TWI671314B - 自斷蛋白的活性控制及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種在無酵素參與下，具自斷能力的自斷蛋白，以及如何控制該自斷蛋白來生產目標蛋白的方法。自斷蛋白主體為一內含蛋白，該內含蛋白的N端胺基酸包含至少有一突變，本發明之自斷蛋白在一“抑制條件”下，自斷蛋白不會產生自我斷裂，在一“促進條件”下，自斷蛋白的C-端會產生自我斷裂，而N-端則不會產生自我斷裂。本發明另提供一種含有該自斷蛋白及目標蛋白的融合蛋白。

Description

自斷蛋白的活性控制及其應用
本發明係有關於一種自斷蛋白，包含此自斷蛋白的融合蛋白，以及控制自斷蛋白生產目標蛋白的方法。
內含蛋白是一種天然存在的自我剪接蛋白結構域，功能為從較大的蛋白質結構中自我切除，同時將兩側的胜肽“外顯子(exteins)”連接在一起形成成熟的宿主蛋白。
內含蛋白因可重新排列兩側的鍵結，造就出許多使用內含蛋白的生物技術。這些技術包括各種類型的蛋白質連接、活化，以及蛋白質標記和追踪應用。內含蛋白還有一個重要應用是生產、純化重組蛋白。特別是，內含蛋白具有自我切除的能力，因此可為研究、醫療及其他商業上應用做出重大的應用。
傳統的純化標籤為純化目標蛋白提供了簡單而有力的方式，可利用簡單的基因重組技術與目標蛋白融合。這些標籤已廣泛地使用於現在的研究中，並且成為研發與製造的主要平台。然而，雖然目標蛋白可在適當的宿主細胞中表現，並利用標籤純化，但標籤的存在可能會降低目標蛋白的活性，並可能產生不需要的免疫原性。因此，在純化後將親和性標籤去除是非常重要的，一般是利用高特異性的內切酶進行切除。雖然這些酵素通常有效，但是酵素過於昂貴，對於量產不利，且需要額外的步 驟來去除這些酵素。
因此，內含蛋白提供一般標籤自我切割的能力是一項重大進步，已有許多文獻揭示使用內含蛋白的自我切割能力來移除親和性標籤的系統。然而，此方法仍然存在一些重大缺點，以阻礙內含蛋白的應用。例如，在蛋白質表現及純化的過程必須確實抑制內含蛋白的自我切割反應，但一旦要純化目標蛋白，則需要控制反應能快速完；在常見的內含蛋白中，經常需要額外添加硫醇化合物(如，二硫蘇糖醇)來誘發斷裂，增加成本及事後移除的程序。
因此，業界需要一種穩定、不需額外填加酵素或硫醇化合物、低成本的蛋白質純化的方法。
有鑑於此，本發明係提供一種自斷蛋白、包含此自斷蛋白的融合蛋白，以及利用此自斷蛋白生產目標蛋白的方法。
本發明係提供一種自斷蛋白，包括一內含蛋白，其中該內含蛋白的N-端胺基酸至少包含一個突變，移除N-端自我斷裂活性，只保留C-端自我斷裂活性，藉由調控鹽濃度、pH值和溫度控制自斷蛋白的活性。
在本發明一實施例中，其中此內含蛋白的N端突變，胺基酸經置換、刪除、插入及/或取代。
在本發明一實施例中，其中此內含蛋白源自於NpuDnaE。
在本發明一實施例中，其中此內含蛋白N端第1個胺基酸由半胱胺酸(Cys)置換為甘胺酸(Gly)或丙胺酸(Ala)。
在本發明一實施例中，其中此自斷蛋白的序列係由下列族群 組成：SEQ ID NO：1-2。
在本發明一實施例中，其中此自斷蛋白的序列為：
在本發明一實施例中，其中此自斷蛋白的序列為：
本發明另提供一種融合蛋白，具有下列式(I)結構：(X)n-(I)-(P)m
其中，X為一胺基酸序列、連接子、磁珠或其類似物，I為申請專利範圍第1項所述之自斷蛋白，P為一目標蛋白，n為0以上的整數，以及m為1以上的整數。
在本發明一實施例中，其中此X為一標籤序列，其中此標籤序列包括His-Tag、GST-Tag，或其他可供協助純化及表現的胺基酸序列。較佳的，該標籤序列有利於在pH值中性至酸性條件下收集、純化該融合蛋白。
在本發明一實施例中，其中此目標蛋白P包括多肽、蛋白質、重組蛋白、抗體、酵素或激素。
本發明另提供一種蛋白質表現載體，其中包含本發明之自斷蛋白的核苷酸序列。
