BRPI0807802B1 - corynebacteria e método para produzir um produto de fermentação utilizando glicerol - Google Patents

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Cho Kwang-Myung
Choi Kyung-Oh
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Description

(54) Título: CORYNEBACTERIA E MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO UTILIZANDO GLICEROL (51) Int.CI.: C12N 1/20 (30) Prioridade Unionista: 24/01/2007 KR 10-2007-0007513 (73) Titular(es): CJ CHEILJEDANG CORPORATION (72) Inventor(es): KWANG-MYUNG CHO; KYUNG-OH CHOI; HYUN-AE BAE
1/22
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para
CORYNEBACTERIA E MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO UTILIZANDO GLICEROL.
Campo da técnica.
[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir o produto de fermentação de fontes de carbono diversas contendo glicerol usando Corynebacteria. Mais particularmente, presente invenção refere-se a um método para a produção de um produto de fermentação tal como aminoácido usando glicerol com alto rendimento e alta produtividade, pela fermentação com Corynebacteria introduzido com um gene diferente em relação à utilização de glicerol diferente capaz da acumulação de aminoácidos comercialmente úteis, tais como aspartato, treonina, lisina, metionina, isoleucina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, alanina, valina, leucina, triptofano, tirosina, fenilalanina e os seus intermediários metabólicos no meio de cultura complementado com o glicerol, o subproduto gerado durante a produção do biodiesel na indústria de óleo, como uma fonte de carbono.
Antecedentes da Invenção [002] Os aminoácidos mencionados são muito úteis. Aspartato foi usado como uma matéria-prima de aspartame, e lisina, treonina, metionina, triptofano, foram usados como aminoácidos para alimentos, na alimentação e em medicamentos. Asparagina, isoleucina, ácido glutâmico, glutamina, leucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina e tirosina, foram usados como aminoácidos para alimentos e medicamentos. Também, a homosserina e a O-succinil-homosserina podem ser usadas como os precursores da produção de aminoácidos. [003] De acordo com o aumento contínuo do preço de óleo, o desenvolvimento de uma energia alternativa usando um material de reciclagem na natureza está adquirindo atenção. Entre muitos
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2/22 candidatos para a fonte de energia alternativa, o biodiesel obtido de óleo vegetal e bioetanol produzido pela fermentação são os candidatos mais atraentes. O biodiesel indica o éster metílico de ácidos graxos ou o éster etílico de ácidos graxos sintetizados pela esterificação do metanol produzido usando óleo vegetal como um substrato na presença de um catalisador. Durante a síntese, o subproduto, glicerol, é necessariamente gerado como 10 % do peso total.
[004] O glicerol (C3H8O3) é convertido da glicose (C6H12O6) por uma etapa de redução, que pode fornecer uma força de redução melhorada durante o metabolismo de um micro-organismo. Muitos produtos produzidos pela fermentação necessitam de uma força de redução nos seus caminhos metabólicos. Desse modo, se o glicerol puder ser eficazmente usado como um substrato, o rendimento e a produtividade do produto de fermentação desejado seriam melhorados. Apesar da expectativa, os estudos sobre o glicerol foram limitados à reuterina (Talarico et al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988)), 2,3-butanodiol (Biebl, et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 50:24-29 (1998)), 1,3-propanodiol (Menzel, e. al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997)), ácido succínico (Patente Coreana N° 10-0313134), ácido itacônico (Patente dos Estados Unidos N° 5.457.040), 3-hidroxipropanaldeídos (Doleyres et al. Appl. Micribiol. Biotechnol. 68 (4):467-474 (2005)) e ácido propiônico (Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 435-440 (2000)). Isso se deve ao preço do glicerol ser mais alto do que o de quaisquer outras fontes de carbono usadas para a fermentação nessa indústria. Agora, estão em andamento os estudos para produção de glicerol via fermentação (Wang et al., Biotechnol. Adv., 19 (3):201-223 (2001)).
[005] Entretanto, com o aumento da produção de biodiesel, a produção de glicerol também está aumentando, resultando na rápida redução do preço. Desse modo, houve um relatório informando que o
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1,3-propanodiol (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 442-446, (2004)), o hidrogênio e o etanol (Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100 (3): 260-265 (2005)) foram produzidos pelo uso do subproduto do biodiesel, incluindo o glicerol. Entretanto, nenhum relatório foi divulgado para a produção do produto de fermentação mais representativo, os aminoácidos, e outros metabólitos principais pelo uso glicerol.
[006] O glicerol foi produzido até então na indústria de sabão, ácido graxo, cera e tensoativos. Entretanto, tal como acima mencionado, pode ocorrer o problema de se tratar eficazmente um subproduto incluindo o glicerol de acordo com o aumento da produção de biodiesel. Ao mesmo tempo, também se espera que o preço do glicerol purificado seja reduzido. Desse modo, a produção de produtos úteis de fermentação usando glicerol poderia trazer efeitos melhores do que os esperados.
