KR20200089734A

KR20200089734A - 뉴클레아제 시스템의 녹-아웃에 의한 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20200089734A
Application number: KR1020207018328A
Authority: KR
Inventors: 민 구오; 링슈안 지앙; 쮸시아 쩽; 쉬에 유
Original assignee: 강마-헬스코드 (상하이) 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2020-07-27
Also published as: WO2019100456A1; KR102345759B1; EP3715462A4; CN108949801B; EP3715462A1; JP2021503951A; JP7093417B2; CN108949801A; US20230192781A1

Abstract

몇몇의 뉴클레아제 중 5개의 뉴클레아제를 스크리닝 하고, 5개의 뉴클레아제 중 하나(예컨대, EXN53)에 대해 하향조절 또는 녹-아웃을 수행하는 것을 포함하는, 뉴클레아제 시스템의 녹-아웃에 의해 시험관 내 생합성 활성을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 시험관 내 단백질 합성 시스템의 핵산의 안정성 및 단백질 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

뉴클레아제 시스템의 녹-아웃에 의한 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위한 방법

본 발명은 생명 공학 분야에 관련된 것으로, 더욱 바람직하게는, 뉴클레아제 시스템(nuclease system)의 녹-아웃(knocking-out)에 의한 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.

세포에서 단백질은 중요한 분자이고, 세포의 거의 모든 기능의 수행한다. 단백질의 서열 및 구조는 그 기능을 결정한다. 세포에서, 단백질은 다양한 생화학 반응을 촉매하는 효소로서 작용할 수 있으며, 유기체의 다양한 활동을 조절(coordinate)하기 위한 신호 분자로서 작용할 수 있다. 단백질은 생물 형태를 지지할 수 있고, 에너지를 저장할 수 있으며, 분자를 운반할 수 있고, 유기체가 움직일 수 있게 한다. 생물의약품 분야에서, 표적 약물인 항체(일종의 단백질)는 암 및 다른 질병을 치료하기 위한 중요한 수단이다^[1][2].

세포에서, 단백질 번역의 조절은 영양 결핍과 같은 외부 압력에 반응할 뿐만 아니라 세포 발달 및 분화와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 한다. 단백질 번역은 4 과정으로 나뉘는데, 번역 개시, 번역 신장(번역 연장), 번역 종결 및 리보솜 재순환을 포함하고, 이 중에서 번역 개시는 가장 규제되는 과정이다^[3]. 번역의 개시 단계에서, 리보솜의 소단위(40S)는 (tRNA)_i ^Met에 결합하고, 번역 개시 인자의 도움으로 mRNA의 5' 부분을 인식한다. 소단위는 다운스트림(downstream)으로 이동한 다음, 리보솜 복합체를 형성하기 위해 개시 코돈(ATG)의 위치에 있는 리보솜 대단위(60S)에 결합한다. 그 후, 번역 신장 단계가 시작된다^[4].

시험관 내 생합성 시스템(in vitro biosynthesis system)은 박테리아, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포에 기반한 용해 시스템을 나타내며, 핵산 DNA, RNA, 기질 및 에너지원이 추가되어 특정 화학 분야 또는 생체 거대 분자(biomacromolecules)(DNA, RNA 및 단백질)의 번역을 빠르고 효율적으로 완료한다. 일반적으로 이용되는 시험관 내 생합성 시스템은 시험관 내 단백질 합성 시스템(in vitro protein synthesis system)으로서, 이는 외래성 재조합 단백질의 신속하고 효율적인 번역을 달성하기 위해 외래성 mRNA 또는 DNA 주형 및 세포 용해물 사용한다^[5].

최근, 상업적으로 이용가능하고 일반적으로 이용되는 시험관 내 단백질 합성 시스템은 시험관 내 전사-번역 시스템(in vitro transcription-translation system)(IVTT 시스템으로 약칭됨)으로, 이는 RNA 중합 효소를 통해 DNA 주형을 mRNA 중간체로 전사한 다음, 아미노산, ATP 등을 포함한 성분(component)을 이용함으로써 외래성 단백질의 효율적인 번역 1 단계를 완료한다. 일반적으로 이용되는 상업적인 시험관 내 단백질 발현 시스템은 대장균 추출물(Escherichia coli extract, ECE)시스템, 토기 망상 적혈구 용해물(rabbit reticulocyte lysate, RRL) 시스템, 밀 배아 추출물(wheat germ extract, WGE) 시스템, 곤충 추출물(insect cell extract, ICE) 시스템 및 인간 자원 시스템을 포함한다.

mRNA 및 DNA의 핵산은 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 기질을 암호화(coding)하고, 그들의 안정성은 단백질의 수율에 영향을 미친다. 뉴클레아제(nuclease)는 핵산 분해의 1단계에서 뉴클레오타이드(nucleotide) 사이의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합을 가수 분해하는 단백질의 일종이다. RNA에만 작용하는 몇몇의 뉴클레아제는 리보뉴클레아제(ribonuclease)(RNase)로 알려져 있으며, DNA에만 작용하는 몇몇의 뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제(deoxyribonucleases)(DNase)로 알려져 있다. 작용 부위(action site)에따라뉴클레아제는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 카테고리로 분류될 수 있다. 세포에서 RNA 대다수는 세포질 및 세포핵에서 5'에서 3' 엑소뉴클레아제에 의해 분해되거나, 세포질 및 세포핵에서 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 단백질 서브유닛 복합체 엑소좀에(exosome) 의해 분해된다.

CRISPR/Cas (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated)는 박테리아와 고세균에 널리 존재하는 생물학적 방어 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템 중에서, 변형 유형 II 시스템(CRISPR/Cas9)은 게놈 변형을 위해 널리 사용되는 도구가 되었다. 가이드RNA (gRNA)의 가이드에 따라, Cas9단백질은 게놈에서 프로토스페이서 인근 모티브(protospacer adjacent motif)(PAM) 및 이의 업스트림(upstream)20bp 서열을 인식하고, PAM의 3번째(3^rd)bp업스트림의 위치에 이중 가닥 닉(nick)을 생성한다. 공여체DNA(donor DNA)가 제공되는 동안의 경우, CRISPR/Cas9 이중 가닥에 의해 절단된 유전자는 유전자 변형의 목적을 달성하기 위해 HDR 방식으로 새로운 서열과 통합적으로(incorporatively) 재조합 될 수 있다. 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)와 관련하여, 유전자 포인트 돌연변이, 유전자 녹-아웃 및 유전자 삽입을 포함하여 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 게놈 변형의 많은 예가 있다.

현재의 시험관내 합성 시스템에는 일부 뉴클레아제가 존재할 수 있다. 이러한 뉴클레아제는, 시험관 내 합성 시스템에서 mRNA 및 DNA를 분해함으로써 시험관 내 합성 시스템에서 핵산의 안정성에 영향을 미칠 수 있다.

Ayyar, B.V., S. Arora, and R. O'Kennedy, Coming-of-Age of Antibodies in Cancer Therapeutics. Trends PharmacolSci, 2016. 37(12): p. 1009-1028. Scott, A.M., J.D. Wolchok, and L.J., Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer, 2012. 12(4): p. 278. Sonenberg, N. and A.G. Hinnebusch, ReguLation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell, 2009. 136(4): p. 731-45. M., D.J.R.G., Nucleic Acid. Encyclopedia of Cell Biology, Elsevier, 2015. Chong, S., Overview of Cell-Free Protein Synthesis: Historic Landmarks, Commercial Systems, and Expanding Applications. 2014: John Wiley & Sons, Inc. 16.30.1-16.30.11.

따라서, 당업계에서는 핵산을 안정화시킴으로써 외래성 단백질의 안정한 발현을 달성하기 위한 방법을 개발하는 것이다.

본 발명의 목적은 핵산을 안정화함으로써 외래성 단백질의 안정적 발현을 달성하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템을 제공한다:

(a) 효모 세포 추출물

(b) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)

(c)선택적(optional) 외래성 수크로오스; 및

(d) 선택적(optional) 용매, 용매는 물 또는 수용성 용매,

상기에서, 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하이다.

다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 0이다.

다른 바람직한 실시예에서, EXN53은 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효모 소스로부터 유래된 것이며, 바람직하게는 클루이베로마이세스로부터 유래된 것이다.

다른 바람직한 실시예에서, 클루이베로마이세스는 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및/또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, EXN53 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(SEQ ID NO.:1.)로 나타내었다.

다른 바람직한 실시예에서, EXN53 단백질의 단백질 서열은 서열번호 6(SEQ ID NO.:6.)으로 나타내었다.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 다음 그룹으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함한다:

(e1) RNA합성을 위한 기질;

(e2) 단백질 합성을 위한 기질;

(e3) 마그네슘 이온;

(e4) 칼륨 이온;

(e5) 버퍼(buffer);

(e6) RNA 중합효소; 및

(e7) 에너지 재생(regeneration) 시스템.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 다음 그룹으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함한다:

(e8) 헴(heme); 및

(e9) 스퍼미딘(spermidine).

다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포는 피히아 파스토리스, 클루이베로마이세스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효모 소스로부터 유래된 것이고; 바람직하게는 클루이베로마이세스를 포함하는 효모세포, 및 더욱 바람직하게는클루이베로마이세스 막시아누스 및/또는 클루이베로마이세스 락티스로부터 유래된 것이다.

다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포 추출물은 효소 세포의 수용성 추출물(aqueous extract)이다.

다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포 추출물은 효모 내인성 장쇄 핵산 분자를 포함하지 않는다.

다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법을 이용함으로써 준비된다:

(i) 효모 세포를 준비하는 단계;

(ii) 효모 세포를 세척하여 세척된 효모 세포를 수득하는 단계;

(iii) 세척된 효모 세포를 세포 용해 처리제로 처리하여 효모 조추출물을 수득하는 단계; 및

(iv) 효모 조추출물을 고액분리(solid-liquid separation)를 통해 액상층, 즉, 효모 세포 추출물을 수득하는 단계.

다른 바람직한 실시예에서, 고액 분리법은 원심분리를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 원심분리는 액상 상태에서 수행한다.

다른 바람직한 실시예에서, 원심분리 조건은 5,000×g-100,000xg, 더욱 바람직하게는8,000×g-30,000×g이다.

다른 바람직한 실시예에서, 원심분리 시간은 0.5시간 내지 2시간, 더욱 바람직하게는20분 내지50분이다.

다른 바람직한 실시예에서, 원심분리는 1-10℃, 더욱 바람직하게는 2-6℃에서 수행한다.

다른 바람직한 실시예에서, 세척 처리제는 pH7-8(바람직하게는 pH7.4)의 세척 용액을 이용하여 수행한다.

다른 바람직한 실시예에서, 세척 용액은 포타슘 4-하이드록시에틸피페라진 에탄설폰산(potassium 4-hydroxyethylpiperazine ethanesulfonate), 아세트산 칼륨(potassium acetate), 아세트산 마그네슘(magnesium acetate) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 세포 용해 처리를 위한 방법은 고압용해 및 동결 융해(예를 들어, 저온의 액화질소에서 처리)용해를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, RNA를 합성하기 위한 기질은 뉴클레오시드 1 인산, 뉴클레오시드 3 인산 및 이들의 조합을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질을 합성하기 위한 기질은 천연 아미노산 1 내지 20종, 및 비천연 아미노산을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 마그네슘 이온은 마그네슘 이온 소스로부터 유래하고, 마그네슘 이온 소스는아세트산 마그네슘, 글루탐산 마그네슘(magnesium glutamate) 또는 이들의 조합이다.

다른 바람직한 실시예에서, 칼륨 이온은 칼륨 이온 소스로부터 유래하고, 칼륨 이온 소스는 아세트산 칼륨, 글루탐산 칼륨(potassium glutamate) 또는 이들의 조합이다.

다른 바람직한 실시예에서, 에너지 재생 시스템은 포스포크레아틴/포스포크레티나아제(phosphocreatine/phosphocreatinase) 시스템, 해당작용(glycolysis) 경로및 이의 중간 생성물 에너지 시스템 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 (f1) 합성 tRNA를 더 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 버퍼는 4-하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산(4-hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 단백질 합성을 가이드 하기 위한 (g1) 외래성 DNA 분자를 더 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, DNA 분자는 선형이다.

다른 바람직한 실시예에서, DNA 분자는 원형이다.

다른 바람직한 실시예에서, DNA 분자는 외래성 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 단백질을 암호화하는 서열은 게놈 서열 및 cDNA서열을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 단백질을 암호화하는 서열은 프로모터 서열, 5' 비번역 서열(untranslated sequence), 및/또는 3' 비번역 서열을 더 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 4-하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산, 아세트산 칼륨, 아세트산 마그네슘, 뉴클레오시드 3 인산, 아미노산, 크레아틴인산(creatine phosphate)(포스포크레아틴)(phosphocreatine), 디티오트레이톨(dithiothreitol)(DTT), 크레아틴포스포키나아제(creatine phosphokinase)(포스포크레아티나아제(phosphocreatinase)), RNA 중합효소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 PEG3000, PEG8000, PEG6000, PEG3350 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 분자량이 200-10,000 Da인 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 분자량이 3,000-10,000 Da인 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 성분 (a)의 농도(v/v)는 단백질 합성 시스템의 총 부피 대비 20% 내지 70%, 바람직하게는 30% 내지 60%, 더욱 바람직하게는 40% 내지 50% 이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 성분 (b)의 농도(w/v, 예를 들어 g/mL)는 0.1% 내지 8%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 및 더욱 바람직하게는 1% 내지 2%이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 성분 (c)의 농도는 단백질 합성 시스템의 총 부피 대비 0.2% 내지 4%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 및 더욱 바람직하게는 0.5% 내지 1% 이다.

다른 바람직한 실시예에서, 뉴클레오시드 3인산은 아데노신 삼인산(ATP), 구아노신 삼인산(GTP), 사이티딘 삼인산(CTP), 우리딘 삼인삼(UTP), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 성분 (e1)의 농도는 0.1 mM 내지 5mM, 바람직하게는 0.5 mM 내지 3 mM, 및 더욱 바람직하게는 1 mM 내지 1.5 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 아미노산은 D-유형 아미노산 및/또는 L-유형 아미노산을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, (e2)성분의 농도는 0.01 mM 내지 0.48 mM, 바람직하게는 0.04 mM 내지 0.24 mM, 더욱 바람직하게는 0.04 mM 내지 0.2, 및 가장 바람직하게는 0.08 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, (e3)의 농도는 1 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 5 mM, 및 더욱 바람직하게는 2 mM 내지 4 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, (e4) 성분의 농도는 30mM 내지 210 mM, 바람직하게는 30 mM 내지 150 mM, 및 더욱 바람직하게는 30 mM 내지 60 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서,(e6)성분의 농도는 0.01 mg/mL 내지 0.3 mg/mL, 바람직하게는 0.02 mg/mL 내지 0.1 mg/mL 및 더욱 바람직하게는 0.027 mg/mL 내지 0.054 mg/mL이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 4-하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산의농도는 5 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 15 mM 내지 30 mM, 및 더욱 바람직하게는 20 mM 내지 25 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 아세트산 칼륨의 농도는 20 mM 내지 210 mM, 바람직하게는 30 mM 내지 210 mM, 더욱 바람직하게는 30 mM 내지 150 mM, 및 더욱 바람직하게는 30 mM 내지 60 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 아세트산 마그네슘의 농도는 1 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 5 mM, 및 더욱 바람직하게는 2 mM 내지 4 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 포스포크레아틴의 농도는 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM, 및 더욱 바람직하게는 25 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 헴의 농도는 0.01 mM 내지 0.1 mM, 바람직하게는 0.02 mM 내지 0.08 mM, 더욱 바람직하게는 0.03 mM 내지 0.05 mM, 및 가장 바람직하게는 0.04 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 스퍼미딘의 농도는 0.05 mM 내지 1 mM, 바람직하게는 0.1 mM 내지 0.8 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 mM 내지 0.5 mM, 더욱 바람직하게는 0.3 mM 내지 0.4 mM, 및 가장 바람직하게는 0.04 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 디티오트레이톨(DTT)의 농도는 0.2 mM 내지 15 mM, 바람직하게는 0.2 mM 내지 7 mM, 및 더욱 바람직하게는 1 mM 내지 2 mM이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, 크레아틴포스포키나아제의 농도는 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL, 바람직하게는 0.2 mg/mL 내지 0.5 mg/mL, 및 더욱 바람직하게는 0.27 mg/mL이다.

