KR102557569B1

KR102557569B1 - 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산방법

Info

Publication number: KR102557569B1
Application number: KR1020210028724A
Authority: KR
Inventors: 최종일
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2023-07-20
Also published as: KR20220124959A

Abstract

본 발명은 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)에 관한 것으로서, 상기 티로실-tRNA 합성효소는 기존에 보고된 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 대체하여 TAG 앰버 코돈(amber codon)이 포함된 단백질의 발현에 사용할 수 있으므로, 이를 효과적으로 단백질의 구조 분석 및 비천연 아미노산 함유 단백질의 생합성 등에 이용할 수 있다.

Description

메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산방법{Tyrosyl-tRNA synthetase derived from Methanosaeta concilii and method for producing protein using the same}

본 발명은 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 및 이를 이용한 단백질 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 TAG 앰버 코돈(amber codon)을 억제하며 단백질의 특정 위치에 다양한 구조의 아미노산을 결합하여 단백질의 발현에 사용할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소에 관한 것이다.

단백질은 거의 모든 생물학적 물질에 관여하지만, 그들은 동일한 20개의 공통 아미노산에서 생합성되며 질소 염기, 카르복시산, 아미드, 알코올 및 티올과 같은 공통된 기능기만을 가지고 있다. 때문에, 단백질을 이루고 있는 아미노산에 비천연 기능기를 결합할 수 있다면 단백질의 기능기 치환이나 단백질 구조의 변화 등을 가능하게 하는 강력한 도구를 제공할 수 있다.

이에 따라, 최근 이와 같은 단백질을 이루고 있는 아미노산에 비천연 기능기를 결합시키기 위한 연구가 활발히 진행되었다. Chin 등은 일반적인 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS) 대신에 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 이용하여 TAG 앰버 코돈(amber codon) 부위에 다양한 비천연 아미노산을 첨가할 수 있는 돌연변이체를 개발하여 티로신(tyrosine) 부위에 선택적으로 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)이 결합된 단백질을 생산하는 기술을 개발하였다.

일반적으로 다양한 구조의 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 발현을 위해서는 코돈들 중에서 가장 낮은 비율로 존재하는 TAG 앰버 코돈을 이용한다. 대장균에서 TAG 앰버 코돈은 약 0.3 frequency/thousand의 가장 낮은 비율로 존재하여 염색체 상의 다른 유전자의 발현에 영향을 미치지 않기 때문에 다양한 단백질에서의 특정 아미노산을 치환할 수 있는 목적지로 사용된다. TAG 앰버 코돈에 다양한 아미노산을 치환하기 위해서는 TAG 앰버 코돈을 인식할 수 있는 돌연변이 tRNA와 함께 돌연변이 tRNA에 아미노산을 결합할 수 있는 아미노아실 tRNA 합성효소(aminoacyl tRNA synthetase)가 필요하다.

이렇게 단백질을 이루고 있는 아미노산에 다양한 기능기가 포함된 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 기존의 천연 아미노산만을 포함하는 단백질에 비하여 선택적 화학반응을 통하여 단백질의 안정성을 높일 수 있었다. Lim 등은 이러한 비천연 아미노산이 포함된 단백질을 이용하여 체내에서 안전성이 증가된 유레이트 옥시다제(Urate oxidase)를 생산할 수 있는 재조합 대장균을 개발하였다.

현재까지 개발된 TAG 앰버 코돈 부위에 아미노산을 결합할 수 있는 tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소와 이로부터 얻어진 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소가 있다. 하지만, 단백질의 구조 분석이나 다양한 치환기가 포함된 단백질의 발현을 위해서는 새로운 tRNA 합성효소가 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 대장균 유전자 내에 TAG 앰버 코돈(amber codon)이 포함된 단백질을 발현하고, 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 이용하여 상기 TAG 앰버 코돈을 억제함으로써 결합된 다른 아미노산을 포함하는 단백질을 발현하는 방법을 수행할 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질 발현에 있어서 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소에 의한, 단백질에 대한 비천연 아미노산 첨가 용도에 관한 것이다.