在本發明一實施例中，其中此蛋白質表現載體包括His-Tag、GST-Tag或其他可供協助純化及表現的胺基酸之核苷酸序列。較佳的，該標籤序列有利於在pH值中性至酸性條件下收集、純化該融合蛋白。
在本發明一實施例中，其中本發明之自斷蛋白的核苷酸序列係由下列族群組成：SEQ ID NO：3-4。
在本發明一實施例中，其中此自斷蛋白的核苷酸序列為：
在本發明一實施例中，其中此自斷蛋白的核苷酸序列為：
本發明另提供一種生產、純化蛋白質的方法，包括：(a)在一宿主中表現一融合蛋白；(b)在一抑制條件下收集、純化該融合蛋白；(c)將該融合蛋白置於一促進條件，使該融合蛋白中的自斷蛋白自C-端斷裂，且目標蛋白與該自斷蛋白分離；以及(d)收集、純化該目標蛋白。
在本發明一實施例中，其中此抑制條件為一pH值中性至酸性條件。
在本發明一實施例中，其中此抑制條件為一高鹽度環境。
在本發明一實施例中，其中此抑制條件為pH值4-7、鹽濃度300mM以上及/或溫度為25℃以下。
在本發明一實施例中，其中此促進條件為一pH鹼性條件。
在本發明一實施例中，其中此促進條件為一低鹽度環境。
在本發明一實施例中，其中此促進條件為pH值7-11、鹽濃度 300mM以下及/或溫度為25℃以上。
本發明所使用之“鹽類”，包含氯化鈉及其他水溶性帶電離子。
第1圖為本發明融合蛋白的結構示意圖。第1圖顯示融合蛋白在特定環境下會斷裂。
第2圖顯示本發明中實施例中所使用的大腸桿菌表現載體pET-NpuDnaEC1Gtag。
第3圖顯示本發明中實施例NpuDnaE-Mms6融合蛋白的SDS-PAGE分析結果，其中Mms6為目標蛋白。利用SDS-PAGE分析融合蛋白從表現至純化過程中，各步驟中的NpuDnaE-Mms6融合蛋白。
第4圖顯示本發明中實施例NpuDnaE-Mms6融合蛋白斷裂前、後的SDS-PAGE分析結果。在本發明NpuDnaE-Mms6融合蛋白斷裂後，NpuDnaE融合蛋白斷裂成2個蛋白片段。
第5圖顯示Mms6目標蛋白的MALDI-TOF MS質譜儀分析結果。以MALDI-TOF MS質譜儀分析由NpuDnaE-Mms6融合蛋白所分離出的Mms6蛋白，分析結果顯示與天然Mms6蛋白具有相同的分子量。
本發明係提供一種自斷蛋白。本發明之自斷蛋白係為一內含蛋白，其中此內含蛋白的N-端胺基酸有至少一突變，來移除N-端自我斷裂活性，只保留C-端自我斷裂活性，藉由調控鹽濃度、pH值和溫度來控制自斷蛋白的活性。
本發明所述之N-端胺基酸至少包含一個“突變”，即為“修飾的”或“突變的”內含蛋白，係指在內含蛋白的N-端胺基酸序列上，相較於天然序列或正常結構有一或多個改變。此改變可為置換、添加、修飾或刪除。
本發明所述之胺基酸的置換、添加、修飾或刪除可以是天然或非天然胺基酸。天然胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、谷胺酸、麩醯胺酸、甘氨酸、組氨酸、異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。非天然胺基酸包括，但不限於，ε-N賴胺酸、ß-丙氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、絲氨酸、瓜氨酸、氨基苯甲酸、6-氨基己酸(Aca；6-Aminohexanoic acid)、羥脯氨酸、巰基丙酸(MPA)、3-硝基-酪氨酸、焦谷氨酸及其類似物。
在本發明一實施例中，本發明自斷蛋白可源自於NpuDnaE，其N-端的第1個胺基酸由半胱胺酸(Cys)置換為其他胺基酸，較佳置換為甘胺酸(Gly)或丙胺酸(Ala)等，但不得為絲胺酸(Ser)或蘇胺酸(Thr)。因此，突變後內含蛋白的N-端不具有斷裂活性，但C-端仍具有斷裂活性。本發明自斷蛋白可具有SEQ ID NO：1-2之序列。
在一實施例中，本發明之自斷蛋白在一“抑制條件”下，自斷蛋白的N-端及C-端的斷裂活性皆被抑制。本發明的“抑制條件”為pH值中性至酸性之條件，較佳的pH值為4至7；鹽濃度為高鹽度環境，較佳的鹽濃度為300mM以上；且較佳的抑制條件之溫度為25℃以下。
