CN1691961A

CN1691961A - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂

Info

Publication number: CN1691961A
Application number: CN 200380100496
Authority: CN
Inventors: 胜沼信彦; 山田明男; 川口靖; 高仓南津子
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2005-11-02

Abstract

本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它所含的活性成分是酪蛋白(一种来源于乳汁的蛋白质)、酪蛋白肽片段和/或酪蛋白水解物。本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可用作骨质疏松症、恶性肿瘤高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、细菌性或病毒性感染疾病等的预防或治疗药物以及用于食品、饮料和饲料等。

Description

半胱氨酸蛋白酶抑制剂

技术领域

本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它所含的活性成分是酪蛋白、酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物，可用作骨质疏松症、恶性高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、细菌性或病毒性感染疾病等的预防或治疗药物，以及用于食品、饮料、饲料等。

技术背景

活性中心具有一个巯基的蛋白水解酶一般称作半胱氨酸蛋白酶(巯基蛋白酶)。组织蛋白酶L、组织蛋白酶B或组织蛋白酶K是典型的半胱氨酸蛋白酶，其它的半胱氨酸蛋白酶还有钙依赖性神经蛋白酶(CAMP)、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和普罗米酶(promelain)等。预期对这些半胱氨酸蛋白酶有抑制作用的物质可用作半胱氨酸蛋白酶相关疾病的治疗药物或用作癌症的生长抑制剂或转移预防药物、抗血栓形成药物等，半胱氨酸蛋白酶相关疾病包括肌肉萎缩症、营养不良、心肌梗死、中风、阿耳茨海默氏病、脑外伤引起的意识或运动机能障碍、多发性硬化、周围神经病、白内障、炎症、过敏症、暴发型肝炎、骨质疏松症、高钙血症、乳腺癌、前列腺癌或前列腺肥大。此外，近年来，基于Katsunuma等人的研究，组织蛋白酶L、组织蛋白酶B与骨质疏松症或恶性高血钙症之间的关系已经得以阐明。据此，特别是将一种组织蛋白酶L抑制剂作为治疗药物具体地应用于骨质疏松症或恶性高血钙症已引起人们的关注(Nobuhikokatsunuma，“BIO media”Vol.7，No.6，pp.73 to 77，1992)。在骨组织中，造骨细胞引起的骨形成和破骨细胞引起的骨吸收贯穿于整个生命过程。在生长发育阶段，骨量因骨生成超过骨吸收而增加，然而随着年龄的增长，骨量因骨吸收超过骨生成而减少，从而导致发生骨质疏松症。引起骨质疏松症的原因有很多，一种特别主要原因是骨塌陷(骨吸收)，它又可以细分为以下两种原因：其一是钙的吸收和沉着障碍，更具体地说是与钙的供应、转移、吸收和沉着有关，一般认为在此过程中有维生素D衍生物、雌性激素(雌激素)等参与；另一种原因与骨支持组织胶原蛋白的加速降解有关，其主要原因是位于破骨细胞中的溶酶体分泌的半胱氨酸蛋白酶，具体来说是组织蛋白酶L、组织蛋白酶B和组织蛋白酶K引起骨胶原蛋白的降解。破骨细胞中的溶酶体分泌的组织蛋白酶L和组织蛋白酶B可促进骨组织胶原蛋白的降解，从而引起旧骨溶解，钙质被游离出来并与羟脯氨酸一同被释放到血液中。因此，抑制组织蛋白酶L、组织蛋白酶B和组织蛋白酶K对胶原蛋白的降解可防止过度的骨塌陷，从而有可能用这种方法来治疗骨质疏松症。雌激素、同化激素、钙制剂、维生素D、降血钙素和双膦酸盐等是已知的此类骨质疏松症的治疗药物。此外，利用一些半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为骨质疏松症的治疗药物的开发正在进行，它是一种具有所谓的半胱氨酸蛋白酶抑制作用包括组织蛋白酶L、组织蛋白酶B和组织蛋白酶K抑制作用机制的骨质疏松治疗药(JP 07-179496 A，JP2002-501502A)。但是仍需进一步开发骨质疏松症的治疗药物。

同时，高血钙症是一种代谢紊乱症，其血清中钙浓度远高于正常水平，常见于肿瘤病人。通常来说，如果忽视了高血钙症，病人的生命最长可能只有10天。在许多病例中，导致高血钙的原因是肿瘤的骨转移。当肿瘤转移到骨时，骨塌陷就会发生，然后钙被释放到血液中。释放出的钙可在肾脏中被处理，但当骨塌陷的速度超过肾脏处理能力时就会形成高血钙。作为一种治疗方法，使用呋塞米生理盐水输液促进钙从肾脏排泄的方法以及使用治疗骨质疏松症的药物降血钙素的方法已为大家所熟知。一般认为作用机理为抑制骨吸收的骨质疏松症治疗药物作为恶性高血钙症的治疗药物也是同样有效。

本发明的发明人已经公开下列可用于上述目的的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

(1)织蛋白酶L特异性抑制多肽(JP 07-179496A)

(2)疏基蛋白酶抑制剂(JP 09-221425 A)

(3)缬氨酸衍生物及其应用(JP 2001-139534 A)

(4)巯基蛋白酶抑制剂(JP 07-242600 A)

(5)化合物FA-70C1(JP 2000-72797 A)

(6)化合物FA-70D，其生产方法及其应用(WO 97/31122)

然而，从食品应用的角度看，迫切需要开发出一种用途更广的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

另一方面，现在已经知道母乳中存在蛋白酶抑制性物质。已知的母乳中含有的蛋白酶抑制性物质包括α1-抗凝乳蛋白酶和α1-抗胰蛋白酶，而抑制剂包括间α2-胰蛋白酶抑制性物质、α2-抗血纤维蛋白溶酶、α2-巨球蛋白、抗凝血酶III、抗白细胞蛋白酶在母乳中仅含微量(Isao Kiyosawa，“Human Milk in Infant Nutrition，”Kanehara & Co.，Ltd.，pp.80-81)。

下列存在于乳汁中的具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的蛋白质已经公开。

(1)一种新的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，分子量约57kDa，带有糖链，来源于牛初乳(JP 07-2896 A)。

(2)一种新的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，分子量为16±2kDa或13±2kDa，来源于初乳(JP 07-126294 A)。

(3)一种新的蛋白质，分子量为16±2kDa或13±2kDa，来源于人初乳，以及其制造方法(JP 10-80281 A)。

(4)一种骨吸收抑制剂，所含活性成份为用乳汁制备的乳源性碱性半胱氨酸蛋白酶抑制剂和/或其降解产物(JP 2000-281587A)。

(5)奶碱性蛋白(MBP)中含有的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C及其体外骨吸收抑制活性(“Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，Japan”Vol.66，No.12，2002，pp.2531 to 2536)。

