KR101668150B1

KR101668150B1 - 앰버 서프레션 활성이 증가된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소

Info

Publication number: KR101668150B1
Application number: KR1020140063078A
Authority: KR
Inventors: 박중찬; 하현준; 오주연
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2016-10-31
Also published as: KR20150136193A

Abstract

본 발명은 앰버 서프레션 활성이 증가된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명은 앰버 서프레서 tRNA의 안티코돈을 더 잘 인식하도록 유전적으로 변이된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)로서,
위 돌연변이 TyrRS는 320번, 321번 아미노산 잔기가 모두 알라닌(alanine)으로 치환되었거나; 또는 320번 잔기가 알라닌(alanine), 321번 잔기가 히스티딘(Histidine)으로 각각 치환된 것임을 특징으로 한다.

Description

앰버 서프레션 활성이 증가된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소{A tyrosyl-tRNA synthetase of Saccharomyces cerevisiae having an increased amber suppression activity}

본 발명은 단백질 생합성 시 앰버 서프레션(amber suppression)을 이용하여 단백질의 특정위치에 천연 및 비천연 아미노산을 도입하는 기술에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명은, 천연 및 비천연 아미노산의 위치특이적 도입에 활용될 수 있는 대장균 (E.coli)의 돌연변이된 initiator tRNA (fMam tRNA)를 더 잘 인식하여 앰버 서프레션 활성이 높아진 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)의 tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS)에 관한 것이다.

자연계에 일반적으로 존재하는 20종의 아미노산이 아닌 새로운 생화학적 특성을 나타내는 비천연 아미노산을 단백질의 특정 위치에 삽입하는 기술은 물리적, 화학적 및 생물학적 특성이 변화된 새로운 단백질을 만드는 좋은 방법이 될 수 있을 뿐만 아니라 단백질의 기능연구에도 활용될 수 있다.

앞서 이러한 시도가 다양한 방법으로 in vitro에서 시도되었다. 난센스 코돈(nonsense codon)을 인식하는 suppressor tRNA에 비천연 아미노산을 화학적으로 결합한 후, 이를 in vitro 번역시스템에 넣어 특정 위치에 아미노산이 삽입되도록 한다. 이 방법은 다양한 비천연 아미노산을 여러 위치에 비교적 용이하게 삽입할 수 있는 장점이 있으나, 세포 밖에서 단백질을 합성한다는 점에서 생산성이 매우 낮고, aminoacyl-tRNA의 화학적 합성이 쉽지 않다는 점에서 한계를 가지고 있다 (Hendrickson etal., 2004).

반면, 비천연 아미노산을 in vivo에서 단백질의 특정 위치에 삽입하는 방법은 높은 생산성과 정확성을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 단백질의 구조와 기능연구를 in vivo와 in vitro에서 모두 할 수 있다는 점에서 장점을 가지고 있다. 이 방법의 기본 원리는 suppressor tRNA와 여기에 비천연 아미노산만을 특이적으로 결합하는 aminoacyl-tRNA synthetase (ARS)를 유전자 변형의 방법을 통하여 얻어서 이를 세포 안에 안정적으로 발현시켜 줌으로써 단백질 생합성시 특정위치에 비천연 아미노산이 삽입되도록 하는 것이다 (Lui and Schultz etal., 2010).

이를 위해 사용되는 suppressor tRNA와 ARS는 숙주 세포가 가지고 있는 내재적인 ARS 및 tRNAs와 상호 작용하지 않아야 하는 특성을 가지고 있어야 하며, 이를 orthogonal tRNA/ARS 짝이라 한다.

