CN113480613B - 一种自剪切蛋白标签、改造方法及其应用 - Google Patents

一种自剪切蛋白标签、改造方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种自剪切蛋白标签的改造方法和产品及其应用，其中，亲和配体的构建是在对Cfa DnaE‑C，即IC的结构进行改造的基础上进行的；在IC的第12号位到第18号位之间的合适位置添加适量的甘氨酸，降低IC蛋白的结构稳定性，用于优化洗脱条件，提升洗脱效果。本发明改变了IC蛋白并没有对内含肽的识别连接产生明显的影响，在断裂反应过程中可以看出断裂率没有明显下降。此外，本发明的改造并没有对亲和介质的载量产生明显的影响，在静态吸附实验过程中可以看出载量出现少量下降。本发明构建的亲和纯化介质具有较好的纯化效果和较高的重复利用率。

Description

一种自剪切蛋白标签、改造方法及其应用
技术领域
本发明属于蛋白纯化领域，涉及一种自剪切蛋白标签的改造方法和产品及其应用。
背景技术
近年来随着生物技术的不断发展，纯化技术越来越受到人们重视。亲和层析技术是对重组蛋白分离纯化的有效手段之一，具有易操作、纯化效率高等特点，但是亲和层析技术通常需要在目的蛋白中引入特殊的亲和标签。工业上常用的去标签手段有内切酶法、化学法等，但处理手段往往耗时耗力且十分昂贵。
内含肽(Intein)是一段插入前体蛋白质中的基因序列，在加工翻译的过程中能够进行自我剪接，将自身从宿主蛋白中切除，并以肽键的形式连接两侧的蛋白质多肽链形成成熟蛋白，这个过程被称为蛋白质剪接，其中位于N端和C端的蛋白多肽链被称为N端和C端外显肽(Extein)。内含肽具有自发的剪接作用，因此在蛋白质工程领域应用广泛。虽然到目前为止发现的大多数内含肽都是连续的，但也存在少量的自然分裂的内含肽。分裂的内含肽域被单独转录翻译成两个独立的多肽，能自发地组装重新构成一个功能性的内含肽，融合连接N端和C端外显蛋白序列的过程被称为反式剪接(PTS)。
断裂内含肽作为一种特殊的内含肽提供了新的研究思路。当内含肽蛋白元件CfaDnaE-N，即IN，和Cfa DnaE-C，即IC两者以单独的片段表达时是不活跃的，在表达的过程中没有断裂现象，或断裂现象被抑制，但在纯化方案完成后可以被迅速激活。依据这些原理，建立了分裂的内含肽介导的无标记蛋白(Tagless Protein,SIRP)超快速纯化系统。该系统直接利用内含肽的自我断裂机制，创建了无标签的蛋白纯化手段。在该系统中，断裂内含肽的N端在大肠杆菌中表达，并以共价键的方式固定在树脂上，而较小的C端内含肽融合到目标蛋白的N端，然后标记的目标在适当的表达系统中表达，而不用担心内含肽的提前断裂。在纯化过程中，在生产具有断裂能力的内含肽复合物的同时，内含肽蛋白片段之间的有效识别。一旦该复合物在通过层析柱进行纯化，经过pH调节诱导内含肽断裂。这项技术的关键是在目标蛋白的N端添加一个短的、自我分裂的标签，通过与所提供的树脂的高特异性亲和力来捕获。一旦目标蛋白被捕获和纯化，一个小的pH值变化触发标签的自我断裂，从而从捕获树脂中释放无标签的目标蛋白。
基于内含肽构建的亲和层析介质纯化过程中可以通过自我剪切作用去除标签，有效的避免了标签对蛋白的影响，简化了蛋白纯化的操作，但在其应用过程中也存在一些不足。
在使用过程中发现，弱碱性的洗脱条件下，IC-GFP复合物上柱后无法完全洗脱；较强碱性的洗脱条件下，部分IN蛋白会发生变性，这两种情况都会导致二次使用的载量下降，影响介质的重复使用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供了一种Cfa DnaE的改造方式，结合蛋白质工程和分子模拟技术，分析IN与IC之间的相互作用，在关键区域内其中插入少量甘氨酸，达到降低IC蛋白的稳定性，实现提高介质再生时洗脱效果的目的。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种自剪切蛋白标签，其特征在于：包括，
所述自剪切蛋白标签，以SEQ ID No.1所示的Cfa DnaE-C氨基酸序列为出发序列，将第12到第18号位之间插入甘氨酸，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述自剪切蛋白标签。
作为本发明所述自剪切蛋白标签一种优选方案，其中：所述自剪切蛋白标签，包括，
以SEQ ID No.1所示氨基酸序列为出发序列，将第12到第18号位任意两个氨基酸之间插入1～18个甘氨酸，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述自剪切蛋白标签。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的一种优选方案，其中：所述自剪切蛋白标签，包括，
以SEQ ID No.1所示氨基酸序列为出发序列，在12和13号位之间添加3、6或12个甘氨酸，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述自剪切蛋白标签。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的一种优选方案，其中：所述自剪切蛋白标签，包括，