哺乳动物乳汁中含量较高的蛋白质包括乳铁蛋白和β-酪蛋白。酪蛋白可分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。人乳中的酪蛋白大多为β-酪蛋白，αs-酪蛋白不存在或仅痕量存在，而牛乳中的酪蛋白由几乎等量的αs-酪蛋白和β-酪蛋白组成。酪蛋白除作为营养成分外，近年来由于发现了一种固有地包含在该蛋白质一级结构中的具有钙吸收刺激效应或促巨噬细胞吞噬作用的生物活性肽而引起人们的关注。除有较高的营养价值外，酪蛋白还为我们的饮食生活提供乳制品的原料或作为许多食物如干酪、酸奶酪和脱脂乳的成分。

作为利用酪蛋白的发明，本发明申请人公开了一种含有活性成分为κ-酪蛋白或κ-酪蛋白水解物的动脉硬化预防药物(JP 08-81388A)。

此外，一种从人乳中分离的β-酪蛋白或其重组产品或其水解物也已经公开，它具有抑制流感嗜血杆菌粘附人类细胞的活性(JP 10-500101 A)和抑制RS病毒(呼吸道合胞病毒)感染哺乳动物细胞的效应(JP10-500100A)。

另外，已经公开了β-酪蛋白水解物对血管紧张素转化酶的抑制作用(JP 06-128287 A和JP 06-277090 A)。

然而，人们仍然不知道酪蛋白及其部分肽具有半胱氨酸蛋白酶抑制作用。

发明公开内容

本发明的目的是提供一种用途广泛的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它既可以广泛地用作食品原料，又可以作为预防或治疗药物用于骨质疏松症、恶性高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、或细菌性和病毒性感染疾病等以及各种类型的食品、饮料和饲料。

本发明的发明人通过对一种有可能无抗原性、可安全使用的物质——半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行深入地研究，结果发现一种来源于乳汁的蛋白质——酪蛋白、酪蛋白部分肽和酪蛋白水解物具有胱氨酸蛋白酶抑制活性，从而完成了本发明。

本发明的要旨见下列(1)至(24)项。

(1)一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，含有的活性成分为酪蛋白或其部分肽。

(2)(1)项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中酪蛋白或其部分肽来源于人或牛。

(3)一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，含有的活性成分为下文(A)或(B)所描述的酪蛋白或其部分肽。

(A)具有至少包含序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸的氨基酸序列的肽，或

(B)具有至少包含序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸的氨基酸序列的肽，该肽包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

(4)一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，含有的活性成分为下文(C)或(D)所描述的酪蛋白或其部分肽。

(C)具有至少包含序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的氨基酸序列的肽，或

(D)具有至少包含序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的氨基酸序列的肽，该肽包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

(5)一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，含有的活性成分为酪蛋白水解物，它可通过用蛋白酶水解酪蛋白来获得并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

(6)(5)项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中蛋白酶可以是的一种或几种蛋白酶，选自于来源于动物的蛋白酶和来源于微生物的蛋白酶。

(7)(5)或(6)项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中酪蛋白水解的水解度为6-45％。

(8)(5)至(7)任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中酪蛋白水解物的数均分子量为200-5,000道尔顿。

(9)(5)至(8)任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其含有的酪蛋白水解物的质量与总量相比不少于0.005％。

(10)(1)至(9)任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶相关疾病的预防或治疗药物。

(11)(10)项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中半胱氨酸蛋白酶相关疾病是骨质疏松症、恶性高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、或细菌性和病毒性感染疾病等。

(12)一种食品及饮料组合物或饲料组合物，其通过添加(1)至(11)任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂制得。

(13)一种治疗半胱氨酸蛋白酶相关疾病的方法，其中将(1)至(11)任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂给予患者。

(14)酪蛋白或其部分肽在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

(15)(14)项的应用，其中酪蛋白或其部分肽来源于人或牛。

(16)下文(A)或(B)所描述的酪蛋白或其部分肽在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

(17)下文(C)或(D)所描述的酪蛋白或其部分肽在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

(18)酪蛋白水解物在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用，所述酪蛋白水解物可通过用蛋白酶水解酪蛋白来获得并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

(19)(18)项的应用，其中蛋白酶可以是的一种或几种蛋白酶，选自于来源于动物的蛋白酶和来源于微生物的蛋白酶。

(20)(18)或(19)项的应用，其中酪蛋白水解物的水解度为6-45％。

(21)(18)至(20)任一项的应用，其中酪蛋白水解物的数均分子量为200-5,000道尔顿。

(22)(18)至(21)任一项的应用，其含有的酪蛋白水解物的质量与总量相比不少于0.005％。

(23)(14)至(22)任一项的应用，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶相关疾病的预防或治疗药物。

(24)(23)项的应用，其中半胱氨酸蛋白酶相关疾病是骨质疏松症、恶性高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、或细菌性和病毒性感染疾病等。

附图简述

图1图示用反相酶谱法检测牛乳蛋白(照片)。

图2图示牛β-酪蛋白和牛β-酪蛋白肽的氨基酸序列。

图3图示酪蛋白对木瓜蛋白的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

图4图示β-酪蛋白的半胱氨酸蛋白酶抑制活性范围。

图5图示人β-酪蛋白和人β-酪蛋白肽的氨基酸序列。

实施本发明的最佳方式

下面将详细描述本发明的优选实施方案。但本发明不限于下列优选实施方案，在本发明的范围内可以对其作任何改进。除另有特别指明外，本说明书中所用的百分比是重量百分比。

本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它所含的活性成分是酪蛋白、酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物。本发明所用的酪蛋白可以是各种商品酪蛋白，也可以用常规方法(例如等电点沉淀法)从人、牛、马或山羊的乳汁中分离，或者采用基因重组技术等生产。酪蛋白可分为α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，任何一种酪蛋白都可以用于本发明，但优选使用β-酪蛋白或κ-酪蛋白。总之，来源于人的β-酪蛋白(例如，来源于人的具有Swiss-Prot Accession No.：P05814所描述氨基酸序列的β-酪蛋白)和来源于牛的β-酪蛋白(例如，具有Swiss-ProtAccession No.：P02666所描述氨基酸序列的牛β-酪蛋白)是最好的。具体地说，人β-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，而牛β-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明所用的部分肽可通过如下方法获得：先根据已知的方法用酸或蛋白酶水解酪蛋白，然后纯化所得到的部分肽。例如，部分肽可以用以下程序生产：在100mM Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)中，用赖氨酰内肽酶于35℃水解酪蛋白3小时或更长时间，然后用高效液相色谱(HPLC)等方法纯化所获得的部分肽。

可用于本发明的酪蛋白或酪蛋白部分肽的优选实施方案包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的人β-酪蛋白或具有至少包括SEQID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸的氨基酸序列的肽。此外，其它实例有具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的牛β-酪蛋白或具有至少包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的氨基酸序列的肽。注意：序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的1-15号氨基酸之间的序列是信号序列。