다른 바람직한 실시예에서, 단백질 합성 시스템에서, T7 RNA중합효소의 농도는 0.01 mg/mL 내지 0.3 mg/mL, 바람직하게는 0.02 mg/mL 내지 0.1 mg/mL, 및 더욱 바람직하게는 0.027 mg/mL 내지 0.054 mg/mL이다.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 시험관 내 합성 시스템은 다음의 특성을 갖는다:

합성 시스템에서, 합성된 단백질의 총량은 합성 시스템의 밀리 리터당(mL)3μg의 단백질에 도달한다.

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 다음 성분을 포함한다:

다른 바람직한 실시예에서, 무세포 단백질 합성 시스템은 또한 다음 성분을 포함한다:

다른 바람직한 실시예에서, PEG는 PEG3350, PEG3000, 및/또는 PEG8000로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서,RNA 중합효소는 T7 RNA중합효소이다.

두 번째 측면에 따르면, 본 발명은 효모 세포 추출물을 제공하고,상기 효모 세포 추출물은 EXN53 단백질을 포함하고, 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 및 더욱 바람직하게는 2% 이하이다.

세 번째 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 제작하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 효모 세포 추출물, (b) 폴리에틸렌 글리콜, (c) 선택적 외래성 수크로오스, 및 (d) 선택적 용매 성분을 혼합하여본 발명의 첫 번째 측면에 따른 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 수득하고, 상기 용매는 물 또는 수용성 용매이고; 효모 세포 추출물은 EXN53 단백질을 포함하고, 및 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하이다.

다른 바람직한 실시예에서,단백질 합성 시스템에서, (a) 성분의 농도(v/v)는 단백질 합성 시스템의 총 부피 대비 20% 내지 70%, 바람직하게는 30% 내지 60%, 및 더욱 바람직하게는 40% 내지 50%이다.

다른 바람직한 실시예에서,단백질 합성 시스템에서,(b) 성분의 농도(w/v, 예를 들어 g/mL)는 0.1% 내지 8%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 및 더욱 바람직하게는 1% 내지 2%이다.

본 발명의 네 번째 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는 단백질의 시험관 내 합성 방법을 제공한다:

(i) 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 준비하고, 및 가이드 단백질 합성을 위한 외래성 DNA 분자를 첨가하는 단계로서, 상기 단백질 합성 시스템에서, EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 및 더욱 바람직하게는 2% 이하이고; 및

(ii) 단계 (i)에서 제공된 단백질 합성 시스템을 적합한 조건 하에서 T1 기간 동안 인큐베이션하여 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질을 합성하는 단계.

다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 (iii) 단백질 합성 시스템으로부터 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질을 선택적으로, 분리 또는 검출하는 단계를 더 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 DNA는 원핵 생물 또는 진핵 생물로부터 유래된 것이다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 DNA는 동물, 식물 또는 병원체로부터 유래된 것이다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 DNA는 포유동물, 바람직하게는 인간, 마우스 및 래트를 포함하는 영장류 또는 설치류로부터 유래된 것이다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 단백질의 암호화 서열은 루시페린, 또는 루시페라아제 (예: 반딧불이 루시페라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역, 루시페라아제 돌연변이, α-아밀라아제, 엔테로신 A, C형간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 전구체, 인터페론 αA, 인터루킨-1β, 라이소자임, 혈청 알부민, 항체의 단쇄가변분절 (scFv), 트란스타이레틴, 티로시나아제, 자일라나아제및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 외래성 단백질을 코딩한다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 단백질은 루시페린, 또는 루시페라아제 (예: 반딧불이 루시페라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역, 루시페라아제 돌연변이, α-아밀라아제, 엔테로신 A, C형간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 전구체, 인터페론 αA, 인터루킨-1β, 라이소자임, 혈청 알부민, 항체의 단쇄가변분절 (scFv), 트란스타이레틴, 티로시나아제, 자일라나아제및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 DNA는 루시페린, 또는 루시페라아제 (예: 반딧불이 루시페라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역, 루시페라아제 돌연변이, α-아밀라아제, 엔테로신 A, C형간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 전구체, 인터페론 αA, 인터루킨-1β, 라이소자임, 혈청 알부민, 항체의 단쇄가변분절 (scFv), 트란스타이레틴, 티로시나아제, 자일라나아제및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 외래성 단백질을 코딩한다.

다른 바람직한 실시예에서, 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질은 루시페린, 또는 루시페라아제 (예: 반딧불이 루시페라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역, 루시페라아제 돌연변이, α-아밀라아제, 엔테로신 A, C형간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 전구체, 인터페론 αA, 인터루킨-1β, 라이소자임, 혈청 알부민, 항체의 단쇄가변분절 (scFv), 트란스타이레틴, 티로시나아제, 자일라나아제및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, (ii) 단계에서, 반응 온도는 20 °C 내지 37 °C, 바람직하게는 20 °C 내지 25 °C이다.

다른 바람직한 실시예에서,(ii) 단계에서,반응 시간은 1 내지 6 시간, 바람직하게는 2 내지 4 시간이다.

다섯 번째 측면에 따르면, 본 발명은 엔지니어링 균주(engineering strain)를 제공하며, 상기 엔지니어링 균주는 클루이베로마이세스 균주이고, 엔지니어링 균주에서 EXN53 유전자(뉴클레아제 유전자)의 발현 수준 또는 활성은 감소된다.

다른 바람직한 실시예에서,용어 “감소된”은 EXN53 유전자의 발현 수준이 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2%이하인 것을 의미한다.

다른 바람직한 실시예에서, 용어 “감소된”은 EXN53 유전자의 발현 수준 또는 활성의 감소가 다음 조건을 만족함을 의미한다:

A1 내지 A0의 비율은 30% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 2% 미만, 및 가장 바람직하게는 0 내지 2%이고;

상기 A1은 EXN53 유전자의 발현 수준 또는 활성에 상응하고; A0는 야생형 EXN53 유전자의 발현 수준 또는 활성에 상응한다.

다른 바람직한 실시예에서, 균주에서 EXN53유전자(뉴클레아제 유전자)의 발현 수준 및 활성은 유전자 돌연변이, 유전자 녹-아웃, 유전자 파괴, RNA 간섭 기술, 크리스퍼(Crispr) 기술 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 이용함으로써 감소된다.

여섯 번째 측면에 다르면, 본 발명은 시험관 내 단백질 합성의 효율성을 개선하기 위한 본 발명의 다섯 번째 측면에 따른 엔지니어링 균주의 용도를 제공한다.

본 발명의 범위 내에서, 상기에서 언급된 기술적 특징과 이하에서 구체적으로 설명되는 기술적 특징(예를 들어, 실시예 또는 예시)이 서로 조합 될 수 있으며, 이로서 새로운 또는 바람직한 기술적 해결책을 형성 할 수 있음을 이해해야한다. 간략화를 위해, 본 명세서에서는 세부 사항이 반복되지 않을 것이다.

1. 본 발명은 핵산의 안정성을 개선하기 위하여 시스템에서 뉴클레아제의 함량을 감소시키고, K. lactis 게놈에서 뉴클레아제 유전자에 대한 조직적 분석 및 특이적 변형을 수행함으로써 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위해 보편적으로 이용되는 기술적 경로 및 방법을 제공한다.

2. 본 발명에서, 대량의 뉴클레아제로부터 뉴클레아제를 스크리닝 하기 위해 많은 노력을 기울였으며, 처음으로 많은 뉴클레아제로부터 5개의 뉴클레아제를 스크리닝 하였다. 놀랍게도, 5개의 뉴클레아중 하나인 EXN53의 하향 조절 또는 녹-아웃은 핵산의 안정성을 개선할 수 있으며, 시험관 내 단백질 합성 시스템의 단백질 생산의 효율을 크게 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다. 놀랍게도, EXN53의 하향조절 또는 녹-아웃 후에, IVTT시스템에서 ΔKLEXN53효모 균주의 루시페라아제 활성은 야생형 균주의 루시페라아제 활성의 2배 이상(예컨대, 2.46배)이다.

3. 시험관 내 단백질 합성 활성을 유의하게 증가시킬 수 있는 K. lactis 균주가 본 발명에서 처음으로 제공되었다.

도 1은 K. lactis게놈에서 분석을 수행하고 뉴클레아제 유전자를 특이적으로 변형시킴을 통해 시험관 내 생합성 시스템에서 뉴클레아제를 하향조절 함으로써 핵산의 안정성을 개선시키기 위한 설계 경로를 나타낸다. (A) K. lactis 야생형 세포. (B) 뉴클레아제가 변형된 K. lactis 세포 (c) 뉴클레아제가 변형된 K. lactis 세포의 용해물을 수집한다.(d) 효모 세포 용액은 유전자 특이적으로 변형된 효모 균주이고, 상기 용액은 보다 안정적인 핵산의 특징을 갖는다.효모 세포 용액은 향상된 시험관 내 생합성 시스템을 제조하는데 이용된다.
도 2는 K. lactis게놈에서 61개의 모든 뉴클레아제 유전자의 분포 및 기능 분석을 나타낸다. A-F는 K. lactis의 여섯 개의 염색체에 해당하고; 상기 A 염색체에 위치한 뉴클레아제 유전자는 KLSEN54, KLDNA2, KLTRM2, KLFCF1, KLDOM34, KLRAD2, KLRNH70, KLDIS3 및 KLNPP1이고; B염색체에 위치한 뉴클레아제 유전자는 KLOGG1이며; C 염색체에 위치한 뉴클레아제 유전자는 KLPOL2, KLRAD50, KLYSH1, KLRCL1, KLNGL2, KLMRE11, KLPOP3, KLMKT1, KLAPN1, KLRPP1 및 KLPOP2이고; D 염색체에 위치한 뉴클레아제 유전자는 KLNUC1, KLRPP6, KLDBR1, KLRPS3, KLRPM2, KLSUV3, KLRAD1, KLIRE1 및 KLPOP1이며; E 염색체에 위치한 뉴클레아제 유전자는 KLPOL3, KLDXO1, KLMUS81, KLPAN3, KLAPN2, KLRAI1, KLEXO1, KLREX4, KLPAN2 및 KLLCL3 이고; F유전자에 위치한 뉴클레아제 유전자는 KLRAD17, KLPOP4, KLPOP5, KLRAD27, KLRNH201, KLVMA1, KLRAT1, KLNGL1, KLREX2, KLPOL31, KLCCR4, KLTRZ1, KLSEN2, KLREX3, KLSWT1, KLEXN53, KLRNT1, KLSEN15, KLNTG1, KLNOB1 및 KLDDP1이다.
도 3은 유전자 변형되고, CRISPR 시스템설계 경로에 해당하는 K. lactis 게놈에서 다섯 개의 뉴클레아제 유전자의 서열을 나타낸다. 공여체DNA의 두 개의 상동성 암(homologous arms), 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 녹-아웃될 뉴클레아제 유전자의 ORF의 약 1,000 bp 업스트림 및 다운스트림에 위치한 유전자 서열이며; 뉴클레아제 유전자의 ORF의 5' 말단 및 3' 말단에서 PAM 서열을 각각 인식하여 동시에 녹-아웃 되도록 하고, Cas9 뉴클레아제가 부위-특이적 방식으로 DNA를 절단하도록 안내하는, 두 개의 gRNA를 제작한 다음DSB (double-strand break) (이중-가닥 절단)가 발생한 후 상동성 재조합이 일어남으로써 유전자 녹-아웃이 달성된다.
도 4는 K. lactis 게놈에서 다섯 개의 뉴클레아제 단백질 도메인의 개략도를 나타낸다.
도 5는 KLEXN53 단백질 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)에서 상동성 단백질 ScEXN53 (KEGG No :: YGL173C) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)에서 KLEXN53 단백질 및 상동성 단백질 SpEXO2 (KEGG No :: SPAC17A5.14) 사이의 아미노산 서열 일부와, 또한 호모 사피엔스(Homo sapiens)에서 KBEN53 단백질 및 상동성 단백질 HsEXN53 (KEGG No :: 54464) 사이의 아미노산의 일부를 각각 비교한 것을 나타내는 것으로, 상기에서 활성 부위는 #으로 표시된다.
도 6은 KlDIS3 단백질및 사카로마이세스 세레비제에서 상동성 단백질 ScDIS3 (KEGG No.: YOL021C) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 스키조사카로마이세스 폼베에서 KlDIS3 단백질 및 상동성 단백질 SpDIS3 (KEGG No.:SPBC26H8.10) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 또한 호모 사피엔스에서 KlDIS3 단백질 및 상동성 단백질 HsDIS3 (KEGG No.: 22894) 사이의 아미노산 서열의 일부를 각각 비교한 것을 나타내는 것으로, 상기에서 활성 부위는 #으로 표시된다.
도 7은 KLRAT1 단백질 및 사카로마이세스 세레비제에서 상동성 단백질 ScRAT1 (KEGG No.: YOR048C) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 스키조사카로마이세스 폼베에서 KLRAT1 단백질 및 상동성 단백질 SpRAT1 (KEGG No.: SPAC26A3.12c)사이의 아미노산 서열의 일부와, 또한 호모 사피엔스에서 KLRAT1 단백질 및 상동성 단백질 HsRAT1 (KEGG No.: 22803) 사이의 아미노산 서열의 일부를 각각 비교한 것을 나타내는 것으로, 상기에서 활성 부위는 #으로 표시된다.
도 8은 KLRRP6 단백질 및 사카로마이세스 세레비제에서 상동성 단백질 ScRRP6 (KEGG No.: YOROO1W) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 스키조사카로마이세스 폼베에서 KLRRP6 단백질 및 상동성 단백질 SpRRP6 (KEGG No.: SPAC1F3.01) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 또한 호모 사피엔스에서 KLRRP6 단백질 및 상동성 단백질 HsRRP6 (KEGG No.: 5394) 사이의 아미노산 서열의 일부를 각각 비교한 것을 나타내는 것으로, 상기에서 활성 부위는 #으로 표시된다.
도 9는 KLNGL2 단백질 및 사카로마이세스 세레비제에서 상동성 단백질 ScNGL3 (KEGG No.: YML118W) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 스키조사카로마이세스 폼베에서 KLNGL2 단백질 및 상동성 단백질 SpNGL2 (KEGG No.: SPBC9B6.11c) 사이의 아미노산 서열의 일부와, 또한 호모 사피엔스에서 KLNGL2 단백질 및 상동성 단백질 HsANGEL2 (KEGG No.: 90806) 사이의 아미노산 서열의 일부를 각각 비교한 것을 나타낸다.
도 10은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLEXN53-1&2의 플라스미드 프로파일을 나타낸다.KLEXN53의 gRNA1 및 gRNA2는 각각 tRNA-Tyr 프로모터 및 SNR52 터미네이터를 갖는KLEXN53 유전자의 ORF의 5'-말단 및 3'-말단에서의 두 개의 gRNA이다. PMZ374-cas9은 최적화된 cas9이다. 플라스미드에는kana 선별 마커가 있다.
도 11은 KLEXN53-DD1-pMD18의 플라스미드 프로파일이다. 상동성 암1 (homologous arm 1) 및 상동성 암2 (homologous arm 2)는 각각 KLEXN53유전자의 ORF의 약 1000 bp 업스트림 및 다운스트림에서의 유전자 서열이다. 플라스미드에는 Amp 선별 마커가 있다.
도 12는 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLDIS3-1&2의 플라스미드 프로파일이다. KLDis3의 gRNA1 및 gRNA2는 각각 tRNA-Tyr 프로모터 및 SNR52 터미네이터를 갖는KLDis3 유전자의 ORF의 5'-말단 및 3'-말단에서의 두 개의 gRNA이다. PMZ374-cas9은 최적화된 cas9이다. 플라스미드에는 kana 선별 마커가 있다.
도 13은 KLDIS3-DD1-pMD18의 플라스미드 프로파일이다.상동성 암 1 (homologous arm 1) 및 상동성 암 2 (homologous arm 2)는 각각 KLDis3유전자의 ORF의 약 1000 bp 업스트림 및 다운스트림에서의 유전자 서열이다. 플라스미드에는 Amp 선별 마커가 있다.
도 14는 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRat1-1&2의 플라스미드 프로파일이다. KLRat1의 gRNA1 및 gRNA2는 각각 tRNA-Tyr 프로모터 및 SNR52 터미네이터를 갖는 KLRat1유전자의 ORF의 5'-말단 및 3'-말단에서의 두 개의 gRNA이다. PMZ374-cas9은 최적화된 cas9이다. 플라스미드에는 kana 선별 마커가 있다.
도 15는 KLRat1-DD1-pMD18의 플라스미드 프로파일이다. 상동성 암 1(homologous arm 1) 및 상동성 암 2(homologous arm 2)는 각각 KLRat1유전자의 ORF의 약 1000 bp 업스트림 및 다운스트림에서의 유전자 서열이다. 플라스미드에는 Amp 선별 마커가 있다.
도 16은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRrp6-1&2의 플라스미드 프로파일이다. KLRrp6의 gRNA1 및 gRNA2는 각각 tRNA-Tyr 프로모터 및 SNR52 터미네이터를 갖는 KLRrp6유전자의ORF의 5'-말단 및 3'-말단에서의 두 개의 gRNA이다. PMZ374-cas9은 최적화된 cas9이다. 플라스미드에는 kana 선별 마커가 있다.
도 17은 KLRrp6-DD1-pMD18의 플라스미드 프로파일이다. 상동성 암1(homologous arm 1) 및 상동성 암2(homologous arm 2)는 각각 KLRrp6유전자의 ORF의 약 1000 bp 업스트림 및 다운스트림에서의 유전자 서열이다. 플라스미드에는 Amp선별 마커가 있다.
도 18은 pHoCas9_SE_kana_tRNA_ScRNR2_KLNGL2-1&2의 플라스미드 프로파일이다. KLNGL3의 gRNA1 및 gRNA2는 각각 tRNA-Tyr 프로모터 및 SNR52 터미네이터를 갖는 KLNGL3유전자의 ORF의 5'-말단 및 3'-말단에서의 두 개의 gRNA이다. PMZ374-cas9은 최적화된 cas9이다. 플라스미드에는 kana선별 마커가 있다.
도 19는 KL NGL2-DD1-pMD18의 플라스미드 프로파일이다. 상동성 암1(homologous arm 1) 및 상동성 암2(homologous arm 2)는 각각 KLNGL3유전자의 ORF의 약 1000 bp 업스트림 및 다운스트림에서의 유전자 서열이다. 플라스미드에는 Amp선별 마커가 있다.
도 20은 변형된 균주의 시험관 내 번역 활성 분석 데이터의 그래프를 나타낸다.반딧불이 형광 단백질(Fluc)의 형광 강도는 시험관내 생합성 시스템에서 재조합 단백질의 합성 능력을 나타내기 위해 이용된다. 상기에서, wt은 야생헝Kluyveromyces를 나타내고, ΔKLEXN53EXN53는 KLEXN53EXN53 유전자가 녹-아웃된 Kluyveromyces 균주를 나타낸다.