[007] Os casos de utilização do glicerol com micro-organismos foram relatados para E. coli e Klebsiella pneumoniae. Na E. coli, o glicerol extracelular infiltra em células pelo uso do GlpF, uma das aquagliceroporinas possuindo a permeabilidade da água, glicerol e ureia, sem consumo de energia (Heller et al., J. Bacteriol. 144:274278, (1980)). O glicerol é convertido no glicerol-3-fosfato pela glicerol quinase, que é convertida novamente no fosfato de diidroxiacetona (DHAP) pela glicerol-3-fosfato desidrogenase, e depois é convertido no gliceroaldeído-3-fosfato (G-3-P) pela triosefosfato isomerase (TpiA), seguido pelo metabolismo final (Lin a CE, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). No caso em que a glicerol quinase não tiver nenhuma atividade, o glicerol é convertido na diidroxiacetona (DHA) pela glicerol desidrogenase (Gdh), que é convertida novamente no fosfato de diidroxiacetona (DHAP) pela glicerol quinase ou pela diidroxiacetona quinase (DHA quinase), seguida pela conversão
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4/22 novamente no gliceraldeído-3-fosfato (G-3-P) antes do metabolismo final (Paulsen et al., Microbiology, 146:2343-2344, (2000)). Tal caminho metabólico do glicerol é regulado por fatores diversos. Particularmente, quando o glicerol e a glicose estão em conjunto, o tipo selvagem da E. coli usa primeiro a glicose, exclusivamente, e depois usa o glicerol (Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). [008] Os micro-organismos do gênero Corynebacterium são aqueles que foram amplamente usados no campo industrial. Por exemplo, Corynebacterium glutamicum foi usado para a produção de aminoácidos tais como a lisina e o glutamato monossódico, e o C. ammoniagenes foi amplamente usado industrialmente para a produção de ácido nucleico por fermentação. Foi informado que a Corynebacteria pode usar diversas fontes de carbono, tais como glicose e açúcar bruto para a fermentação. Também se informou que Corynebacteria pode usar a xilose pela introdução de um gene, tal como o xy1AB (Kawaguchi et al., Appl. Envion. Microbiol. 72 (5): 34183428 (2006)). Entretanto, há relatos de casos raros em que a Corynebacteria usam o glicerol como uma fonte de carbono. Os casos de utilização do glicerol em Corynebacterium glutamicum são também muito poucos (Pedido de Patente Coreana N° 2006-057633).
[009] Entre os micro-organismos do gênero Corynebacterium, somente 4 micro-organismos foram analisados para identificação das suas sequências integrais do genoma. E, um gene completo utilizando glicerol foi encontrado somente no Corynebacterium diphtheriae e tais genes envolvidos no consumo de glicerol, tal como o GlpF, foi deficiente em outros três micro-organismos, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, e Corynebacterium jeikeium. A deficiência do gene é o obstáculo principal para que a Corynebacteria utilize o glicerol eficientemente.
Descrição de Invenção
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Problema Técnico [0010] Como explicado anteriormente, existe um valor agregado pelo uso de glicerol que é o subproduto da produção do biodiesel como uma fonte de carbono. Assim, baseado nesse fato, os presentes inventores enfocaram seus estudos sobre a disponibilidade de glicerol para uma Corynebacteria com um valor industrialmente elevado, tal como a Corynebacterium glutamicum e a Corynebacterium ammoniagenes. Como resultado os presentes inventores concluíram a presente invenção confirmando que a disponibilidade de glicerol pode ser notavelmente melhorada pela introdução de um gene diferente envolvido com o uso do glicerol naquelas Corynebacteria.
[0011] É um objetivo da presente invenção fornecer um gene envolvido no uso do glicerol para melhorar significativamente a assimilação do glicerol pela Corynebacteria.
[0012] É outro objetivo da presente invenção fornecer um mutante originado da Corynebacteria utilizando o glicerol ou sozinho como uma fonte de carbono ou em conjunto com outras fontes de carbono.
[0013] É um objetivo adicional da presente invenção fornecer um método para a produção do produto de fermentação pela fermentação com Corynebacteria utilizando uma fonte de carbono compreendendo o glicerol ou uma porção do glicerol.
Solução Técnica [0014] Os objetivos acima e outros objetivos da presente invenção podem ser atingidos pelas seguintes modalidades da presente invenção.
[0015] A presente invenção é descrita detalhadamente daqui por diante.
[0016] Para atingir o objetivo da invenção, a presente invenção fornece um gene envolvido no uso do glicerol para melhorar significativamente a assimilação do glicerol pela Corynebacteria.
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6/22 [0017] O gene envolvido aqui no uso do glicerol indica um gene que codifica proteína facilitadora da absorção do glicerol originada da Corynebacterium diphtheriae (referido daqui por diante como glpF), um gene que codifica a glicerol quinase que é a enzima de produção do glicerol-3-fosfato por fosforilação usando o ATP (referido daqui por diante como glpK), e um gene que codifica a glicerol-3fosfodiidrogenase que é a enzima de produção do diidroxiacetona-3fosfato pela oxidação do glicerol-3-fosfato (referido daqui por diante como glpD).
