CN102154259A

CN102154259A - 溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102154259A
Application number: CN201010616973XA
Authority: CN
Inventors: 张巍; 党素英; 张鑫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明涉及生物制药中应用基因工程技术生产蛋白质药物领域，特别是一种新的具有快速溶解动脉血栓团块中血小板成分的人源化单克隆抗体(A11)和解整合素金属蛋白酶-18羧基端重组蛋白（AD18C）的制备方法和应用。其制备方法是应用基因工程技术构建了表达A11及ADAMTS-18C的重组质粒，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达。经分离纯化后获得高纯度的具有快速溶解动脉血栓团块中血小板成分的人源化基因工程抗体及重组蛋白，可用于脑卒中、急性心肌梗塞等动脉血栓相关性疾病的治疗。

Description

溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及用基因工程方法生产一种能够快速溶解动脉血栓团块中血小板成分的基因工程抗体及重组蛋白以及其在疾病治疗中的应用。

背景技术

抗血小板整合素β3亚基第49-66表位（GPIIIa49-66）抗体是从“艾滋病感染相关性血小板减少症病人”的血液免疫循环复合物中分离获得的一种特殊的自身抗体（命名为：GP49）。这种抗体非常独特，它与血小板整合素GPIIIa49-66表位结合后，可诱导血小板内产生反应性氧自由基（ROS），从而启动补体-非依赖性“血小板氧化破碎”这一全新的血小板死亡途径。因此利用GPIIIa49-66抗体及其天然配体溶解血栓团块中的血小板成分将代表一种全新而有巨大治疗价值的溶栓策略。尽管如此，以血小板整合素GPIIIa49-66为靶点的新型溶栓体系还有待进一步建立及完善。首先，由于人和小鼠的血小板GPIIIa49-66氨基酸序列具有高度同源性（83%），因此鼠源性抗GPIIIa49-66单克隆抗体至今无法获得。目前的 Anti-GPIIIa49-66抗体多为兔源性多克隆抗体。虽然体外实验证实它们与从病人体内亲和纯化的抗GPIIIa49-66抗体具有类似的诱导血小板栓块氧化破碎的效应，但多克隆抗体分子间存在异质性，特异性较差，溶栓效果不稳定。更为重要的是，兔源性多抗无法直接用于临床动脉血栓疾病的治疗。因此，制备人源性的抗GPIIIa49-66抗体单克隆抗体及GPIIIa49-66的天然配体对于上述疾病的治疗具有重要意义。本发明首次公开了一种抗血小板整合素GPIIIa49-66表位人源性单克隆抗体（A11）及其天然配体（AD18C）制备方法及应用。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程技术制备抗血小板整合素GPIIIa49-66表位的基因工程抗体及重组蛋白。新型抗体及重组蛋白是完全人源化的，可靶向性溶解动脉血栓团块中血小板成分，适用于脑卒中、急性心肌梗死等动脉血栓相关性疾病的治疗。

本发明的具体技术方案是：

一种溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法，该方法包括：

a）人源性抗体A11工程菌的构建

将从噬菌体抗体文库中获得的能特异性识别血小板整合素β3亚基第49-66表位的噬菌体-A11基因用限制性内切酶Noc I 和Not I双酶切后插入到表达质粒pET29a中，构建成重组质粒pET29a-A11；将重组后的表达质粒pET29a-A11转化宿主菌BL21(DE3) pLysS获得能稳定分泌人源性抗体A11工程菌；

b）解整合素金属蛋白酶-18羧基端重组蛋白AD18C工程菌的构建

通过多聚酶链式反应法，扩增人源性解整合素金属蛋白酶18蛋白羧基端基因；通过限制性内切酶Nde I 和Not I双酶切后插入到表达质粒pGEX-4T2中，构建成重组质粒pGEX-4T2-AD18C_840-1221；将重组后的表达质粒pGEX-4T2-AD18C_840-1221转化宿主菌BL21(DE3) pLysS获得能稳定分泌人源性重组蛋白AD18C工程菌；

c）制备溶解血小板栓块的基因工程制剂

ⅰ）将步骤a）或步骤b）中的人源性抗体A11或人源性重组蛋白AD18C工程菌于LB培养基中37℃培养过夜，按1:50比例转接后继续培养至光密度值OD_600nm≈0.6，加1mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导4个小时进行诱导表达，获得含目的蛋白的菌体；将已知重量的菌体，按10ml/g湿重比例加入裂解液，搅拌均匀，于4℃进行超声破菌，12000 r/min离心30min获得包涵体；其中：裂解液为：100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、100 mM/L氯化钠（ NaCl）， pH 7.0；

