CN104558120B - 一种免疫调节多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药及生物工程领域，公开了一种免疫调节多肽及其制备方法和应用。该免疫调节多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该免疫调节多肽具有很强的促T淋巴细胞增殖作用，能够用于制备促T淋巴细胞增殖的药物。

Description

一种免疫调节多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药及生物工程领域，涉及一种免疫调节多肽及其制备方法和应用。

背景技术

现代营养学研究发现：人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以小肽形式消化吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小，进一步的试验又揭示了小肽的吸收比游离氨基酸的吸收更为迅速。肽营养作用的另一新认识是蛋白质在酶解过程中可以产生一些具有特殊生理调节功能的生物活性肽。这些生物活性肽在调节胃肠道运动、调节免疫系统、抗高血压、抗菌、抗血栓、抗病毒、抗癌、清除自由基和促进矿物元素吸收等方面发挥着重要作用。这些生物活性肽本身以非活性状态存在于蛋白质氨基酸序列之中，当用适当的蛋白酶进行体外水解或在胃肠道消化过程中以及食品加工过程中，它们的活性就被释放出来。尽管其它动物和植物蛋白质中也包含活性肽序列，但是乳蛋白是目前生物活性肽的主要来源，对其研究最为深入。

Intein(内含肽)是存在于前体蛋白中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来，时间将两端的蛋白质外显肽(extein)连接在一起，该过程即蛋白质剪接过程。在蛋白质纯化过程中，Intein的自动切割可避免了外源蛋白酶的加入以及后期对蛋白酶的清除步骤。

ELP(类弹性蛋白)可进行可逆相变，在低温环境下的水溶液中，ELP呈无序结构状，均匀可溶分布于溶液中，但当温度逐渐升高达到一定相变温度时，它们会逐渐脱去结合水，各ELP分子的疏水区互相接触，最终发生相变聚集成团，这一相变具有典型的可逆性，并且可以通过向溶液中加入盐来加速启动。将ELP作为融合标签与目标蛋白融合表达时，融合蛋白同样具有这种相变特征。当携带ELP的整合蛋白发生聚集时，其他杂蛋白不发生聚集，因此可以通过高速离心将密度高的聚集体融合蛋白与不发生聚集的杂蛋白分开，从而达到纯化目的。

ELP-Intein系统是充分利用ELP的自聚集以及Intein的自切割特征而构建的一种非常独特的蛋白质纯化系统。将表达出的可溶性的“ELP-Intein-目标蛋白”三联体经过相变聚集进行纯化，再诱导Intein发生自切割以释放目的蛋白，再经过一次相变过程，将附带Intein的ELP标签聚集体去除而得到纯化的目标蛋白。运用ELP系统大大降低了蛋白纯化成本，为工业规模的应用提供了可能性。

免疫活性肽是蛋白质中25种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。免疫活性肽具有能刺激多核淋巴细胞，促进淋巴细胞分化和成熟，转移免疫信息，增强机体免疫机能等一系列的生物学功能。大量试验表明乳蛋白中隐含有许多免疫调节多肽序列，这些免疫调节多肽对免疫系统具有重要的调节功能。我们借助超滤技术分离出母乳中小于10KDa的多肽成分，进一步借助串联质谱技术对其具体组成进行鉴定分析。这些多肽是主要从人β-酪蛋白(Homo sapiens beta casein，基因Bank号：NM_001891)中断裂下来的片段，天然存在于母乳中。现有技术中没有对这些片断及其功能进一步研究的报道，为此，我们筛选了一些多肽进行深入的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫调节多肽。

本发明的另一个目的是提供上述免疫调节多肽的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述免疫调节多肽的应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种免疫调节多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

表达上述免疫调节多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述多肽的扩增引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

所述免疫调节多肽的制备方法，该方法包括下列步骤：

a.构建权利要求1所述多肽的表达载体pET-EI-GFP；

b.pET-EI-GFP融合蛋白的诱导表达；

c.pET-EI-GFP融合蛋白的纯化；

d.pET-EI-GFP融合蛋白的自动切割；

e.重组多肽的纯化、收集。

所述的制备方法，该方法包括以下步骤：

a.构建权利要求1所述多肽的表达载体pET-EI-GFP：

人工合成该多肽核酸序列，利用上述的上下游引物(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4)通过PCR技术扩增出含有BsrG I和Hind III酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切后载入pET-EI-GFP载体；

b.pET-EI-GFP融合蛋白的诱导表达：

1)测序正确的表达载体转入感受态细胞BLR(DE3)，接种于含氨苄青霉素的LB培养液培养；

2)收集菌体，重悬后加入IPTG诱导pET-EI-GFP融合蛋白表达；

c.pET-EI-GFP融合蛋白的纯化：

诱导表达后的菌液沉淀PBS缓冲液重悬后，超声破碎，离心，取上清液加热进行相变聚集，离心，弃上清液，沉淀用预冷的PBS缓冲液重悬，离心，取上清液再次加热进行下一轮相变聚集，离心，弃上清液，沉淀用切割缓冲液重悬；

d.融合蛋白的自动切割：

切割缓冲液与蛋白混合后，开始自动切割过程，释放重组多肽的目的蛋白；

e.重组多肽的纯化、收集：

切割过程结束，再次进行相变聚集，切割下的ELP-Intein标签和未切割完全的融合蛋白将转变为沉淀，失去标签的目的蛋白则保持可溶状态存在于上清中；弃沉淀，将上清液透析过夜后进行真空冷冻干燥即可。