[0018] O gene inclui qualquer gene que codifica um polipeptídio na Corynebacteria que desempenha um papel na absorção do glicerol extracelular e na conversão do glicerol no glicerol-3-fosfato por fosforilação, e na conversão de glicerol-3-fosfato em diidroxiacetona-3fosfato, e depois finalmente na conversão do diidroxiacetona-3-fosfato em gliceraldeído-3-fosfato, o intermediário da glicólise, para metabolizar o glicerol.
[0019] O gene pode ser originado de animais, plantas, e microorganismos. É mais preferido selecionar um gene originado de um micro-organismo, particularmente da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 (Registro no Banco de Genes N° NC_002935).
[0020] A presente invenção também fornece um mutante originado da Corynebacteria utilizando o glicerol sozinho como uma fonte de carbono ou em conjunto com outras fontes de carbono.
[0021] A cepa usada na presente invenção pode ser cultivada consumindo glicerol e glicose simultaneamente para usar o glicerol eficazmente. Quando a glicose e o glicerol são fornecidos simultaneamente como uma fonte de carbono, o tipo selvagem E. coli usa exclusivamente a glicose, e depois de consumir toda a glicose o tipo selvagem E. coli usa o glicerol, que é assim chamado ‘diauxy’. Assim, quando uma fonte de carbono complexa contendo glicerol é
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7/22 fornecida, a eficiência da fermentação é reduzida.
[0022] Para superar o problema acima, os presentes inventores investigaram a possibilidade de utilização simultânea de glicose e glicerol na cepa. E como resultado os inventores confirmaram que o glicerol e outras fontes de carbono podem ser eficazmente usadas pela inserção de um gene diferente envolvido no uso do glicerol originado da Corynebacteria.
[0023] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os presentes inventores fornecem um micro-organismo contendo o gene que codifica o GlpF (Registro no Banco de Genes N° NC_940539.1), o GlpK (Registro no Banco de Genes N° NC_940538.1) e o GlpD (Registro no Banco de Genes N° NC_040540.1), e a proteína implicada no uso de glicerol, originada da Corynebacterium diphtheriae. A transformação da Corynebacteria com o gene pode ser realizada pelo método convencional conhecido daqueles na técnica, e pode ser fornecido um mutante da Corynebacterium para produção de aminoácidos usando uma fonte de carbono compreendendo o glicerol ou uma parte do glicerol.
[0024] O vetor para presente invenção não está limitado a um vetor específico e qualquer vetor de expressão informado pode ser usado. Particularmente, o vetor lançador E.coli-Corynebacterium pECCG 117 (Biotechnology letters vol 13, N° 10, p.721-726 (1991)) é preferido.
[0025] Na presente descrição, o termo ‘transformação’ indica o processo de introduzir um gene em uma célula hospedeira e expressar o gene na mesma. O gene transformado inclui qualquer gene, ou inserido no cromossomo da célula hospedeira ou apresentado no exterior do cromossomo, enquanto puder ser expressado na célula. O gene é um polinucleotídio capaz de codificar um polipeptídio e contendo DNA e RNA. O gene não está limitado na sua forma para a
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8/22 introdução, enquanto puder ser expressado na célula hospedeira. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira como um cassete de expressão, ou o construtor de polinucleotídio que contém todos os elementos necessários para a autoexpressão. O cassete de expressão compreende um promotor operacionalmente ligado ao gene, um terminador de transcrição, um sítio de ligação do ribossoma, e um terminador de tradução. O cassete de expressão pode ser o vetor de expressão capaz de autorreplicação. Também, o gene pode ser operacionalmente ligado à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira pela introdução em uma célula hospedeira como ele próprio, ou na forma de um polinucleotídio construtor.
[0026] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a transformação é realizada transformando uma célula hospedeira com o vetor contendo o gene glpDFK e introduzindo o plasmídio obtido pelo método do pulso elétrico. A célula hospedeira transformada pode ser a E. coli CO02-0014 (Registro N° KCCM 10834P).