광범위하고 심층적인 연구 끝에, 5개의 뉴클레아제가 광범위한 선별 및 모색을 통해 많은 뉴클레아제로부터 선택되었다. 놀랍게도, 뉴클레아제 중 하나인 EXN53의 하향 조절 또는 녹-아웃은 핵산의 안정성을 개선할 수 있고, 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 단백질 생산 효율을 크게 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 특히, EXN53의 하향 조절 또는 녹-아웃 후, IVTT 시스템에서 ΔKLEXN53효모 균주의 루시페라아제 활성은 야행성 균주의 2배 이상이었다. 이에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명을 완성시켰다.

달리 언급되지 않는 한, 본 발명에 사용 된 모든 %는 질랑 백분율(wt%)을 지칭한다.

효모-기반 시험관 내 단백질 합성 시스템

효모(yeast)는 단순한 배양, 효율적인 단백질 접힘(protein folding) 및 번역 후 변형의 장점을 갖는다. 효모들 중에서, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 및 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)는 복잡한 진핵 생물 단백질 및 막 단백질을 발현하는 유기체 모델이다. 또한, 효모는 또한 시험관 내 번역 시스템의 준비를 위한 원료로서 사용될 수 있다.

클루이베로마이세스(Kluyveromyces)는 자낭포자형성효모(ascosporogenous yeast)이다. 클루이베로마이세스 중에서 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)는 산업에서 널리 사용되고 있는 효모이다. 다른 효모들과 비교할 때, 클루이베로마이세스 락티스는 뛰어난 분비 능력, 더 나은 대규모 발효 특성, 식품 안전성 수준에 부합(conforming)하고, 단백질의 번역 후 변형의 능력을 갖는 것과 같은 많은 장점을 가지고 있다.

본 발명에 있어서, 효모-기반 시험관 내 단백질 합성은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 효모-기반 시험관 내 단백질 합성 시스템은 클루이베로마이세스-기반 발현 시스템(더욱 바람직하게는, 클루이베로마이세스 락티스 기반 발현 시스템)이다.

본 발명에 있어서,효모-기반 단백질 합성 시스템은 다음을 포함한다:

(a) 효모 세포 추출물;

(b) 폴리에틸렌 글리콜;

(c)선택적 외래성 수크로오스; 및

(d) 물 또는 수용성 용매인 선택적 용매;

여기서, 효모 세포 추출물은 EXN53 단백질을 포함하고, 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 및 더욱 바람직하게는 2% 이하이다.

바람직한 실시예에서, EXN53은 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효모 소스로부터 유래된 것이며, 바람직하게는 클루이베로마이세스(예컨대, 클루이베로마이세스 막시아누스, 클루이베로마이세스 락티스)로부터 유래된 것이다.

본 발명에 있어서, 클루이베로마이세스는(예컨대, 클루이베로마이세스 락티스)는 특별히 제한되지 않으나, 클루이베로마이세스는(예컨대, 클루이베로마이세스 락티스) 균주를 포함하고, 이는 단백질 합성 효율을 개선할 수 있다.

바람직한 실시예에서, EXN53의 단백질 서열은 서열번호 6(SEQ ID No.:6)로 나타내고,EXN53의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(SEQ ID No.:1)로 나타내었다.

특히 바람직한 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 시험관 내 단백질 합성 시스템은 효모 세포 추출물, 4-하이드록시 피페라진에탄설폰산, 아세트산 칼륨, 아세트산 마그네슘, 아데노신 3인산(ATP), 구아노신 3인산(GTP), 사이티딘 3인산(CTP) 및 티미딘 3인산(TTP), 아미노산 혼합물, 포스포크레아틴, 디티오쓰레이톨(DTT), 크레아틴 포스포키네이스, 리보핵산가수분해효소 억제제, 루시페린, 루시페라아제의 DNA 및 RNA 중합효소를 포함한다.

본 발명에 있어서, RNA중합효소는 특별히 제한되지 않는다. RNA 중합효소는 하나 이상의 RNA 중합효소일 수 있으며, 전형적인 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이다.

본 발명에 있어서, 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 효모 세포 추출물의 비율은 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 효모 세포 추출물은 20% 내지 70%, 바람직하게는, 30% 내지 60%, 더욱 바람직하게는, 40% 내지 50%를 차지한다.

본 발명에 있어서, 효모 세포 추출물은 온전한 기능을 갖춘 세포(intact cells)를 포함하지 않으며, 대표적인 효모 세포 추출물은 리보솜, 운반 RNA(tRNA), 아미노아실-tRNA 합성효소, 및 개시 인자, 신장 인자, 종결 방출 인자(종결에 매개되는 방출 인자)를 포함하는 단백질 번역을 위해 요구되는 인자를 포함한다. 게다가, 효모 추출물은 또한 효모 세포의 세포질로부터 유래된 몇몇의 다른 단백질, 특히 수용성 단백질을 포함한다.

본 발명에 있어서, 효모 세포 추출물의 단백질 함량은 20-100 mg/mL, 바람직하게는 50-100 mg/mL이다. 단백질 함량을 측정하는 방법은 쿠마시브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 분석법이다.

본 발명에 있어서, 효모 세포 추출물을 준비하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 제조방법은 다음 단계를 포함한다:

(i) 효모 세포를 준비하는 단계;

(iii) 세척된 효모 세포를 세포 용해 처리제로 처리하여 효모 조추출물을 수득하는 단계;및

(iv) 효모 조추출물을 고액분리(solid-liquid separation)를 통해 액상층(즉,효모 세포 추출물)을 수득하는 단계.

바람직한 실시예에서, 고액 분리법의 방법은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 방법은 원심분리이다.

바람직한 실시예에서 원심분리는 액상 상태에서 수행한다.

바람직한 실시예에서, 원심분리 조건은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 원심분리 조건은 5,000×g-100,000×g, 더욱 바람직하게는 8,000×g-30,000×g이다.

본 발명에 있어서, 원심분리 시간은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 원심분리 시간은 0.5분에서 2시간, 더욱 바람직하게는20분에서 50분이다.

본 발명에 있어서, 원심분리 온도는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 원심분리는 1-10℃, 더욱 바람직하게는 2-6℃에서 수행한다.

본 발명에 있어서, 세척 방법은 특별히 세한되지 않는다. 바람직하게는, 세척 처리는 pH7-8(바람직하게는 pH7.4)의 환경에서 세척 용액을 이용함으로써 수행된다. 세척 용액은 특별히 제한되지 않으나, 전형적인 세척 용액은 포타슘 4-하이드록시에틸피페라진 에탄설폰산, 아세트산 칼륨, 마세트산 마그네슘 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명에 있어서, 세포 용해 처리를 위한 방법은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 세포 처리 방법은 고압용해 및 동결 융해(예를 들어, 저온의 액화질소에서 처리)용해를 포함한다.

시험관 내 단백질 합성 시스템에서 뉴클레오시드 삼인산의 혼합물은 아데노신 삼인산, 구아노신 삼인산, 사이티딘 삼인산, 및 우리딘 삼인삼을 포함한다. 본 발명에 있어서, 각 단일 뉴클레오타이드의 농도는 제한되지 않는다. 일반적으로, 각 단일 뉴클레오타이드의 농도는 0.5 mM 내지 5 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 2.0 mM이다.

시험관 내 단백질 합성 시스템에서 아미노산 혼합물은 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하고, D-유형 아미노산 또는 L-유형 아미노산을 포함한다. 대표적인 아미노산은 제한되지 않으나, 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 20 유형의 천연 아미노산을 포함한다. 아미노산 각 유형의 농도는 일반적으로 0.01 mM 내지 0.5 mM, 바람직하게는 0.02 mM 내지 0.2 mM, 예컨대, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 및 0.08 mM이다.

바람직한 실시예에서, 시험관 내 단백질 합성 시스템은 폴리에틸렌 글리콜 또는 그 유사체를 더 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그 유사체의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 또는 그 유사헤의 농도(w/v)는 단백질 합성 시스템의 총 중량 대비 0.1% 내지 8%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 더욱 바람직하게는 1% 내지 2%이다. PEG의 대표적인 예로서, PEG3000, PEG8000, PEG6000 및 PEG3350를 포함하나, 이제 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 시스템은 다른 다양한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함 할 수 있음을 이해해야한다(예컨대, PEG 200, 400, 1500, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 등).

바람직한 실시예에서, 시험관 내 단백질 합성 시스템은 수크로오스를 더 포함한다. 수크로오스의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 수크로오스의 농도는 단백질 합성 시스템의 총 중량 대비 0.03 wt% 내지 40 wt%, 바람직하게는 0.08 wt% 내지 10 wt%, 더욱 바람직하게는 0.1 wt% 내지 5 wt%이다.

효모 추출물 이외에, 특히 바람직한 시험관내 단백질 합성 시스템은하기 성분을 추가로 포함한다: 22 mM 4-하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산(pH 7.4), 30-150 mM 아세테이트 칼륨, 1.0-5.0 mM 아세테이트 마그네슘, 1.5-4 mM 뉴클레오시드 삼인산 혼합물, 0.08-0.24 mM 아미노산 혼합물, 25 mM 포스포크레아틴, 1.7 mM 디티오트레이톨, 0.27 mg/mL 크레아틴 포스포크레티나아제, 1%-4% 폴리에틸렌 글리콜, 0.5%-2% 수크로오즈, 8-20 ng/μL 반딧불이 루시페라아지의 DNA 및 0.027-0.054 mg/mL T7 RNA 폴리머라아제.

외래성 단백질(외래성 DNA)의 암호화 서열

본 발명에서 사용된 용어 “외래성 단백질의 코딩 서열” 및 “외래성 DNA의 코딩서열”은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 둘 다 단백질 합성을 가이드하기 위한 DNA 분자를 지칭한다. DNA 분자는 일반적으로 선형 또는 원형이다. DNA 분자는 외래성 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 본 발명에 있어서, 외래성 단백질을 암호화하는 서열의 예는 게놈 서열 및 cDNA 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 외래성 단백질을 암호화하는 서열은 프로모터 서열, 5'-비번역 서열, 및/또는 3'-비번역 서열을 더 포함한다.

본 발명에 있어서, 외래성 DNA의 선택은 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 외래성 DNA는 루시페린, 또는 루시페라아제 (예: 반딧불이 루시페라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역, 루시페라아제 돌연변이 및 이들의 조합을 암호화하는 DNA로부터 선택된다.

외래성 DNA는 또한 α-아밀라아제, 엔테로신 A, C형간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 전구체, 인터페론 αA, 인터루킨-1β, 라이소자임, 혈청 알부민, 항체의 단쇄가변분절 (scFv), 트란스타이레틴, 티로시나아제, 자일라나아제및 이들의 조합을 암호화 하는 외래성 DNA로부터 선택된다.

바람직한 실시예에서, 외래성 DNA는 녹색형광단백질(enhanced GFP, eGFP), 황색형광단백질(YFP), 대장균, β-갈락토시다아제(β-galactosidase, LacZ), 인간 라이신-tRNA 합성 효소(lysine-tRNA synthetase), 인간 류신-tRNA 합성 효소(leucine-tRNA synthetase), 애기장대글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(Arabidopsis thaliana glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 쥐 과산화수소분해효소(murine catalase) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩한다.

고수율 시험관 내 단백질 합성 방법(시험관 내 단백질 번역 효율성을 개선하기 위한 방법)

본 발명은 다음 단계를 포함하는 시험관 내 단백질을 고수율로 합성하기 위한 방법을 제공한다:

(i) 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 준비하고, 단백질 합성 가이드를 위한 외래성 DNA분자를 첨가하며, 상기 단백질 합성 시스템에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하이며; 및

(ii) 단계 (i)에서 준비된 단백질 합성 시스템을 적합한 조건 하에서 T1 기간 동안 인큐베이션하여 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질을 합성하는 단계.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 효모 게놈에서 뉴클레아제 유전자를 녹-아웃시킴으로써 시험관 내 단백질 번역 효율을 개선하기 위한 설계 및 방법을 제공한다:

1. 다음과 같은 시험관내 생합성 활성을 향상시키기위한 설계 계획 및 분석 방법;

A. 시험관 내 생합성 시스템에서 성분이 활성에 미치는 영향 분석;

B. K. lactis 게놈에서 뉴클레아제 유전자의 기능 및 분포 분석;

C. K. lactis 게놈에서 선택된 뉴클레아제 유전자를 변형 디자인;

2. 다음을 포함하는 표적화된 유전자의 녹-아웃을 처리한 클로닝 벡터의 구축:

A. 특정유전자 서열에 대한 엔도튜클레아제 절단을 가이드하는 sgRNA 서열 설계;

B. sgRNA 서열을 엔도튜클레아제를 포함하는 벡터에 제조합하여 sgRNA 및 엔도뉴클레아제가 공동으로 발현되는 제1벡터를 수득;

3. 다음을 포함하는 특정 유전자의 녹아웃을 위해 사용되는 공여체 DNA의 구축:

A. 유전자 데이터베이스로부터 특정 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 다운로드 한 후, 유전자의 1000 bp 업스트림 및 다운스트림에 각각 위치한 서열을 이용함으로써 제2 벡터를 설계;

B.프라이머 M13F 및 M13R로 제2 벡터를 증폭시키고, 수득된 PCR 산물을 에탄올 침전에 의해 농축시켜 공여체 DNA를 수득;

4. 제1 번째 벡터와 공여체 DNA를 동시에 효모 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환 시킴;

확대 배양(enlargement culture)을 위해 단일 클론 세포를 스크리닝하고, 효모 게놈을 추출하고, 설계된 프라이머로 녹-아웃 부위를 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 시퀀싱하여 확인한 다음, 특정 유전자가 녹-아웃 된 균주를 수득;

5. 무세포 시험관 내 단백질 합성 시스템

특정 유전자가 녹-아웃된 효모 균주를 이용하여 효모 세포 용액을 제조하고,효모 세포 용액을 시험관 내 단백질 번역 시스템에 첨가하고, 20-30 ℃의 환경에서 2 내지 6 시간 동안 반응을 지속하기 위하여 혼합물을 그대로 두고; 다기능 마이크로플레이트리더기(multifunctional microplate reader)(Perkin Elmer)를 이용하여 반딧불이 루시페라아제의 활성을 검출하기 위해 흡광도를 측정한다.

본 발명은 특정 예(또는 실시예)와 조합하여 이하에 더 설명될 것이다. 이들의 예(또는 실시예)는 단지 설명의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 하기의 예(또는 실시예)에서 구체적으로 기술된 조건이 제외된 실험 방법과 관련하여, 일반적으로 Sambrook et.al, Molecular Cloning에 기술된 조건과 같은 통상적인 조건을 따를 수 있다: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 또는 제조업체가 권장하는 조건을 따른다. 달리 언급되지 않는 한, 백분율 및 부분은 중량 백분율 및 중량 부를 지칭한다.