본 발명은 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 및 이를 이용한 단백질 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 티로실-tRNA 합성효소는 TAG 앰버 코돈(amber codon)을 억제하며 단백질의 특정 위치에 다양한 구조의 아미노산을 결합하여 단백질의 발현에 사용할 수 있다.

본 발명자들은 메타노사에타 콘실리에서 유래한 신규 티로실-tRNA 합성효소가 기존에 사용되고 있는 돌연변이 tRNA를 이용하여 TAG 앰버 코돈 위치에 아미노산을 결합할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 또한 확보된 메타노사에타 콘실리에서 유래한 신규 티로실-tRNA 합성효소가 TAG 앰버 코돈을 억제할 수 있는가를 확인하기 위하여 TAG 앰버 코돈이 있는 유레이트 옥시다제(Urate oxidase)를 재조합 대장균에서 발현하여 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소이다.

본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.

상기 재조합 벡터는 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈(amber codon), 오커 코돈(ochre codon), 오팔 코돈(opal codon), 특이 코돈(unique codon), 희귀 코돈(rare codon) 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 tRNA는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소에 의해 천연 또는 비천연 아미노산이 결합되는 것일 수 있고, 상기 비천연 아미노산은 예를 들어 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서상의 용어 “벡터(vector)”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pL^λ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 일 예에서, 재조합 벡터를 숙주 세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.

상기 숙주 세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 숙주 세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 앰버 코돈을 제거한 대장균을 숙주 세포로 사용하였다. 이 경우, 숙주 세포에 대한 형질전환을 통하여 발현하고자 하는 단백질만 앰버 코돈을 가지도록 만들어 활용할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이다.

본 발명에 있어서 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것일 수 있고, 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.

상기 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.

상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법이다.

본 발명에 있어서 미생물은 대장균인 것일 수 있고, 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.

상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 형질전환 단계는 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 동일한 하나의 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있고, 또는 각각의 독립적인 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법이다.

본 발명에 있어서 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.

상기 형질전환은 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 동일한 하나의 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있고, 또는 각각의 독립적인 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 단백질은 유레이트 옥시다제(urate oxidase), 형광단백질(superfolder green fluorescent protein, sfGFP) 또는 이의 재조합체인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 단백질 발현 단계는 미생물에서 넌센스 코돈이 포함된 단백질 코딩 유전자가 발현되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 단백질 발현 단계는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 비천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 대장균에서 발현시킬 수 있는 pEVOL_Mc_tyrS_WT 플라스미드(plasmid)의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 메타노사에타 콘실리 및 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 각각 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 이용하여 TAG 앰버 코돈(amber codon)이 포함된 유레이트 옥시다제(Urate oxidase)를 생산할 수 있는 재조합 대장균 E. coli C321 deltaA OPT (pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_Mc_tyrS_WT), 및 E. coli C321 deltaA OPT (pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_pAzF)로부터 확인한 유레이트 옥시다제의 활성(U/mg protein)을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1: 메타노사에타 콘실리 유래 tRNA 합성효소의 확인