[0027] Na presente invenção, o micro-organismo transformado com um gene envolvido no uso do glicerol para eficazmente produzir aminoácidos usando glicerol, pode ser uma das Corynebacteriaceae, mais preferivelmente um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e bem mais preferivelmente um micro-organismo selecionado do grupo consistindo na Corynebacterium glutamicum (exemplo ATCC 13032), Corynebacterium ammoniagenes (exemplo ATCC 6872), Brevibacterium lactofermentum (exemplo ATCC13869), Brevibacterium flavum (exemplo ATCC14067), Corynebacterium thermoaminogenes (exemplo FERM-BP 1539) e Corynebacterium efficiens (exemplo C. efficiens str. YS-314), mas nem sempre limitado a esses. E também, o micro-organismo que produz materiais úteis, tais como aminoácidos ou ácidos nucleicos, por exemplo, Corynebacterium glutamicum SM5 para a produção de ácido glutâmico e
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Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881) para a produção de lisina, podem estar incluídos, mas nem sempre limitado a esses. [0028] Presente invenção também fornece um método de produzir o produto de fermentação pela fermentação com Corynebacteria utilizando uma fonte de carbono compreendendo glicerol ou uma parte do glicerol. Particularmente, a presente invenção fornece um método para produzir o produto de fermentação usando o glicerol compreendendo as etapas de: transformação de uma célula hospedeira com o vetor contendo o glpDFK que é um complexo gênico facilitador do uso de glicerol; transformação da Corynebacteria com o plasmídio obtido da célula hospedeira transformada pelo método de pulso elétrico; cultivo da Corynebacteria transformada pela inoculação em um meio de cultura contendo glicerol ou uma parte de glicerol como uma fonte de carbono; e separando produto de fermentação do meio de cultura.
[0029] No método para produzir o produto de fermentação da presente invenção, o cultivo do micro-organismo pode ser realizada em um meio próprio e sob condições de cultura adequadas conhecidas daquelas da técnica. Estas condições podem ser reguladas por aquelas da técnica de acordo com a cepa selecionada. Os métodos de cultivo são exemplificados como culturas em batelada, cultura contínua e culturas em batelada alimentada, mas nem sempre limitados a esses. Os vários métodos de cultura são descritos em Biochemical Engineering' por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138-176.
[0030] O meio tem que satisfazer as condições para a cultura de uma cepa específica. O meio usado na presente invenção contém o glicerol ou uma parte do glicerol como uma fonte de carbono, preferivelmente contém o glicerol em 1g a 300 g por 1 litro do meio de cultura. Além do glicerol, outras fontes de carbono podem ser
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10/22 adequadamente acrescentadas, e neste momento a glicose é preferida como uma fonte de carbono. Como uma fonte de nitrogênio, uma fonte de nitrogênio orgânica tal como a peptona, o extrato de levedura, o caldo de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho e farinha de soja, e como uma fonte de nitrogênio inorgânica a ureia, o sulfato de amônio, o cloreto de amônio, o fosfato de amônio, o carbonato de amônio e o nitrato de amônio podem ser incluídos no meio. Como uma fonte de fosfato, o diidrogenofosfato de potássio, o bifosfato dipotássico e os seus sais correspondentes contendo sódio podem ser incluídos no meio. Além disso, um sal de metal, tal como o sulfato de magnésio ou o sulfato de ferro também pode ser incluído. Os aminoácidos, as vitaminas e os precursores adequados podem também ser incluídos. Esses meios ou precursores podem ser acrescentados à cultura do tipo batelada ou do tipo contínua.
[0031] O pH da cultura pode ser ajustado durante o cultivo acrescentando um composto tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A geração de bolhas de ar pode ser inibida durante o cultivo pelo uso um agente antiespumante, tal como o éster do ácido graxo poliglicólico. Para manter a condição aeróbica da cultura, o oxigênio ou o gás contendo o oxigênio podem ser injetados na cultura. A temperatura da cultura está preferivelmente de 20°C a 45°C, mais preferivelment e de 25°C 40°C. O cultivo pode ser continuado até que a produção do aminoácido atinja um nível desejado, e o tempo de cultura preferível é de 10 a 160 horas.
Breve Descrição dos Desenhos.
[0032] A aplicação das modalidades preferidas da presente invenção é melhor entendida com referência aos desenhos que acompanham, em que:
[0033] a figura 1 ilustra as taxas de crescimento dependentes do
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11/22 tempo, representadas pelas densidades óticas, da Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1 e Corynebacterium glutamicum aTCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2 no meio mínimo complementado com glicose a 100 % como uma fonte de carbono. [0034] A figura 2 ilustra as taxas de crescimento dependentes do tempo dos micro-organismos no meio mínimo complementado com glicose:glicerol (50:50 %) como uma fonte de carbono, representada pelas densidades óticas.
[0035] A figura 3 ilustra as taxas de crescimento dependentes do tempo dos micro-organismos no meio mínimo complementado com o glicerol a 100% como uma fonte de carbono, representada pelas densidades óticas.
ATCC13032: Corynebacterium glutamicum ATCC13032
DFK-1: Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1
DFK-2: Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2
Melhor Modo para Executar a Invenção [0036] As modalidades práticas e atualmente preferidas da presente invenção são ilustrativas, tal como mostrado nos Exemplos que se seguem.