以SEQ ID No.1所示氨基酸序列为出发序列，在17和18号位之间添加3、6或12个甘氨酸，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述自剪切蛋白标签。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的改造方法的一种优选方案，其中：包括，
设计引物，根据GeneBank提供的基因序列，利用分子生物学软件Primer Premier5基于重叠PCR设计IC *的引物；
重组菌的构建，以重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC为模板，利用引物进行改造，获得改造后的片段IC *，最后转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到改造后的重组IC *表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC *；
Cfa DnaE IC*的表达纯化，对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC*进行诱导表达，获得改造后的重组IC *蛋白IC *D。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的改造方法的一种优选方案，其中：所述设计引物，其中，所述引物序列包括：
A_F:AAGCCTGGGTACCCAAAACGTTGGAGGAGGATACGGCATTGGC；
A_R:GCCAATGCCGTATCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCCAGGCTT；
B_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGATACGGCATTGGCGTCG；
B_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCC；
C_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATACGG；
C_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGT；
D_F:ACGTTGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATACGG；
D_R:CCGTATCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGT；
其中，引物A_F，A_R可构建菌株pET28a-IC *12-3G-13，即在IC第12位与13位间插入3个甘氨酸；
引物B_F，B_R可构建菌株pET28a-IC *12-6G-13，即在IC第12位与13位间插入6个甘氨酸；
引物C_F，C_R可构建菌株pET28a-IC *12-12G-13，即在IC第12位与13位间插入12个甘氨酸；
引物D_F，D_R可构建菌株pET28a-IC *12-18G-13，即在IC第12位与13位间插入18个甘氨酸。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的改造方法的一种优选方案，其中：所述重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC，其中，菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-IC中的IC序列为人工合成，末端添加氨基酸CFN，后连接到pET28a上，酶切位点为NdeI和HindIII。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的改造方法的一种优选方案，其中：所述PCR反应条件包括：预变性94℃反应5min；变性94℃反应30s，退火温度65℃反应30s，延伸温度72℃延伸5min 30s，进行30个循环；最后72℃保持10min。
作为本发明所述自剪切蛋白标签的改造方案所制得的产品，在蛋白纯化标签中的应用，其中：包括，
将自剪切蛋白标签与目标蛋白以重叠PCR融合表达；
破胞获取粗蛋白液并过滤；
将过滤后的粗蛋白液与含有Cfa DnaE-N蛋白的介质接触；
将上述介质用清洗液清洗；
将上述介质用再生液0.1M～0.5M的NaOH或KOH再生；
所述目标蛋白，包括模式蛋白GFP。
作为本发明所述自剪切蛋白标签在蛋白纯化标签中的应用，其中：所述含有CfaDnaE-N蛋白的介质，其中，所述Cfa DnaE-N的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述介质由以环氧活化基质作为载体，以1g抽干基质加入浓度为15mg/mL的1.5mLIN溶液，恒温振荡反应24h得到。
本发明有益效果：
(1)与当前已存在的一些断裂内含肽纯化系统相比，本发明将在IC蛋白的第12到18氨基酸之间插入少量甘氨酸来降低IC的稳定性，优化再生效果；通过降低IC的稳定性，介质在亲和纯化后再生效果达到97％以上，且由实验数据表明，当插入甘氨酸数量为3个时，所得到的IC *12-3G-13-GFP蛋白的断裂速率和断裂率更好。