달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 예에서 이용된 재료 및 시약은 모두 통상적으로 이용하는 제품이다.

실시예 1: 시험관 내 생합성 시스템에서 뉴클레아제의 함량을 감소시킴으로써 핵산의 안정성 개선, K. lactis 게놈에서 뉴클레아제 유전자에 대한 분석 수행 및 특이적 변형 제조

1. K . lactis 게놈을 변형시킴으로써 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위한 원리 설계

1.1 시험관 내 생합성 시스템 분석

1.1.1 다른 시험관 내 생합성 시스템에서 성분 분석

시험관 내 생합성 시스템은 세포 용해물을 추출하기 위해 상이한 유형의 세포(미생물, 동물 및 식물을 포함)상에서 세포 용해를 수행함으로써 외래성 단백질의 번역을 위해 이용된다. 전사, 번역, 단백질 접힘, 에너지 대사 등과 같은 시험관 내 생합성 시스템의 기능을 달성하기 위하여, 세포 용해물은 리보솜, 아미노아실-tRNA 합성 효소, 번역 개시 인자, 번역 신장 인자, 리보솜 방출 인자, 뉴클레오타이드 재순환 효소, 대사 효소, 샤프론 분자(molecular chaperones), 폴다아제(foldases) 등을 포함한 에너지 재생 및 단백질 합성을 위한 요소를 포함해야 한다. 기질, 즉 외래성으로 첨가되어야 하는 물질은아미노산, 뉴클레오타이드, DNA주형, 에너지 기질, 보조인자, 염 분자(salt molecules) 등을 포함한다. 시스템에서 다른 성분의 안정성은 반응 시간 및 최종 단백질 수율에 중요한 영향을 미친다. 특정 기질(예컨대,ATP, 시스테인 등)의 고갈은 반응의 종료에 중요한 이유가 된다.

1.1.2 시험관 내 생합성 시스템에서의 성분이 합성 산물에 미치는 영향 분석 모델

시험관 내 번역 시스템에서, 에너지 대사 기질(포스포크레아틴 등), mRNA 합성에 관여하는 기질(예컨대, NTPs 등), 단백질 합성에 관여하는 기질(예컨대, 아미노산 등), 포스페이트 및 다른 요소의 농도 값과 pH 값은 반응의 진행과 함께 변화하여 최종적으로 반응을 종결시킨다. 상응하는 성분(예컨대, NTPs, 아미노산 등)을 보충하고, 상이한 기술을 이용하여 상응하는 조건(예컨대, pH 값, 포스페이트 농도등)을 안정화시키는 것 둘 다는 시험관 내 번역 시스템의 반응 시간을 효과적으로 연장시킬 수 있으며, 따라서 단백질 수율을 증가시킬 수 있다.

1.1.3 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 핵산 및 뉴클레아제가 단백질 합성에 미치는 영향 분석

단백질 번역을 위한 중요한 기질로서, DNA 주형 및 DNA 주형으로부터 전사된 mRNA의 안정성은 시험관 내 번역 시스템의 반응 시간 및 수율에 중요한 영향을 미친다. 세포를 용해한 후에, 세포 용해물을 수집하고, 이를 이용하여 시험관 내 번역 시스템을 구축한다. 시험관 내 번역 시스템은 또한 단백질 합성을 위해 필요한 다양한 성분 이외에도 뉴클레아제, 프로테아제 등과 같은 반응에 불리한 성분을 포함한다. 다양한 정제된 성분으로 구성된 시스템에서,단백질 번역의 효율은 억제 인자의 부재로 인해 상당히 증가될 수 있다.

한편, 시험관 내 번역 시스템에서 핵산의 안정성은 다른 기술적 수단(뉴클레아제 유전자의 녹-아웃 및 안정화 요소의 추가)을 이용함으로써 효율적으로 증가시킬 수 있으며, 이는 단백질 번역 효율을 개선시킬 수 있다. 도 1은 시험관 내 생합성 시스템에서 뉴클레아제 레벨을 감소시킴으로써 핵산의 안정성을 증가시키기 위한 설계 경로를 나타내며, K. lactis 게놈에서 뉴클레아제 유전자에 대한 분석을 수행하고 특이적 변형을 제조하였다.

1.2 K. lactis 게놈에서 뉴클레아제 유전자 분석

1.2.1 K. lactis 게놈에서 뉴클레아제 유전자의 분류 및 분포;

뉴클레아제(핵 중합효소 또는 폴리뉴클레오디타아제라고도 함)는 효소로서, 핵산 분해의 첫 번째 단계에서 뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터결합을 가수분해 할 수 있다. 뉴클레아제는 뉴클레아제의 작용 위치에 따라 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 카테고리로 분류될 수 있다. 3'-말단으로부터 시작하여 뉴클레오타이드를 하나씩 가수분해하는 엑소뉴클레아제는 3'에서 5' 엑소뉴클레아제로 지칭된다. 5'-말단으로부터 시작하여 뉴클레오타이드를 하나씩 가수분해하는 엑소뉴클레아제는 5'에서 3'엑소뉴클레아제로 지칭된다.엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드에서 포스포다이에스터 결합을 촉매하고 가수분해한다.뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 및 리보뉴클레아제(RNase)의 카테고리로 분류될 수 있다.데옥시뉴클레아제(DNase)는 DNA에서 작용하고, 리보뉴클레아제(RNase)는 RNA에서 작용한다.뉴클레아제는 또한 뉴클레아제의 작용 방향에 따라 5'에서 3' 엑소뉴클레아제와 3'에서 5'엑소뉴클레아제로 분류될 수 있다.

데이터베이스에서 유전자 기능의 정렬 분석을 통해 K. lactis는 K. lactis A-F의 6 개의 염색체에 분포된 총 61 개의 뉴클레아제를 포함하고 있고, 상기 A염색체에 위치한 뉴클레아제는: KLSEN54, KLDNA2, KLTRM2, KLFCF1, KLDOM34, KLRAD2, KLRNH70, KLDIS3및KLNPP1이다. KEGG 데이터베이스에서 KLSEN54에 대한 코드(code)는 KlLA0A00803g, KEGG 데이터베이스에서 KLDNA2에 대한 코드는 KlLA0A05324g, KEGG 데이터베이스에서 KLTRM2에 대한 코드는 KlLA0A05665g, KEGG 데이터베이스에서 KLFCF1에 대한 코드는 KlLA0A07018g, KEGG 데이터베이스에서 KLDOM34에 대한 코드는 KlLA0A08646g, KEGG 데이터베이스에서 KLRAD2에 대한 코드는 KlLA0A09427g, KEGG 데이터베이스에서 KLRNH70에 대한 코드는 KlLA0A10065g, KEGG 데이터베이스에서 KLDIS3에 대한 코드는 KlLA0A10835g, 및 KEGG 데이터베이스에서KLNPP1에 대한 코드는 KlLA0A11374g이다.

B염색체에 위치한 뉴클레아제는: KLOGG1이고; KEGG 데이터베이스에서 KLOGG1에 대한 코드는 KlLA0B05159g이다.

C염색체에 위치한 뉴클레아제는:KLPOL2, KLRAD50, KLYSH1, KLRCL1, KLNGL2, KLMRE11, KLPOP3 , KLMKT1 , KLAPN1 , KLRPP1및KLPOP2이다. KEGG 데이터베이스에서 KLPOL2에 대한 코드는 KlLA0C02585g, KEGG 데이터베이스에서 KLRAD50에 대한 코드는 KlLA0C02915g, KEGG 데이터베이스에서 KLYSH1에 대한코드는 KlLA0C04598g, KEGG 데이터베이스에서 KLRCL1에 대한 코드는 KlLA0C05984g, KEGG 데이터베이스에서 KLRCL2에 대한 코드는 KlLA0C06248g, KEGG 데이터베이스에서 KLMRE11에 대한 코드는 KlLA0C06930g, KEGG 데이터베이스에서 KLPOP3에 대한 코드는 KlLA0C12199g, KEGG 데이터베이스에서 KLMKT1에 대한 코드는 KlLA0C13926g, KEGG 데이터베이스에서 KLAPN1에 대한 코드는 KlLA0C14256g, KEGG 데이터베이스에서 KLRPP1에 대한 코드는 KlLA0C14718g, 및 KEGG 데이터베이스에서 KLPOP2에 대한 코드는 KlLA0C18821g이다.

D염색체에 위치한 뉴클레아제는:KLNUC1, KLRPP6, KLDBR1, KLRPS3, KLRPM2, KLSUV3, KLRAD1 , KLIRE1및KLPOP1이다. KEGG 데이터베이스에서 KLNUC1에 대한 코드는 KlLA0D00440g, KEGG 데이터베이스에서KLRPP6에 대한 코드는 KlLA0D01309g KEGG 데이터베이스에서 KLDBR1에 대한 코드는 KlLA0D04466g, KEGG 데이터베이스에서 KLRPS3에 대한 코드는 KlLA0D08305g, KEGG 데이터베이스에서 KLRPM2에 대한 코드는 KlLA0D10483g, KEGG 데이터베이스에서 KLSUV3에 대한 코드는 KlLA0D12034g, KEGG 데이터베이스에서 KLRAD1에 대한 코드는 KlLA0D12210g, KEGG 데이터베이스에서 KLIRE1에 대한 코드는 KlLA0D12210g, 및 KEGG 데이터베이스에서 KLPOP1에 대한 코드는 KlLA0D19448g이다.

E염색체에 위치한 뉴클레아제는:KLPOL3, KLDXO1, KLMUS81, KLPAN3, KLAPN2, KLRAI1, KLEXO1 , KLREX4 , KLPAN2및KLLCL3이다. KEGG 데이터베이스에서 KLPOL3에 대한 코드는 KlLA0E01607g, KEGG 데이터베이스에서 KLDXO1에 대한 코드는 KlLA0E02245g, KEGG 데이터베이스에서 KLMUS81에 대한 코드는 KlLA0E03015g, KEGG 데이터베이스에서 KLPAN3에 대한 코드는 KlLA0E08097g, KEGG 데이터베이스에서KLAPN2에 대한 코드는 KlLA0E18877g, KEGG 데이터베이스에서 KLRAI1에 대한 코드는 KlLA0E12893g, KEGG 데이터베이스에서 KLEXO1에 대한 코드는 KlLA0E16743g, KEGG 데이터베이스에서 KLREX4에 대한 코드는 KlLA0E17865g, KEGG 데이터베이스에서 KLPAN2에 대한 코드는 KlLA0E18877g, 및 KEGG 데이터베이스에서 KLLCL3에 대한 코드는 KlLA0E19163g이다.

F염색체에 위치한 뉴클레아제는:KLRAD17, KLPOP4, KLPOP5, KLRAD27, KLRNH201, KLVMA1, KLRAT1, KLNGL1, KLREX2, KLTRL1, KLPOL31, KLCCR4, KLTRZ1, KLSEN2, KLREX3, KLSWT1, KLEXN53, KLRNT1, KLSEN15, KLNTG1, KLNOB1및 KLDDP1이다.KEGG 데이터베이스에서 KLRAD17에 대한 코드는 KlLA0F00330g, KEGG 데이터베이스에서KLPOP4에 대한 코드는 KlLA0F02211g, KEGG 데이터베이스에서 KLPOP5에 대한 코드는 KlLA0F02453g, KEGG 데이터베이스에서 KLRAD27에 대한 코드는 KlLA0F02992g, KEGG 데이터베이스에서 KLRNH201에 대한 코드는 KlLA0F04774g, KEGG 데이터베이스에서 KLVMA1에 대한 코드는 KlLA0F05401g, KEGG 데이터베이스에서 KLRAT1에 대한 코드는 KlLA0F07469g, KEGG 데이터베이스에서 KLNGL1에 대한 코드는 KlLA0F07733g, KEGG 데이터베이스에서 KLREX2에 대한 코드는 KlLA0F08998g, KEGG 데이터베이스에서 KLPOL31에 대한 코드는 KlLA0F14949g, KEGG 데이터베이스에서 KLCCR4에 대한 코드는 KlLA0F15884g, KEGG 데이터베이스에서 KLTRZ1에 대한 코드는 KlLA0F16665g, KEGG 데이터베이스에서 KLSEN2에 대한 코드는 KlLA0F19866g, KEGG 데이터베이스에서 KLREX3에 대한 코드는 KlLA0F19910g, KEGG 데이터베이스에서 KLSWT1에 대한 코드는 KlLA0F20361g, KEGG 데이터베이스에서 KLEXN53에 대한 코드는 KlLA0F22385g, KEGG 데이터베이스에서 KLRNT1에 대한 코드는 KlLA0F24816g, KEGG 데이터베이스에서 KLSEN15에 대한 코드는 KlLA0F26334g, KEGG 데이터베이스에서 KLNTG1에 대한 코드는 KlLA0F07711g, KEGG 데이터베이스에서 KLNOB1에 대한 코드는 KlLA0F16280g, 및 KEGG 데이터베이스에서 KLDDP1에 대한 코드는 KlLA0F20273g이다.

K. lactis뉴클레아제는 기능에 따라 2 개의 카테고리로 분류될 수 있다.여기에는 18 개의 DNase와 41 개의 RNase가 있으며, 분류되지 않은 뉴클레아제도 있다(표 1 참조). 3'에서 5'기능을 갖는 DNase에는 KLAPN1가 포함되고, 5'에서 3' 기능을 갖는 DNase에는 KLRAD27 및 KLEX01가 포함되며; 3'에서 5'기능을 갖는 RNase에는 KLRNH70, KLDIS3, KLNGL2 및 KLRPP6가 포함되고, 5'에서 3' 기능을 갖는 RNase에는 KLDXO1, KLRAT1 및 KLEXN53가 포함된다.

뉴클레아제	뉴클레아제 유전자의 분류	전체 개수
DNases	Chromosome A: KLDNA2,KLNPP1, KLRAD2;Chromosome B: KLOGG1; Chromosome C: KLPOL2, KLRAD50, KLMRE11, KLAPN1; Chromosome D: KLRPS3, KLRAD1; Chromosome E: KLPOL3, KLMUS81, KLAPN2, KLEXO1; Chromosome F: KLRAD27, KLRAD17, KLPOL31, KLNTG1;	18
RNases	Chromosome A: KLSEN54, KLTRM2, KLFCF1, KLRNH70, KLDIS3;Chromosome C:KLYSH1, KLRCL1, KLNGL2, KLPOP3, KLMKT1, KLRPP1, KLPOP2; Chromosome D: KLNUC1, KLRPP6, KLDBR1, KLRPM2, KLSUV3, KLIRE1, KLPOP1; Chromosome E: KLDXO1, KLPAN3, KLRAI1, KLREX4, KLPAN2; Chromosome F:KLPOP4, KLPOP5, KLRNH201, KLVMA1, KLRAT1, KLNGL1, KLREX2, KLCCR4, KLTRZ1, KLSEN2, KLREX3, KLSWT1, KLEXN53, KLRNT1, KLSEN15, KLNOB1, KLDDP1;	41
카테고리 없음	KLDOM34, KLLCL3;	2

1.2.2 시험관 내 단백질 합성에 관여하는 K. lactis게놈에서 뉴클레아제 유전자의 선택에 대한 분석

RNA또는 DNA의 핵산은 시험관 내 단백질 합성 시스템의 기질을 암호화하고, 이들의 안정성은 단백질 수율에 영향을 미친다. 진핵 생물 번역 과정 동안에, RNA의 5'-말단은 캡 구조의 과정을 즉시 완료할 수 있고, RNA의 5'-말단에서 캡 구조는 RNA 안정성 및 번역 효율에 중요한 역할을 한다.

진핵 생물에는, 탈아데닐화-의존적(deadenylation-dependent) RNA 분해 메커니즘 및 아데닐화-의존적(adenylation-independent)RNA 분해 메커니즘이 존재한다. 탈아데닐화-의존적RNA 분해 메커니즘에서, RNA의 5'-말단에서 성숙 캡 구조 또는 미성숙 캡 구조는 캡-제거 복합체를 모집함으로써 제거될 수 있고, 그 동안에 RNA는 뉴클레아제 작용하에 5'에서 3'방향으로 분해된다. 아데닐화-의존적 RNA 분해 메커니즘에서, 핵산 분자는 엔도뉴클레아제의 작용하에 중간 위치로부터 부서진 가닥으로 분해되고, 엑소뉴클레아제는3'에서 5'방향으로 RNA를 분해한다.