[0037] Entretanto, será apreciado que os versados na técnica, em consideração à presente descrição, possam fazer modificações e melhorias dentro do espírito e do alcance da presente invenção. Exemplos
Exemplo 1: Avaliação e clonagem de um gene envolvido no uso de glicerol que é operável na Corynebacteria [0038] A sequência de nucleotídios do gene envolvido no uso do glicerol da Corynebacterium diphtheriae já foi identificada e
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12/22 oficialmente liberada. A informação a respeito dos genes que codificam GlpF, GlpK e GlpD (glpF, glpK e glpD respectivamente) que são proteínas da Corynebacterium diphtheriae associadas com o uso do glicerol e as sequências adjacentes de nucleotídio foi obtida do GeneBank, NIH, EUA. O Número de Registro no Banco de Genes do GlpF da Corynebacterium diphtheriae foi NC_940539.1, o Número de Registro no Banco de Genes do GlpK foi NC_940538.1, e o Número de Registro no Banco de Genes do GlpD foi NC_940540.1. Os genes foram confirmados como estando arranjados como uma série no genoma. Deste modo, um tempo de um PCR poderia amplificar todos dos três genes como um único polinucleotídio. Os iniciadores representados pelas SEQ. ID. NO: 1 e NO: 2 são usados para que a PCR possa amplificar os genes envolvidos no uso do glicerol da Corynebacterium diphtheriae.
SEQ. ID. NO: 1: 5' GATGCGGCCGCGCTGTGTGGCGTATGTCG 3'
SEQ. ID. NO: 2: 5' GATGCGGCCGCAATCATCAAACCCAACCCCA 3' [0039] O cromossomo da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 foi comprado da Coleção Americana de Cultura de Tipos (ATCC) (ATCC ID. NO: 700971D-5) para amplificar o gene envolvido no uso do glicerol da Corynebacterium diphtheriae. A PCR foi executada usando o cromossomo da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 como um padrão para amplificar o gene envolvido no uso do glicerol. A PCR foi executada como se segue; pré-desnaturação a 94°C durante 3 minutos, desnaturação em 94°C por 30 segundos, anelamento da 56°C por 30 segundos, polimerização a 72°C durante 4 minutos e 30 segundos, 25 ciclos de desnaturação a polimerização, e a extensão final a 72°C durante 5 minutos. Como res ultado foi obtido o polinucleotídio ajustado 4281 bp. O polinucleotídio foi clonado no pCR2.1 pelo uso do kit de clonagem da TOPO TA (Invitrogen).
Exemplo 2: Determinação de sequência de nucleotídios e restauração
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13/22 da mutação de aminoácidos do gene glpDFK.
[0040] O plasmídio obtido acima foi digerido com solução Não I para obter um fragmento de DNA contendo o gene envolvido no uso do glicerol. O fragmento de DNA foi clonado em pECCG117, vetor lançador E.coli-Corynebacterium, seguido pela transformação de E. coli TOP10. A cepa transformada foi nomeada E. coli CO02-0014 que foi depositada no KCCM (Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos) da KFCC (a Federação coreana de Coleção de Cultura), a Autoridade de Depósito Internacional localizada em 361221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seul, Coréia, no dia 8 de janeiro de 2007 (Registro N° KCCM 10834P).
[0041] O plasmídio obtido pelo minipreparativo convencional de plasmídio foi denominado de pECCG117-cdi glpDFK-1. A sequência de nucleotídios do DNA do pECCG117-cdi glpDFK-1 foi determinada e conseqüentemente confirmou-se que a sequência de nucleotídios do 171° ao 1904° gene codificado do glpD (SEQ. ID. NO: 4), a sequência de nucleotídios do 1904° ao 2644° gene codificado do glpF (SEQ. ID. NO: 5) e a sequência de nucleotídios do 2663° a 4181° gene codificado do glpK (SEQ. ID. NO: 6) e foram 5 modificações de sequência de nucleotídios (SEQ. ID. NO: 3), comparadas com a sequência obtida pelo sequenciamento convencional do genoma. As modificações na sequência de nucleotídios foram como se segue; a 54a timina foi modificada em citidina, a 1598a adenina foi modificada em guanina, a 2608a adenina foi modificada em guanina, a 2829a adenina foi modificada ema guanina, e a 3037a adenina foi modificada em guanina. Entre estas modificações, a modificação da mutação 2829a somente induzida do aminoácido e as restantes 4 modificações da sequência de nucleotídios foram confirmadas como sendo uma mutação silenciosa. A mutação do aminoácido foi aquela da 56a asparagina da região glpK que foi modificada em serina. A sequência
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14/22 de aminoácidos da glpK possuindo o aminoácido mutado é representada pela SEQ. ID. NO: 6.
[0042] Para restituir o aminoácido transformado à asparagina original, foi realizada a mutagênese direcionada para o sítio. Os iniciadores da mutagênese direcionada para o sítio para modificar o 56° aminoácido, a serina mutada em asparagina, foram construídos e representados pelas SEQ. ID. NO: 7 e N° 8.
