KR102655597B1 - 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법 - Google Patents

티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102655597B1
KR102655597B1 KR1020210076715A KR20210076715A KR102655597B1 KR 102655597 B1 KR102655597 B1 KR 102655597B1 KR 1020210076715 A KR1020210076715 A KR 1020210076715A KR 20210076715 A KR20210076715 A KR 20210076715A KR 102655597 B1 KR102655597 B1 KR 102655597B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tyrosyl
lys
leu
glu
trna synthetase
Prior art date
Application number
KR1020210076715A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220167578A (ko
Inventor
최종일
Original Assignee
전남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교 산학협력단 filed Critical 전남대학교 산학협력단
Priority to KR1020210076715A priority Critical patent/KR102655597B1/ko
Publication of KR20220167578A publication Critical patent/KR20220167578A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102655597B1 publication Critical patent/KR102655597B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
    • C12Y601/01001—Tyrosine-tRNA ligase (6.1.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 기존의 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)보다 앰버 서프레션 활성과 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine) 결합능이 향상된 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들, 및 이를 이용하여 단백질의 특이 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌이 결합된 재조합 단백질을 대장균에서 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 얻어진 돌연변이체들은 단일 복제수(copy)를 가지고 클로닝되어도 기존 돌연변이체의 2 복제수 대비 높은 수율로 앰버 코든(amber codon)의 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌을 결합하여 단백질의 합성에 이용할 수 있다.

Description

티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법{Tyrosyl-tRNA synthetase mutant and method for producing protein with improved binding ability of 4-azido-L-phenylalanine using the same}
본 발명은 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)의 결합능이 향상된 단백질 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존에 사용된 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소보다 앰버 서프레션과 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된, 기존 티로실-tRNA 합성효소의 2 복제수(copy) 대신 단일 복제수로 클로닝하여도 비천연 아미노산이 결합되어 있는 재조합 단백질을 높은 효율로 발현할 수 있는 돌연변이체와 이를 포함하는 재조합 대장균을 이용한 단백질 생산방법에 관한 것이다.
단백질은 거의 모든 생물학적 물질에 관여하지만, 그들은 동일한 20개의 공통 아미노산에서 생합성되며 질소 염기, 카르복시산, 아미드, 알코올 및 티올과 같은 공통된 기능기만을 가지고 있다. 때문에, 단백질을 이루고 있는 아미노산에 비천연 기능기를 결합할 수 있다면 단백질의 기능기 치환이나 단백질 구조의 변화 등을 가능하게 하는 강력한 도구를 제공할 수 있다.
자연계에 일반적으로 존재하는 20종의 아미노산이 아닌 새로운 생화학적 특성을 나타내는 비천연 아미노산을 단백질의 특정 위치에 삽입하는 기술은 물리적, 화학적 및 생물학적 특성이 변화된 새로운 단백질을 만드는 좋은 방법이 될 수 있을 뿐만 아니라 단백질의 기능연구에도 활용될 수 있다.
이에 따라, 최근 이와 같은 단백질을 이루고 있는 아미노산에 비천연 기능기를 결합시키기 위한 연구가 활발히 진행되었다. Chin 등은 일반적인 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS) 대신에 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체를 개발하여 특정 티로신(tyrosine) 부위에 선택적으로 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)이 결합된 단백질을 생산하는 기술을 개발하였다.
이렇게 비천연 기능기가 포함된 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 기존의 천연 아미노산만을 포함하는 단백질에 비하여 선택적 화학반응을 통하여 단백질의 안정성을 높일 수 있었다. Lim 등은 이러한 비천연 아미노산이 포함된 단백질을 이용하여 체내에서 안전성이 증가된 유레이트 옥시다제(Urate oxidase)를 생산할 수 있는 재조합 대장균을 개발하였다.
유레이트 옥시다제는 체내에 축적된 요산을 분해하는 효소로써 축적된 요산으로 인한 통풍을 치료하는 의약용 단백질 치료제로 사용되고 있다. 하지만 천연 아미노산으로 이루어진 유레이트 옥시다제는 체내에서 분해가 급속히 일어나기 때문에 적절한 치료를 위해서는 유레이트 옥시다제를 자주 섭취해야 하는 문제점을 가지고 있다. 이에 반해, 비천연 아미노산이 포함된 유레이트 옥시다제는 체내에서 지속되는 시간이 증가하였기 때문에 통풍 치료제로서의 높은 가능성을 가지고 있다.
