(总体积按40mL计)，于30℃、150r/min恒温振荡水浴中转化12h。转化反应结束后，转化体系用布氏漏斗抽滤，滤饼连同滤纸一起于85℃烘干10h，用HPLC分析经处理的香加皮中杠柳苷元的含量。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306制备的粗酶液转化处理香加皮，样品中杠柳苷元含量为3.93mg/g。实施例2转化方法重复实验3批次，3批次实验结果无显著性差异，表明黑曲霉HC306制备的粗酶液转化杠柳毒苷为杠柳苷元的性能稳定。
实施例3：优选转化工艺
在实施例2的基础上，优化了发酵培养基成分浓度、培养条件、香加皮浓度、转化时间等，黑曲霉HC306发酵制备粗酶液转化处理香加皮，其中的杠柳苷元含量显著提高。优选的生物转化法制备杠柳苷元的工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为5.63g/L的种子液。所述种子培养基组成和配制方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即5mL)的接种量接种至50mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为8.04g/L的发酵液。所述的发酵培养基终浓度组成如下：蔗糖20g/L，(NH4)2SO4 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO40.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为水，pH 6，250mL的三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(4)发酵培养结束后，将步骤(3)获得发酵液50mL经4层纱布过滤，收集的滤液即为粗酶液。取其中的40mL粗酶液于150mL三角瓶中，再加入4g香加皮(终浓度为100g/L)于粗酶液中构成反应体系(总体积按40mL计)，于35℃、200r/min恒温振荡水浴中转化8h。转化反应结束后，转化体系用布氏漏斗抽滤，滤饼连同滤纸一起与105℃烘干5h，用HPLC分析经处理的香加皮中杠柳苷元含量。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306制备的粗酶液转化处理香加皮，转化样品中杠柳苷元含量为7.36mg/g，较实施例3提高了87.3％。
实施例4：转化工艺放大
以黑曲霉HC306为产酶菌种，在实施例3的基础上，将产酶培养放大到300mL摇瓶发酵，转化体系放大到250mL，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为5.78g/L的种子液。所述种子培养基组成和配制方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即30mL)的接种量接种至300mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为7.92g/L的发酵液。所述的发酵培养基组成同实施例3，1L的三角瓶装300mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)发酵培养结束后，将步骤(3)获得发酵液300mL经4层纱布过滤，收集的滤液即为粗酶液。取其中的250mL粗酶液于1L三角瓶中，再加入25g香加皮(终浓度为100g/L)于粗酶液中构成反应体系(总体积按250mL计)，于30℃、200r/min恒温振荡水浴中转化8h。转化反应结束后，转化体系用布氏漏斗抽滤，滤饼连同滤纸一起与105℃烘干5h，用HPLC分析经处理的香加皮中杠柳苷元的含量。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉HC306制备的粗酶液转化处理香加皮，样品中杠柳苷元含量为7.23mg/g。
实施例5：杠柳苷元的分离纯化
按实施例4方法，步骤(4)滤饼100g(即转化处理后的香加皮粉)加入500mL的体积浓度70％甲醇水溶液，于40℃、40KHz、180W条件下超声提取30min后，布氏漏斗抽滤，收集滤液，滤饼(即香加皮)再次加入500mL的体积浓度70％甲醇水溶液，重复上述方法提取3次。合并提取液约1400mL，于45℃减压蒸干，得膏状物4.62g，加10mL甲醇溶解膏状物，进行柱层析分离。柱填料为硅胶，层析柱直径为4cm，硅胶填装高度为30cm，用体积比为10:5的石油醚和乙酸乙酯进行等度洗脱，洗脱液50mL收集一份，HPLC分析各份洗脱液中的杠柳苷元浓度，将含有杠柳苷元的洗脱液合并，45℃减压蒸干燥得杠柳苷元。
按本实施例方法，100g经转化处理后的香加皮，从中提取得到杠柳苷元0.705g，提取得率为0.705％，纯度为92.6％。

Claims (5)

1.一种杠柳苷元的生物转化制备方法，其特征在于所述方法是以黑曲霉(Aspergillusniger)HC306发酵培养获得的发酵液经抽滤后的滤液为催化剂，以香加皮为原料构成转化体系，在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液过滤，滤饼干燥后分离纯化，获得杠柳苷元。
2.如权利要求1所述杠柳苷元的生物转化制备方法，其特征在于所述转化体系中，香加皮的终浓度为50～100g/L转化体系，所述催化剂用量以抽滤前发酵液中干菌体重量计为6～8g/L转化体系。
3.如权利要求1所述杠柳苷元的生物转化制备方法，其特征在于所述香加皮在加入转化体系前先烘干粉碎过60目筛。
4.如权利要求1所述杠柳苷元的生物转化制备方法，其特征在于所述转化反应时间为8～12h。
5.如权利要求1所述杠柳苷元的生物转化制备方法，其特征在于所述黑曲霉HC306发酵培养方法为：
(1)活化培养：将黑曲霉HC306菌种孢子接种于PDA培养基，于28～30℃恒温培养2～3d，获得平板孢子，所述的PDA培养基组成为：马铃薯100～200g/L，蔗糖10～20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉HC306孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10～20g/L，(NH4)2SO4 3～5g/L，酵母浸出粉2～3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 5～6；
(3)发酵培养：将步骤(2)制备的种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，获得发酵液，将发酵液用4层纱布过滤，滤液即为催化剂；所述发酵培养基组成同种子培养基。
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