所述的制备方法，其中切割缓冲液的组成为0.585g/L EDTA和8.368g/L Bis-Tri溶解于PBS缓冲液中，调节pH值至6.5，高压灭菌，4℃保存。

所述的免疫调节多肽在制备促T淋巴细胞增殖的药物中的应用。

所述的免疫调节肽在制备奶制品添加剂中的应用。

本发明有益效果：

本发明提供的免疫调节多肽具有很强的促T淋巴细胞增殖作用，能够用于制备促T淋巴细胞增殖的药物。

本发明抛弃了传统亲和层析柱纯化，采用ELP-Intein系统纯化方法,该系统则通过ELP特有的可逆相变特性将融合蛋白与其他杂蛋白分开，并且融合蛋白可以自行切割掉携带的标签蛋白从而释放出目标蛋白免疫调节多肽，通过此法获得的免疫调节多肽同样表现出较好的效果。该方法减少了柱纯化过程中，蛋白的损失，大大降低了纯化多肽成本。

该调节肽是母乳来源，母乳作为新生儿最重要的食物，因此该调解肽具有很高的安全性。新生儿免疫力和抵抗力都比较低下，该肽也可用于制备奶制品添加剂。

附图说明

图1是化学合成多肽对人T淋巴细胞有极强的促增殖作用MTT图。

图2 12％SDS-PAGE鉴定融合蛋白的纯化过程。

其中：M：蛋白Marker；1：诱导前菌裂解液；2：诱导后裂解液上清；3：第二轮相变后融合蛋白沉淀。

图3是切割后纯化后的重组多肽Tricine/SDS-PAGE电泳

其中：1：蛋白Marker；2：切割后的重组多肽

图4是重组多肽对人T淋巴细胞的促增值作用MTT图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

1.该多肽具有一下的序列特征：

氨基酸序列：

SPTIPFFDPQIPKLTDLEN(SEQ ID NO：1)

核苷酸序列：

TCTCCAACGATACCCTTTTTTGACCCTCAAATCCCAAAACTCACTGATCTTGAAAAT(SEQ ID NO：2)

具有等电点(pI):4.03，分子量(Mw)：2172.46。

2.化学合成该多肽后发现该肽具有很强的促人T淋巴细胞增殖的作用(见图1)。

采用T淋巴细胞分离试剂(ONE LAMBDA,US)分离人血液T淋巴细胞，RPMI 1640(含10％FCS，100U/ml penicillin/streptomycin)培养液调整细胞浓度至约4×106个/ml。

(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入化学合成的该多肽，终浓度分别为2、4、6μg/ml，以加PBS为空白对照。

(3)每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液。

(4)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。

(5)实验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。

3.重组制备方法的建立

3.1载体构建：

人工合成该多肽核酸序列，借助PCR技术利用下面引物：

扩增出含有上述酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切，同时酶切pET-EI-GFP载体(Lifesensors，USA，该质粒中本身含有ELP和Intein基因)，然后置于16℃恒温水浴锅中过夜连接。

3.2连接产物转化入克隆菌

(1)取100μl制备好的感受态细胞DH5α和10μl连接产物混合，冰浴30min后，42℃热激90s，然后立即置于冰上冰浴5min，加入600μl经37℃预热的LB液体培养基，37℃振荡培养1.5h，离心浓缩至100μl左右涂布于固体LB平板上(含50μg/ml Amp),37℃倒置培养12～16h；

(2)随机挑取几个单克隆至含50μg/ml Amp(氨苄青霉素)的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振荡培养至菌液浑浊，用移液枪吸取菌液作为模板进行菌落PCR；

(3)将菌落PCR有目的条带者进行质粒抽提，用BsrG I和Hind III进行双酶切鉴定，结果为阳性者将其菌液与80％的甘油混匀后(甘油终浓度为10％)保存三份于-20℃，其中一份送测序公司进行测序作最终鉴定。