다양한 미생물에 존재하는 tRNA 합성효소(synthetase)를 클로닝하여 TAG 앰버 코돈(amber codon)을 억제할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 선별하였다. 그 결과 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소가 대장균에서 사용되는 TAG 앰버 코돈을 억제하여 단백질을 합성할 수 있는 것을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명에서 확인된 메타노사에타 콘실리 유래의 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 서열, 및 대장균에서 메타노사에타 콘실리 유래의 티로실-tRNA 합성효소의 발현을 위해 코돈(codon) 최적화를 진행한 염기서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열
1	메타노사에타 콘실리 유래 티로실-tRNA 합성효소	MDKLELVMRNTEEIVTVDELKGLLEKPSRPRAYVGYETSGKVHLGHMLTANKLLDLQRAGFDVVVLLADLHAFLNEKGTLEEVRQIADYNRDCFMALGLDPERTEFVYGTDYQLQPDFMLKILQMARNTSLNRARRSMDEVSRNAENPMVSQMIYPLMQAVDIADLKIDLAVGGIDQRKIHMLAREELPRLGLPAPVCLHTPLIPGLNGEKMSSSKGNNIAVDEPAQDVEKKIKSAFCPAKVVENNPVLAICKYHVFPRMEVGMTISRPEKFGGDVHYASYEQLEADFVSGAMHPMDLKKSCAECMIEILAPVREKMKV
2	메타노사에타 콘실리 유래 티로실-tRNA 합성효소 코딩 염기서열	AGATCTATGGACAAACTGGAACTGGTTATGCGTAACACCGAAGAAATTGTTACCGTGGATGAACTGAAAGGTCTGCTGGAAAAACCGAGCCGTCCGCGTGCCTATGTTGGTTATGAAACCAGCGGTAAAGTTCATCTGGGTCACATGCTGACCGCAAATAAACTGCTGGATCTGCAACGTGCAGGTTTTGATGTTGTTGTTCTGCTGGCCGATCTGCACGCATTTCTGAATGAAAAAGGCACCCTGGAAGAAGTTCGTCAGATTGCAGATTATAACCGCGATTGTTTTATGGCCCTGGGTTTAGATCCGGAACGTACCGAATTTGTTTATGGCACCGATTATCAGCTGCAACCGGATTTTATGCTGAAAATTCTGCAAATGGCACGTAATACCAGCCTGAATCGTGCACGTCGTAGCATGGATGAAGTTAGCCGTAATGCAGAAAATCCGATGGTTAGCCAGATGATTTATCCGCTGATGCAGGCAGTTGATATTGCCGATCTGAAAATTGATCTGGCAGTTGGTGGTATTGATCAGCGTAAAATTCACATGTTAGCCCGTGAAGAACTGCCTCGTCTGGGTCTGCCTGCACCGGTTTGTCTGCATACACCGCTGATTCCGGGTCTGAATGGTGAAAAAATGAGCAGCAGCAAAGGTAATAACATTGCAGTTGATGAACCGGCACAGGATGTGGAAAAAAAGATTAAAAGCGCATTTTGCCCTGCCAAAGTGGTTGAAAACAACCCGGTTCTGGCAATCTGTAAATATCATGTTTTTCCGCGTATGGAAGTGGGTATGACCATTAGCCGTCCGGAAAAATTTGGTGGTGATGTTCATTATGCAAGCTATGAACAGCTGGAAGCAGATTTTGTTAGCGGTGCAATGCATCCGATGGACCTGAAAAAAAGCTGTGCAGAATGCATGATTGAAATTCTGGCACCGGTTCGTGAGAAAATGAAAGTGTAACCTGCAGG

이후 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소가 포함된 재조합 대장균(Escherichia coli; E. coli)을 이용하여 TAG 앰버 코돈이 유전자 내에 위치한 유레이트 옥시다제(Urate oxidase)의 생산을 확인하는 실험을 진행하였다.

실시예 2: 메타노사에타 콘실리 유래 tRNA 합성효소 발현 재조합 대장균의 제작

메타노사에타 콘실리 유래 Mc_tyrS_WT 유전자는 메타노사에타 콘실리 균주로부터 BglII 과 PstI 제한효소 인식부위를 고려한 프라이머를 하기 표 2와 같이 제작하여 증폭시켜 준비하였다.

서열번호	명칭	서열
3	Mc_tyrS_WT-F primer	AGATCTATGGACAAACTGGAA
4	Mc_tyrS_WT-R primer	CCCTGCAGGTTACACTTTCATTTTCTC

메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii) 유래의 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 및 tRNA 쌍의 코딩 염기서열을 포함하는 플라스미드 pEVOL-pAzF(Plasmid ID: 31186)는 Addgene(Cambridge, MA)에서 구입하였다.

구체적으로, pEVOL-pAzF 플라스미드에서 메타노코커스 자나쉬아이 유래의 티로실-tRNA 합성효소가 있는 부분을 BglII 과 PstI 제한효소를 이용하여 삭제하고, 상기 BglII 과 PstI 제한효소 인식부위에 상기와 같이 증폭시킨 Mc_tyrS_WT 유전자를 삽입하여 도 1과 같이 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소가 클로닝된 pEVOL_Mc_tyrS_WT 플라스미드를 제작하였다.