K. lactis기반 시험관 내 단백질 합성 시스템에서, 주형으로 이용되는 외래성 선형 또는 원형 DNA는 3' 폴리A 태그(3' polyA tag)를 이용하여 mRNA로 전사될 수 있으며; 프로모터(promotor) 및 RNA 전사효소의 차이에 따라, 전사된 mRNA는 5' 성숙 캡 구조를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 그러므로, DNase, RNase, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제는 모두 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 주형의 안정성에 영향을 미치고, 이들의 효소 변형은 시험관 내 생합성 활성에 대한 향상된 효과를 생성할 수 있다.

상기와 같이,mRNA의 특수한 불안정성 및 시험관 내 RNase의 높은 활성으로 인해, mRNA의 수명은 시험관 내에서 단백질 합성을 제한하는 주요 장애물이다. 변형을 통해 시험관 내 RNase를 감소시키는 것이 가장 바람직한 변형 계획이다. 물론, 본 발명은 시험관 내 단백질 합성 활성을 개선하기 위하여, 다른 뉴클레아제를 위한 설계에도 여전히 적용 가능하다는 것을 유의해야 한다.

1.2.3 K. lactis게놈에서 뉴클레아제 유전자(EXN53, Rat 1, Rrp6, Dis3및NGL2)의 특이적 변형 설계

K. lactis에서, 5'에서 3'엑소뉴클레아제는 EXN53 및 Rat 1을 포함하고, 상기 EXN53는 세포질에, Rat 1은 핵에 위치한다. 탈아데닐화-의존적RNA 분해 메커니즘에서, 탈아데닐화의 과정 후에, RNA는 세포질 및 핵 둘 다에 위치하며, 3'에서 5'엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 다를 갖는 단백질 서브유닛 복합체(엑소좀)(exosome)에 의해 분해될 수 있다. K. lactis에서, 3'에서 5'엑소뉴클레아제는 Rrp6, Dis3 (Rrp44라고도 함), NGL2 등을 포함한다. 상기에서, Rrp6 및 Dis3은 모두 엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 단백질 서브유닛 복합체(엑소좀)의 일부이다. Rrp6은 일종의 3'에서 5'엑소뉴클레아제이며, RNase D 군의 구성원이고; Rrp6는 핵에 위치하고, 핵에 있는 엑소좀의 주요 촉매 서브유닛이다. 또한, Rrp6는 세포에서 다양한 RNA의 처리, 분해 및 품질 관리를 책임지고 있다. Dis3(Rrp44라고도 함)는 엑소좀의 주요 촉매 서브유닛이고,고도로 보존된(highly conserved) RNaseII / RNB 군의 구성원이고; Dis3는 핵 및 세포질 모두에 위치한다.또한,Dis3은 3'에서 5'엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 모두를 가지며, 세포질 및 핵 둘 다에서 RNA의 대사 및 RNA 모든 유형의 과정을 담당한다. NGL2는 3'에서 5'방향으로 RNA를 가수분해하는 폴리 A를 특이적으로 인식하는 효소이다.

상기 분석에 기초하여, EXN53 , Rat1 , Rrp6 , Dis3 및 NGL2의 5개의 유전자가 특별히 제한되는 것은 아니나 녹-아웃 및 유전자 돌연변이를 포함하는 관련 방법을 이용하여 본 발명에서 변형되도록 선택되었다. K. lactis게놈에서 뉴클레아제 유전자에 분석을 수행하고 특이적 변형을 제조하기 위한 설계에 의해 시험관 내 생합성 시스템에서 뉴클레아제의 하향 조절을 통해 핵산의 안정성을 개선하고; 시험관내 단백질 합성 활성을 조절하기위한 설계 및 기술적 세부 사항에 의해 시험관내 단백질 번역 효율을 개선시킨다.

1.3.3 K . lactis게놈에서 lactis뉴클레아제 유전자(EXN53, Rat1, Rrp6, Dis3 및 NGL3)의 녹-아웃을 위한 CRISPR-Cas9의 설계

본 발명에 있어서, 공여체 DNA의 두 개의 상동성 암은 각각 녹-아웃될 뉴클레아제 유전자의 ORF의 약 1,000 bp업스트림 및 다운스트림에 위치한 유전자 서열이고; 각각 뉴클레아제 유전자의 ORF의 5' 및 3' PAM 서열을 동시에 인식하여 녹-아웃 될 수 있는 2개의 gRNA를 구축하고, Cas9뉴클레아제 부위-특이적 방식으로 DNA를 절단하도록 안내한 다음, DSB(이중-가닥 절단)(double-strand break)이 발생한 후에 상동성 재조합이 일어남으로써 뉴클레아제의 녹-아웃을 달성한다. 예를 들어, EXN53, Rat1, Rrp6, Dis3 및 NGL3의 다섯 개의 유전자의 녹-아웃은 개시 코돈 근처의 하나의 gRNA 및 종결 코돈 근처의 하나의 gRNA를 각각 배치함으로써 수행된다. K. lactis게놈에서 다섯 개의 뉴클레아제 유전자의 변형을 위해 설계된 CRISPR 시스템은 도 3에 나타내었다.

실시예 2: CRISPR-Cas9을 통한 EXN53 유전자의 표적 녹-아웃

2.1 KLEXN53 서열 검색 및 CRISPR gRNA 서열 결정

2.1.1 유저자의 표적 녹-아웃을 위한 클로닝 벡터 플라스미드의 구축

KEGG 데이터베이스에서, BLAST 정렬 분석은 EXN53 유전자에 기초하여 수행되었다. 그 결과, KEGG 데이터베이스에서 K1LA0F22385g의 코드를 갖는클루이베로마이세스 락티스에서 EXN53의 유전자 서열(서열번호 1)(SEQ ID No.: 1)이 결정되었다. 결정된 유전자 서열은 사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae)에서 EXN53에 대해 60.93%의 유전자 서열 상동성 및 57.65%의 단백질 서열 상동성을 갖고, 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서 EXN53 대해 47.38% 유전자 서열 상동성 및 38.29% 단백질 서열 상동성을 가지며, 및 호모 사피엔스(H. sapiens)에서 EXN53 대해 43.81% 유전자 서열 상동성 및 33.48% 유전자 서열 상동성을 갖는다. 결정된 유전자 서열은 특유의 EXN53 5'에서 3'엑소뉴클레아제 도메인 및 아멜로게닌(amelogenin) 도메인을 갖는다(도 4에 나타냄). 이 유전자의 이름은 KLEXN53(염색체 F의 2091235 ... 2095596에 위치함)이다.

PAM 서열(NGG)은 KLEXN53 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈에서 검색하였고, gRNA서열을 확인하였다.gRNA의 선택의 원리는 다음과 같다: GC 함량이 적당해야 하고(본 발명에서 표준은 GC 함량이 40% 내지 60%의 범위에 있다는 것이다), 폴리 T(poly T)구조의 존재는 피해야 한다. 이에 따라, 본 발명에 의해 확인된 KLEXN53 gRNA-1 서열은 AGAGTTCGACAATTTGTACT이고, 본 발명에 의해 확인된 KLEXN53 gRNA-2 서열은 CGTCGTGGCCGTAGTAATCG이다.

플라스미드의 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다:pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLEXN53-F1:AGAGTTCGACAATTTGTACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC(서열번호 7) 및 pCas9-KLEXN53-R1:GCTCTAAAACAGTACAAATTGTCGAACTCTAAAGTCCCATTCGCCACCCG(서열번호 8)와 pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLEXN53-F2: CGTCGTGGCCGTAGTAATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC(서열번호 9) 및 pCas9- KLEXN53-R2: GCTCTAAAACCGATTACTACGGCCACGACGAAAGTCCCATTCGCCACCCG(서열번호 10)을 각각 이용하여 두 개의 PCR 증폭 과정을 수행하였다. 각각의 PCR 증폭 과정의 산물 17μL을 혼합한 후 1 μL의 Dpn I(DpnI) 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를(digestion buffer) 첨가 한 후, 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI이 처리된 혼합물 10μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다.PCR-양성 검출후 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLEXN53-1 및 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLEXN53-2이다. pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLEXN53-1를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F1: TAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCG(서열번호 11) 및 pCas9-R: TATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 12)를 이용하여 하나의 PCR 증폭 과정을 수행하였으며, 다른 PCR 증폭 과정은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLEXN533-2를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F2:TATGGAACGCAAACTTCTGTCTAGTGGATAGTATATGTGTTATGTAGTATACTCTTTCTTCAACAATTAAATACTCTCGG(서열번호 13) 및 pCas9-F2: CGAGGCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC(서열번호 14)를 이용하여 수행하였다. pCas9-F1/pCas9-R1 및 pCas9-F2/pCas9-R2 PCR 증폭 산물을 1:5의 비율로 혼합한 후, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다.그 후, 혼합물을 카나마이신-내성(Kan-resistant)LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출후 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLEXN53-1&2이다(도 10에 나타냄).

2.2 공여체 DNA플라스미드의 구축 및 증폭

선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pMD18 플라스미드에 삽입한 다음 PCR에 의해 증폭시켜 본 발명에서 선형 공여체 DNA 서열을 수득 하였다.

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 한프라이머 KLEXN53-F1: GTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCCAGTTGCAGAGCCTCCGAA (서열번호 15) 및 KLEXN53-R1: CATGCCTGCAGGTCGACGATGCGAAACCTTAGCTCTTTATCGAAC (서열번호 16)을 이용하여 수행하였으며; 다른 PCR 증폭은 pMD18 플라스미드를 주형으로 한 프라이머 pMD18-F: ATCGTCGACCTGCAGGCATG (서열번호 17) 및 pMD18-R: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG (서열번호 18)을 이용하여 수행하였다. 두 PCR 증폭 과정의 산물(각 PCR 산물에 대해 8.5μL)을 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린-내성(Amp-resistant)LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출후 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 KLEXN53-pMD18이다

PCR 증폭은 KLEXN53-pMD18 플라스미드를 주형으로 한 프라이머 KLEXN53-F2: ATGTTGGTTTGAATGGACTATTAACAGTAAATATTATATCACTTC (서열번호 19) 및 KLEXN53-R2: GAAGTGATATAATATTTACTGTTAATAGTCCATTCAAACCAACATTTATTTTAGTTAAGCCACAAACCGTAATTAATTGAACAC (서열번호 20)를 이용하여 수행하였고; KLEXN53-pMD18의 플라스미드를 구축하였다(도 11에 나타냄).구체적인 단계는 다음과 같다: 두 개의 PCR 산물(PCR 산물 각 8.5μL)를 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린-내성(Amp-resistant)LB 고체 배지에 코팅한 다음,단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. 그것들을 PCR을 통해 양성 확인을 하고 시퀀싱을 통해 확인한 다음, 플라스미드를 추출 및 저장하였다.

2.3 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환 및 양성 확인

2.3.1 클루이베로마이세스 락티스 용액을YPD 고체 배지에서 획선 도말(streaked)하고 배양 하였다. 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 25 mL 2× YPD 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. 2 mL 효모 용액을 취한 다음 50 mL 2×YPD 액체 배지에서 2시간 내지 8시간 동안 추가적으로 진탕 배양 하였다. 그 후, 효모 세포를 20℃의 조건 하에서 3,000g에서 5분 동안 원심 분리하여 수집하고, 500 μL의 멸균수를 첨가하여 재현탁시켰다. 유사하게, 동일한 조건 하에 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 컴피턴트 세포 용액(5% v/v 글리세롤 및 10% v/v DMSO)를 준비하고, 해당 용액 500μL에 효모 세포를 용해시켰다. 50 ㎕의 등분량(aliquots)을 1.5 mL 원심분리 튜브에 등분하고 -80 ℃에서 저장 하였다.

1.3.2. 컴피턴트 세포를 37 ℃에서 15 내지 30초 동안 해동시키고, 13,000g에서 2 분 동안 원심분리한 다음, 상층액(supernatant)을 제거하였다. 형질전환 버퍼 용액은 다음과 같이 준비하였다: 260 μL PEG 3350(50% (w/v)), 36 μL LiAc(1.0 M), 20 μL 캐리어(carrier) DNA (5.0 mg/mL), 5 μL Cas9/gRNA 플라스미드 및 10 μL 공여체 DNA를 첨가한다; 그 다음 멸균수를 첨가하여 최종 부피 360μL의 혼합물을 형성하였다. 열충격 후, 상층액을 제거하기 위하여 30초 동안 13,000g 조건에서 원심분리를 수행하였다. 1 mL YPD 액체 배지를 첨가하고, 혼합물을 2시간 내지 3시간 동안 인큐베이션 하였다. 혼합물 200 μL를 파이펫(pipetted)하고, YPD (200 μg/mL G418) 고체배지 상에 코팅한 다음 단일클론 콜로니로 자랄 때까지 2 내지 3일동안 인큐베이션 하였다.

1.3.3 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포를 갖는 플레이트로부터 10 내지 20개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라내었다. 단일 클론 콜로니를 1mL YPD (200 μg/mL G418)에 놓고 밤새 진탕배양 하였다. 샘플은 효모 용액을 주형으로 한 CRISPR 삽입 확인 프라이머KLEXN53-CICF1: TTTGCTGGTTGCCCGTATTCCC (서열번호 21) 및KLEXN53-CICR1: TAATAGCACAGGGAATGCACCTT (서열번호 22)를 사용하여 PCR에 의해 검출되었다. PCR에 의해 양성으로 확인되고 시퀀싱에 의해 확인된 균주는 양성 균주로 결정되었다.

실시예 3: CRISPR-Cas9를 통한 DIS3 유전자의 표적 녹아웃

3.1 KLDIS3 서열 검색 및 CIRSPR gRNA 서열 결정

3.1.1 유전자의 표적화된 녹아웃을위한 클로닝 벡터 플라스미드의 구축

KEGG 데이터베이스에서, BLAST 정렬 분석은 DIS3 유전자에 기초하여 수행되었다. 그 결과, KEGG 데이터베이스에서 K1LA0A10835g의 코드를 갖는 클루이베로마이세스 락티스에서 DIS3의유전자 서열(서열번호 2)이 결정되었다.결정된 유전자 서열은 사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae)에서 DIS3에 대해 70.54%의 유전자 서열 상동성 및 77.59%의 단백질 서열 상동성을 갖고, 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서 DIS3에 대해 56.86%의 유전자 서열 상동성 및 51.82%의 단백질 서열 상동성을 가지며, 호모 사피엔스(H. sapiens)에서 DIS3에 대해 48.83%의 유전자 서열 상동성 및 40.19%의 단백질 서열 상동성을 갖는다(도 6에 도시됨). 결정된 유전자 서열은 특유의 VacB 도메인 및 PIN_Rrp44 도메인을 갖는다(도 4에 나타냄). 이 유전자의 이름은 KLDIS3 (염색체 A의 938712…에 위치함)이다.

PAM 서열(NGG)은 KLDIS3 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈에서 검색하였고, gRNA서열을 확인하였다.gRNA의 선택의 원리는 다음과 같다:GC 함량이 적당해야 하고(본 발명에서 표준은 GC 함량이 40% 내지 60%의 범위에 있는 것이다), 폴리 T구조의 존재는 피해야 한다. 이에 따라, 본 발명에 의해 확인된 KLDIS3 gRNA-1 서열은 TTCAGCAGCTAAGAAGGAAG(서열번호 23)이고, 본 발명에 의해 확인된 KLDIS3 gRNA-2 서열은 AGAGGTCAGTGTCTTTGATA (서열번호 24)이다.

플라스미드의 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLDIS3-F1: ATGGGACTTTTTCAGCAGCTAAGAAGGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC (서열번호 25) 및 pCas9-KLDIS3-R1: AGCTCTAAAACCTTCCTTCTTAGCTGCTGAAAAAGTCCCATTCGCCACCCG(서열번호 26)와 pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLDIS3-F2: ATGGGACTTTAGAGGTCAGTGTCTTTGATAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC (서열번호 27) 및 pCas9-KLDIS3-R2: AGCTCTAAAACTATCAAAGACACTGACCTCTAAAGTCCCATTCGCCACCCG (서열번호 28)을 각각 이용하여 두 개의 PCR 증폭 과정을 수행하였다.각각의 PCR 증폭 과정에서의 산물 17μL을 혼합한 후 1 μL의 Dpn I및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가 한 후, 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI이 처리된 혼합물 10μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLDIS3-1 및 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_ KLDIS3-2이다. pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLDIS3-1를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F1: TAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCG (서열번호 29) 및 pCas9-R1: TATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 30) 를 이용하여 하나의 PCR 증폭 과정을 수행하였으며, 다른 PCR 증폭 과정은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLDIS3-2를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F2: TATGGAACGCAAACTTCTGTCTAGTGGATAGTATATGTGTTATGTAGTATACTCTTTCTTCAACAATTAAATACTCTCGG (서열번호 31) and pCas9-R2: CGAGGCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 32)를 이용하여 수행하였다. pCas9-F1/pCas9-R1 및 pCas9-F2/pCas9-R2 PCR 증폭 산물을 1:5의 비율로 혼합한 후, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신-내성 (Kan-resistant) LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLDIS-1&2이다(도 12에 나타냄).