SEQ. ID. NO: 7: 5' GGAAATCTGGGCCAACACGCGCCAAGCC 3'
SEQ. ID. NO: 8: 5' GGCTTGGCGCGTGTTGGCCCAGATTTCC 3' [0043] A mutagênese direcionada para o sítio foi realizada com os iniciadores acima usando o kit de mutagênese direcionada para o sítio QuickChange II XL (Stratagene). O experimento foi realizado de acordo com a instrução do fabricante. O plasmídio foi extraído das colônias obtidas de acordo com o método convencional, pelo qual a sequência de nucleotídios foi determinada. Como resultado confirmouse que a 2829a adenina foi modificada em guanina, de modo que a 56a serina da região glpK do pECCG117-cdi glpDFK-1 foi modificada em asparagina, sugerindo que isto poderia produzir a mesma proteína que a proteína GlpK da Corynebacterium diphtheriae produziu (SEQ. ID. NO: 9; SEQ. ID. NO: 10). O plasmídio glpDFK obtido foi denominado pECCG117-cdi glpDFK-2.
Exemplo 3: Introdução no Corynebacterium slutamicum ATCC13032.
[0044] Os pECCG117-cdi glpDFK-1 e o pECCG117-cdi glpDFK-2 preparados são introduzido na Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, respectivamente pelo método de pulso elétrico. As células são cultivadas num meio em placa contendo bacto-peptona 10 g/L, extrato de levedura 10 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCl 2,5 g/L e canamicina 25 ?/mL. As colônias obtidas seguiram com a clonagem por PCR para selecionar as colônias contendo o plasmídio compreendendo o gene envolvido no uso do glicerol. As cepas selecionadas são denominadas
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15/22 respectivamente de Corynebacterium glutamicum
ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1, e Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2.
Exemplo 4: Disponibilidade de glicerol da Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 [0045] Para confirmar a disponibilidade de glicerol da Corynebacterium glutamicum/pECCG117-cdi glpDFK-1 e
Corynebacterium glutamicum/ pECCG117-cdi glpDFK-2, a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 contendo o plasmídio acima e Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 não contendo o plasmídio são respectivamente cultivados no meio mínimo sólido. A composição do meio mínimo é tal como se segue.
Composição do meio mínimo da cultura de Corynebacterium slutamicum (pH 7,2):
[0046] Glicerol 10 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 2 g/L, MgSO4.H2O 0,4 g/L, ureia 2 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, NaCl 0,5 g/L, amida de ácido nicotínico 5 mg/L, pantotenato de cálcio 1 mg/L, tiamina 3 mg/L, biotina 200 ?/L, elementos traço 1 mL, agar-agar 20 g/L.
[0047] A cepa inoculada foi culta em uma incubadora 30? durante 48 horas. Como resultado o crescimento da Corynebacterium glutamicum introduzida com o pECCG117-cdi glpDF-1 ou pECCG117cdi glpDF-2 foi confirmado no meio mínimo. Mas, o crescimento da cepa não introduzida com o plasmídio foi insignificante.
[0048] O crescimento das duas cepas no meio mínimo líquido também foi investigado. Em primeiro lugar, as duas cepas são inoculadas no meio de semeadura, seguido pela cultura durante 24 horas. O meio foi eliminado por centrifugação. O meio restante foi completamente eliminado por dispersão por duas vezes em tampão de fosfato (pH 7,0). A cepa é inoculada em 40 mL do meio mínimo, seguido pelo cultivo em 30°C durante 36 horas. O crescimento foi
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16/22 comparado entre as duas cepas. Os meios mínimos foram suplementados com diferentes fontes de carbono, 12 g/L de glicose; 12 g/L de glicerol; 6 g/L de cada glicose e glicerol, para comparar a disponibilidade de glicerol. E os resultados são mostrados na figura 1. [0049] Tal como mostrado na figura 1, o Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 não introduzido com o gene envolvido no uso do glicerol não cresceu tão bem porque ele não pode usar o glicerol eficazmente. Ao mesmo tempo, a cepa introduzida com o gene envolvido no uso do glicerol foi bem cultivada pelo uso o glicerol como uma fonte de carbono. Quando o glicerol foi acrescentado sozinho, favoreceu o crescimento da Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2. Mas, quando a glicose sozinha ou ambos a glicose e o glicerol são acrescentados em conjunto, foi favorecido o crescimento da Corynebacterium glutamicum ATCC13032/ pECCG117-cdi glpDFK-1, e desse modo elas são usadas nesse experimento.
Exemplo 5: Disponibilidade de glicerol a partir de uma cepa produtora de ácido glutâmico.