酪蛋白和酪蛋白部分肽具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，因此它们可用作本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。此外，一般认为具有包括序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸并向N-未端或C-未端一端或两端延伸的氨基酸序列的肽以及具有包括序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸并向N-未端或C-未端一端或两端延伸的氨基酸序列的肽具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，因为全长酪蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

鉴于本发明揭示一个具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的功能域，所以我们可以基于包括该功能域在内的氨基酸序列来化学合成以及利用基因重组技术来获得上述肽。例如，我们基于编码包括该功能域在内的氨基酸序列的核苷酸序列来合成合适的引物。然后使用引物和以含目标核苷酸序列的cDNA为模板，用PCR等方法来扩增该核苷酸序列。获得的核苷酸序列用合适的表达系统来表达，就可获得上述肽。

一般来说，由于种属和个体等差别，在一个基因的一个或多个位点上存在一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等突变，从而导致由包含上述突变的基因所编码的蛋白质氨基酸存在突变。因此可用于本发明的酪蛋白或酪蛋白部分肽也可能含有这些突变，但其半胱氨酸蛋白酶抑制活性不因此而减弱。可用于本发明的酪蛋白或酪蛋白部分肽包括：具有至少包括序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸的氨基酸序列的肽，该肽包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性；以及具有至少包括序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的氨基酸序列的肽，而且该肽包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。本发明使用的术语“多个”，随序列表SEQID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸或序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的蛋白质构象中氨基酸的种类或位置而不同，例如它可涉及2-5个氨基酸，优选为2-3个氨基酸。

更深入一步讲，一个或多个氨基酸的取代、缺失等可发生于SEQID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸或序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸之外的氨基酸。在这种情况下，该术语可指2-10个氨基酸，优选为2-5个氨基酸，同样它随着氨基酸残基的种类或在蛋白质构象中的位置而不同。

此外，可用于本发明的酪蛋白或酪蛋白部分肽实例包括这样的蛋白或肽：其氨基酸序列同一性应不低于80％，优选为不低于90％，更优选为不低于95％；以及具有至少包括序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸的氨基酸序列或具有至少包括序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的氨基酸序列的蛋白质或肽，并且它们均具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

编码与上述酪蛋白或肽基本相同的蛋白或肽的核苷酸序列可以通过诸如用定点突变的方法修饰核苷酸序列的方法来获得，用此法可使特定位置上的氨基酸残基发生包括取代、缺失、插入、添加或倒位突变。这种修饰的核苷酸序列也可以用传统的突变剂处理的方法来获得。编码与酪蛋白或酪蛋白肽基本相同的蛋白或肽的核苷酸序列还可以通过在合适的细胞中表达含有突变的核苷酸序列，然后用本发明实施例中描述的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的测定方法检查半胱氨酸蛋白酶抑制活性的方法来获得。

酪蛋白的水解物也可用于本发明。可供水解的酪蛋白包括上述的那些酪蛋白。酪蛋白水解物可以通过下述的用蛋白酶水解酪蛋白方法来获得。

即，将上述酪蛋白原料分散并溶解在水或热水中。虽然对溶液的浓度没有特别的限制，但从水解的效率和可操作性上来看，通常需要将蛋白质浓度控制在5-15％范围内。为防止因污染引起的酸败，需要将含酪蛋白的溶液置于70-90℃加热15秒钟至10分钟消毒。然后，最好在含有酪蛋白的溶液加入碱或酸试剂将pH调到蛋白酶的最适pH或附近。本发明方法中使用的碱试剂或酸试剂可以是可用于食品或药物的任何一种碱试剂或酸试剂。具体的碱试剂实例包括氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钾，而具体的酸试剂实例包括盐酸、柠檬酸、磷酸和醋酸。

然后，将蛋白酶加入到酪蛋白溶液中。蛋白酶只要是能水解蛋白质，并无特别的限制，但最好是来源于动物或微生物的酶。并且最好是内肽酶。作为内肽酶，许多种酶如胰酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等都可使用。术语“来源于”指上述那些天然产生蛋白酶的生物，并不是指从哪里提取的。例如，将编码枯草杆菌产生的蛋白酶的基因导入大肠杆菌中表达所得的蛋白酶，是“来源于”枯草杆菌。

最好按20-200活性单位/克酪蛋白(该单位将在下文中述及)的比例加入蛋白酶。此处的活性单位可用下例的方法测定：按0.2g/100ml的比例将含蛋白酶的酶粉分散或溶解在0.1mol磷酸缓冲液(pH 7.0)中以制备酶溶液。同时将亮氨酰对硝基苯胺(Kokusan Chemical Co.，Ltd生产，以下称作Leu-pNA)溶于0.1mol磷酸缓冲液(pH7.0)中制备2mM的底物溶液。将1ml底物溶液加入到1ml酶溶液中，使于37℃反应5分钟，然后加入2ml 30％醋酸溶液终止反应。接着将反应溶液用薄膜过滤器过滤，在410nm波长处测定滤过液的吸光度。蛋白酶活性单位定义为：1分钟降解1μmol Leu-pNA所需的酶量为1个活性单位。蛋白酶的活性单位可按下式计算。

活性单位(每克酶粉)＝20×(A/B)

上式中，A和B分别为样品和0.25mM对硝基苯胺在410nm波长处的吸光度。

本发明中使用的蛋白酶可以是一种、两种或多种。当用两种或多种酶时，酶反应可能是同时或分别进行。

加入了酶的溶液应根据酶的种类保持在适宜的温度下，例如于30-60℃，优选为45-55℃，然后开始酪蛋白的水解。水解反应可以持续至取得满意的水解度为止，其间可以监测酶反应的水解度。在本发明中，酪蛋白水解物的最适水解度为6-45％。此处，酪蛋白水解物的水解度不低于6％表明降解已深入进行。即，水解度最好不低于6％，如果水解度低于6％，表明可能仍然存在没有进行酶反应的未降解的酪蛋白。

计算蛋白质水解度的方法是：例如，用凯氏定氮法(The JapaneseSociety for Food Science and Technology edition，“Shokuhinbunsekiho，”p102，Korin Publishing Co.，Ltd.，1984)测定样品中的总氮，用甲醛滴定法(Ikeda et al.edited，“Food Engineering Experiments，”Vol.1，p547，Yokendo Co.Ltd.，1970)测定样品中的甲醛氮，然后根据这些测定结果，按下式计算出水解度。

水解度(％)＝(甲醛氮/总氮)×100

水解反应的终止可以通过灭活水解液中的酶来进行，可以用传统的加热处理的方法来进行灭活。热处理方法的灭活温度和维持时间的设定要考虑到所用酶的热稳定性并应将酶充分灭活。例如热处理可以在80-130℃的温度范围内并维持2秒至30分钟来进行。如需要，可以将所得反应液用诸如柠檬酸等酸调至pH 5.5至7的范围内。