(2)本发明实现的插入适量甘氨酸能有效的降低IC的稳定性，提升相同洗脱条件下的洗脱效果，做到了在不改变洗脱条件或略提高洗脱条件的前提下，有效的提高了洗脱柱上IC的效果。
(3)本发明改变了并没有对内含肽的识别连接产生明显的影响，在断裂反应过程中可以看出断裂率和断裂速率没有明显下降。
(4)此外，本发明的改造没有对亲和介质的载量产生明显的影响，在静态吸附实验过程中可以看出载量出现一定下降，但下降程度不大。
(5)本发明明显提高了内含肽亲和层析介质的再生效果，对比IC的约70％的再生率，IC *能达到约97％的再生率，有明显提升。
(6)本发明改造的IC *在亲和纯化应用中，同样能获得约99％的目标蛋白，回收率也与IC相近，说明改造并没有对亲和纯化产生明显影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1A为本发明所得自剪切蛋白在0～25min下的断裂性能的测试结果图。图1B为本发明所得自剪切蛋白在0～350min下的断裂性能的测试结果图。由图可知，IC *D-12-3G-13在前10分钟的断裂速率最快，6小时后几种改造配体的最终断裂率与未改造的IC相近，趋于平稳。
图2为不同洗脱液下IC *D-12-3G-13的洗脱率。
图3为本发明所得自剪切蛋白的柱上使用0.1mol·L-1NaOH洗脱效果的测试结果图。其中IC *D-12-3G-13和IC *D-12-6G-13的洗脱率最高，达到了97.72％和97.77％。
图4为本发明所得自剪切蛋白的静态吸附载量的拟合曲线图。
图5为本发明所得自剪切蛋白的动态吸附载量及重复上样后的测试结果图。由图可知，改造后的配体具有更好的再生效果。
图6为本发明所得自剪切蛋白的亲和纯化应用的测试结果图。其中A泳道为上样液，B泳道为穿透，C泳道为洗脱。使用本发明改造的配体纯化GFP蛋白可得到纯度为99.21％的GFP蛋白。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明设计了一种经改造的Cfa DnaE的C端剪接结构域(IC *)形成的亲和配基，通过在其中插入适量甘氨酸降低稳定性，构建出一种新型蛋白亲和纯化的层析介质。目标蛋白只需在分子水平上构建于IC的C端(相当于亲和标签的作用)并与IC融合表达，通过在体外IC与IN的亲和结合以及控制条件诱导下的剪接反应即可实现目的蛋白的纯化。
亲和配基片段的构建是在对Cfa DnaE-C(IC)的结构进行改造的基础上进行的。由于甘氨酸没有侧链，会让蛋白更加灵活，也就降低了稳定性，所以选用甘氨酸作为添加氨基酸。且根据分子对接，分析氢键位置，选择在IC的第12号位到第18号位之间的合适位置添加甘氨酸，以降低IC蛋白的结构稳定性。
所述的经改造的Cfa DnaE C端剪接结构域亲和配基的构建方法的步骤为：
步骤一：引物设计
本发明对天然断裂型内含肽Cfa DnaE的C端剪接结构域进行分子改造。改造后的IC片段命名为IC *，改造的内容为在IC的第12号位到第18号位之间的合适位置添加适量的甘氨酸。由于改造的位点位于目标片段的中间，因此可以通过设计引物进行PCR完成对IC片段的改造。经这种方式表达获得的蛋白即为所需的亲和配基片段。
步骤二：重组菌的构建
本发明根据步骤一所设计的引物，以E.coli BL21(DE3)/pET28a-IC为模板质粒，通过重叠PCR的方法将在IC-GFP蛋白中第12号位和第18号氨基酸之间插入适量个数的甘氨酸，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IC *。依据重组PCR原理结合IC蛋白碱基序列，设计引物。以实验室已有的IC片段作为模板，选用合适的引物，使用Prime STAR DNA聚合酶的50μL体系，对IC进行PCR扩增。
步骤三：Cfa DnaE IC *的表达纯化
本发明使用IPTG对步骤(2)所构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IC *进行诱导表达，获得改造后的重组IC *蛋白。利用Ni亲和层析柱获得纯化的IC *。
实施例1
引物设计：
使用PCR技术对天然断裂型内含肽Cfa DnaE的C端剪接结构域进行分子改造，并将改造后的IC片段命名为IC *。根据GeneBank提供的基因序列，利用分子生物学软件PrimerPremier 5基于重叠PCR设计IC *的正向引物A_F、B_F、C_F、D_F和反向引物A_R、B_R、C_R、D_R：
A_F:AAGCCTGGGTACCCAAAACGTTGGAGGAGGATACGGCATTGGC
A_R:GCCAATGCCGTATCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCCAGGCTT
B_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGATACGGCATTGGCGTCG
B_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCC
C_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATACGG
C_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGT
D_F:ACGTTGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATACGG
D_R:CCGTATCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGT
其中，引物A_F，A_R可构建菌株pET28a-IC *12-3G-13，即在IC第12位与13位间插入3个甘氨酸，下同；引物B_F，B_R可构建菌株pET28a-IC *12-6G-13；引物C_F，C_R可构建菌株pET28a-IC *12-12G-13；引物D_F，D_R可构建菌株pET28a-IC *12-18G-13。
将所设计的引物交由天霖生物科技无锡有限公司合成。
实施例2
重组载体pET28a-IC *的构建：
提取质粒pET28a-IC，利用实施例1设计的正向引物A_F、B_F、C_F、D_F和反向引物A_R、B_R、C_R、D_R为引物，质粒pET28a-IC为模板，利用Prime STAR DNA聚合酶对pET28a-IC *12-3G-13、pET28a-IC *12-6G-13、pET28a-IC *12-12G-13、pET28a-IC *12-18G-13序列进行PCR。按照Prime STAR DNA聚合酶说明书，选择50μL体系进行。
PCR反应条件：预变性94℃反应5min；变性94℃反应30s，退火温度65℃反应30s，延伸温度72℃延伸5min 30s，进行30个循环；最后72℃保持10min。
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收得到质粒pET28a-IC *12-3G-13、pET28a-IC *12-6G-13、pET28a-IC *12-12G-13、pET28a-IC *12-18G-13。将重组质粒转化感受态细胞E.coliJM109，得到重组菌E.coli JM109/pET28a-IC*(E.coli JM109/pET28a-IC *12-3G-13、E.coliJM109/pET28a-IC *12-6G-13、E.coli JM109/pET28a-IC *12-12G-13、E.coli JM109/pET28a-IC *12-18G-13)。
实施例3
重组载体pET-28a-IC *的构建：
过夜培养菌株E.coli JM109/pET28a-IC *，提取质粒，转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到改造后的重组IC *表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-IC *备用。
实施例4
IC-目的基因融合蛋白的表达纯化：
将实施例3得到的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IC *过夜培养，转接50mL LB培养基，培养至OD600＝0.6时，添加IPTG至终浓度0.4M，16℃180rpm诱导表达。离心收集培养后的菌体，超声破碎细胞，离心收集上清。上清液上样至预先用平衡缓冲液(50mmol·L- 1Na2HPO4,50mmol·L-1NaH2PO4，0.5mol·L-1NaCl,pH6.0)平衡的Ni亲和层析柱，平衡缓冲液洗脱7～8个柱体积至平衡，然后用洗脱缓冲液(500mM咪唑；50mmol·L-1Na2HPO4,50mmol·L-1NaH2PO4，0.5mol·L-1NaCl，pH6)洗脱。收集洗脱的IC *，用SDS-PAGE检测其浓度。利用Ni亲和层析填料纯化所表达的亲和配基片段IC *，将纯化产物进行冷冻干燥备用。
实施例5
首先测得IN和IC的蛋白浓度，结合各个片段的相对分子质量，以IN和IC *-GFP蛋白摩尔浓度比4:1的比例将适量的IN、IC *-GFP蛋白溶液混合，进行37℃水浴。反应开始后，分别0.5、1、5、10、30、60、120、240、360min取样20μL，加入5μL 5×上样缓冲液中，沸水浴10min终止断裂反应。在所有的样品都经过处理后，取10μL加入SDS-PAGE胶孔中进行蛋白电泳。使用Image Lab软件进行分析电泳结果，得到不同的时间段断裂前IC *-GFP蛋白和断裂后的GFP蛋白相对应条带的含量并计算分析起断裂反应速率随时间变化。IN、IC *-GFP蛋白的断裂反应主要研究蛋白之间的识别连接能力的变化。结果如图1所示。
Figure BDA0003196816790000091
式中：
CC-GFP和CGFP分别表示断裂前后的IC-GFP蛋白和GFP蛋白的相对含量。
MC-GFP和MGFP分别表示IC *-GFP蛋白和GFP蛋白的相对分子量。
实施例6