[0050] Para confirmar se foi possível não somente produzir materiais úteis, mas também estimular o crescimento de Corynebacteria utilizando glicerol, o de vetor de expressão pECCG117-cdi glpDFK-1 foi introduzido na Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC-11112), que é uma cepa produtora de ácido glutâmico, da mesma maneira que descrito no Exemplo 3. A produtividade de ácido glutâmico foi comparada entre Corynebacterium glutamicum SM5 e Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1 com diferentes fontes de carbono (glicerol sozinho, glicose sozinha, e glicose e glicerol em conjunto (misturados na proporção necessária)). A Corynebacterium glutamicum SM5 e a Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117Petição 870180018822, de 08/03/2018, pág. 21/37
17/22 cdi glpDFK-1 são inoculadas no meio de semeadura com um laço de platina, seguido pelo cultivo em 30°C durante 18 horas. A composição do meio de semeadura foi como se segue: peptona 1 g/L, extrato de levedura 0,5 g/L, caldo de carne 0,5 g/L, glicose 1 g/L, cloreto de sódio 0,25 g/L, ureia 0,13 g/L, pH 7,2. Para a fermentação, 1 mL da solução da cultura de semeadura foi inoculado no meio de cultura, seguido pelo cultivo em 30°C durante 24 horas. A composição do meio de cultura foi tal como se segue: HSM 3 mL, biotina 1 ?/L, resíduo de melaço 0,05 g/L, sulfato de amônio 0,1 g/L, sulfato de ferro 0,002 g/L, sulfato de manganês 0,002 g/L, sulfato de magnésio 0,05 g/L, tiaminaHCl 500 ?/L, fosfato de monopotássio 0,2 g/L, ureia 0,95 g/L, pH 7,2. Uma fonte de carbono foi acrescentada ao mesmo considerando as condições de cultura. Como resultado a produção de L-ácidoglutâmico foi confirmada e os resultados de comparação são mostrados na Tabela 1.
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Tabela 1.
Comparação do crescimento e produtividade de ácido glutâmico em meio de fermentação contendo glicerol entre
Corynebacterium glutamicum SM5 e SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1.
SM5 S M5/117-cd i glpDFK-'
24h 51h 72h 120h 24h 51h 72h 120h
D.O. Glicose 30 g/L 7,73 10,15 9,36 9,72 5,94 9,92 9,0 9,89
Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 4,69 7,09 6,86 6,27 4,68 7,94 6,8 6,77
Glicerol 30 g/L 1,45 2,16 1,56 1,14 1,87 1,82 1,4 1,38
Glucose consumida (g/L) Glicose 30 g/L 10,47 30,93 30,93 30,93 8,73 30 30 30
Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 5,21 15,21 15,21 15,21 3,96 15 15 15
Glicerol 30 g/L 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Glicerol consumido (g/L) Glicose 30 g/L 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 1,46 2,3 2,30 2,30 2,15 15 15 15
Glicerol 30 g/L 2,75 3,4 4,75 4,31 3,62 6,5 8,0 7,89
Ácido glutâmico produzido (g/L) Glicose 30 g/L 0,85 6,63 6,42 6,55 1,17 11,06 11,1 11,21
Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 0,23 1,69 1,76 1,71 0,82 11,86 12,0 12,47
Glicerol 30 g/L 0,03 0 0,05 0,00 0,19 1,6 1,9 1,96
18/22
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19/22 [0051] Tal como mostrado na Tabela 1, quando o glicerol foi usado sozinho como uma fonte de carbono, o crescimento da Corynebacterium glutamicum SM5 foi muito pobre e a produtividade de ácido glutâmico foi insignificante. Ao mesmo tempo, a Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1 pode crescer até com a utilização de glicerol sozinho como uma fonte de carbono, e pode produzir o ácido glutâmico com rendimento semelhante, mesmo se a produtividade foi reduzida. Quando o glicerol foi acrescentado em conjunto com a glicose (aproximadamente 50:50), o ácido glutâmico foi produzido sem reduzir o rendimento ou a produtividade. Mas, a SM5 exibiu uma produção reduzida de ácido glutâmico.
Exemplo 6: Introdução de um gene envolvido no uso de glicerol em uma cepa produtora de lisina e produção de lisina usando o mesmo.
[0052] Para investigar se foi possível produzir não somente os materiais úteis, mas também estimular o crescimento da Corynebacteria utilizando de glicerol, o vetor de expressão pECCG117-cdi glpDFK-1 foi introduzido na Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881), uma cepa produtora de lisina, pelo mesmo modo que foi descrito no Exemplo 3.
[0053] A cepa original Corynebacterium glutamicum KFCC 10881 e KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1, as cepas da presente invenção, foram inoculadas respectivamente em frascos de cantos arredondados de 250 ml contendo 25 ml do meio de semeadura, seguido pela agitação da cultura (200 revoluções por minuto) em 30°C durante 20 horas. 1 ml da solução de cultivo de sementes foi inoculado em frascos de cantos arredondados de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção, seguido pela agitação da cultura (200 revoluções por minuto) em 30°C durante 72 horas. Quando da finalização da cultura, a produção de L-lisina foi medida com um analisador de aminoácido.
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20/22
Os níveis de L-lisina nas culturas de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1 foram investigados e os resultados são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2
Fonte de Carbono 72 horas
DO Consumo deglucose (g/L) Consumo deglicerol (g/L) Lisina
KFCC10881 Glicose 100 g/L 42,4 100,0 23,90
43,2 100,0 21,74
Glicose 50 g/L glicerol 50 g/L 32,8 50,0 0,00 13,22
32,7 50,0 0,00 13,52
KFCC 10881/Peccg117cdi glpDFK-1 Glicose 100 g/L 27,4 100,0 41,27
22,3 100,0 41,27
Glicose 50 g/L glicerol 50 g/L 34,3 50,0 50,0 28,95
33,9 50,0 50,0 30,89
[0054] Tal como mostrado na Tabela 2, quando o vetor pECCG117-cdi glpDFK-1 contido no gene envolvido no uso do glicerol foi introduzido na cepa produtora de lisina, a cepa exibiu a disponibilidade ao glicerol diferente da cepa original, e a produção de lisina foi aumentada.