특히 대장균에서 고세균(Archeae)인 Methanococcus jannaschii TyrRS/tRNA^Tyr _CUA쌍은 매우 효과적인 orthogonal 짝으로 활용되어 30 여종 이상의 비천연 아미노산을 삽입하는 기술이 보고되었다 (Lui and Schultz etal., 2010). 또 다른 orthogonal suppressor tRNA/ARS 짝으로 효모균(Saccharomycescerevisiea, Sc) TyrRS와 대장균의 initiator tRNA (tRNA₂ ^fMet)를 돌연변이한 trnfMT2:A71/T35A36/G72 (fMamtRNA) 쌍이 이용 가능하다 (Lee and RajBhandary, 1991; Kowal etal., 2001). 그 외에 효모균의 tRNA^Tyr, tRNA^Gln, tRNA^Asp와 이들의 cognate ARS 짝이 역시 orthogonal tRNA/ARS 짝으로 활용될 수 있다.

비록 orthogonal suppressor tRNA/ARS 짝을 활용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입하지만, 일반적으로 천연 아미노산을 도입하는 것에 비해 효율이 낮다. 그 이유 중의 하나는 suppressor tRNA는 안티코돈이 stop codon을 인지하도록 다른 염기로 치환되어 있으나, 아미노산 결합을 위해 짝으로 사용되는 ARS는 이 치환된 안티코돈을 효과적으로 인지하도록 변형이 이루어지지 않아 원래의 tRNA를 인식할 때보다 낮은 효율로 suppressor tRNA를 인식하게 된다. 따라서 앰버 서프레션 활성을 보다 효과적으로 높이기 위한 방법의 개발이 필요하다.

본 발명은 상기와 같은 배경하에서 안출된 것으로, 대장균에서 활용될 수 있는 orthogonal suppressor tRNA/ARS 짝 중 효모균 TyrRS의 유전자변형을 유발하여 이것이 인지하는 앰버 서프레서(amber suppressor) tRNA의 안티코돈 "CUA"를 더 잘 인식함으로써 앰버 서프레션 활성이 더 높아진 돌연변이 TyrRS를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 앰버 서프레서 tRNA의 안티코돈을 더 잘 인식하도록 유전적으로 변이된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)로서,

위 돌연변이 TyrRS는 320번, 321번 아미노산 잔기가 모두 알라닌(alanine)으로 치환되었거나; 또는 320번 잔기가 알라닌(alanine), 321번 잔기가 히스티딘(Histidine)으로 각각 치환된 것임을 특징으로 한다.

이때, 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소(TyrRS)에 의해 천연 또는 비천연 아미노산이 결합하는 앰버 서프레서 tRNA는 효모균의 tRNA^Tyr _CUA, 또는 효모균의 TyrRS가 인식할 수 있는 대장균 (E. coli)의 돌연변이된 initiator tRNA (fMamtRNA)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 돌연변이 TyrRS는 대장균에서 fMam tRNA와 함께, 와일드 타입(wild type) TyrRS과 비교해 2.5~4.5배 높은 앰버 서프레션 활성을 나타낸다. 따라서 이를 활용하여 보다 효율적으로 단백질에 천연 및 비천연 아미노산을 도입할 수 있음은 물론 앰버 서프레션을 이용한 단백질 조절에 사용할 수 있다.

도 1은 효모균 tRNA^Tyr _GUA및 대장균의 돌연변이된 initiator tRNA, trnfMT2:A71/T35A36/G72(fMamtRNA)의 염기서열 및 2차원적 구조로 원래의 대장균 tRNA₂ ^fMet에서 fMam tRNA로 변화된 염기서열을 볼 수 있다.
도 2는 fMam tRNA의 안티코돈을 인식하는 부위에 위치한 효모 TyrRS의 320 및 321 아미노산 잔기를 PCR 방법으로 무작위로 변화시킨 돌연변이 라이브러리 제작을 위한 도면이다.
도 3은 1차 PCR 결과를 젤에서 전기영동한 결과(A)와 2개의 1차 PCR 산물을 합친 후 최종 2차 PCR 결과를 젤에서 전기영동한 결과(B)이다.
도 4는 라이브러리 제작을 위한 최종 PCR 산물의 염기서열 분석결과이다.
도 5는 라이브러리 탐색을 통해 높은 앰버 서프레션 활성을 나타내는 클론을 선별한 후, 선별된 클론이 앰버 서프레션에 의해 나타나는 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항성을 조사한 결과이다.
도 6은 선별된 2개의 돌연변이 TyrRS가 대장균에서 wild type TyrRS에 비해 앰버 서프레션 활성이 얼마나 높아졌나를 β-galactosidase 활성분석을 통해 조사한 결과이다.