3.3转化入表达菌

(1)取100μl感受态细胞BLR(DE3)和0.5μl测序正确的表达载体混合，冰浴30min后，42℃热激90s，然后立即置于冰上冰浴5min，加入600μl经37℃预热的LB液体培养基，37℃振荡培养1.5h，离心浓缩至200μl左右涂布固体LB平板(含50μg/ml Amp)，37℃倒置培养5～6h；

(2)次日随机挑取单克隆，为保险起见，做菌落PCR，取阳性菌液与80％的甘油混匀后(甘油终浓度为10％)-20℃保存三份。

3.4融合蛋白的诱导表达

(1)转接甘油冻存菌100μl于10ml LB液体培养基中(含Amp 50μg/ml)，37℃，220rpm振荡培养过夜；

(2)次日将这10ml过夜培养物以2,000g，4℃离心15min以去除β内酰胺酶，用冷的PBS缓冲液重悬洗菌后再次离心一次，然后用相同体积的新鲜TB培养基重悬，将这10ml菌液加入到1L TB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀至0.6左右(约3h)；

(3)取出1ml培养物，1,2000g室温离心1min，弃上清，沉淀冻存于-20℃作为电泳鉴定样品。向剩余培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃100rpm振荡培养24h，诱导融合蛋白的表达；

(4)取出1ml培养物，1,2000g室温离心1min，弃上清，沉淀冻存作于-20℃作为电泳鉴定样品。剩余培养物以3,000g，4℃离心10min，弃上清，沉淀冻存于-20℃冰箱。

3.5融合蛋白的纯化

(1)将冻存于冰箱的菌块沉淀用15m1pH 8.5的PBS缓冲液彻底重悬；

(2)在冰浴中对重悬液进行超声波破碎，设置为：功率400W，工作4s，间歇8s。超声破碎期间，将离心机打开预热至35℃；

(3)超声破碎完毕，破碎液以16,000g，4℃离心20min，留上清，弃沉淀，并留40μl上清作为电泳鉴定样品；

(4)将上清液分装于干净的EP管中，每管加入浓度为3M的NaCl溶液至终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于30℃恒温水浴锅中孵育10min使融合蛋白发生相变反应；

(5)孵育完毕，立即将各管放入预热好的离心机中，16,000g，35℃离心10min；

(6)离心结束，迅速取出EP管，用力甩出各管里的上清液弃之，由于融合蛋白发生相变聚集，离心后即沉淀，而杂蛋白不发生相变因此任保留在上清中。含有融合蛋白的沉淀用4℃预冷的pH 8.5的PBS缓冲液轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)使融合蛋白发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态。留10μl重悬液作为电泳鉴定样品。重悬期间，打开另外一部离心机预冷至4℃；

(7)重悬完毕，将各EP管放用预冷好的离心机以16,000g，4℃离心10min去除蛋白液中残留的不溶杂质；

(8)离心结束，收集上清至新的干净EP管中，重复步骤4-7进行另一轮相变以提高融合蛋白的纯度，在重复第6步时用pH 6.5的切割缓冲液(0.585g/L EDTA和8.368g/LBis-Tri溶解于PBS缓冲液中，调节pH值至6.5，高压灭菌，4℃保存)代替PBS。将最终收集的上清取10μl作为电泳鉴定样品。

结果见图2。

3.6融合蛋白的自动切割

切割缓冲液与蛋白混合后，28℃自我切割6h。

3.7免疫调节多肽的纯化

切割过程结束，向各EP管中加入终浓度为1.5M的NaCl溶液，30℃水浴10min，诱发相变。切割下的ELP-Intein标签和未切割完全的融合蛋白将转变为沉淀，失去标签的抗菌肽则保持可溶状态存在于上清中。弃沉淀，将上清透析过夜后进行真空冷冻干燥以备后-20℃待后续实验使用；切割后纯化后的重组多肽Tricine/SDS-PAGE电泳见图3。

4、重组免疫调节多肽的活性检测

采用T淋巴细胞分离试剂(ONE LAMBDA,US)分离人血液T淋巴细胞,RPMI 1640(含10％FCS，100U/ml penicillin/streptomycin)培养液调整细胞浓度至约4×106个/ml。采用传统的MTT法检测重组免疫调节多肽对T淋巴细胞增值的作用。在96孔板中每孔加入50μl细胞，150μl RPMI 1640培养液。再分组依次加入重组多肽，终浓度分别为2、4、6μg/ml，以加PBS为空白对照。在37℃、5％CO₂浓度条件下培养48h后每孔加入50μl 2mg/mL MTT，37℃，5％CO₂继续培养4h，离心，去上清，加入150μl DMSO微孔板震荡上震荡10分钟，使结晶物溶解，测定各孔OD₅₇₀值。实验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。

结果见图4。

结果显示重组多肽具有极强的促进T淋巴细胞增值的作用，并呈现一定的浓度依赖性。

Claims (1)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的免疫调节多肽在制备促T淋巴细胞增殖的药物中的应用。