3.2 공여체 DNA플라스미드의 구축 및 증폭

선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pMD18 플라스미드에 삽입한 다음 PCR에 의해 증폭시켜 본 발명에서 선형 공여체 DNA를 수득 하였다.

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 한프라이머 KLDIS3-F1: CCCGGGGATCCTCTAGAGATGCTGCTAGGTGACAGAAGGTTGTCC (서열번호 33) 및 KLDIS3-R1: CATGCCTGCAGGTCGACGATCCAAAGAAGAACGTCGTAAGACCGC (서열번호 34)을 이용하여 수행하였으며; 다른 PCR 증폭은 pMD18 플라스미드를 주형으로 한 쌍의 프라이머 pMD18-F: ATCGTCGACCTGCAGGCATG (서열번호 35) 및 pMD18-R: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG (서열번호 36) 을 이용하여 수행하였다. 두 PCR 증폭 과정의 산물(각 PCR 산물에 대해 8.5μL)을 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 KLDIS3-pMD18이다

PCR 증폭은KLDIS3-DD-pMD18플라스미드를 주형으로 한 프라이머 KLDIS3-F2: CTCTTCTGTTTAGCACCCGGTTATAGCTTAATTTATTAATTATGTACATTATATAAAAACTATTGTC (서열번호 37) 및 KLDIS3-R2: AAGCTATAACCGGGTGCTAAACAGAAGAGTATGACGTTTTATACTTCTCCAG (서열번호 38)를 이용하여 수행하였고; KLDIS3-DD-pMD18의 플라스미드를 구축하였다(도 13에 나타냄). 구체적인 단계는 다음과 같다: 두 개의 PCR 산물(PCR 산물 각 8.5μL)를 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음,단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. 그것들을 PCR을 통해 양성 확인을 하고 시퀀싱을 통해 확인한 다음, 플라스미드를 추출 및 저장하였다.

3.3 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환 및 양성 확인

3.3.1 클루이베로마이세스 락티스 용액을 YPD 고체 배지에서 획선 도말(streaked)하고 배양 하였다. 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 25 mL 2× YPD 액체 배지에서 밤새도록 진탕 배양 하였다. 2 mL 효모 용액을 취한 다음 50 mL 2×YPD 액체 배지에서 2시간 내지 8시간 동안 추가적으로 진탕 배양하였다. 그 후, 효모 세포를 20℃의 조건 하에서 3,000g에서 5분 동안 원심 분리하여 수집하고, 500㎕의 멸균수를 첨가하여 재현탁시켰다. 유사하게, 일한 조건 하에 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 컴피턴트 세포 용액(5% v/v 글리세롤 및 10% v/v DMSO)를 준비하고, 해당 용액 500μL에 효모 세포를 용해시켰다. 50 μL의 등분량을 1.5 mL 원심분리 튜브에 등분하고 -80 ℃에서 저장하였다.

3.3.2. 컴피턴트 세포를 37 ℃에서 15 내지 30초 동안 해동시키고, 13,000g에서 2 분 동안 원심분리한 다음, 상층액(supernatant)을 제거하였다. 형질전환 버퍼 용액은 다음과 같이 준비하였다: 260 μL PEG 3350(50% (w/v)), 36 μL LiAc(1.0 M), 20 μL 캐리어(carrier) DNA (5.0 mg/mL), 15 μL Cas9/gRNA 플라스미드 및 10 μL 공여체 DNA를 첨가한다; 그 다음 멸균수를 첨가하여 최종 부피 360μL의 혼합물을 형성하였다. 열충격 후, 상층액을 제거하기 위하여 30초 동안 13,000g 조건에서 원심분리를 수행하였다. 1 mL YPD 액체 배지를 첨가하고, 혼합물을 2시간 내지 3시간 동안 인큐베이션 하였다. 혼합물 200 μL를 파이펫(pipetted)하고, YPD (200 μg/mL G418) 고체배지 상에 코팅한 다음 단일클론 콜로니로 자랄 때까지 2 내지 3일동안 인큐베이션하였다.

3.3.3 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포를 갖는 플레이트로부터 10 내지 20개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라내었다. 단일 클론 콜로니를 1mL YPD (200μg / mL G418)에 놓고 밤새 진탕배양 하였다. 효모 용액을 주형으로 한 KLEXN53-CICF1의 CRISPR 삽입 체크 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 샘플을 검출하였다. 샘플은 효모 용액을 주형으로 한 CRISPR 삽입 확인 프라이머KLDIS3-CICF1: CACCAACAACAGGAAATCTCATG (서열번호 39) 및 KLDIS3-CICR1: CAGTACAGAA GCTCAGCAAC AACC (서열번호 40) 를 사용하여 PCR에 의해 검출되었다. PCR에 의해 양성으로 확인되고 시퀀싱에 의해 확인된 균주는 양성 균주로 결정되었다.

실시예 4: CRISPR-Cas9를 통한 Rat1 유전자의 표적 녹-아웃

4.1 KLRat1 서열 검색 및 CIRSPR gRNA 서열 결정

4.1.1 유전자의 표적화된 녹-아웃을위한 클로닝 벡터 플라스미드의 구축

KEGG 데이터베이스에서, BLAST 정렬 분석은 Rat1 유전자에 기초하여 수행되었다. 그 결과, KEGG 데이터베이스에서 K1LA0A10835g의 코드를 갖는 클루이베로마이세스 락티스에서 Rat1의유전자 서열(서열번호 3)이 결정되었다. 결정된 유전자 서열은 사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae)에서 Rat1에 대해 60.38%의 유전자 서열 상동성 및 62.30%의 단백질 서열 상동성을 갖고, 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서Rat1에 대해 50.53%의 유전자 서열 상동성 및 39.73%의 단백질 서열 상동성을 가지며, 호모 사피엔스(H. sapiens)에서 Rat1에 대해 50.15%의 유전자 서열 상동성 및 41.41%의 단백질 서열 상동성을 갖는다(도 7에 나타냄). 결정된 유전자 서열은 특유의EXN53 5'에서 3'엑소뉴클레아제 도메인을 갖는다(도 4에 나타냄). 이 유전자의 이름은 KLRat1(염색체 F의 703955…에 위치함)이다.

PAM 서열(NGG)은 Rat1 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈에서 검색하였고, gRNA서열을 확인하였다.gRNA의 선택의 원리는 다음과 같다: GC 함량이 적당해야 하고(본 발명에서 표준은 GC 함량이 40% 내지 60%의 범위에 있다는 것이다), 폴리 T구조의 존재는 피해야 한다. 이에 따라, 본 발명에 의해 확인된 KLRat1 gRNA-1서열은 GTAAGGCCAGGTACTCACAA (서열번호 41)이고, 본 발명에 의해 확인된 KLRat1 gRNA-2 서열은 CTCGCAACAGAGACAGCCAC (서열번호 42)이다.

플라스미드의 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLRat1-F1:ATGGGACTTTGTAAGGCCAGGTACTCACAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC (서열번호 43) 및 pCas9-KLRat1-R1: AGCTCTAAAACTTGTGAGTACCTGGCCTTACAAAGTCCCATTCGCCACCCG (서열번호 44) 와 pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLRat1-F2: ATGGGACTTTCTCGCAACAGAGACAGCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC (서열번호 45) 및 pCas9-KLRat1-R2: AGCTCTAAAACGTGGCTGTCTCTGTTGCGAGAAAGTCCCATTCGCCACCCG (서열번호 46) 을 각각 이용하여 두 개의 PCR 증폭 과정을 수행하였다. 각각의 PCR 증폭 과정에서의 산물 17μL을 혼합한 후 1 μL의 Dpn I및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가 한 후, 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI이 처리된 혼합물 10μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신-내성(Kan-resistant) LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRat1-1 및pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRat1-2이다.

pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRat1-1를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F1: TAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCG (서열번호 47) 및 pCas9-R1: TATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 48) 를 이용하여 하나의 PCR 증폭 과정을 수행하였으며, 다른 PCR 증폭 과정은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLDIS3-2를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F2: TATGGAACGCAAACTTCTGTCTAGTGGATAGTATATGTGTTATGTAGTATACTCTTTCTTCAACAATTAAATACTCTCGG (서열번호 49) 및 pCas9-R2: CGAGGCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 50)를 이용하여 수행하였다. pCas9-F1/pCas9-R1 및 pCas9-F2/ pCas9-R2 증폭 산물을 1:5의 비율로 혼합한 후, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRat1-1&2이다(도 14에 나타냄).

4.2 공여체 DNA플라스미드의 구축 및 증폭

선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저본 발명에서 pMD18 플라스미드에 삽입한 다음 PCR에 의해 증폭시켜 선형 공여체 DNA서열을 수득 하였다.

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 한프라이머 KLRat1-F1: CCCGGGGATCCTCTAGAGATGCTGCATGGTCACAGGAGATGC (서열번호 51) 및 KLRat1-R1: CATGCCTGCAGGTCGACGATGGTACGTGAGGCGACAATATGGTCC (서열번호 52)을 이용하여 수행하였으며; 다른 PCR 증폭 과정은 pMD18 플라스미드를 주형으로 한 프라이머 pMD18-F: ATCGTCGACCTGCAGGCATG (서열번호 53) 및 pMD18-R: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG (서열번호 54)을 이용하여 수행하였다. 두 PCR 증폭 과정의 산물(각 PCR 산물에 대해 8.5μL)을 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 KLRat1-pMD18이다.

PCR 증폭은 KLRat1-pMD18 플라스미드를 주형으로 한 프라이머 KLRat1-F2: CCAGGTACTCACATGAACTGTGGACAATTTTATACCCGTTTATATCAGCAC (서열번호 55) 및 KLRat1-R2: TGTCCACAGTTCATGTGAGTACCTGGCCTTACTTCTCGC (서열번호 56)를 이용하여 수행하였고; KLRat1-DD-pMD18를 (도 15에 나타냄). 구체적인 단계는 다음과 같다: 두 개의 PCR 산물(PCR 산물 각 8.5μL)를 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. 그것들을 PCR을 통해 양성 확인을 하고 시퀀싱을 통해 확인한 다음, 플라스미드를 추출 및 저장하였다.

4.3 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환 및 양성 확인

4.3.1 클루이베로마이세스 락티스 용액을 YPD 고체 배지에서 획선 도말(streaked)하고 배양 하였다. 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 25 mL 2× YPD 액체 배지에서 밤새도록 진탕 배양하였다. 2 mL 효모 용액을 취한 2×YPD 액체 배지에서 2시간 내지 8시간 동안 추가적으로 진탕 배양하였다. 그 후, 효모 세포를 20℃의 조건 하에서 3,000g에서 5분 동안 원심 분리하여 수집하고, 500 μL의 멸균수를 첨가하여 재현탁시켰다. 유사하게, 동일한 조건 하에 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 컴피턴트 세포 용액(5% v/v 글리세롤 및 10% v/v DMSO)를 준비하고, 해당 용액 500μL에 효모 세포를 용해시켰다. 50 μL의 등분량을 1.5 mL 원심분리 튜브에 등분하고 -80 ℃에서 저장 하였다.

4.3.2. 컴피턴트 세포를 37 ℃에서 15 내지 30초 동안 해동시키고, 13,000g에서 2 분 동안 원심분리한 다음,상층액(supernatant)을 제거하였다. 형질전환 버퍼 용액은 다음과 같이 준비하였다: 260 μL PEG 3350(50% (w/v)), 36 μL LiAc(1.0 M), 20 μL 캐리어(carrier) DNA (5.0 mg/mL), 15 μL Cas9/gRNA 플라스미드 및 10 μL 공여체 DNA를 첨가한다; 그 다음 멸균수를 첨가하여 최종 부피 360μL의 혼합물을 형성하였다. 열충격 후, 상층액을 제거하기 위하여 30초 동안 13,000g 조건에서 원심분리를 수행하였다. 1 mL YPD 액체 배지를 첨가하고, 혼합물을 2시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물 200 μL를 파이펫(pipetted)하고, YPD (200 μg/mL G418) 고체배지 상에 코팅한 다음 단일클론 콜로니로 자랄 때까지 2 내지 3일동안 인큐베이션 하였다.

4.3.3 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포를 갖는 플레이트로부터 10 내지 20개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라내었다. 단일 클론 콜로니를 1mL YPD (200 μg/mL G418)에 놓고 밤새 진탕배양하였다. 샘플은 효모 용액을 주형으로 한 CRISPR 삽입 확인 프라이머KLRat1-CICF1: TAAGACAGGTACCCTCACGACG (서열번호 57) 및 KLRat1-CICR1: CTTGGAAGTGGATACATTTCTAGAGG (서열번호 58) 를 사용하여 PCR에 의해 검출되었다. PCR에 의해 양성으로 확인되고 시퀀싱에 의해 확인된 균주는 양성 균주로 결정되었다.

실시예 5: CRISPR-Cas9를 통한 Rrp6 유전자의 표적 녹-아웃

5.1 KLRrp6 서열 검색 및 CIRSPR gRNA 서열 결정

5.1.1 유전자의 표적화된 녹-아웃을위한 클로닝 벡터 플라스미드의 구축

KEGG 데이터베이스에서, BLAST 정렬 분석은 Rrp6 유전자에 기초하여 수행되었다. 그 결과, KEGG 데이터베이스에서 KlLA0D01309g의 코드를 가지며 가설 단백질로 지칭되는 클루이베로마이세스 락티스에서 Rrp6의유전자 서열(서열번호 4)이 결정되었다. 결정된 유전자 서열은 사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae)에서 Rrp6에 대해55.04%의 유전자 서열 상동성 및 46.93%의 단백질 서열 상동성을 갖고, 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서Rrp6에 대해 44.04%의유전자 서열 상동성 및 29.85%의 단백질 서열 상동성을 가지며, 호모 사피엔스(H. sapiens)에서Rrp6에 대해 40.44%의 유전자 서열 상동성 및 23.53%의 단백질 서열 상동성을 갖는다(도 8에 도시됨). 결정된 유전자 서열은 특유의Rrp6p-유사 엑소뉴클레아제 도메인, PMC2NT 도메인뿐만 아니라 헬리카아제(Helicase) 및 RNase D c-말단 도메인을 갖는다(도 4에 나타냄). 이 유전자의 이름은 KLRrp6 (염색체 D의 114713…에 위치함)이다.

PAM 서열(NGG)은 Rrp6 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈에서 검색하였고, gRNA서열을 확인하였다. gRNA의 선택의 원리는 다음과 같다:GC 함량이 적당해야 하고(본 발명에서 표준은 GC 함량이 40% 내지 60%의 범위에 있다는 것이다), 폴리 T구조의 존재는 피해야 한다. 이에 따라, 본 발명에 의해 확인된 KLRrp6 gRNA -1 서열은 CACCATGTCTTCAGAGGATA이고, 본 발명에 의해 확인된 KLRrp6gRNA - 2서열은 CCGACATGTTCAACAGAGTA이다.

플라스미드의 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다:pCAS플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLRrp6-F1: ATGGGACTTTCACCATGTCTTCAGAGGATAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC (서열번호 59) 및pCas9-KLRrp6-R1: AGCTCTAAAACTATCCTCTGAAGACATGGTGAAAGTCCCATTCGCCACCCG (서열번호 60) 와 pCAS플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLRrp6-F2: ATGGGACTTTCCGACATGTTCAACAGAGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC (서열번호 61) 및Rrp6-R2: AGCTCTAAAACTACTCTGTTGAACATGTCGGAAAGTCCCATTCGCCACCCG (서열번호 62)을 각각 이용하여 두 개의 PCR 증폭 과정을 수행하였다. 각각의 PCR 증폭 과정에서의 산물 17μL을 혼합한 후 1 μL의 Dpn I및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가 한 후, 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI이 처리된 혼합물 10μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후,1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRrp6-1 및 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRrp6-2이다. pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRrp6-1를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F1: TAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCG (서열번호 63) 및 pCas9-R1: TATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 64)를 이용하여 하나의 PCR 증폭 과정을 수행하였으며, 다른 PCR 증폭 과정은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRrp6-2를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F2: TATGGAACGCAAACTTCTGTCTAGTGGATAGTATATGTGTTATGTAGTATACTCTTTCTTCAACAATTAAATACTCTCGG (서열번호 65) 및 pCas9-R2: CGAGGCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 66) 를 이용하여 수행하였다. pCas9-F1/pCas9-R1 및 pCas9-F2/pCas9-R2 증폭 산물을 1:5의 비율로 혼합한 후, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLRrp6-1&2이다(도 16에 나타냄).