在本说明书中，术语“数均分子量”是指基于一篇关于数均分子量的文献(edition by The Society of Polymer Science，Japan“TheFoundation of Polymer Science”pp.116 to 119，Tokyo Kagaku Dozin Co.，Ltd.，1978)所述的各种不同参数而计算出的大分子化合物的平均分子量。即，诸如蛋白质水解物的大分子化合物是非单一成分的物质，其分子量具有一定的分布特征，因此在理化特征上蛋白水解物的分子量需要用平均分子量来代表。数均分子量(下文有时简称为Mn)是与分子数有关的平均值。假设用Mi代表肽链i的分子量，Ni代表其分子数，那么数均分子量由以下通式I定义：

[通式I]

Mn = Σ_{i = 1}^{\infty} \underset{\cdot}{M} iNi / Σ_{i = 1}^{\infty} Ni

当在本发明中确定数均分子量时，可通过用高效液相色谱测定分子量的分布，然后用GPC系统分析分析曲线上的数据而计算出来。高效液相色谱的详细条件如下：用聚羟乙基天冬酰胺柱(Poly LC，Inc.生产，4.6mm×400mm)为色谱柱，用20mM氯化钠和50mM甲酸以0.5ml/min的洗脱速度进行洗脱。分子量由紫外检测器(ShimadzuCorporation生产，波长215nm)测定，同时用已知分子量的样品做出分析曲线，检测数据用GPC系统进行分析(Shimadzu Corporation生产，波长215nm)分析，如此可以计算出数均分子量。

在本发明中，酪蛋白水解物的数均分子量最好为200-5000道尔顿。此处，数均分子量最好不超过5000道尔顿，因为它不含未水解的未降解酪蛋白。因此一般认为当数均分子量不超过5000道尔顿时，就能更确定地认为已获得了本发明中的活性成分酪蛋白水解物。

所获得的含有酪蛋白水解物的溶液可直接使用，也可以用传统的方法将其浓缩后得到浓缩液或用传统的方法将浓缩液干燥得到粉末。

上述得到的酪蛋白水解物具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。因此可以用半胱氨酸蛋白酶抑制活性作为一个指标来设定生产酪蛋白水解的适宜条件。

本发明的蛋白酶抑制剂中，酪蛋白、酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物可以单独使用，也可以两个或多个一起使用。此外，一种类型的酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物可单独使用，也可以多种类型联合使用。

可用于本发明的酪蛋白、酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物对诸如组织蛋白酶B、L和木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶具有抑制活性。半胱氨酸蛋白酶抑制活性可以根据Barrett等(Methods in Enzymology，Vol.80，pp.535-561，1981)的方法测定。例如，将酪蛋白、酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物溶于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)中，在此溶液中加入Z-Phe-Arg-MCA(苄氧基碳酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酸4-甲基-香豆酰-7-胺：终浓度20mM，Peptide Institute，Inc.生产)作为底物。然后加入半胱氨酸蛋白酶(本实例中为木瓜蛋白酶：Sigma Co.，Ltd生产)溶液(终浓度：15单位/ml)，将整个溶液混合，使于37℃反应10分钟。然后用荧光分光计(Hatachi，Ltd.生产)测定从消化的底物中释放出的AMC(7-氨基-4-甲基-香豆素)的荧光强度(激发波长：370nm，发射波长：460nm)。

本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可用酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物与合适的药物载体混合来生产。本发明的药物的剂型没有特别的限制，可根据治疗目的做出适当的选择。具体地说，剂型的实例包括片剂、丸剂、散剂、液体制剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、软膏剂和贴剂。在制备时可能要用到诸如赋形剂、粘合剂、崩解剂、滑润剂、稳定剂、调味剂、稀释剂、表面活性剂以及用于注射剂的溶液等添加剂，这些添加剂作为药物载体广泛应用于一般药物。

本发明药物中所含的酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物的量没有特别规定，可适当选择。例如，通常可设定为制品质量的0.005％至80％，优选为0.05％至60％。

半胱氨酸蛋白酶相关疾病可通过给患者口服或胃肠外给予本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂来治疗。本发明使用的术语“患者”可以是人类或其它哺乳动物。本发明药物的给药方式也没有特别的限制，可根据药物的剂型、患者的年龄或性别及其它情况包括患者的病情轻重来决定。本发明药物活性成分的剂量可基于给药方案、患者的年龄或性别、疾病的轻重和其它情况来做出恰当地确定。通常，活性成分酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物的量可基于0.1至1200毫克/公斤/天的剂量范围，优选为500毫克/公斤/天的量来确定。药物一天可给药一次或几次。

本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可用作半胱氨酸蛋白酶相关疾病诸如过敏症、肌肉萎缩症、心肌梗死、中风、阿耳茨海默氏病、多发性硬化、白内障、骨质疏松症、恶性高钙血症、前列腺肥大、乳腺癌、前列腺癌和牙周炎等疾病的预防和治疗药物，或用作癌细胞生长或转移的抑制剂，或用作细菌(金黄色葡萄球菌V8等)或病毒(脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、冠状病毒、AIDS病毒等)的生长抑制剂。本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可单独使用，或与上述疾病公知的预防和治疗药物或公知的细菌或病毒的生长抑制剂联合使用。联合使用可提高对疾病的预防和治疗作用或增强对细菌或病毒的生长抑制作用。联合使用的公知的上述疾病预防和治疗药物或细菌或病毒的生长抑制剂可包含在本发明活性成分的抑制剂中，也可开发成另一种药物，或不包含在本发明的抑制剂中而联合使用。

本发明的食品及饮料组合物可通过向食品或饮料的原料中添加酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物来生产，它可口服吸收。一般用于饮料或食品的原料都可使用。本发明的食品及饮料组合物可用与一般的食品及饮料组合物类似的制造方法而制造，不同的只是添加了半胱氨酸蛋白酶抑制剂。食品及饮料组合物的使用形式实例包括诸如冷饮料、碳酸饮料、营养饮料、果汁饮料和乳酸菌饮料等饮料(包括这些饮料的浓缩液和调节粉末)；诸如冰淇淋、冻果汁露、刨冰等冰冻甜食；诸如糖果、口香糖、泡泡糖、巧克力、糖丸、点心、饼干、果冻、果酱、乳酪和烘烤糖果等糖果；诸如加工牛奶、牛奶饮料、发酵牛奶和黄油等乳制品；面包；肠道营养剂、液体剂、婴儿剂和运动饮料；以及其它的功能食品。

在本发明中的食品及饮料组合物中，酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物的加入量可根据食品及饮料组合物的使用方式来适当地确定，通常加入的量为食品及饮料总重量的0.005％至80％，优选为总重量的0.05％至60％。