메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소가 클로닝된 pEVOL_Mc_tyrS_WT 플라스미드를 E. coli C321 deltaA OPT (pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O) 균주(Addgene, MA, USA)에 삽입하고, 유레이트 옥시다제의 생산 및 활성을 확인하기 위한 형질전환체를 제작하였다. E. coli C321 deltaA OPT 균주는 Lim 등이 보고(Site-specific albumination of a therapeutic protein with multi-subunit to prolong activity in vivo, J Control Release. 2015 June 10; 207: 93-100)한 균주를 분양 받아 사용하였다.

대조군을 위하여 pEVOL_pAzF 플라스미드를 E. coli C321 deltaA OPT 균주에 삽입하였다. 형질전환을 위해 숙주세포로 E. coli C321 deltaA OPT 균주를 준비하고, 전기천공법(electrophoresis)용 컴피턴트 셀(competent cell)로 제조하였다. 제조된 컴피턴트 셀에 정제된 pEVOL_Mc_tyrS_WT 및 pEVOL_pAzF 플라스미드를 각각 공지의 방법으로 형질전환을 수행하였다.

pEVOL_Mc_tyrS_WT 플라스미드가 삽입된 재조합 균주 E. coli C321 deltaA OPT(pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_Mc_tyrS_WT)와 pEVOL_pAzF 플라스미드가 삽입된 재조합 균주 E. coli C321 deltaA OPT(pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_pAZF)로부터 유레이트 옥시다제의 발현 및 활성 측정 실험을 진행하였다.

실시예 3: 메타노사에타 콘실리 유래 tRNA 합성효소 발현 재조합 대장균의 유레이트 옥시다제 활성 비교

유레이트 옥시다제 생산균주 E. coli C321 deltaA OPT (Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_Mc_tyrS_WT)와 E. coli C321 deltaA OPT (pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_pAzF)를 이스트 추출물(yeast extract) 24 g/L, 트립톤(tryptone) 12 g/L, KH-₂PO₄2.3 g/L, K₂HPO₄12.53 g/L, 글루코스(glucose) 5 g/L가 포함된 배지 50 ml이 포함된 250 ml 배플 플라스크(baffle flask)에 250 rpm, 30℃를 유지하고, 엠피실린(ampicillin, Fisher bioreagents) 100 ug/ml, 클로람페니콜(chloramphenicol, Daejung) 35 ug/ml가 되도록 배지에 첨가하여 0.5 OD-₆₀₀에서 단백질 과발현(induction)을 진행하였다.

과발현을 위하여 IPTG(Isopropyl βSigma-Aldrich) 1 mM 및 아라비노오스(arabinose, Sigma-Aldrich) 0.2%를 첨가하였다. 아라비노오스(20%)와 IPTG(1 M) 스탁(stock)은 증류수(distilled water; DW)를 이용하여 제조하였다.

또한, 유레이트 옥시다제 생산균주 E. coli C321 deltaA OPT(Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_Mc_tyrS_WT)의 경우에는 비천연 아미노산의 도입을 위하여 배지에 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine, Chem-Impex)을 1 mM로 첨가하여 7시간 동안 단백질 과발현을 진행하였다. 4-아지도-L-페닐알라닌은 100 mM 스탁을 0.2 N NaOH 용액(solution)에 녹여 제조하였다.

과발현된 TAG 앰버 코돈이 포함된 재조합 단백질 유레이트 옥시다제의 활성을 측정하기 위하여 7시간 동안 단백질 과발현을 한 샘플의 OD₆₀₀를 10으로 맞추었다. 10 OD₆₀₀인 배양액 5 ml을 50 ml 튜브(tube)에 옮긴 후 원심분리를 통하여 상등액을 제거하고 펠렛(pellet)을 수집하였다. 수집된 펠렛은 용균 버퍼(lysis buffer, 50 mM sodium phosphate, 0.3 M NaCl, pH 7.5) 5 ml로 현탁하여 풀어주었다.