다양한 비천연 아미노산이 포함된 재조합 단백질의 생산을 위해서는 먼저 비천연 아미노산으로 치환하고자 하는 위치에 앰버 코돈(amber codon)으로 유전자의 염기서열을 변화시키고 앰버 서프레션이 가능하면서 비천연 아미노산을 결합할 수 있는 특별한 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소가 필요하다.
현재 사용되고 있는 대표적인 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소이다. 하지만, 비천연 아미노산을 단백질에 도입할 수 있는 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소의 활성은 천연 아미노산을 도입하는 것에 비해 효율이 낮다. 따라서 기존 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소가 클로닝된 pEVOL-pAzF 벡터에는 낮은 효율을 해결하기 위하여 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소가 2 복제수(copy)로 들어있다.
낮은 효율성의 이유 중 하나는 안티 코돈을 인식하는 서프레서(suppressor) tRNA의 아미노-아실레이션(amino-acylation)을 진행하는 tRNA 합성효소의 낮은 효율 때문이다. 따라서 앰버 서프레션과 비천연 아미노산의 결합 활성이 높은 신규 돌연변이 tRNA 합성효소의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS)를 기반으로 하여 에러-프론(error-prone) PCR의 방법으로 다양한 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소들을 제작하고, 이들 중에서 앰버 서프레션 활성과 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine) 결합능이 증가된 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소들을 선별한 결과 높은 수율로 4-아지도-L-페닐알라닌이 결합된 재조합 단백질의 발현을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 3, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 발현에 있어서 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체에 의한, 단백질에 대한 비천연 아미노산 첨가 용도에 관한 것이다.
본 발명은 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)의 결합능이 향상된 단백질 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체는 앰버 서프레션 활성과 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine) 결합능이 향상됨으로써 높은 수율로 4-아지도-L-페닐알라닌이 결합된 재조합 단백질의 발현을 나타낸다.
본 발명자들은 현재 사용되고 있는 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS)를 이용하여 에러-프론(error-prone) PCR의 방법으로 다양한 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 라이브러리(library)를 제작하고, 이중에서 앰버 서프레션 활성과 비천연 아미노산의 결합능이 우수한 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소를 선별하였다. 선별된 티로실-tRNA 합성효소는 재조합 대장균 내에서 기존 대비 낮은 복제수(copy)로도 높은 효율로 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌을 단백질 내에 결합할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 3, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소이다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론(Error-prone) PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “에러프론 PCR”은, 실수유발 PCR이라고도 지칭되고, 특정 유전자의 염기서열을 PCR로 증폭시킬 때 생길 수 있는 점 돌연변이(point mutation)를 인위적으로 많이 일으킴으로써 특정 단백질의 아미노산서열을 무작위로 변경시키는 돌연변이 기법을 의미한다.
본 발명의 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈(amber codon), 오커 코돈(ochre codon), 오팔 코돈(opal codon), 특이 코돈(unique codon), 희귀 코돈(rare codon) 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 tRNA는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체에 의해 천연 또는 비천연 아미노산이 결합되는 것일 수 있고, 상기 비천연 아미노산은 예를 들어 4-아지도-L-페닐알라닌인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 “벡터(vector)”는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 일 예에서, 재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이다.
본 발명에 있어서 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것일 수 있고, 상기 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
상기 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 형질전환된 미생물 내에서 발현함에 있어서, 동일한 하나의 벡터 상에서 발현하여 사용할 수 있고, 또는 각각의 벡터에서 독립적으로 발현하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법이다.
본 발명에 있어서 미생물은 대장균인 것일 수 있고, 상기 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.
상기 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 동일한 하나의 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있고, 또는 각각의 독립적인 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법이다.