将不断裂的目标蛋白IC *D上柱完毕后，在上样10mL以后，分别使用0.1mol·L-1的NaOH溶液、0.5mol·L-1的NaOH溶液、8mol·L-1的尿素、6mol·L-1的盐酸胍、0.1mol·L-1的HCl溶液对介质冲洗10个柱体积，根据紫外峰显示收集洗脱液，待紫外检测器显示重新恢复平衡后缓冲液冲洗至中性，完成介质的再生。收集上样液、穿透液、洗脱液进行SDS-PAGE实验，根据胶图分析洗脱结果，测定穿透液、洗脱液中蛋白浓度，计算IC *D蛋白洗脱率。根据IC *D的洗脱情况和洗脱液的蛋白电泳图，分析得出最优洗脱条件为0.1mol·L-1NaOH。结果如图2所示。使用0.1mol·L-1NaOH再生上述条件上柱的ICD、IC *D-12-3G-13、IC *D-12-6G-13、IC *D-12-12G-13，IC *D-12-18G-13，以相同方式计算洗脱率，所得结果如图3，可见，IC *D-12-3G-13、IC *D-12-6G-13的洗脱效果最好，均高过ICD。ICD为IC敲除尾部的NCFN，ICD无法发生断裂反应，避免了内含肽提前断裂影响本实验结果。
ICD、IC *D-12-3G-13、IC *D-12-6G-13、IC *D-12-12G-13的氨基酸序列如SEQ ID No.3～6所示。
实施例7
选择无法断裂的IC *-GFP-D作为吸附模型蛋白，以Buffer A(50mmol·L-1Na2HPO4,50mmol·L-1NaH2PO4，0.5mol·L-1NaCl,pH 7.0)作为平衡缓冲溶液，研究不同个数的甘氨酸在同一IN亲和层析介质的静态饱和载量和动态吸附载量变化。
用Buffer A缓冲液将IC *-GFP-D蛋白溶液稀释至不同浓度：0.25、0.5、1、2、3mg·mL-1。将5mL IC *-GFP-D蛋白溶液分别与0.1g的充分抽干的IN亲和层析介质混合，置于25mL具塞三角瓶中恒温振荡5h(25℃，180rpm)。待反应结束后，室温静置15min，小心吸取上清，并通过分光光度计分析上清液以确定蛋白质浓度。
通过吸附前后上清液中蛋白浓度变化计算静态吸附量。通过Langmuir方程来评估不同甘氨酸个数的IC *蛋白对于IN介质的吸附性能的影响，按照以下公式计算介质的饱和吸附载量Qm和解离常数Kd。
Figure BDA0003196816790000101
其中：Qm代表介质的饱和吸附载量(mg·mL-1)；Kd为解离常数(mg·mL-1)。Q*代表介质的吸附量(mg·mL-1)；C*为平衡时体系中蛋白液浓度(mg·mL-1)。
利用测得的Q*和C*，通过非线性拟合，绘制饱和吸附曲线。结果如图3所示。
表1插入不同甘氨酸数量对结合能力的影响。
Figure BDA0003196816790000102
实施例8
使用过膜水冲洗1mL的预装柱10到20个柱体积，彻底清除介质中的乙醇，使用Buffer A冲洗介质至紫外基线水平。平衡完成后，上样已过膜的IC *-GFP-D蛋白，浓度为1mg·mL-1，流速为0.17mL·min-1。通过紫外检测器数值变化记录OD280，观察穿出蛋白浓度变化，绘制IC *-GFP-D的穿透曲线。当流穿浓度超过IC *-GFP-D上样浓度的10％时停止上样。根据Griffith方法计算动态载量。
Figure BDA0003196816790000103
式中，Q10％为动态吸附载量(mg·mL-1)；C和C0分别为流穿和上样的蛋白浓度(mg·mL-1)；Vsolution为10％穿透上样时的蛋白溶液的体积(mL)；Vabsorbents为纯化柱中的介质的体积(mL)。
实施例9
用超滤的方法将含有融合蛋白表达片段的粗蛋白样品的缓冲液更换为平衡缓冲液Buffer B(1mmol·L-1Zn2+；20mmol·L-1咪唑；0.5mol·L-1NaCl；20mmol·L-1Na2HPO4；pH6.5)。
利用本发明中构建的亲和层析系统，对目标蛋白进行纯化的具体过程如下：
1)平衡。用3倍柱体积的平衡缓冲液Buffer B(1mmol·L-1Zn2+；20mmol·L-1咪唑；0.5mol·L-1NaCl；20mmol·L-1Na2HPO4；pH 6.5)对介质进行平衡。
2)上样。用Buffer B冲洗介质至紫外基线水平后，将未纯化的粗蛋白液过膜上样。
3)清洗杂蛋白。用4倍柱体积的Buffer B充分冲洗，除去未结合的蛋白。用2倍体积不含Zn2+的Buffer B冲洗。
4)诱导断裂。3倍体积的断裂缓冲液Buffer C(50mmol·L-1DTT，20mmol·L-1EDTA，0.5mol·L-1NaCl，10mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)冲洗层析介质，将层析介质中的缓冲液置换为断裂缓冲液。室温下静置6h。
5)洗脱。用洗脱缓冲液Buffer D(0.5mol·L-1NaCl，10mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0)洗下断裂后的目标蛋白并进行收集。目标蛋白电泳图如图6。
6)使用再生液对IN亲和层析柱的再生
表2IC *-12-3G-13的纯化效果
Figure BDA0003196816790000111
实施例10
为了验证插入甘氨酸个数对IN、IC识别连接作用的影响，需要对插入不同个数甘氨酸的IC *-GFP蛋白进行断裂反应。依次纯化IN蛋白和不同个数的甘氨酸的IC *蛋白，按比例混合进行断裂反应，将结果进行电泳实验。根据蛋白胶图结构分析计算，得到不同个数甘氨酸的IC *蛋白的断裂率，分析插入不同甘氨酸个数对断裂反应的影响。实验结果如图1所示。
实施例11