ⅱ）将步骤ⅰ）的包涵体进行复性处理，取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液中，洗涤3次；取洗涤后的湿包涵体按10mL/g比例加入变性缓冲液，37℃变性3h，4℃，8000r/min离心30min，取上清，按1/40比例逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍、氯化钠、尿素、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽的复性缓冲液中，4℃搅拌30 min后，静置18 h获得包涵体复性产物上清液；其中：洗涤缓冲液为：100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），2 mmol/L乙二胺四乙酸盐（EDTA），0.005/L Triton，2 mol/L 尿素（Urea），pH7.0；变性缓冲液为：50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），6 mmol/L盐酸胍，5 mmol/L 乙二胺四乙酸盐（EDTA），100 mmol/L 巯基乙醇，pH8.0；

ⅲ）将步骤ⅱ）的包涵体复性产物上清液通过Ni-NTA亲和柱（A11）或谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和柱（AD18C）进行纯化，获得溶解血小板栓块的基因工程制剂，该制剂为基因工程抗体或重组蛋白。

所述重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔源性抗AD18C多克隆抗体。

所述溶解血小板栓块的基因工程制剂的应用，在于用于脑血管栓塞或心血管栓塞的治疗。

所述兔源性抗AD18C多克隆抗体的应用，在于用于动脉血管出血的治疗及动脉血栓的监测。

所述人源性抗体A11的脱氧核苷酸序列。

本发明中抗体及重组蛋白的生产具有快速、人源化等优点，且适合工业化生产。抗体及其重组蛋白可用于治疗脑卒中、急性心梗等心脑血管相关性疾病。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-29a(+)/A11的构建、诱导表达及纯化图；

图2为重组表达质粒pGEX-4T2/ADAMTS18-C_840-1221的诱导表达图；

图3为基因工程抗体A11、AD18C体外解聚血小板栓块图；

图4为基因工程抗体A11体内与颈动脉血栓的结合效应图；

图5为基因工程抗体A11,AD18C对脑细胞的保护效应GFAP染色图；

图6为重组蛋白ADAMTS-18 C_840-1221治疗脑卒中TCC染色图。

具体实施方式

实施例1

重组表达质粒pET-29a(+)-A11的构建

克隆-11是从人源性噬菌体抗体库中获得的可与血小板整合素GPIIIa49-66表位反应的噬菌体抗体。制备方法：为获得可溶性表达的单链抗体片段（scFv），将噬菌粒(pIT2-A11)和pET29a质粒用Nco I和Not I分别进行双酶切．经1%琼脂糖电泳后，回收目的基因片段和pET29a的酶切大片段。用T4 DNA Ligase将目的基因片段与载体片段于16℃连接过夜。将连接产物pET29a（+）-A11 转化DH5 a感受态细胞，在含卡那霉素的LB平板上培养．挑取单菌落，用Nco I/Not I双酶切鉴定筛选阳性克隆．抽提阳性克隆的质粒DNA，目的基因经测序确证。用正确基因序列的pET29a（+）-A11质粒转化BL21(DE3)pLysS表达菌。

实施例2

重组表达质粒pGEX-4T2-ADAMTS-18 C_840-1221的构建

人源性ADAMTS-18蛋白是血小板整合素GPIIIa49-66的天然配体，它可通过其C末端与血小板结合。制备方法：以ADAMTS-18 cDNA序列为模板，通过PCR法，扩增人源性ADAMTS-18蛋白C端（840-1221）基因；通过Nde I 和Not I双酶切后将其插入到pGEX-4T2质粒，构建成重组质粒pGEX-4T2-ADAMTS-18 C_840-1221。

实施例3

基因工程抗体A11及AD18C重组蛋白的制备

从培养平板上挑取单菌落于LB培养基（A11为卡那霉素抗性，AD18C蛋白为氨苄抗性）中，37℃，200rpm振荡培养过夜，按1:50比例转接后继续培养至OD_600nm≈0.8，加0.5mM IPTG诱导3个小时。离心（6,000rpm，20minutes）收集菌体。将已知重量的菌体，按10ml/g湿重比例加入裂解液【100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），100 mM/L氯化钠（ NaCl）， pH 7.0】搅拌均匀，于4℃进行超声破菌，12000 r/min离心30min获得包涵体。将上述包涵体进行复性处理。复性方法为取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液【100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），2 mmol/L乙二胺四乙酸盐（EDTA），0.5% Triton，2 mol/L 尿素（Urea），pH7.0中】，洗涤3次。取洗涤后的湿包涵体按10mL/g比例加入变性缓冲液【50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），6 mmol/L盐酸胍，5 mmol/L 乙二胺四乙酸盐（EDTA），100 mmol/L 巯基乙醇，pH8.0】，37℃变性3h，4℃，8000r/min离心30min，取上清，按1/40比例逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍、氯化钠（NaCl）、尿素（Urea）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）等的复产物上清通过Ni-NTA亲和柱（A11）或谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和柱（AD18C）进行纯化，获得高纯度基因工程抗体A11或AD18C重组蛋白。