본 발명에 있어서 미생물은 대장균인 것일 수 있고, 상기 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형질전환은 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 동일한 하나의 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있고, 또는 각각의 독립적인 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단백질은 유레이트 옥시다제(urate oxidase), 형광단백질(superfolder green fluorescent protein, sfGFP) 또는 이의 재조합체인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단백질 발현 단계는 미생물에서 넌센스 코돈이 포함된 단백질 코딩 유전자가 발현되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단백질 발현 단계는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 기존의 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)보다 앰버 서프레션 활성과 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine) 결합능이 향상된 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들, 및 이를 이용하여 단백질의 특이 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌이 결합된 재조합 단백질을 대장균에서 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 얻어진 돌연변이체들은 단일 복제수(copy)를 가지고 클로닝되어도 기존 돌연변이체의 2 복제수 대비 높은 수율로 앰버 코돈(amber codon)의 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌을 결합하여 단백질의 합성에 이용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS) 돌연변이체 84의 아미노산 서열을 기존 돌연변이체의 아미노산 서열과 비교한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 231의 아미노산 서열을 기존 돌연변이체의 아미노산 서열과 비교한 결과이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 822의 아미노산 서열을 기존 돌연변이체의 아미노산 서열과 비교한 결과이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 1054의 아미노산 서열을 기존 돌연변이체의 아미노산 서열과 비교한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 대장균(Escherichia coli; E. coli)에서의 기존 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 대조군(상) 대비 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 84(하)를 이용하여 확인한 형광단백질 발현 결과 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 대장균에서의 기존 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 대조군(상) 대비 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 231(하)을 이용하여 확인한 형광단백질 발현 결과 사진이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 대장균에서의 기존 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 대조군(상) 대비 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 822(하)를 이용하여 확인한 형광단백질 발현 결과 사진이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 대장균에서의 기존 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 대조군(상) 대비 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 1054(하)를 이용하여 확인한 형광단백질 발현 결과 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소로부터 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 라이브러리 제작
본 발명자는 기존에 사용되고 있는 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii) 유래 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS)보다 앰버 서프레션 활성과 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)의 결합능이 우수한 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소를 확보하기 위하여 에러 프론(error-prone) PCR 방법으로 다양한 돌연변이체들을 제작하였다.
구체적으로, 에러 프론 PCR 방법은 키트(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)를 사용하여 진행하였다. 먼저 pEVOL-pAzF(Plasmid ID: 31186, Addgene(Cambridge, MA))에 클로닝된 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소를 주형으로 사용하여, 적절한 농도로 희석한 후 키트를 이용하여 PCR을 진행하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 명칭 서열 (5'->3')
1 TyrRS forward primer agatctatggacgagttcg
2 TyrRS reverse primer ctgcagttacagacgtttgc
얻어진 PCR 결과물은 제한효소 BglII와 PstI으로 절단하고, 같은 제한효소로 절단된 pEVOL-pAzF에 라이게이즈(ligase)를 이용하여 재조합 벡터 pEVOL-Mj_Mut를 제작하고, 이를 형질전환하여 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 라이브러리를 하기 표 2와 같이 제작하였으며, 도 1a 내지 1d와 같이 기존의 돌연변이체와 비교하여 확인하였다.
서열번호 명칭 서열 (5'->3')