이후 소니케이터(sonicator)를 이용하여 세포 파쇄를 진행하였다. 세포 파쇄는 10% 적용(amplication)하여, 15초(sec) on, 10초 off 조건에서 5분간 진행하였다. 세포 파쇄 이후 원심분리(4000 rpm, 15 min, 4℃를 진행하여 순수한 세포파쇄 상등액을 얻었다.

세포파쇄 상등액 10 ul를 800 ul 버퍼(urate oxidase assay buffer, 50 mM Boric acid, 0.3M NaCl, pH 8.5), 90 ul 용균 버퍼(50 mM sodium phosphate, 0.3 M NaCl, pH 7.5)와 100 mg/ml 유레이트 옥시다제 용액(urate oxidase solution) 100 ul이 첨가된 반응 용액(reaction solution)에 넣어 37℃에서 10분 간격으로 요산(uric acid)의 소모량을 293 nm에서의 흡광도 값을 이용하여 간접적으로 측정하였다. 표준곡선을 위하여 요산 용액을 각각 1, 2, 5 및 10 mg/L로 첨가하여 세포파쇄 상등액을 첨가하지 않고 흡광도 값을 측정하여 얻었다.

10분 동안 변화된 흡광도 값을 이용하여 10분 동안 소모된 요산의 양을 얻어내고, 상등액 속의 단백질 농도를 분석 키트(assay kit, Pierce BCA protein Assay Kit, Thermo scientific, protocol)에 포함된 BSA 용액으로 단백질 농도에 따른 표준곡선을 제조하여 562 nm에서의 흡광도 값을 이용하여 측정하였다. 요산 용액은 0.6 M NaOH 용액을 사용하여 제조하였고, 나머지 용균 버퍼 및 유레이트 옥시다제 분석 버퍼(Urate oxidase assay buffer)는 증류수(distilled water; DW)를 이용하여 제조하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 유레이트 옥시다제 활성을 측정한 결과 기존에 보고된 E. coli C321 deltaA OPT (pQE80_Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_pAzF) 균주에서는 48 U/mg protein의 활성을 가졌으나, 본 발명에서 제작한 E. coli C321 deltaA OPT (Uox160.174amb_6hisW/O + pEVOL_Mc_tyrS_WT) 균주에서는 89 U/mg protein의 활성을 나타내었다.