Meio de Semeadura (pH 7,0):
[0055] Açúcar bruto 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, K2HPO4 8 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, biotina 100?, tiamina-HCl 1000?, pantotenato de cálcio 2000?, nicotinamida 2000? (em 1 litro de água de processo).
Meio de produção (pH 7,0):
[0056] Glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, proteína de Soja 2,5g, Sóidos de infusão de milho 5 g, ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, biotina 100?, tiamina HCl 1000?, cálcio-ácido pantotênico 2000?, nicotinamida 3000?, CaCO3 30 g (em 1 litro de água de processo).
Aplicabilidade Industrial [0057] Tal como explicado anteriormente, a presente invenção fornece um método para produção de um produto de fermentação com
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21/22 alto rendimento, utilizando eficazmente glicerol que é o subproduto da indústria do óleo e da produção de biodiesel. O micro-organismo da presente invenção pode produzir o produto de fermentação eficazmente no meio contendo uma fonte complexa de carbono compreendendo glicerol e no meio contendo glicerol sozinho como uma fonte de carbono. Desse modo, o micro-organismo capaz de produzir o produto de fermentação, baseado no micro-organismo da presente invenção, pode usar eficazmente o glicerol como uma fonte de carbono.
[0058] Os versados na técnica apreciarão que os conceitos e as modalidades específicas divulgadas na descrição precedente podem ser prontamente utilizados como uma base para modificar ou projetar outras modalidades para executar os mesmos objetivos da presente invenção. Os versados na técnica também apreciarão que tais modalidades equivalentes não fogem do espírito e do alcance da invenção tal como apresentado nas reivindicações anexas.
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22/22
TRATADO DE BUDAPESTE
SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE
MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE
PATENTES
FORMATO INTERNACIONAL
Para CJ
500 5-GA NAMDAEMEN-RO CHUNG-KU, SEOUL REPUBLICA DA COREIA
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante Escherichia coli CO02-0014 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO KCCM10834P
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar com um X quando aplicável).
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 08-01-2007 (data do depósito original)1.
AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: 361-221, Yurim B/D Hongj e-1 -dong, Seodaermun-gu SEOUL 120-091 Republic a da coreia Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Data: 08-01-2007
Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido; onde um depósito efetuado fora do Tratado de Budapeste após a aquisição do status da Autoridade Internacional de depósito é convertido em um depósito sob o Tratado de Budapeste, tal data é a data em que o microorganismo foi recebido pela Autoridade Internacional de depósito.
Formato DSMZ-BP / 4
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Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Corynebacteria, caracterizada pelo fato de que possui uma sequência de nucleotídios representada pela SEQ. ID. NO: 9 originada da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129, que é transformada com o glpDFK, um complexo gênico facilitador do uso de glicerol, em que SEQ ID NO: 9 refere-se ao complexo gênico glpDFK.
  2. 2. Corynebacteria, caracterizada pelo fato de que possui uma sequência de nucleotídios representada pela SEQ. ID. NO: 3 originada da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129, que é transformada com o glpDFK, um complexo gênico facilitador do uso de glicerol, em que SEQ ID NO: 3 refere-se ao complexo gênico glpDFK.
  3. 3. Corynebacteria, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a Corynebacteria é selecionada do grupo consistindo na Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC11112) e Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881).
  4. 4. Método para produzir um produto de fermentação utilizando glicerol, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas de: inoculação e cultivo de Corynebacteria transformada com glpDFK, o complexo gênico facilitador do uso de glicerol em um meio de cultura contendo glicerol ou uma parte de glicerol como uma fonte de carbono; e separação da cultura o produto da fermentação.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o glpDFK possui a sequência de nucleotídios representada pela SEQ. ID. NO: 9 originada da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o glpDFK possui a sequência de nucleotídios representada pela SEQ. ID. NO: 3 originada da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129.
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  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a transformação é realizada com o vetor contendo o gene glpDFK.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a transformação é realizada introduzindo um plasmídio que é obtido após a transformação de uma célula hospedeira com o vetor contendo o gene glpDFK, na Corynebacteria pelo método de pulso elétrico.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é a E. coli CO02-0014 (Registro N° KCCM 10834P).
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a Corynebacteria é selecionada do grupo consistindo na Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC-11112) e Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881).
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é o ácido glutâmico ou a lisina.
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    OD(562nm) OD(562nm)
BRPI0807802A 2007-01-24 2008-01-22 corynebacteria e método para produzir um produto de fermentação utilizando glicerol BRPI0807802B1 (pt)

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