3 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 84 아미노산 서열 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMFDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKNGDYNKKVFEAMGLKAKYVNGSNFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRTMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVYVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKEAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMRLKNAVAEELIKSLEPIRKRL
4 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 84 염기서열 atggacgagttcgaaatgattaaacgcaacaccagcgaaattatctctgaagaagagctgcgcgaggtgctgaagaaagacgagaagagcgcgactattggctttgagccgtccggtaaaattcacctgggtcactacctgcaaatcaagaagatgtttgatctgcaaaacgctggttttgacatcattatcctgctggcggacctgcacgcctacctgaatcaaaagggcgagctggatgagattcgcaagaacggcgactacaataagaaagtcttcgaagccatgggtttgaaggctaaatacgtcaacggtagcaattttcagctggataaggattacacgttgaatgtgtaccgtctggcgctgaaaaccacgctgaaacgcgcccgtcgtaccatggagctgattgcgcgcgaggatgagaatccaaaagttgcggaggttatttaccctattatgcaagttaatccgttgcactaccagggtgtttatgttgccgtcggtggtatggagcaacgcaaaattcacatgctggcacgtgaactgctgccgaaaaaggttgtctgtattcataatccggtcctgaccggcctggatggcgagggtaaaatgagcagcagcaagggtaactttattgcagttgacgatagcccggaagaaatccgtgcgaagatcaaggaagcgtactgcccggcaggcgtggttgagggtaacccgatcatggaaatagccaagtattttctggaatacccactgacgattaagcgcccggagaaatttggcggcgacctgaccgtcaacagctacgaggagctggaaagcttgtttaagaacaaagaactgcatccgatgcgcctgaaaaacgccgtggcggaagagctgattaagagtctggaaccaattcgcaaacgtctgtaa
5 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 231 아미노산 서열 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAIGLKAKYVYGSNFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFDGGLNVDSYEELESLFKNKELHPMRLKNAVAEELIKILEPIRKRL
6 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 231 염기서열 atggacgagttcgaaatgattaaacgcaacaccagcgaaattatctctgaagaagagctgcgcgaggtgctgaagaaagacgagaagagcgcgactattggctttgagccgtccggtaaaattcacctgggtcactacctgcaaatcaagaagatgattgatctgcaaaacgctggttttgacatcattatcctgctggcggacctgcacgcctacctgaatcaaaagggcgagctggatgagattcgcaagatcggcgactacaataagaaagtcttcgaagccataggtttgaaggctaaatacgtctacggtagcaattttcagctggacaaggattacacgttgaatgtgtaccgtctggcgctgaaaaccacgctgaaacgcgcccgtcgttccatggagctgatagcgcgcgaggatgagaatccaaaagtcgctgaggttatttaccctattatgcaagttaatccgttgcactaccagggtgttgatgttgccgtcggtggtatggagcaacgcaaaattcacatgctggcacgtgaactgctgccgaaaaaggttgtctgtattcataatccggtcctaaccggcctggatggcgagggtaaaatgagcagcagcaagggtaactttattgcagttgacgatagcccggaagaaatccgtgcgaagatcaagaaagcgtactgcccggcaggcgtggttgagggtaacccgatcatggaaatcgccaagtattttctggaatacccactgacgattaagcgcccggagaaattcgacggcggcctgaacgtcgacagctacgaggagctggaaagcttgtttaagaacaaagaactgcatccgatgcgcctgaaaaacgccgtggcggaagagctgataaagattctggaaccaattcgcaaacgtctgtaa
7 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 822 아미노산 서열 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILMADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSNFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDVNPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKGPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELQPMRLKNAVAEELIKILEPIRKRL
8 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 822염기서열 atggacgagttcgaaatgattaaacgcaacaccagcgaaattatctctgaagaagagctgcgcgaggtgctgaagaaagacgagaagagcgcgactattggctttgagccgtccggtaaaattcacctgggtcactacctgcaaatcaagaagatgattgatctgcaaaacgctggttttgacatcattatcctgatggcggacctgcacgcctacctgaatcaaaagggcgagctggatgagattcgcaagatcggcgactacaataagaaagtcttcgaagccatgggtttgaaggctaaatacgtctacggtagcaattttcagctggataaggattacacgttgaatgtgtaccgtctggcgctgaaaaccacgctgaaacgcgcccgtcgttccatggagctgattgcgcgcgaggatgtgaatccaaaagttgctgaggttatttaccctattatgcaagttaatccgttgcactaccagggtgttgatgttgccgtcggtggtatggagcaacgcaaaatacacatgctggcacgtgaactgctgccgaaaaaggttgtctgtattcataatccggtcctgaccggcctggatggcgagggtaaaatgagcagcagcaagggtaactttattgcagttgacgatagcccggaagaaatccgtgcgaagatcaagaaagcgtactgcccggcaggcgtggttgagggtaacccgatcatggaaatcgccaagtattttctggaatacccactgacgattaagggcccggagaaatttggtggcgacctgaccgtcaacagctacgaggagctggaaagcttgtttaagaacaaagaactgcaaccgatgcgcctgaaaaacgccgtggcggaagagctgattaagattctggaaccaattcgcaaacgtctg