5.2 공여체 DNA플라스미드의 구축 및 증폭

선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pMD18 플라스미드에 삽입한 다음 PCR에 의해 증폭시켜 선형 공여체 DNA서열을수득하였다.

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 한프라이머 KLRrp6-F1: CCCGGGGATCCTCTAGAGATGCGATAGCTTTAATCTGAGTGAACACCG (서열번호 67) 및 KLRrp6-R1: CATGCCTGCAGGTCGACGATGGGTACTCGTTGATAACATGATGCGTAG (서열번호 68)을 이용하여 수행하였으며; 다른 PCR 증폭 과정은 pMD18플라스미드를 주형으로 한 프라이머 pMD18-F: ATCGTCGACCTGCAGGCATG (서열번호 69) 및 pMD18-R: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG (서열번호 70) 을 이용하여 수행하였다. 두 PCR 증폭 과정의 산물(각 PCR 산물에 대해 8.5μL)을 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다.PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 KLRrp6-pMD18이다.

PCR 증폭은 KLRrp6-pMD18 플라스미드를 주형으로 한 프라이머 KLRrp6-F2: CTGACTCTAATCCACCAGCATCTTGAGCAGCTCTAATGGTATAAATATCG (서열번호 71) 및 KLRrp6-R2: GCTCAAGATGCTGGTGGATTAGAGTCAGCTGGTAGTCTAC (서열번호 72)를 이용하여 수행하였고; KLRrp6-DD-pMD18이 구축되었다(도 17에 나타냄). 구체적인 단계는 다음과 같다: 두 개의 PCR 산물(PCR 산물 각 8.5μL)를 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다.혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린-내성(Amp-resistant) LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. 그것들을 PCR을 통해 양성 확인을 하고 시퀀싱을 통해 확인한 다음, 플라스미드를 추출 및 저장하였다.

5.3 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환 및 양성 확인

5.3.1 클루이베로마이세스 락티스 용액을 YPD 고체 배지에서 획선 도말(streaked)하고 배양 하였다. 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 25 mL 2× YPD 액체 배지에서 밤새도록 진탕 배양 하였다. 2 mL 효모 용액을 취한 다음 50 mL 2×YPD 액체 배지에서 2시간 내지 8시간 동안 추가적으로 진탕 배양하였다. 그 후, 효모 세포를 20℃의 조건 하에서 3,000g에서 5분 동안 원심 분리하여 수집하고, 500 μL의 멸균수를 첨가하여 재현탁시켰다. 유사하게, 동일한 조건 하에 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 컴피턴트 세포 용액(5% v/v 글리세롤 및 10% v/v DMSO)를 준비하고, 해당 용액 500μL에 효모 세포를 용해시켰다. 50 μL의 등분량을 1.5 mL 원심분리 튜브에 등분하고 -80 ℃에서 저장하였다.

5.3.2. 컴피턴트 세포를 37 ℃에서 15 내지 30초 동안 해동시키고, 13,000g에서 2분 동안 원심분리한 다음, 상층액(supernatant)을 제거하였다. 형질전환 버퍼 용액은 다음과 같이 준비하였다: 260 μL PEG 3350(50% (w/v)), 36 μL LiAc(1.0 M), 20 μL 캐리어(carrier) DNA (5.0 mg/mL), 15 μL Cas9/gRNA 플라스미드 및 10 μL 공여체 DNA를 준비한다; 그 다음 멸균수를 첨가하여 최종 부피 360μL의 혼합물을 형성하였다. 열충격 후, 상층액을 제거하기 위하여 30초 동안 13,000g 조건에서 원심분리를 수행하였다. 1 mL YPD 액체 배지를 첨가하고, 혼합물을 2시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물 200 μL를 파이펫(pipetted)하고, YPD (200 μg/mL G418) 고체배지 상에 코팅한 다음 단일클론 콜로니로 자랄 때까지 2 내지 3일동안 인큐베이션 하였다.

5.3.3 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포를 갖는 플레이트로부터 10 내지 20개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라내었다. 단일 클론 콜로니를 1mL YPD (200 μg/mL G418)에 놓고 밤새 진탕배양 하였다. 샘플은 효모 용액을 주형으로 한 CRISPR 삽입 확인 프라이머KlRrp6-CICF1: TGGAGGCGTACAATGCAGTG (서열번호 73) 및 KlRrp6-CICR1: TGAACCCTCT TCCATGTCTC ATC (서열번호 74) 를 사용하여 PCR에 의해 검출되었다. PCR에 의해 양성으로 확인되고 시퀀싱에 의해 확인된 균주는 양성 균주로 결정되었다.

실시예 6: CRISPR-Cas9를 통한 NGL2 유전자의 표적 녹-아웃

6.1 KlNGL2 서열 검색 및 CIRSPR gRNA 서열 결정

6.1.1 유전자의 표적화된 녹-아웃을위한 클로닝 벡터 플라스미드의 구축

KEGG 데이터베이스에서, BLAST 정렬 분석은 NGL3 유전자에 기초하여 수행되었다. 그 결과, KEGG 데이터베이스에서 KlLA0C06248g의 코드를 갖는 클루이베로마이세스 락티스에서 NGL의유전자 서열(서열번호 5)이 결정되었다. 결정된 유전자 서열은 사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae)에서NGL3에 대해 46.26%의 유전자 서열 상동성 및 46.34%의 단백질 서열 상동성을 갖고, 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서NGL2에 대해 45.42%의 유전자 서열 상동성 및 29.07%의 단백질 서열 상동성을 가지며, 호모 사피엔스(H. sapiens)에서NGL3에 대해 38.72%의 유전자 서열 상동성 및 19.89%의 단백질 서열 상동성을 갖는다(도 9에 도시됨). 결정된 유전자 서열은 특유의엑소뉴클레아제-엔도뉴클레아제-포스파타아제 (Exonuclease-Endonuclease-Phosphatase, EEP) 도메인을 갖는다(도 4에 나타냄). 이 유전자의 이름은 KlNGL2(염색체 C의 552493…에 위치함)이다.

PAM 서열(NGG)은 KlNGL2 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈에서 검색하였고, gRNA서열을 확인하였다. gRNA의 선택의 원리는 다음과 같다: GC 함량이 적당해야 하고(본 발명에서 표준은 GC 함량이 40% 내지 60%의 범위에 있다는 것이다), 폴리 T구조의 존재는 피해야 한다. 이에 따라, 본 발명에 의해 확인된 KlNGL2 gRNA -1 서열은 GCTGGTAGTACGCAAGACAC (서열번호 75)이고, 본 발명에 의해 확인된 KlNGL2 gRNA -2서열은 TTGTGCATGATTGTTAAACT (서열번호 76)이다.

플라스미드의 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLNGL2-F1: TATCCAGACACCAAAGTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC (서열번호 77) 및 pCas9-KLNGL3-R1: GCTCTAAAACCTGACTTTGGTGTCTGGATAAAAGTCCCATTCGCCACCCG (서열번호 78) 와 pCAS 플라스미드를 주형으로 한 한 쌍의 프라이머 pCas9-KLNGL2-F2: TTGTGCATGATTGTTAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT (서열번호 79) 및 pCas9-KLNGL2-R2: CGGGTGGCGAATGGGACTTTTTGTGCATGATTGTTAAACTGTTTTAGAGC (서열번호 80) 을 각각 이용하여 두 개의 PCR 증폭 과정을 수행하였다. 각각의 PCR 증폭 과정에서의 산물 17μL을 혼합한 후 1 μL의 Dpn I및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가 한 후, 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI이 처리된 혼합물 10μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신-내성(Kan-resistant)LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행 하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLNGL2-1 및pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLNGL3-2, 이다.pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLNGL2-1 를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F1: TAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCG (서열번호 81) 및 pCas9-R1: TATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 82) 를 이용하여 하나의 PCR 증폭 과정을 수행하였다.다른 PCR 증폭 과정은 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLNGL2-2를 주형으로 한 프라이머 pCas9-F2: TATGGAACGCAAACTTCTGTCTAGTGGATAGTATATGTGTTATGTAGTATACTCTTTCTTCAACAATTAAATACTCTCGG (서열번호 83) 및 pCas9-R2: CGAGGCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATCCACTAGACAGAAGTTTGCGTTCC (서열번호 84)를 이용하여 수행하였다. pCas9-F1/pCas9-R1 및 pCas9-F2/pCas9-R2 증폭 산물을 1:5의 비율로 혼합한 후, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 각각 pHoCas9_SE_Kana_tRNA_ScRNR2_KLNGL3-1&2이다(도 18에 나타냄).

6.2 공여체 DNA플라스미드의 구축 및 증폭

선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pMD18 플라스미드에 삽입한 다음 PCR에 의해 증폭시켜 선형 공여체 DNA 서열을 수득 하였다.

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 한프라이머 KlNGL2-F1: GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCGAATACGTGAAACAGCCTAGGAA (서열번호 85) 및 KlNGL2-R1: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCACGGCCCTAGTACTAATCCCAT (서열번호 86)을 이용하여 수행하였으며; 다른 PCR 증폭 과정은 pMD18 플라스미드를 주형으로 한 pMD18-F: ATCGTCGACCTGCAGGCATG (서열번호 87) 및 pMD18-R: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG (서열번호 88)을 이용하여 수행하였다. 두 PCR 증폭 과정의 산물(각 PCR 산물에 대해 8.5μL)을 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다.PCR-양성 검출및 시퀀싱으로 확인하고,플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드의 이름은 KlNGL2-pMD18이다.

PCR 증폭은 KlNGL3-pMD1 플라스미드를 주형으로 한 프라이머 KlNGL2-F2: GAAGTAATAATTTGAGCCAATATATTCATAAACTGTTTAACTATGGACTACACTACAG (서열번호 89) 및 KlNGL2-R2: CCATAGTTAAACAGTTTATGAATATATTGGCTCAAATTATTACTTCTACTTTGCAGTG (서열번호 90)를 이용하여 수행하였고; KlNGL2-DD-pMD18는 구축되었다(도 19에 나타냄). 구체적인 단계는 다음과 같다: 두 개의 PCR 산물(PCR 산물 각 8.5μL)를 혼합하고, 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가한 다음 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 100μL에 첨가하였다.혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42 ℃에서 45초 동안 열-충격한 후, 1mL의 LB 액체 배지를 첨가한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(shaking) 배양하였다. 그 후, 혼합물을 엠피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 다음, 단일클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 다섯 개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. 그것들을 PCR을 통해 양성 확인을 하고 시퀀싱을 통해 확인한 다음, 플라스미드를 추출 및 저장하였다.

6.3 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환 및 양성 확인

6.3.1 클루이베로마이세스 락티스 용액을 YPD 고체 배지에서 획선 도말(streaked)하고 배양 하였다. 단일클론 콜로니를 선택하여 골라낸 다음 25 mL 2× YPD 액체 배지에서 밤새도록 진탕 배양 하였다. 2 mL 효모 용액을 취한 다음 50 mL 2×YPD 액체 배지에서 2시간 내지 8시간 동안 추가적으로 진탕 배양 하였다. 그 후, 효모 세포를 20℃의 조건 하에서 3,000g에서 5분 동안 원심 분리하여 수집하고, 500 μL의 멸균수를 첨가하여 재현탁시켰다. 유사하게, 동일한 조건 하에 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 컴피턴트 세포 용액(5% v/v 글리세롤 및 10% v/v DMSO)를 준비하고, 해당 용액 500μL에 효모 세포를 용해시켰다. 50 μL의 등분량을 1.5 mL 원심분리 튜브에 등분하고 -80 ℃에서 저장 하였다.

6.3.2. 컴피턴트 세포를 37 ℃에서 15 내지 30초 동안 해동시키고, 13,000g에서 2분 동안 원심분리한 다음, 상층액(supernatant)을 제거하였다. 형질전환 버퍼 용액은 다음과 같이 준비하였다: 260 μL PEG 3350(50% (w/v)), 36 μL LiAc(1.0 M), 20 μL 캐리어(carrier) DNA (5.0 mg/mL), 15 μL Cas9/gRNA 플라스미드 및 10 μL 공여체 DNA를 첨가한다; 그 다음 멸균수를 첨가하여 최종 부피 360μL의 혼합물을 형성하였다. 열충격 후, 상층액을 제거하기 위하여 30초 동안 13,000g 조건에서 원심분리를 수행하였다. 1 mL YPD 액체 배지를 첨가하고, 혼합물을 2시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물 200 μL를 파이펫(pipetted)하고, YPD (200 μg/mL G418) 고체배지 상에 코팅한 다음 단일클론 콜로니로 자랄 때까지 2 내지 3일동안 인큐베이션하였다.

6.3.3 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포를 갖는 플레이트로부터 10 내지 20개의 단일클론 콜로니를 선택하여 골라내었다. 단일 클론 콜로니를 1mL YPD (200 μg/mL G418)에 놓고 밤새 진탕배양하였다. 샘플은 효모 용액을 주형으로 한 CRISPR 삽입 확인 프라이머KlNGL2-CICF1: ATATTGTCTAGCAGCTCATCGCGTA (서열번호 91) 및 KlNGL2-CICR1: AAGCAGATTTATGCACGAATTGCC (서열번호 92) 를 사용하여 PCR에 의해 검출되었다. PCR에 의해 양성으로 확인되고 시퀀싱에 의해 확인된 균주는 양성 균주로 결정되었다.

실시예 7: 무세포 시험관 내 단백질 합성 시스템의 준비 및 단백질 합성 효율의 분석

실험 방법:

i. 시험관 내 단백질 합성 시스템의 보관 용액(stored solution)을 위한 준비: pH 7.4인 1M 4-하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산; 5M아세트산 칼륨; 250 mM아세트산 마그네슘;25 mM ATP, GTP, CTP 및 UTP를 포함하는 4개의 뉴클레오시드 3 인삼염의 혼합물; 1mM 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하는 20가지 유형의 아미노산 혼합물; 상기 각 유형의 아미노산 농도는 1.0 mM; 1M 포스포크레아틴; 1M 디티오트레이톨(DTT); 6.48 mg/mL 크레아틴 포스포키나아제; 1.7mg/mL T7 RNA 중합효소; 20%-50% PEG 3350 또는 PEG 8000; 및 20%-40% 수크로오스;

ii. 시험관 내 단백질 합성 반응 시스템은: pH7.4의 최종농도가 22mM인 4-하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산, 30-150 mM 아세트산 칼륨, 1.0-5.0 mM 아세트산 마그네슘, 1.5 mM - 4 mM 4개의 뉴클레오시드 3 인삼염의 혼합물(ATP, GTP, CTP 및 UTP을 포함), 0.08-0.24 mM 아미노산 혼합물(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함), 25 mM 포스포크레아틴, 1.7 mM 디티오트레이톨(DTT), 0.27 mg/ml 크레아틴 포스포키나아제, 8-20 ng/μL 반딧불이 루시페라아제 DNA, 0.027-0.054 mg/mL T7 RNA 중합효소, 1%-4% PEG, 및 최종적으로 효모 추출물을 부피의 50% 첨가;

iii. 시험관 내 단백질 합성 반응:상기 언급된 반응 시스템을 20-30℃ 환경에 두고,혼합물을 2 내지 6시간 동안 반응을 위해 유지시킴;

iv. 루시페라아제의 활성 분석: 반응을 완료한 후에, 동일한 부피의 기질로서 루시페린(luciferin)을 96-웰 화이트 플레이트 또는 384-웰 화이트 플레이드에 상기 반응을 위해 웰에 첨가하고, 이를 바로 Envision 2120 다기능 마이크로플레이트리더기(multifunctional microplate reader)(Perkin Elmer)에 놓고;반딧불이 루시페라아제의 활성을 확인하기 위해 흡광도를 측정하고,활성 값은 상대적 발광 수치(RLU) 값이며, 도20에 나타내었다.

실험 결과

실시예 7의 분석 결과는 뉴클레아제가 녹-아웃된 모든 돌연변이 균주 중에서 ΔKLEXN53균주가 효모-기반 시험관 내 단백질 시스템의 효율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 나타낸다(표 2에 나타냄). 이것은 또한 야생형 균주는 IVTT 시스템에서 2.90×10⁸의 루시페라아제 활성 값을 갖고, ΔKLEXN53 효모 균주는 IVTT 시스템에서 7.16×10⁸의 루시페라아제 활성 값을 갖는 것을 나타내며, 상기 ΔKLEXN53의루시페라아제 활성 값은 야생형 균주의 값의 2.46배 임을 나타낸다(도 20에 나타냄).