이로부터 본 발명에서 제작한 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소가 클로닝된 pEVOL_Mc_tyrS_WT 플라스미드를 이용할 경우 TAG 앰버 코돈이 포함된 재조합 유레이트 옥시다제의 활성이 더 높은 것이 확인되었으며, 즉 신규한 티로실-tRNA 합성효소로 기존의 메타노코커스 자나쉬아이 유래 티로실-tRNA 합성효소를 대체함으로써 생산된 단백질의 활성이 약 1.85배 증가하였음을 입증하였다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Tyrosyl-tRNA synthetase derived from Methanosaeta concilii and method for producing protein using the same <130> PN210058 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 319 <212> PRT <213> Methanosaeta concilii <400> 1 Met Asp Lys Leu Glu Leu Val Met Arg Asn Thr Glu Glu Ile Val Thr 1 5 10 15 Val Asp Glu Leu Lys Gly Leu Leu Glu Lys Pro Ser Arg Pro Arg Ala 20 25 30 Tyr Val Gly Tyr Glu Thr Ser Gly Lys Val His Leu Gly His Met Leu 35 40 45 Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Leu Gln Arg Ala Gly Phe Asp Val Val 50 55 60 Val Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Phe Leu Asn Glu Lys Gly Thr Leu 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg Gln Ile Ala Asp Tyr Asn Arg Asp Cys Phe Met Ala 85 90 95 Leu Gly Leu Asp Pro Glu Arg Thr Glu Phe Val Tyr Gly Thr Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gln Pro Asp Phe Met Leu Lys Ile Leu Gln Met Ala Arg Asn 115 120 125 Thr Ser Leu Asn Arg Ala Arg Arg Ser Met Asp Glu Val Ser Arg Asn 130 135 140 Ala Glu Asn Pro Met Val Ser Gln Met Ile Tyr Pro Leu Met Gln Ala 145 150 155 160 Val Asp Ile Ala Asp Leu Lys Ile Asp Leu Ala Val Gly Gly Ile Asp 165 170 175 Gln Arg Lys Ile His Met Leu Ala Arg Glu Glu Leu Pro Arg Leu Gly 180 185 190 Leu Pro Ala Pro Val Cys Leu His Thr Pro Leu Ile Pro Gly Leu Asn 195 200 205 Gly Glu Lys Met Ser Ser Ser Lys Gly Asn Asn Ile Ala Val Asp Glu 210 215 220 Pro Ala Gln Asp Val Glu Lys Lys Ile Lys Ser Ala Phe Cys Pro Ala 225 230 235 240 Lys Val Val Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Ile Cys Lys Tyr His Val 245 250 255 Phe Pro Arg Met Glu Val Gly Met Thr Ile Ser Arg Pro Glu Lys Phe 260 265 270 Gly Gly Asp Val His Tyr Ala Ser Tyr Glu Gln Leu Glu Ala Asp Phe 275 280 285 Val Ser Gly Ala Met His Pro Met Asp Leu Lys Lys Ser Cys Ala Glu 290 295 300 Cys Met Ile Glu Ile Leu Ala Pro Val Arg Glu Lys Met Lys Val 305 310 315 <210> 2 <211> 974 <212> DNA <213> Methanosaeta concilii <400> 2 agatctatgg acaaactgga actggttatg cgtaacaccg aagaaattgt taccgtggat 60 gaactgaaag gtctgctgga aaaaccgagc cgtccgcgtg cctatgttgg ttatgaaacc 120 agcggtaaag ttcatctggg tcacatgctg accgcaaata aactgctgga tctgcaacgt 180 gcaggttttg atgttgttgt tctgctggcc gatctgcacg catttctgaa tgaaaaaggc 240 accctggaag aagttcgtca gattgcagat tataaccgcg attgttttat ggccctgggt 300 ttagatccgg aacgtaccga atttgtttat ggcaccgatt atcagctgca accggatttt 360 atgctgaaaa ttctgcaaat ggcacgtaat accagcctga atcgtgcacg tcgtagcatg 420 gatgaagtta gccgtaatgc agaaaatccg atggttagcc agatgattta tccgctgatg 480 caggcagttg atattgccga tctgaaaatt gatctggcag ttggtggtat tgatcagcgt 540 aaaattcaca tgttagcccg tgaagaactg cctcgtctgg gtctgcctgc accggtttgt 600 ctgcatacac cgctgattcc gggtctgaat ggtgaaaaaa tgagcagcag caaaggtaat 660 aacattgcag ttgatgaacc ggcacaggat gtggaaaaaa agattaaaag cgcattttgc 720 cctgccaaag tggttgaaaa caacccggtt ctggcaatct gtaaatatca tgtttttccg 780 cgtatggaag tgggtatgac cattagccgt ccggaaaaat ttggtggtga tgttcattat 840 gcaagctatg aacagctgga agcagatttt gttagcggtg caatgcatcc gatggacctg 900 aaaaaaagct gtgcagaatg catgattgaa attctggcac cggttcgtga gaaaatgaaa 960 gtgtaacctg cagg 974 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mc_tyrS_WT-F primer <400> 3 agatctatgg acaaactgga a 21 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mc_tyrS_WT-R primer <400> 4 ccctgcaggt tacactttca ttttctc 27

Claims

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티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여, 상기 미생물에서 넌센스 코돈이 포함된 유레이트 옥시다제(urate oxidase) 코딩 유전자를 발현시키는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법.
제7항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 단백질 생산방법.
제7항에 있어서, 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것인, 단백질 생산방법.
제7항에 있어서, 단백질 발현 단계는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 단백질 생산방법.
제10항에 있어서, 비천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것인, 단백질 생산방법.