9 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 1054 아미노산 서열 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMTDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSNFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDVAVGGMEQRKIHMLAREQLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEEFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMRLKNAVAGELIKILEPIRKRL
10 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 1054 염기서열 atggacgagttcgaaatgattaaacgcaacaccagcgaaattatctctgaagaagagctgcgcgaggtgctgaagaaagacgagaagagcgcgactattggctttgagccgtccggtaaaattcacctgggtcactacctgcaaatcaagaagatgactgatctgcaaaacgctggttttgacatcattatcctgctggcggacctgcacgcctacctgaatcaaaagggcgagctggatgagattcgcaagatcggcgactacaataagaaagtcttcgaagccatgggtttgaaggctaaatacgtctacggtagcaattttcagctggataaggattacacgttgaatgtgtaccgtctggcgctgaaaaccacgctgaaacgcgcccgtcgttccatggagctgattgcgcgcgaggatgagaatccaaaagttgctgaggttatttaccctattatgcaagttaatccgttgcactaccagggtgttgatgttgccgtcggtggtatggagcaacgcaaaattcacatgctggcacgtgaacagctgccgaaaaaggttgtctgtattcataatccggtcctgaccggcctggatggcgagggtaaaatgagcagcagcaagggtaactttattgcagttgacgatagcccggaagaaatccgtgcgaagatcaagaaagcgtactgcccggcaggcgtggttgagggtaacccgatcatggaaatcgccaagtattttctagaatacccactgacgattaagcgcccggaggaatttggcggcgacctgaccgtcaacagctacgaggagctggaaagcttgtttaagaacaaagaactgcatccgatgcgcctgaaaaacgccgtggcgggagagctgattaagattctggaaccaattcgcaaacgtctgt
pEVOL-pAzF 벡터에는 2 복제수(copy)의 합성효소가 클로닝되어 있지만, 돌연변이체 84, 231, 822 및 1054로 선택되어 제작된 pEVOL-Mj_Mut 벡터들은 모두 단일 복제수로 합성효소가 클로닝되었다.
실시예 2: 앰버 서프레션 활성과 4-아지도-L-페닐알라닌 결합성이 증가된 신규 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 선별
이러한 방법으로 얻어진 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들 중에서 앰버 서프레션 활성과 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)에 선택성이 증가된 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소의 선별은 앰버 코돈(amber codon)이 있는 형광단백질(superfolder green fluorescent protein, sfGFP)의 발현을 확인함으로써 이루어졌다.
앰버 코돈이 있는 형광단백질은 원래의 형광단백질의 204번 아미노산 자리에 앰버 코돈을 치환하여 제작하였다. 앰버 코돈이 있는 형광단백질 유전자는 pSEVA631(Silva-Rocha R　et al　(2013) The Standard European Vector Architecture (SEVA): a coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes.　Nucleic Acids Res. 41(Database issue):D666-75.)의 EcoRI과 KpnI 자리에 삽입하여 발현 벡터 pSEVA631-sfGFP를 제작하였다.
대장균 DH10B(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 컴피턴트 셀(competent cell)에 먼저 앰버 코돈이 있는 형광단백질 유전자를 포함하는 pSEVA631-sfGFP를 형질전환하여 젠타마이신(gentamycin)이 함유된 배지에서 형질전환체를 얻었다.
얻어진 재조합 대장균을 컴피턴트 셀로 준비하고, 에러-프론 PCR 방법으로 얻어진 84번, 231번, 822번 및 1054번에 해당하는 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들을 포함하는 pEVOL-Mj_Mut 벡터를 형질전환하여 두개의 벡터가 있는 재조합 대장균을 앰피실린(ampicillin) 및 젠타마이신 혼합 배지에서 선별하여 얻었다. 얻어진 형질전환체들을 4-아지도-L-페닐알라닌이 첨가된 액체 배지에 접종하여 형광단백질의 발현 여부를 확인하였다.
도 2a 내지 2d에서 확인할 수 있듯이, 84번, 231번, 822번 및 1054번 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체를 갖고 있는 재조합 대장균은 형광단백질의 발현이 기존의 pEVOL-pAzF를 갖는 재조합 대장균보다 높음이 확인되었다.
기존의 pEVOL-pAzF는 티로실-tRNA 합성효소가 2개의 복제수로 클로닝되어 각각 ara 프로모터(promoter)와 glnS 프로모터 하에서 발현되나, 본 실시예에서 제작된 pEVOL-Mj_Mut는 ara 프로모터 하에 단일 복제수를 갖고 있어서 기존보다 낮은 복제수를 가짐에도 불구하고 더 높은 앰버 서프레션 활성과 4-아지도-L-페닐알라닌 결합능이 확인되었다.