为验证改造IC *在再生过程中的效果，对IC *和IC进行重复过量饱和上样。使用IC和IC *上样至过饱和，收集穿透液，计算饱和动态吸附量，上样完成后进行洗脱，随后重复多次，分析饱和动态吸附量随洗脱次数增加发生的变化，研究在重复饱和上样后再进行洗脱后载量发生的变化。结果如图5，IC *的再生效率为94.52％、96.59％，而IC的再生销量为76.01％和77.82％。
由此可见，本利用本发明表达的IC *作为亲和配基结合目标蛋白进行纯化具有以下优点：
(1)与当前已存在的一些断裂内含肽纯化系统相比，本发明将在IC蛋白的第12到18氨基酸之间插入少量甘氨酸来降低IC的稳定性，优化再生效果。通过降低IC的稳定性，介质在亲和纯化后再生效果达到97％以上，且由实验数据表明，当插入甘氨酸数量为3个时，所得到的IC *12-3G-13-GFP蛋白的断裂速率和断裂率更好。
(2)本发明实现的插入适量甘氨酸能有效的降低IC的稳定性，提升相同洗脱条件下的洗脱效果，做到了在不改变洗脱条件或略提高洗脱条件的前提下，有效的提高了洗脱柱上IC的效果。
(3)本发明改变了并没有对内含肽的识别连接产生明显的影响，在断裂反应过程中可以看出断裂率和断裂速率没有明显下降。
(4)此外，本发明的改造没有对亲和介质的载量产生明显的影响，在静态吸附实验过程中可以看出载量出现一定下降，但下降程度不大。
(5)本发明明显提高了内含肽亲和层析介质的再生效果，对比IC的约70％的再生率，IC *能达到约97％的再生率，有明显提升。
(6)本发明改造的IC *在亲和纯化应用中，同样能获得约99％的目标蛋白，回收率也与IC相近，说明改造并没有对亲和纯化产生明显影响。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种自剪切蛋白标签、改造方法及其应用
<141> 2021-07-29
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
His Met Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Asn Val
1 5 10 15
Tyr Gly Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly
20 25 30
Leu Val Ala Ser Asn Cys Phe Asn
35 40
<210> 2
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ala Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Leu
1 5 10 15
Val Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Ser Thr Val Tyr Thr
20 25 30
Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His
35 40 45
Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Ser
50 55 60
Ile Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Asp Gly Gln
65 70 75 80
Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Gly Leu Asp Leu Lys Gln
85 90 95
Val Asp Gly Leu Pro
100
<210> 3
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
His Met Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Asn Val
1 5 10 15
Tyr Gly Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly
20 25 30
Leu Val Ala Ser
35
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
His Met Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asn Val Tyr Gly Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu
20 25 30
Lys Asn Gly Leu Val Ala Ser
35
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
His Met Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Asn Val Tyr Gly Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn
20 25 30
Phe Leu Leu Lys Asn Gly Leu Val Ala Ser
35 40
<210> 6
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