本发明的饲料组合物可通过向饲料中添加酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物来生产，它可通过口服给予一般哺乳动物、家畜、水产养殖鱼和宠物。饲料组合物的使用形式实例包括宠物食品、家畜饲料和鱼饲料，本发明的饲料组合物也可通过调配酪蛋白与谷物、酒糟、米糠、鱼粉、骨肥、油脂、脱脂乳、乳清、矿物饲料、酵母等来生产。

加入本发明饲料组合物的酪蛋白、酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物的用量根据饲料组合物形式适当选定，一般其加入量为饲料组合物重量的0.005-80％(重量)，优选0.05-60％(重量)。

本发明的食品及饮料组合物或饲料组合物是一种指明了具有预防或治疗下述疾病的效果的食品及饮料组合物或饲料组合物。即，它可指明可用于半胱氨酸蛋白酶相关疾病诸如骨质疏松症、恶性高钙血症、乳腺癌、前列腺癌和牙周炎或细菌或病毒感染性疾病的预防和治疗。

本发明使用的术语“指明”是指告知使用者上述功效，包括例如在本发明的食品及饮料组合物或饲料组合物的商品上或包装上或其广告上指明上述功效，散发、转送和展示有该说明的物质。特别优选指明特定健康用途的食品的实施方案[参阅Article 12(1)，5 of theregulation of Health Enforcement Law(April 30，2003，Ordinance No.86of the Japanese Ministry of Health，Labor and Walfare)]。

用作本发明半胱氨酸蛋白酶抑制剂的活性成分的酪蛋白部分肽和/或酪蛋白水解物的生产的实施例列举如下。

[生产实施例1]

具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列中133至151号氨基酸的氨基酸序列的肽可按下述方法生产。

本发明的肽可用自动肽合成仪(Applied Biosystems Co.，Ltd.生产，型号433A)合成。

用含20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮(Applied Biosystems Co.，Ltd.生产，下文简称为NMP)切割用于肽合成的固化树脂HMP树脂(AppliedBiosystems Co.，Ltd.生产)上的氨基保护基Fmoc基，然后用NMP洗涤。接着用FastMoc(商标)试剂盒(Applied Biosystems Co.，Ltd.)将Fmoc-苏氨酸[具体地说是Fmoc-氨基酸(Applied Biosystems Co.，Ltd.生产)，该氨基酸对应于需要合成的肽C末端氨基酸]缩合到树脂上，再用NMP洗涤。接着，再次切割Fmoc基，将对应于C-末端的第二个氨基酸的Fmoc-丙氨酸缩合连接，随后用NMP洗涤。通过进一步重复缩合Fmoc-氨基酸和洗涤过程可制备保护性的肽树脂，最后可以从树脂中回收肽的粗制品。

可以用高效液相色谱(下文简称为HPLC)将肽从粗肽中纯化出来。所用的色谱柱有如反相色谱柱C18-ODS(Merck&Co.，Inc.生产，Lichrospher 100)。所得到的纯化肽可以用HPLC进行分析以更一步证实纯化产物为单一的肽。纯化肽的氨基酸序列用气相自动氨基酸测序仪(Applied Biosystems Co.，Ltd.生产，型号473A)来测定，发现它具有SEQ ID No.1中133至151号氨基酸的氨基酸序列。

用相似的方法，我们生产出了具有序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列中142至160号氨基酸的氨基酸序列的肽。

[生产实施例2]

将100克商品乳酪蛋白“Alacid”(蛋白质含量为90％，NewzealandMilk Products生产)悬浮到预热至60℃的纯化水中，使浓度为10％，加入2.5g氢氧化钠使完全溶解。将此溶液于85℃灭菌10分钟，然后将此溶液的温度调至50℃。接着，加入2,500U作为蛋白酶的胰酶(Amano Enzyme Co.，Ltd.生产，112,000U/g)，于50℃保温4小时进行水解反应。于90℃保温10分钟热处理灭活酶，然后将此溶液冻干，得约100克酪蛋白水解物。所得酪蛋白水解物水解度为9.5％，数均分子量为910道尔顿。

[生产实施例3]

将100克商品酪蛋白钠“Alanate”(蛋白质含量为90％，NewzealandMilk Products生产)溶解于50℃的纯化水中，使浓度为12％。然后将此溶液于85℃灭菌10分钟，再将此溶液的温度调至40℃，然后加入2,50U作为蛋白酶的猪胰蛋白酶(PTN6.0S；Novozyme Inc.生产，1,250U/g)，于40℃保温6小时进行水解反应。然后于90℃保温10分钟热处理灭活酶，将此溶液冻干，得到100克酪蛋白水解物。所得酪蛋白水解物水解度为10.8％，数均分子量为750道尔顿。

以下我们通过列举测试实施例来详细地描述本发明。

[测试实施例1]

进行本测试的目的是检测乳汁中的半胱氨酸蛋白酶抑制性物质。

(1)检测方法

本发明人使用“反向酶谱”技术作为检测半胱氨酸蛋白酶抑制性物质的方法，检测位于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上的半胱氨酸蛋白酶抑制性物质。反向酶谱法是基于与常规的酶谱法相反的一种技术，其基本原理如下：将含有蛋白酶抑制性物质的样品加到含有明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳，然后将凝胶浸泡到一种蛋白酶溶液中以降解胶中的蛋白质。在有抑制性物质存在的部分，蛋白酶的活性受到抑制，该部分中的明胶因此也避免了被蛋白酶所降解，用染色液对它进行染色，就能检测出抑制性物质。

(2)测试方法

本发明采用的一种反向酶谱法描述如下。

用总乳蛋白和天然牛β-酪蛋白作为样品，用含0.1％明胶的12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(下文中SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有时缩写为SDS-PAGE)。电泳后，将凝胶浸没在2.5％Triton X-100溶液中洗涤45分钟。然后将凝胶浸没在蒸馏水中进一步洗涤，重复三次，每次45分钟。再将凝胶浸没在100ml含1mg木瓜蛋白酶(31units/ml)的0.025M醋酸缓冲液(pH5.5)中，将此溶液置于37℃10小时消化明胶。凝胶用蒸馏水洗涤后，用染色液(0.025％考马斯亮蓝(CBR)R-250，40％甲醇，7％醋酸水溶液)染色1小时，再用脱色液(40％甲醇，10％醋酸水溶液)脱色。

此外，用不含0.1％明胶的12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶按上述相同的方式进行反向酶谱作为对照试验。另处我们还进行了常规的12.5％SDS-PAGE(CBB染色)。