在一實施例中，本發明之自斷蛋白在一“促進條件”下，自斷蛋白的C-端斷裂活性被活化。由於本發明之自斷蛋白的N-端胺基酸經 突變、修飾過，已失去斷裂活性，故通常僅C-端會產生斷裂。
本發明的“促進條件”為pH值為鹼性之條件，較佳的pH值為7至11；鹽濃度為低鹽度環境，較佳的鹽濃度為300mM以下；且較佳的促進條件之溫度為25℃以上。
本發明所使用之“鹽類”，不限於氯化鈉，亦包含其他水溶性帶電離子。
本發明之融合蛋白包括本發明之自斷蛋白，在自斷蛋白的N-端連接一標籤序列、連接子、磁珠或其類似物，而自斷蛋白的C-端連接一目標蛋白。
本發明所述之“標籤序列”係指可專一性與一特定配體(ligand)反應的胜肽。為了進行親和性純化，目標蛋白經常與一可與配體專一性結合的標籤序列結合。各種已開發的標籤包括，但不限於，myc tag、Flag-peptide tag、His-Tag、Strep-Tag、GST-Tag、MBP-Tag、SNAP-Tag、Halo-Tag、Tap-Tag及INPACT-CN。較佳的，該標籤序列有利於在pH值中性至酸性條件下收集、純化該融合蛋白。
本發明所示“目標蛋白”係指一生物分子，例如蛋白質及重組多肽等。
由上述可知，本發明自斷蛋白的N-端包含有一或多個突變，導致N-端不具有斷裂活性。在本發明所述之融合蛋白中，自斷蛋白與目標蛋白可選擇性地在一特定環境下產生斷裂或維持鍵結連接。參照第1圖，融合蛋白具有標籤序列、自斷蛋白及目標蛋白。由宿主所產生的融合蛋白在一抑制條件下(如，pH值中性至酸性，高鹽度)，融合蛋白不會產斷裂 現象。然而，將融合蛋白置於一促進條件下(如，pH值鹼性，低鹽度)，則自斷蛋白的C-端斷裂，目標蛋白與自斷蛋白分離。可進一步使用已知的分離、純化方法，獲得目標蛋白。
本發明另提供一種生產、製備分離蛋白的方法，包括(a)在一宿主中表現本發明之融合蛋白，(b)在一抑制條件下收集、純化該融合蛋白，(c)將融合蛋白置於一促進條件，使該融合蛋白中的自斷蛋白產生斷裂，且目標蛋白與該自斷蛋白分離，(d)收集、純化該目標蛋白。
利用基因分子工程先行構築表現融合蛋白的載體，並將載體導入一宿主中進行表現。本發明之融合蛋白及表現載體包含於動物細胞、低等真核生物或原核生物各式表現系統。動物細胞可包括猴COS細胞、CHO細胞、人類腎臟293細胞、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、其他經轉殖的靈長類細胞、正常的雙套細胞、由體外培養之原生組織衍生細胞株、原生移殖體、HeLa細胞、老鼠L細胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。低等真核生物包括酵母菌，如Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces strains、Candida或任何可表現異源性蛋白的酵母菌。原核生物可包括Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、或任何可表現異源性蛋白的細菌。
本發明另提供一表現載體，其中包含前述之自斷蛋白的核苷酸序列。
本發明所述之“載體”係包含但不限於pET、pQE、pICZa、pFastBac、pGFP2，或任何可表現異源性蛋白的載體。
在一實施例中，本發明之表現載體係包含SEQ ID NO：3-4之 序列。
在一實施例中，本發明之表現載體係包括His-Tag或GST-Tag之核苷酸序列，或其他已開發的標籤序列之胺基酸序列。較佳的，該標籤序列有利於在pH值中性至酸性條件下收集、純化該融合蛋白。
在融合蛋白表現、收集及純化時，應將環境控制在適合宿主生長且不會造成蛋白產生斷裂的條件下。在一實施例中，可將融合蛋白置於本發明之“抑制條件”下，進行融合蛋白的表現、收集與純化。