본 발명은 대장균에서 단백질 생합성 시, 단백질의 특정위치에 비천연 아미노산을 도입하기 위해 사용되는 효모균의 TyrRS 효소가 amber suppressor tRNA를 더 잘 인식할 수 있도록 유전진화적 방법을 이용하여 돌연변이 라이브러리를 만들고, 이로부터 앰버 서프레션 활성이 높은 돌연변이 TyrRS를 선별하여 제작한 것이다. 이 돌연변이 TyrRS는 2종류로 320번 및 321번 아미노산 잔기가 모두 알라닌(alanine)으로 치환되었거나, 또는 알라닌(alanine)과 히스티딘(histidine)으로 각각 치환된 것이다.

본 발명에서 효모균 TyrRS는 원래 효모균의 tRNA^Tyr _GUA를 인식하여 tRNA의 3'-말단에 천연 아미노산 타이로신을 결합하는 효소이다. 대장균의 번역시작 tRNA인 tRNA₂ ^fMet는 효모균의 tRNA^Tyr _GUA와 유사한 구조를 하고 있으며 T2:A71, T35, A36, G72로 돌연변이를 유도하였을 때 대장균의 MetRS에 의해서는 인식되지 않지만 효모균의 TyrRS에 의해 인식되어 타이로신을 결합할 수 있다고 알려져 있다 (Lee and RajBhandary, 1991). 따라서 대장균에서 orthogonal 하게 작용하는 효모균 TyrRS의 짝으로 돌연변이된 대장균의 tRNA₂ ^fMet, 즉 trnfMT2 :A71/ T35A36 / G72 (fMamtRNA)을 사용하였다.

본 발명에서 사용한 fMam tRNA는 안티코돈이 엠버 정지코돈을 인식할 수 있도록 "CUA"로 치환되어 있어 앰버 서프레션을 이용해 엠버코돈에 천연 또는 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 그러나 이것의 orthogonal 짝인 효모 TyrRS는 안티코돈 인식부위가 tyrosine 안티코돈인 "GUA"를 인식하도록 최적화되어 있어 fMam tRNA 인식활성이 낮다. 이러한 문제를 해결하기 위해 효모균 TyrRS-tRNA^Tyr-tyrosine 복합체의 X-선 결정구조 분석결과를 (Tsunoda etal ., 2007) 바탕으로 타이로신 안티코돈 "GUA" 중 G를 인식하는 부위에 존재하는 TyrRS 효소의 아미노산 잔기 320, 321번 코돈을 PCR 기술을 이용하여 무작위 코돈으로 변형된 라이브러리를 제작하였다.

본 발명에서 만들어진 TyrRS 돌연변이 라이브러리를 앰버 서프레션에 의해 클로람페니콜 저항성 유전자(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)가 발현되도록 제작된 플라스미드 pACamG (Chow and RajBhandary, 1993)를 가지고 있는 대장균 균주 DH10B에 형질전환하여 고농도의 클로람페니콜을 포함한 배지에서 성장하는 클론들을 선별하였다.

본 발명에서는 최종적으로 높은 클로람페니콜 저항성을 나타내는 2개의 클론을 얻어 염기서열 분석을 통해 아미노산의 치환을 확인한 결과 앞서 언급한 TyrRS(P320A/D321A)와 TyrRS(P320A/D321H)로 나타났다.