(3)测试结果

本发明的试验结果如图1所示。图1显示反向酶谱图。泳道1是乳总蛋白的典型的SDS-PAGE图谱，泳道2是乳总蛋白的反向酶谱，泳道3是乳总蛋白的对照反向酶谱，其中凝胶中不含明胶，泳道6是天然牛β-酪蛋白的反向酶谱，泳道7是天然牛β-酪蛋白的对照反向酶谱，其中凝胶中不含明胶。图中箭头所指的是天然牛β-酪蛋白(分子量35kDa)在SDS-PAGE中的迁移位置。补充说明一点，泳道4和5与本测试实施例无直接关系。

从图1可明显发现，泳道2中的反向酶谱阳性条带的位置基本上与牛β-酪蛋白(35kDa)的迁移位置一样。这证实了牛奶中存在具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的物质。此外泳道6中也发现了阳性条带，泳道6显示的是天然牛β-酪蛋白在使用木瓜蛋白酶的反向酶谱中的迁移情况。

上述结果表明来源于牛的β-酪蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

[测试实施例2]

进行本测试的目的是测定测试实施例1中证明的具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的35kDa条带的N-未端氨基酸序列。

(1)测试方法

用实施例1中使用的牛奶总蛋白样品进行SDS-PAGE，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将PVDF膜用CBB染色，接着将迁移在35kDa附近的染色条带切下。用惠普公司生产的G1005A蛋白测序系统测定该条带的N-末端氨基酸序列。

(2)测试结果

本测试的结果如图2所示。图2显示了牛奶中35kDa染色条带的氨基酸序列测定结果。结果表明，35kDa染色条带的N-末端氨基酸序列与牛β-酪蛋白完全吻合。因此，本测试和测试实施例1的结果都表明β-酪蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

[测试实施例3]

进行本测试的目的是检测酪蛋白分子中具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的功能域。

(1)测试方法

将250μg牛β-酪蛋白溶解于100mM Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)中，用赖氨酰内肽酶于35℃消化16小时。测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性以证实消化后的牛β-酪蛋白肽混合物是否仍然保留有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

抑制活性的测量方法请参考Barrett等的方法(“Methods inEnaymology，”Vol.80，p535-561，1981)。具体描述如下：将Z-Phe-Arg-MCA(终浓度20mM，Peptide Institute，Inc.生产)作为底物，加入到含牛β-酪蛋白肽混合物的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)中。然后加入半胱氨酸蛋白酶(本实施例中是木瓜蛋白酶：Sigma Co.，Ltd生产)溶液(终浓度：15单位/ml)，将整个溶液混合，使其于37℃反应10分钟。然后用荧光分度计(Hatachi，Ltd.生产)测定从消化的底物中释放出的AMC的荧光强度(激发波长：370nm，发射波长：460nm)。

因为此测定证实了牛β-酪蛋白肽混合物具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，所以我们将主峰从肽混合物中分离出来。分离过程基于使用TSK Gel DDS-80Ts柱(Tosoh Corporation生产)的反相HPLC，用乙腈线性浓度进行洗脱。然后对每一分离峰样品(下文称为肽样品)按上述相同的方法测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

对抑制活性测量结果证明有活性的肽样品，用惠普公司生产的G1005A蛋白测序系统进行氨基酸序列测定。

(2)测试结果

本测试的结果如图2所示。结果表明，主要的具有抑制活性的肽样品的氨基酸序列(下划线部分：下文中具有此序列的肽称为牛β-酪蛋白肽)为图2牛β-酪蛋白氨基酸序列中从第142残基Leu到第160残基His之间。

[测试实施例4]

进行本测试的目的是测量酪蛋白对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。

(1)测试方法

测试样品为牛β-酪蛋白、牛α-酪蛋白和牛κ-酪蛋白。用测试实施例3中描述的测量半胱氨酸蛋白酶抑制活性相同的方法测量每一试样的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

(2)测试结果

本测试结果如图3所示。图3显示的是牛β-酪蛋白、牛α-酪蛋白和牛κ-酪蛋白分别对木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，β-酪蛋白和κ-酪蛋白浓度为10^-5M时就能完全抑制木瓜蛋白酶，而α-酪蛋白的活性虽然弱些，但在浓度为10^-4时也基本上能抑制木瓜蛋白酶。因此，无论是κ-酪蛋白和α-酪蛋白，还是β-酪蛋白都发现具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

[测试实施例5]

进行本测试的目的是测量牛β-酪蛋白半胱氨酸蛋白酶抑制活性的范围。

(1)测试方法

试样的半胱氨酸蛋白酶抑制活性谱测量方法与测试实施例3中描述的测量半胱氨酸蛋白酶抑制活性的相同，所用的试验样品为牛β-酪蛋白，所用的半胱氨酸蛋白酶有木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L。

(2)测试结果

本测试的结果如图4所示。图4显示的是牛β-酪蛋白对木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L的抑制活性的测量结果。结果表明，牛β-酪蛋白在浓度为10^-5M时就能完全抑制木瓜蛋白酶。结果还表明，牛β-酪蛋白在浓度为10^-4时能基本上抑制组织蛋白酶B和组织蛋白酶L的蛋白酶活性。因此，很明显牛β-酪蛋白能抑制木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L的蛋白酶活性，它具有广谱半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

[测试实施例6]

进行本测试的目的是测量人β-酪蛋白对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。

(1)测试方法

用与测试实施例3中描述的测量半胱氨酸蛋白酶抑制活性的相同的方法测量试样的半胱氨酸蛋白酶抑制活性，所用的试验样品为用传统的工艺(例如，根据下面文献所描述的方法，“J.Daily Sci.”Vol.53，No.2，pp.136 to 145，1970)纯化的人β-酪蛋白或用实施例1中所合成的具有序列表SEQ ID No.1(人β-酪蛋白氨基酸序列)所示氨基酸序列中133至151氨基酸的氨基酸序列的肽(图5人β-酪蛋白中下划线部分的肽，下文将具有该序列的肽称为β-酪蛋白肽)。

(2)测试结果

本测试的结果表明，人β-酪蛋白在浓度为10^-5M时基本上能完全抑制木瓜蛋白酶的蛋白酶活性，在浓度为10^-5时人β-酪蛋白肽能抑制65％的木瓜蛋白酶蛋白酶活性，而在浓度为10^-4M时能完全抑制木瓜蛋白酶的蛋白酶活性。

[测试实施例7]

进行本测试的目的是测量酪蛋白水解物对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。

(1)样品制备

酪蛋白水解物的生产方法与生产实施例2相同，所不同的只是分别加入了2,000、8,000、9,000单位的胰酶，所得的水解物分别称为试样1、试样2和试样3。试样1、试样2和试样3的水解度(％)分别为8.2、33.5、38.0。此外，试样1、试样2和试样3的数均分子量(道尔顿)分别为1,020、250和210。