接著，將純化的融合蛋白置於本發明之“促進條件”下，使自斷蛋白產生斷裂，目標蛋白與自斷蛋白分離(第1圖)。最後，收集、純化該目標蛋白。
本發明之方法具有以下優點：(1)只需控制水溶液條件，無需酵素或其他額外物質，節省生產成本；(2)本發明所使用之自斷蛋白(內含蛋白)對其後方所連接的序列有廣泛的容忍性；以及(3)不會有任何殘留序列於C端後的目標蛋白上。
實施例1
融合蛋白的製備：構築一編碼NpuDnaEC1G融合蛋白(含有His-tag標籤、NpuDnaEC1G及Mms6蛋白)於表現載體pET-NpuDnaEC1Gtag上(第2圖)，將表現載體導入E.coli中，加入IPTG誘導NpuDnaE融合蛋白的表現，將NpuDnaE融合蛋白置於高鹽環境(300mM NaCl)並經鎳離子樹酯純化後，以SDS-PAGE分析(第3圖)。
由第3圖可知，在加入IPTG誘導蛋白表現後，E.coli可大量表現NpuDnaE融合蛋白。NpuDnaE融合蛋白主要存在於上清液中，且可經 鎳離子樹酯純化。NpuDnaE融合蛋白在高鹽環境(300mM NaCl以上)，不會斷裂。
實施例2
融合蛋白的斷裂：利用緩衝液交換將NpuDnaE融合蛋白溶液的鹽濃度降至300mM NaCl以下，pH值增加至鹼性環境，置於於50℃下，反應30分鐘。將NpuDnaE融合蛋白以SDS-PAGE分析(第3圖)。由第4圖可知，NpuDnaE融合蛋白裂解成2個片斷，分別是分子量20kDa的NpuDnaE融合蛋白(含有His-tag標籤及NpuDnaE內含蛋白)，以及17kDa的NpuDnaE自斷蛋白。
實施例3
質譜分析：利用高效液相層析法(HPLC)分離實施例2中的NpuDnaE自斷蛋白與Mms6目標蛋白，並利用MALDI-TOF MS質譜儀分析Mms6蛋白(第5圖)。由第4圖所示，測得Mms6蛋白分子量為2.49223kDa，而Mms6蛋白分子量的理論值為2.4927kDa，兩者幾乎相同。
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Claims (7)

  1. 一種生產或純化蛋白質的方法，包括：(a)在一宿主中表現二融合蛋白；(b)在一抑制條件下收集或純化該融合蛋白，其中該抑制條件為一pH值中性至酸性條件；(c)將該融合蛋白置於一促進條件，使該融合蛋白中的一自斷蛋白斷裂，且一目標蛋白與該自斷蛋白分離，該促進條件為一pH鹼性條件，其中該pH鹼性條件為一低鹽度環境，而該低鹽度環境為鹽濃度300mM以下；以及(d)收集或純化該目標蛋白；其中，該方法不使用DTT(dithiothreitol)斷裂緩衝液；其中該融合蛋白具有下列式(I)結構：(X)n-(I)-(P)m其中，X為一胺基酸序列、連接子、磁珠或其類似物；I為申請專利範圍第1項所述之自斷蛋白；P為一目標蛋白；n為0以上的整數；以及m為1以上的整數。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該pH值中性至酸性條件為pH值4-7。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抑制條件為一高鹽度環境。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該高鹽度環境為鹽濃度300mM以上。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抑制條件為一溫度為25℃以下之環境。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該pH鹼性條件為pH值7-11。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該促進條件為一溫度為25℃以上之環境。
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