본 발명에서는 선별된 2개 TyrRS 돌연변이주의 앰버 서프레션 활성을 비교하기 위해 엠버코돈을 가진 lacZ 유전자가 염색체 내에 안정적으로 도입된 대장균 DH10(Tn:lacZam)에 (김경태 등, 2007) 형질전환하여 lacZ 유전자의 앰버 서프레션에 의해 생산되는 β-galactosidase 효소의 활성을 분석한 결과 wild type TyrRS와 비교하여 mtTyrRS-3과 mtTyrRS-5가 각각 4.5배, 2.5배 높은 활성을 나타냈다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예와 함께 설명한다.

실시예 1. 효묘균 TyrRS의 돌연변이 라이브러리 제작

Amber suppressor tRNA인 fMam tRNA anticodon "CUA" 를 더 잘 인식하는 효모균 TyrRS를 유전진화적 방법으로 얻기 위해 효모균 TyrRS-tRNA^Tyr-tyrosine복합체의 X-선 결정구조 분석결과를 (Tsunoda etal., 2007) 바탕으로 tRNA 안티코돈 인식부위에 위치하는 TyrRS 효소의 P320, D321 잔기가 무작위 코돈으로 치환되도록 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 도면 1에 표시된 것과 같이 4종류의 프라이머를 만들었으며 이들의 염기서열은 다음과 같다(이들 서열은 서열목록 1 내지 4로 첨부함).

P11, 5'-AGATGTTGATTGCCAATTTGGTGG

P12, 5'-GATAGCGTCAGCAACACCAATTTTTAGNNNNNNTGGGGACAATTTTTC

P13, 5'-CTAAAAATTGGTGTTGCTGACGCTATC

P14, 5'-GCCAAAACAGAAGCTTGGCTGCAG

Wild type의 효모균 TyrRS 유전자를 담고 있는 벡터 pQE-TyrRS을 주형으로 사용하고, 4종류의 프라이머를 이용하여 도면 2와 같이 1차 PCR 반응을 수행하였다. 2 종류의 1차 PCR 산물을 1:1의 비율로 혼합한 후, P11, P14 프라이머를 첨가하여 2차 PCR을 수행하여 최종 PCR 산물을 얻었다. 그 결과는 도면 3에 기재되어 있다.

최종 PCR 산물의 돌연변이 상태를 확인하기 위해 염기서열 분석을 (주)바이오니어에 의뢰하였다. 그 결과 320번 및 321번 잔기의 코돈이 무작위 코돈으로 치환된 것을 확인할 수 있다 (도면 4). 최종 PCR 산물을 제한효소 Bst XI과 Pst I을 이용하여 pQE-TyrRS의 TyrRS 유전자 C-말단쪽 절반부위와 치환함으로써 최종 TyrRS 돌연변이 라이브러리를 제작하였다.

실시예 2. TyrRS 돌연변이 라이브러리 탐색

pACamG를 가진 대장균 DH10B에 라이브러리 플라스미드를 형질전환한 후 100 μg/ml ampicillin과 20 μg/ml tetracycline이 첨가되고 클로람페니콜이 각각 100μg/ml, 200 μg/ml, 또는 300 μg/ml 포함된 LB고형배지에 도말하여 37℃에서 16~24시간 배양하였다. 가장 높은 농도의 클로람페니콜 배지에서 성장한 콜로니를 20개 골라 염기서열 분석 및 추가적인 항생제 저항성 실험을 거쳐 최종 2개의 TyrRS 돌연변이 클론을 선정하였다.

실시예 3. 클로람페니콜 저항성 조사

최종 선별된 2개의 클론을 100 μg/ml ampicillin와 20 μg/ml tetracycline을 첨가한 LB배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 진탕배양하여 초기배양액을 만들었다. 초기배양액을 역시 100 μg/ml ampicillin와 20 μg/ml tetracycline이 첨가되고 클로람페니콜이 0, 200, 400, 600, 800 μg/ml 첨가된 새로운 배지에 1/50 농도로 접종한 후, 37℃에서 진탕배양하며 6시간마다 OD₆₀₀을 측정하여 도면 5와 같은 결과를 얻었다. 선별된 2개의 TyrRS 돌연변이 클론은 wild type TyrRS에 비해 클로람페니콜에 대한 저항성이 높아진 것을 보였다.