(2)测试方法

将试样溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)中，在此溶液中加入Z-Phe-Arg-MCA(终浓度20mM，Peptide Institute，Inc.生产)作为底物。然后加入作为半胱氨酸蛋白酶溶液的木瓜蛋白酶溶液(终浓度：15单位/ml)，混合，于37℃反应10分钟。然后用荧光分度计(Hatachi，Ltd.生产)测定从消化的底物中释放出的AMC的荧光强度(激发波长；370nm，发射波长：460nm)。

(3)测试结果

本测试的结果如下表表1所示。表1显示的是每一试样的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，试样1在浓度为0.1mg/ml时能抑制39％的木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶活性，而在浓度为0.2mg/ml时能抑制61％。结果还表明，试样2在浓度为0.2mg/ml时能抑制76％的木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶活性，而在浓度为0.05mg/ml时能抑制50％；试样3在浓度为0.2mg/ml时能抑制53％的木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶活性，在0.1mg/ml浓度时抑制44％而在浓度为0.05mg/ml时能抑制37％。

[表1]

样品	水解度(％)	数均分子量(Dalton)	每种浓度下的抑制率(％)
			每种浓度下的抑制率(％)			0.2(mg/ml)	0.1(mg/ml)	0.05(mg/ml)
			试样1试样2试样3	8.233.538.0	1,020250210	0.2(mg/ml)	0.1(mg/ml)	0.05(mg/ml)	617653	396444	85037

实施例

下面通过举例来更详细地描述本发明。但本发明并不仅限于下列实施例。

[实施例1]

(牛β-酪蛋白片的配制)

一种具有下列成分的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的片剂，可按下述程序生产。

牛β-酪蛋白(Sigma Co.，Ltd.生产)40.0(％)

乳糖(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.生产)18.5

玉米淀粉(Nisshin Flour Milling Co.，Ltd.生产)30.7

硬脂酸镁(Taihei Chemica Industrial Co.，Ltd.生产)1.4

羧甲基纤维素钙(Gotoku Chemical Co.，Ltd.生产)9.4

将牛β-酪蛋白、乳糖、玉米淀粉和羧甲基纤维素钙的混合物捏和均匀，在此过程中适当地加入一些无菌纯化水，捏和好的产品置于50℃干燥3小时。然后向烘干的产品中加入硬脂酸镁，混合，接着用传统的工艺压片，从而可获得片剂。

[实施例2]

(牛β-酪蛋白胶囊的制备)

用50目筛(Yamato Scientific Co.生产)将600g乳糖(Wako PureChemical Industries，Ltd.生产)、400g玉米淀粉(Nisshin Flour MillingCo.，Ltd.生产)、400g结晶纤维素(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)和600g牛β-酪蛋白(Sigma Co.，Ltd.生产)过筛后装入一厚为0.5mm的聚乙烯塑料袋，上下翻转使混合。所得粉末用全自动胶囊分装机(Cesere Pedini生产，挤压型)将其包装入胶囊(ShionogiQualicaps，Inc.生产，gelatin capsule No.1，Op Yellow No.6 Body，空胶囊重75mg)中，每胶囊装量275mg。最后得到每粒含82mg牛β-酪蛋白的胶囊7,000粒。

[实施例3]

(加有牛β-酪蛋白的饮料的制备)

将90g脱脂牛奶(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.生产)溶解于800ml 50℃的热水中，然后先后加入30g糖(Nissin Sugar ManufacturingCo.，Ltd.生产)、14g速溶咖啡粉(Nestle生产)、2g焦糖(Showa KakoCo.，Ltd.生产)和0.01g咖啡香精(San-Ei Gen F.F.I.Inc.生产)，在此过程中不停搅拌使溶解。然后将混合物冷至10℃，加入1g牛β-酪蛋白(Sigma Co.，Ltd.生产)，从而得到约含0.1％牛β-酪蛋白并具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的牛奶饮料。

[实施例4]

(加有牛β-酪蛋白的肠道营养配方散剂的制备)

在罐中，将10.8g乳清蛋白的酶降解产物(Morinaga Milk IndustryCo.，Ltd.生产)、36g糊精(Showa Sangyo Co.，Ltd.生产)和少量的水溶性维生素和矿物质溶解于200kg水中，制备出水相。同时将3kg大豆色拉油(Taiyo Yushi Co.，Ltd.生产)、8.5kg棕榈油(Taiyo Yushi Co.，Ltd.生产)、2.5kg红花油(Taiyo Yushi Co.，Ltd.生产)、0.2kg卵磷脂(AjinomotoCo.，Inc.生产)、0.2kg甘油单脂肪酸酯(Ajinomoto Co.，Inc.生产)和少量的脂溶性维生素混合并溶解以制备油相。将油相加入到罐中的水相中，搅拌混合。然后加热至70℃，用匀浆器在14.7MPa压力下匀浆。接着，将所得产物于90℃灭菌10分钟，浓缩后喷雾干燥，由此可得到约59kg中间产品粉末。然后将6.8kg蔗糖(Hokuren-Federation ofAgriculture Cooperatives生产)、167g氨基酸混合物粉末(Ajinomoto Co.，Inc.生产)和60g牛β-酪蛋白(Sigma Co.，Ltd.生产)加入到50kg中间产品粉末中，混合均匀，由此可得到约57kg含有牛β-酪蛋白并具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的的肠道营养配方散剂。

[实施例5]

(牛酪蛋白水解物片的配制)

一种具有下列成分的半胱氨酸蛋白酶抑制剂片剂，可按下述程序生产。

生产实施例2中生产的酪蛋白水解物40.0(％)

乳糖(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.生产)18.5

玉米淀粉(Nisshin Flour Milling Co.，Ltd.生产)30.7

硬脂酸镁(Taihei Chemical Industrial Co.，Ltd.生产)1.4羧甲基纤维素钙(Gotoku Chemical Co.，Ltd.生产)9.4

将牛酪蛋白水解物、乳糖、玉米淀粉和羧甲基纤维素钙的混合物捏和均匀，在此过程中适当地加入一些无菌纯化水，将全部产品置于50℃干燥3小时。然后向烘干的产品中加入硬脂酸镁，混合，接着用传统的工艺压片，从而可获得片剂。

[实施例6]

(加有牛酪蛋白水解物的饮料的制备)

将90g脱脂牛奶(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.生产)溶解于800ml 50℃的热水中，然后先后加入30g糖(Nissin Sugar ManufacturingCo.，Ltd.生产)、14g速溶咖啡粉、2g焦糖(Showa Kako Co.，Ltd.生产)和0.01g咖啡香精(San-Ei Gen F.F.I.Inc.生产)，不停搅拌使溶解。然后将混合物冷却至10℃，加入1g生产实施例2生产的牛酪蛋白水解物，从而得到约含0.1％牛酪蛋白水解物并具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的牛奶饮料。

[实施例7]

(加有牛酪蛋白水解物的肠道营养配方剂的制备)