	IVTT (RLU)에서의 루시퍼라제 활성	야생형 균주에 대한 ΔKLEXN53 균주의 활성비 (RLU value ofΔKLEXN53 strain /RLU value of wild-type strain)
ΔKLEXN53 균주	7.16×10⁸	2.46 folds
ΔKLNGL2 균주	5.83×10⁸	2.03 folds

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ctgaaatatc taattgggca 1320 catgcatgga gaggtttgtt agactacttg tattatgtta catcatggga tggatgcgat 1380 tgtactaaga tagatgagct atcaacattt gagcaaaatt atggagttca agttcttgag 1440 cttctaagaa tacctcccgc caaggaaatg acagagcatg gacaacctca tgaaggtgaa 1500 tatcctagtg atcatttgtg catgattgtt aaactgggaa tcataatgta a 1551 <210> 6 <211> 513 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 6 Met Gly Ile Pro Lys Phe Phe His Phe Ile Ser Glu Arg Trp Pro Gln 1 5 10 15 Ile Ser Gln Leu Ile Asp Gly Ser Gln Ile Pro Glu Phe Asp Asn Leu 20 25 30 Tyr Leu Asp Met Asn Ser Ile Leu His Asn Cys Thr His Gly Asp Gly 35 40 45 Ser Glu Val Asn Ser Arg Leu Ser Glu Glu Glu Val Tyr Ser Lys Ile 50 55 60 Phe Ser Tyr Ile Asp His Leu Phe His Thr Ile Lys Pro Lys Gln Thr 65 70 75 80 Phe Tyr Met Ala Ile Asp Gly Val Ala Pro Arg Ala Lys Met Asn Gln 85 90 95 Gln Arg Ala Arg Arg Phe Arg Thr Ala Met Asp Ala Glu Lys Ala Leu 100 105 110 Gln Lys Ala Ile Glu Asn Gly Asp Glu Leu Pro Lys Gly Glu Pro Phe 115 120 125 Asp Ser Asn Ala Ile Thr Pro Gly Thr Glu Phe Met Ala Lys Leu Thr 130 135 140 Glu Asn Leu Lys Tyr Phe Ile His Asp Lys Ile Thr Asn Asp Thr Arg 145 150 155 160 Trp Gln Asn Val Lys Val Ile Phe Ser Gly His Glu Val Pro Gly Glu 165 170 175 Gly Glu His Lys Ile Met Asp Tyr Ile Arg Ala Ile Arg Ala Gln Glu 180 185 190 Asp Tyr Asn Pro Asn Thr Arg His Cys Ile Tyr Gly Leu Asp Ala Asp 195 200 205 Leu Ile Ile Leu Gly Leu Ser Thr His Asp His His Phe Cys Leu Leu 210 215 220 Arg Glu Glu Val Thr Phe Gly Lys Arg Ser Ser Ser Val Lys Thr Leu 225 230 235 240 Glu Thr Gln Asn Phe Phe Leu Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Glu Tyr 245 250 255 Leu Ala Leu Glu Phe Glu Glu Ile Thr Asp Ser Val Gln Phe Glu Tyr 260 265 270 Asp Phe Glu Arg Val Leu Asp Asp Phe Ile Phe Val Leu Phe Thr Ile 275 280 285 Gly Asn Asp Phe Leu Pro Asn Leu Pro Asp Leu His Leu Lys Lys Gly 290 295 300 Ala Phe Pro Val Leu Leu Gln Thr Phe Lys Glu Ala Leu Gln His Met 305 310 315 320 Asp Gly Tyr Ile Asn Glu Gln Gly Lys Ile Asn Leu Ala Arg Phe Ser 325 330 335 Ile Trp Leu Lys Tyr Leu Ser Asp Phe Glu Tyr Leu Asn Phe Glu Lys 340 345 350 Lys Asp Ile Asp Val Glu Trp Phe Asn Gln Gln Leu Glu Asn Ile Ser 355 360 365 Leu Glu Gly Glu Arg Lys Arg Thr Arg Met Gly Lys Lys Leu Leu Met 370 375 380 Lys Gln Gln Lys Lys Leu Ile Gly Ala Val Lys Pro Trp Leu Leu Lys 385 390 395 400 Thr Val Gln Arg Lys Val Thr Ser Glu Leu Gln Asp Ala Asp Phe Glu 405 410 415 Ile Phe Pro Leu Glu Asp Lys Glu Leu Val Arg Ala Asn Leu Asp Phe 420 425 430 Leu Lys Glu Phe Ala Phe Asp Leu Gly Leu Ile Leu Ala His Ser Lys 435 440 445 Ser Lys Asp Leu Tyr Tyr Phe Lys Leu Asp Leu Asp Ser Ile Asn Val 450 455 460 Gln Glu Thr Asp Glu Glu His Glu Ala Arg Ile His Glu Thr Arg Arg 465 470 475 480 Ser Ile Lys Lys Tyr Glu Gln Gly Ile Ile Ile Ala Ser Glu Glu Glu 485 490 495 Leu Glu Glu Glu Arg Glu Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Val Glu Trp Lys 500 505 510 Asp <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 agagttcgac aatttgtact gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 60 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 8 gctctaaaac agtacaaatt gtcgaactct aaagtcccat tcgccacccg 50 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 9 cgtcgtggcc gtagtaatcg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 60 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 10 gctctaaaac cgattactac ggccacgacg aaagtcccat tcgccacccg 50 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 11 taggtctaga gatctgttta gcttgcctcg 30 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 12 tatccactag acagaagttt gcgttcc 27 <210> 13 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 13 tatggaacgc aaacttctgt ctagtggata gtatatgtgt tatgtagtat actctttctt 60 caacaattaa atactctcgg 80 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 14 cgaggcaagc taaacagatc tctagaccta tatccactag acagaagttt gcgttcc 57 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 15 gtacccgggg atcctctaga gatccagttg cagagcctcc gaa 43 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 16 catgcctgca ggtcgacgat gcgaaacctt agctctttat cgaac 45 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 17 atcgtcgacc tgcaggcatg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 18 atctctagag gatccccggg 20 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 19 atgttggttt gaatggacta ttaacagtaa atattatatc acttc 45 <210> 20 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 20 gaagtgatat aatatttact gttaatagtc cattcaaacc aacatttatt ttagttaagc 60 cacaaaccgt aattaattga acac 84 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 21 tttgctggtt gcccgtattc cc 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 22 taatagcaca gggaatgcac ctt 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 23 ttcagcagct aagaaggaag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 24 agaggtcagt gtctttgata 20 <210> 25 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 25 atgggacttt ttcagcagct aagaaggaag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60 aaggctagtc c 71 <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 26 agctctaaaa ccttccttct tagctgctga aaaagtccca ttcgccaccc g 51 <210> 27 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 27 atgggacttt agaggtcagt gtctttgata gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60 aaggctagtc c 71 <210> 28 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 28 agctctaaaa ctatcaaaga cactgacctc taaagtccca ttcgccaccc g 51 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 29 taggtctaga gatctgttta gcttgcctcg 30 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 30 tatccactag acagaagttt gcgttcc 27 <210> 31 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 31 tatggaacgc aaacttctgt ctagtggata gtatatgtgt tatgtagtat actctttctt 60 caacaattaa atactctcgg 80 <210> 32 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 32 cgaggcaagc taaacagatc tctagaccta tatccactag acagaagttt gcgttcc 57 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 33 cccggggatc ctctagagat gctgctaggt gacagaaggt tgtcc 45 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 34 catgcctgca ggtcgacgat ccaaagaaga acgtcgtaag accgc 45 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 35 atcgtcgacc tgcaggcatg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 36 atctctagag gatccccggg 20 <210> 37 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 37 ctcttctgtt tagcacccgg ttatagctta atttattaat tatgtacatt atataaaaac 60 tattgtc 67 <210> 38 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 38 aagctataac cgggtgctaa acagaagagt atgacgtttt atacttctcc ag 52 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 39 caccaacaac aggaaatctc atg 23 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 40 cagtacagaa gctcagcaac aacc 24 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 41 gtaaggccag gtactcacaa 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 42 ctcgcaacag agacagccac 20 <210> 43 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 43 atgggacttt gtaaggccag gtactcacaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60 aaggctagtc c 71 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 44 agctctaaaa cttgtgagta cctggcctta caaagtccca ttcgccaccc g 51 <210> 45 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 45 atgggacttt ctcgcaacag agacagccac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60 aaggctagtc c 71 <210> 46 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 46 agctctaaaa cgtggctgtc tctgttgcga gaaagtccca ttcgccaccc g 51 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 47 taggtctaga gatctgttta gcttgcctcg 30 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 48 tatccactag acagaagttt gcgttcc 27 <210> 49 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 49 tatggaacgc aaacttctgt ctagtggata gtatatgtgt tatgtagtat actctttctt 60 caacaattaa atactctcgg 80 <210> 50 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 50 cgaggcaagc taaacagatc tctagaccta tatccactag acagaagttt gcgttcc 57 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 51 cccggggatc ctctagagat gctgcatggt cacaggagat gc 42 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 52 catgcctgca ggtcgacgat ggtacgtgag gcgacaatat ggtcc 45 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 53 atcgtcgacc tgcaggcatg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 54 atctctagag gatccccggg 20 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 55 ccaggtactc acatgaactg tggacaattt tatacccgtt tatatcagca c 51 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 56 tgtccacagt tcatgtgagt acctggcctt acttctcgc 39 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 57 taagacaggt accctcacga cg 22 <210> 58 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 58 cttggaagtg gatacatttc tagagg 26 <210> 59 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 59 atgggacttt caccatgtct tcagaggata gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60 aaggctagtc c 71 <210> 60 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 60 agctctaaaa ctatcctctg aagacatggt gaaagtccca ttcgccaccc g 51 <210> 61 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 61 atgggacttt ccgacatgtt caacagagta gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60 aaggctagtc c 71 <210> 62 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 62 agctctaaaa ctactctgtt gaacatgtcg gaaagtccca ttcgccaccc g 51 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 63 taggtctaga gatctgttta gcttgcctcg 30 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 64 tatccactag acagaagttt gcgttcc 27 <210> 65 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 65 tatggaacgc aaacttctgt ctagtggata gtatatgtgt tatgtagtat actctttctt 60 caacaattaa atactctcgg 80 <210> 66 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 66 cgaggcaagc taaacagatc tctagaccta tatccactag acagaagttt gcgttcc 57 <210> 67 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 67 cccggggatc ctctagagat gcgatagctt taatctgagt gaacaccg 48 <210> 68 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 68 catgcctgca ggtcgacgat gggtactcgt tgataacatg atgcgtag 48 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 69 atcgtcgacc tgcaggcatg 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 70 atctctagag gatccccggg 20 <210> 71 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 71 ctgactctaa tccaccagca tcttgagcag ctctaatggt ataaatatcg 50 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 72 gctcaagatg ctggtggatt agagtcagct ggtagtctac 40 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 73 tggaggcgta caatgcagtg 20 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 74 tgaaccctct tccatgtctc atc 23 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 75 gctggtagta cgcaagacac 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 76 ttgtgcatga ttgttaaact 20 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 77 tatccagaca ccaaagtcag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 60 <210> 78 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 78 gctctaaaac ctgactttgg tgtctggata aaagtcccat tcgccacccg 50 <210> 79 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 79 ttgtgcatga ttgttaaact gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagt 59 <210> 80 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 80 cgggtggcga atgggacttt ttgtgcatga ttgttaaact gttttagagc 50 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 81 taggtctaga gatctgttta gcttgcctcg 30 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 82 tatccactag acagaagttt gcgttcc 27 <210> 83 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 83 tatggaacgc aaacttctgt ctagtggata gtatatgtgt tatgtagtat actctttctt 60 caacaattaa atactctcgg 80 <210> 84 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 84 cgaggcaagc taaacagatc tctagaccta tatccactag acagaagttt gcgttcc 57 <210> 85 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 85 gagctcggta cccggggatc ctctagagat cgaatacgtg aaacagccta ggaa 54 <210> 86 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 86 gccaagcttg catgcctgca ggtcgacgat cacggcccta gtactaatcc cat 53 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 87 atcgtcgacc tgcaggcatg 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 88 atctctagag gatccccggg 20 <210> 89 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 89 gaagtaataa tttgagccaa tatattcata aactgtttaa ctatggacta cactacag 58 <210> 90 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 90 ccatagttaa acagtttatg aatatattgg ctcaaattat tacttctact ttgcagtg 58 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 91 atattgtcta gcagctcatc gcgta 25 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 92 aagcagattt atgcacgaat tgcc 24

Claims

다음을 포함하는 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템:
(a) 효모 세포 추출물;
(b) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol);
(c) 선택적(optional) 외래성 수크로오스; 및
(d) 선택적(optional) 용매, 상기 용매는 물 또는 수용성 용매이고,
상기에서, 효모 세포 추출물은 EXN53 단백질을 포함하고, 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하이다.
제1항에 있어서, 상기 EXN53 단백질은 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효모 소스로부터 유래된 것이며, 바람직하게는 클루이베로마이세스로부터 유래된 것인, 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템.
제1항에 있어서, 상기 EXN53 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(SEQ ID NO.: 1)인 것인, 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템.
제1항에 있어서, 상기 EXN53 단백질의 단백질 서열은 서열번호 6(SEQ ID NO.: 6)인 것인, 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템.
제1항에 있어서, 상기 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 0인 것인, 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템.
제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은 다음 그룹으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것인, 시험관 내 무세포(cell-free) 단백질 합성 시스템:
(e1) RNA합성을 위한 기질;
(e2) 단백질 합성을 위한 기질;
(e3) 마그네슘 이온;
(e4) 칼륨 이온;
(e5) 버퍼(buffer)용매;
(e6) RNA 중합효소;및
(e7) 에너지 재생(regeneration) 시스템.
EXN53 단백질을 포함하고, EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하인, 효모 세포 추출물.
다음 단계를 포함하는 제1항의 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 제작하기 위한 방법:
(a) 효모 세포 추출물, (b) 폴리에틸렌 글리콜, (c) 선택적 외래성 수크로오스, 및 (d) 선택적 용매 성분을 혼합하여 청구항 제1항의 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 수득하고, 상기 용매는 물 또는 수용성 용매이고; 효모 세포 추출물은 EXN53 단백질을 포함하고, 및 효모 세포 추출물에서 EXN53 단백질의 함량은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하이다.
다음 단계를 포함하는 시험관 내 단백질 합성 방법:
(i) 청구항 제1항의 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 준비하고, 및 가이드 단백질 합성을 위한 외래성 DNA 분자를 첨가하는 단계, 상기 단백질 합성 시스템에서 EXN53 단백질의 농도는 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 및 더욱 바람직하게는 2% 이하이고; 및
(ii) 단계 (i)에서 제공된 단백질 합성 시스템을 적합한 조건 하에서 T1 기간 동안 인큐베이션하여 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질을 합성하는 단계.
제9항에 있어서, 상기 방법은 (iii) 선택적으로, 단백질 합성 시스템으로부터 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질을 분리; 및/또는
단백질 합성 시스템으로부터 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질을 검출하는 것을 더 포함하는 것인, 시험관 내 단백질 합성 방법.
제9항에 있어서, 상기 외래성 DNA에 의해 암호화된 단백질은 루시페린, 또는 루시페라아제(예: 반딧불이 루시페라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역, 루시페라아제 돌연변이, α-아밀라아제, 엔테로신 A, C형간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 전구체, 인터페론 αA, 인터루킨-1β, 라이소자임, 혈청 알부민, 항체의 단쇄가변분절(scFv), 트란스타이레틴, 티로시나아제, 자일라나아제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 시험관 내 단백질 합성 방법.
엔지니어링 균주(engineering strain)로서,
상기 엔지니어링 균주는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 균주이고, 및
클루이베로마이세스 균주에서 EXN53 유전자(뉴클레아제 유전자)의 발현 수준 또는 활성은 감소되는 것인, 엔지니어링 균주.
제12항에 있어서, 상기 EXN53유전자의 발현 수준에 대응되는 발현 수준 또는 활성의 감소는 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하인 것인, 엔지니어링 균주.
제12항에 있어서, 상기 EXN53 유전자의 발현 수준 또는 활성의 감소가 다음 조건을 만족시키는 것인, 엔지니어링 균주:
A1 : A0의 비는 30% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하, 가장 바람직하게는 범위 는 0 내지 2%이고;
상기에서, A1은 EXN53 유전자의 발현 수준 또는 활성에 상응하고; 및
A0은 야생형 EXN53 유전자의 발현 수준 또는 활성에 상응한다.
시험관 내 단백질 합성의 효율성을 개선하기 위한 청구항 제12항의 엔지니어링 균주의 용도.