실시예 4. 돌연변이 TyrRS 클론의 앰버 서프레션 활성 검사

최종 선별된 클론의 앰버 서프레션 활성을 검사하기 위해 1개의 엠버코돈을 N-말단부위에 가지고 있는 lacZ 유전자가 염색체에 안정적으로 도입된 대장균 DH10B(Tn:lacZam)(김경태 등., 2009)에 돌연변이 TyrRS 및 wild type TyrRS를 발현하는 플라스미드를 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 100 μg/ml ampicillin와 20 μg/ml tetracycline을 첨가한 LB배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 진탕배양하여 초기배양액을 만들었다. 초기배양액을 새로운 배지에 1/50 농도로 접종한 후 4시간 30분 배양하였으며, 0.5mM IPTG를 첨가한 후 3시간 30분 동안 추가 진탕배양 하였다.

1 ml 배양액을 원심분리하여 수확한 후, Z buffer(60mM Na₂HPO₄, 40mM NaH₂PO₄, 10mM KCl, 1mM MgSO₄, 50mM 2-mercaptoethanol, pH7.0)로 한번 세척하고, 100 μl lysis buffer(1μg/ml lysozyme, 30mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 20% Sucrose)에 풀고 0.1% SDS와 몇 방울의 Chloroform을 넣어 세균을 파괴하였다. 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포추출물을 얻었다.

50~80 μl 세포추출물과 Z buffer, 0.5 mM MUG를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 500 ml 1M Na₂CO₃를 첨가하여 반응을 멈추었으며, 형광측정기(Biorad)로 4-MU (methyl-umbelliferone) 형광을 측정하였다. 측정값은 4-MU standard curve와 시료의 단백질 농도분석 값과 함께 계산되어 각 시료의 상대값으로 나타냈다 (도면 6).

그 결과 mt TyrRS-3 및 mt TyrRS-5 가 각각 4.5배, 2.5 배 증가된 앰버 서프레션 활성을 나타냈다.

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANKUK UNIVERSTIY OF FOREIGN STUDIES <120> A tyrosyl-tRNA synthetase of Saccharomyces cerevisiae having an increased amber suppression activity <130> ula14-2 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 agatgttgat tgccaatttg gtgg 24 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 gatagcgtca gcaacaccaa tttttagnnn nnntggggac aatttttc 48 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 ctaaaaattg gtgttgctga cgctatc 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 gccaaaacag aagcttggct gcag 24

Claims

야생 효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 유전적으로 변이된 티로실-티알엔에이 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)로서, 위 변이된 티로실-티알엔에이 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)는 앰버 서프레서 tRNA의 안티코돈을 더 잘 인식하도록 (ⅰ) 320번과 321번 아미노산 잔기인 프롤린과 아스파르트산이 모두 알라닌(alanine)으로 치환되었거나; 또는 (ⅱ) 320번 잔기인 프롤린은 알라닌(alanine)으로 치환되고 321번 잔기인 아스파르트산은 히스티딘(Histidine)으로 치환된 것;임을 특징으로 하는,
효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 티로실-티알엔에이 합성효소.
제1항에 있어서,
효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 티로실-티알엔에이 합성효소(TyrRS)에 의해 천연 또는 비천연 아미노산이 결합하는 앰버 서프레서 tRNA는 효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 tRNA^Tyr _CUA, 또는 효모균의 TyrRS가 인식할 수 있는 대장균 (E.coli)의 돌연변이된 initiator tRNA (fMamtRNA)인 것을 특징으로 하는,
효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 티로실-티알엔에이 합성효소.