实施例4

基因工程抗体A11及AD18C端蛋白的体外活性测定

利用高倍显微镜检测A11 及AD18C蛋白对血小板栓块解聚的解聚效应。方法是：将A11抗体及AD18C蛋白分别加入到胶原蛋白（collagen）激活的血小板栓块中，37℃反应1小时，在高倍显微镜下计数血小板栓块的解聚数目（血小板栓块数目/1000血小板）。

实施例6

A11抗体及AD18C蛋白的体内溶栓效应测定

6-8周Swiss Webster大鼠按照动物体重，以10%乌拉坦（1 ｇ/㎏）腹腔注射进行全身麻醉，麻醉完毕后，尾静脉注射罗丹明（Rhodamine 6G）标记的血小板。将麻醉后的动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，暴露一侧颈总动脉。将吸有10%三氯化铁溶液10 μl的1 cm×1 cm的滤纸小片包裹在此段颈总动脉上，计时20分钟取下，于激光共聚焦显微镜下观察血栓大小。造模成功后，静脉注射A11抗体或AD18C蛋白，观察溶栓疗效。取成年雄性Swiss Webster大鼠，采用腔内线栓法制作大鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型。造模成功后，静脉注射A11抗体或AD18C蛋白，观察溶栓疗效。将大鼠断头取脑并速冻后自视交叉向后作厚约2mm的连续切片，置于2％氯代三苯基四氮唑（TTC）缓冲液中，37℃避光孵育30min。观察结果并用扫描仪将照片扫入LUZEX-F型图像分析仪内分析，根据面积和切片间隔计算出脑片上梗塞灶体积占全脑体积的百分比。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)染色，将2mm厚脑切片放入3% H2O2溶液中室温浸泡15 min后，5%牛血清白蛋白封闭30 min后依次入:① 抗GFAP(兔源，1∶200，Santa Cruz公司)染色，4℃过夜;②生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温孵育2～4 h;③生物素-卵白素-HRP复合物(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1 h。DAB-H2O2显色。以上每一步骤之后均用0.01 mol/L PBS液充分漂洗3次，每次5 min，显微镜下观察星型胶质纤维酸性蛋白染色。

人源性抗体A11核苷酸序列表

<110> 张巍

<120> 溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> mat_peptide

<400> 1

atggccgagg tgcagctatt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 120

caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcatctatta ctagtacggg tatggagaca 180

cgttacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa 300

ggtaagtcgc attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 420

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 480

cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 540

ctgatctata ctgcatcctt tttgcaaagt ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 600

tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 660

tactgtcaac agcggaagtc gtatcctagg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc 720

aaacgg 726

Claims

1.一种溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法，其特征在于该方法包括：

a）人源性抗体A11工程菌的构建

b）解整合素金属蛋白酶-18羧基端重组蛋白AD18C工程菌的构建

c）制备溶解血小板栓块的基因工程制剂

ⅰ）将步骤a）或步骤b）中的人源性抗体A11或人源性重组蛋白AD18C工程菌于LB培养基中37℃培养过夜，按1:50比例转接后继续培养至光密度值OD_600nm≈0.6，加1mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时进行诱导表达，获得含目的蛋白的菌体；将已知重量的菌体，按10ml/g湿重比例加入裂解液，搅拌均匀，于4℃进行超声破菌，12000 r/min离心30min获得包涵体；其中：裂解液为：100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2mmol/L乙二胺四乙酸、100 mM/L氯化钠， pH 7.0；

ⅱ）将步骤ⅰ）的包涵体进行复性处理，取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液中，洗涤3次；取洗涤后的湿包涵体按10mL/g比例加入变性缓冲液，37℃变性3h，4℃，8000r/min离心30min，取上清，按1/40比例逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍、氯化钠、尿素、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽的复性缓冲液中，4℃搅拌30 min后，静置18 h获得包涵体复性产物上清液；其中：洗涤缓冲液为：100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，2 mmol/L乙二胺四乙酸盐，0.005/L Triton，2 mol/L 尿素，pH7.0；变性缓冲液为：50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，6 mmol/L盐酸胍，5 mmol/L 乙二胺四乙酸盐，100 mmol/L 巯基乙醇，pH8.0；

2.根据权利要求1所述的溶解血小板栓块的基因工程制剂，其特征在于所述重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔源性抗AD18C多克隆抗体。

3.一种权利要求1制备的溶解血小板栓块的基因工程制剂的应用，其特征在于用于脑血管栓塞或心血管栓塞的治疗。

4.一种权利要求2所述兔源性抗AD18C多克隆抗体的应用，其特征在于用于动脉血管出血的治疗及动脉血栓的监测。

5.根据权利要求1所述的溶解血小板栓块的基因工程制剂，其特征在于所述人源性抗体A11的脱氧核苷酸序列。