在罐中，将10.8kg乳清蛋白的水解产物(Morinaga Milk IndustryCo.，Ltd.生产)、36g糊精(Showa Sangyo Co.，Ltd.生产)和少量的水溶性维生素和矿物质溶解于200kg水中，制备出水相。同时将3kg大豆色拉油(Taiyo Yushi Co.，Ltd.生产)、8.5kg棕榈油(Taiyo Yushi Co.，Ltd.生产)、2.5kg红花油(Taiyo Yushi Co.，Ltd.生产)、0.2kg卵磷脂(AjinomotoCo.，Inc.生产)、0.2kg甘油单脂肪酸酯(Kao Corporation生产)和少量的脂溶性维生素混合并溶解以制备油相。将油相加入到罐中的水相中，搅拌混合。然后加热至70℃，用匀浆器在14.7MPa压力下匀浆。接着，将所得产物于90℃灭菌10分钟，浓缩后喷雾干燥，由此可得到约59kg中间产品粉末。然后将6.8kg蔗糖(Hokuren-Federation ofAgriculture Cooperatives生产)、167g氨基酸混合物粉末(AjinomotoCo.，Inc.生产)和60g生产实施例2生产的牛酪蛋白水解物加入到50kg中间产品粉末中，混合均匀，由此可得到约57kg含有牛酪蛋白水解物并具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的的肠道营养配方散剂。

工业实用性

正如上文所详述，本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它所含的活性成分是酪蛋白、酪蛋白部分肽或酪蛋白水解物。本发明具有如下作用。

(1)由于它是用作为食品原料的蛋白质及其部分肽和/或其水解物制成的，因此具有良好的安全性，可长期日常给服或服食。

(2)对各种半胱氨酸蛋白酶有广谱抑制活性。

(3)可用作半胱氨酸蛋白酶相关疾病的预防或治疗药。

(4)可应用于生产功能食品包括特定健康用途的食品和营养补充食品。

(5)用于食品加工领域，作为食品物理特性的调节剂。

序列表

<110>Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.

<120>蛋白酶抑制剂

<130>FP1480P1618

<150>JP 2002/347801

<151>2002-11-29

<150>JP 2003/147035

<151>2003-05-23

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>226

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<220>

<221>sig_肽

<222>(1)...(15)

<223>酪蛋白

<400>1

Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Glu Thr Ile Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Glu Tyr

20 25 30

Lys Gln Lys Val Glu Lys Val Lys His Glu Asp Gln Gln Gln Gly Glu

35 40 45

Asp Glu His Gln Asp Lys Ile Tyr Pro Ser Phe Gln Pro Gln Pro Leu

50 55 60

Ile Tyr Pro Phe Val Glu Pro Ile Pro Tyr Gly Phe Leu Pro Gln Asn

65 70 75 80

Ile Leu Pro Leu Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Pro Val Pro Gln Pro

85 90 95

Glu Ile Met Glu Val Pro Lys Ala Lys Asp Thr Val Tyr Thr Lys Gly

100 105 110

Arg Val Met Pro Val Leu Lys Ser Pro Thr Ile Pro Phe Phe Asp Pro

115 120 125

Gln Ile Pro Lys Leu Thr Asp Leu Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro

130 135 140

Leu Leu Gln Pro Leu Met Gln Gln Val Pro Gln Pro Ile Pro Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ala Leu Pro Pro Gln Pro Leu Trp Ser Val Pro Gln Pro Lys Val

165 170 175

Leu Pro Ile Pro Gln Gln Val Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro

180 185 190

Val Gln Ala Leu Leu Leu Asn Gln Glu Leu Leu Leu Asn Pro Thr His

195 200 205

Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val His Asn Pro Ile

210 215 220

Ser Val

225

<210>2

<211>224

<212>PRT

<213>黄牛(Bos taurus)

<220>

<221>sig_肽

<222>(1)...(15)

<223>酪蛋白

<400>2

Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser Leu Ser

20 25 30

Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys Phe

35 40 45

Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys Ile

50 55 60

His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro

65 70 75 80

Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro

85 90 95

Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys

100 105 110

Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys

115 120 125

Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp

130 135 140

Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His

145 150 155 160

Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser

165 170 175

Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala

180 185 190

Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr

195 200 205

Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val

210 215 220

Claims

1.一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其包含作为活性成分的酪蛋白或其部分肽。

2.权利要求1的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中酪蛋白或其部分肽来源于人或牛。

3.一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其包含作为活性成分的下列(A)或(B)所描述的酪蛋白或其部分肽：

4.一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其包含作为活性成分的下列(C)或(D)所描述的酪蛋白或其部分肽：

5.一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其包含作为活性成分的酪蛋白水解物，该酪蛋白水解物可通过用蛋白酶水解酪蛋白来获得并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

6.权利要求5的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中蛋白酶为一种或几种蛋白酶，所述蛋白酶选自于来源于动物的蛋白酶和来源于微生物的蛋白酶。

7.权利要求5或6的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中酪蛋白水解物的水解度为6-45％。

8.权利要求5至7任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中酪蛋白水解物的数均分子量为200-5,000道尔顿。

9.权利要求5至8任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其含有的酪蛋白水解物的质量与总量相比不少于0.005％。

10.权利要求1至9任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶相关疾病的预防或治疗药物。

11.权利要求10的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中半胱氨酸蛋白酶相关疾病是骨质疏松症、恶性高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、或细菌性和病毒性感染疾病。

12.一种食品及饮料组合物或饲料组合物，其通过加入权利要求1至11任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂而制得。

13.一种治疗半胱氨酸蛋白酶相关疾病的方法，其中将权利要求1至11任一项的半胱氨酸蛋白酶抑制剂给予患者。

14.酪蛋白或其部分肽在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

15.权利要求14的应用，其中酪蛋白或其部分肽来源于人或牛。

16.下列(A)或(B)所描述的酪蛋白或其部分肽在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用：

17.下列(C)或(D)所描述的酪蛋白或其部分肽在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用：

18.酪蛋白水解物在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用，所述酪蛋白水解物是通过用蛋白酶水解酪蛋白来获得的并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

19.权利要求18的应用，其中蛋白酶是一种或几种蛋白酶，该蛋白酶选自来源于动物的蛋白酶和来源于微生物的蛋白酶。

20.权利要求18或19的应用，其中酪蛋白水解物的水解度为6-45％。

21.权利要求18至20任一项的应用，其中酪蛋白水解物的数均分子量为200-5,000道尔顿。

22.权利要求18至21任一项的应用，其含有的酪蛋白水解物的质量与总量相比不少于0.005％。

23.权利要求14至22任一项的应用，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶相关疾病的预防或治疗药物。

24.权利要求23的应用，其中半胱氨酸蛋白酶相关疾病是骨质疏松症、恶性高血钙症、乳腺癌、前列腺癌、牙周炎、或细菌性和病毒性感染疾病。