His Met Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Val Tyr Gly Ile Gly
20 25 30
Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly Leu Val Ala Ser
35 40 45

Claims (7)

1.一种自剪切蛋白标签，其特征在于：所述自剪切蛋白标签，以SEQ ID No.1所示的CfaDnaE-C，即IC氨基酸序列为出发序列，将第12到第13号位之间插入3～12个甘氨酸，即IC *，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述自剪切蛋白标签。
2.如权利要求1所述的自剪切蛋白标签，其特征在于：所述自剪切蛋白标签，以SEQ IDNo.1所示氨基酸序列为出发序列，在第12和第13号位之间添加3、6或12个甘氨酸，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述自剪切蛋白标签。
3.如权利要求1～2中任一所述的自剪切蛋白标签的改造方法，其特征在于：包括，
设计引物：根据GeneBank提供的基因序列，利用分子生物学软件Primer Premier 5基于重叠PCR设计IC *基因序列的引物；
重组菌的构建，以重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-IC为模板，利用引物进行改造：获得改造后的蛋白IC *的基因序列，最后转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到改造后的重组IC *表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC *；
改造后重组蛋白IC *的表达纯化：对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC *进行诱导表达，获得改造后的重组蛋白IC *，即Cfa DnaE IC *；
所述重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC，其中，菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-IC中的IC序列为人工合成，末端添加氨基酸CFN，后连接到pET28a上，酶切位点为NdeI和HindIII。
4.如权利要求3所述的自剪切蛋白标签的改造方法，其特征在于：所述设计引物，其中，所述引物序列包括：
A_F:AAGCCTGGGTACCCAAAACGTTGGAGGAGGATACGGCATTGGC；
A_R:GCCAATGCCGTATCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCCAGGCTT；
B_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGATACGGCATTGGCGTCG；
B_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCC；
C_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATACGG；
C_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGT；
其中，引物A_F，A_R可构建菌株pET28a-IC *12-3G-13，即在IC第12位与13位间插入3个甘氨酸；
引物B_F，B_R可构建菌株pET28a-IC *12-6G-13，即在IC第12位与13位间插入6个甘氨酸；
引物C_F，C_R可构建菌株pET28a-IC *12-12G-13，即在IC第12位与13位间插入12个甘氨酸。
5.如权利要求3所述的自剪切蛋白标签的改造方法，其特征在于：所述PCR反应条件包括：预变性94℃反应5min；变性94℃反应30s，退火温度65℃反应30s，延伸温度72℃延伸5min 30s，进行30个循环；最后72℃保持10min。
6.如权利要求3中所述的自剪切蛋白标签的改造方法制得的自剪切蛋白标签在蛋白纯化标签中的应用，其特征在于：所述应用，其过程包括，
将自剪切蛋白标签与目标蛋白以重叠PCR融合表达；
破胞获取粗蛋白液并过滤；
将过滤后的粗蛋白液与含有Cfa DnaE-N，即IN蛋白的介质接触；
将上述介质用清洗液清洗；
将上述介质用再生液0.1M～0.5M的NaOH或KOH再生；
所述目标蛋白，包括模式蛋白GFP。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述含有Cfa DnaE-N蛋白的介质，其中，所述Cfa DnaE-N的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述介质由以环氧活化基质作为载体，以1g抽干基质加入浓度为15mg/mL的1.5mL IN溶液，恒温振荡反应24h得到。
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