이러한 결과들로부터 84번, 231번, 822번 및 1054번의 서열을 갖는 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들은 기존의 pEVOL-pAzF에 클로닝되어 있는 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소보다 우수한 앰버 서프레션 활성과 4-아지도-L-페닐알라닌 결합능을 가지고 있다는 것이 확인되었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Tyrosyl-tRNA synthetase mutant and method for producing protein with improved binding ability of 4-azido-L-phenylalanine using the same <130> PN210102 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TyrRS forward primer <400> 1 agatctatgg acgagttcg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TyrRS reverse primer <400> 2 ctgcagttac agacgtttgc 20 <210> 3 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 3 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Phe Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Asn Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Asn Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Thr Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Tyr Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Glu Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ser Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 4 <211> 921 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 4 atggacgagt tcgaaatgat taaacgcaac accagcgaaa ttatctctga agaagagctg 60 cgcgaggtgc tgaagaaaga cgagaagagc gcgactattg gctttgagcc gtccggtaaa 120 attcacctgg gtcactacct gcaaatcaag aagatgtttg atctgcaaaa cgctggtttt 180 gacatcatta tcctgctggc ggacctgcac gcctacctga atcaaaaggg cgagctggat 240 gagattcgca agaacggcga ctacaataag aaagtcttcg aagccatggg tttgaaggct 300 aaatacgtca acggtagcaa ttttcagctg gataaggatt acacgttgaa tgtgtaccgt 360 ctggcgctga aaaccacgct gaaacgcgcc cgtcgtacca tggagctgat tgcgcgcgag 420 gatgagaatc caaaagttgc ggaggttatt taccctatta tgcaagttaa tccgttgcac 480 taccagggtg tttatgttgc cgtcggtggt atggagcaac gcaaaattca catgctggca 540 cgtgaactgc tgccgaaaaa ggttgtctgt attcataatc cggtcctgac cggcctggat 600 ggcgagggta aaatgagcag cagcaagggt aactttattg cagttgacga tagcccggaa 660 gaaatccgtg cgaagatcaa ggaagcgtac tgcccggcag gcgtggttga gggtaacccg 720 atcatggaaa tagccaagta ttttctggaa tacccactga cgattaagcg cccggagaaa 780 tttggcggcg acctgaccgt caacagctac gaggagctgg aaagcttgtt taagaacaaa 840 gaactgcatc cgatgcgcct gaaaaacgcc gtggcggaag agctgattaa gagtctggaa 900 ccaattcgca aacgtctgta a 921 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Ile 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Asp Gly Gly Leu Asn Val Asp Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 6 <211> 921 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 6 atggacgagt tcgaaatgat taaacgcaac accagcgaaa ttatctctga agaagagctg 60 cgcgaggtgc tgaagaaaga cgagaagagc gcgactattg gctttgagcc gtccggtaaa 120 attcacctgg gtcactacct gcaaatcaag aagatgattg atctgcaaaa cgctggtttt 180 gacatcatta tcctgctggc ggacctgcac gcctacctga atcaaaaggg cgagctggat 240 gagattcgca agatcggcga ctacaataag aaagtcttcg aagccatagg tttgaaggct 300 aaatacgtct acggtagcaa ttttcagctg gacaaggatt acacgttgaa tgtgtaccgt 360 ctggcgctga aaaccacgct gaaacgcgcc cgtcgttcca tggagctgat agcgcgcgag 420 gatgagaatc caaaagtcgc tgaggttatt taccctatta tgcaagttaa tccgttgcac 480 taccagggtg ttgatgttgc cgtcggtggt atggagcaac gcaaaattca catgctggca 540 cgtgaactgc tgccgaaaaa ggttgtctgt attcataatc cggtcctaac cggcctggat 600 ggcgagggta aaatgagcag cagcaagggt aactttattg cagttgacga tagcccggaa 660 gaaatccgtg cgaagatcaa gaaagcgtac tgcccggcag gcgtggttga gggtaacccg 720 atcatggaaa tcgccaagta ttttctggaa tacccactga cgattaagcg cccggagaaa 780 ttcgacggcg gcctgaacgt cgacagctac gaggagctgg aaagcttgtt taagaacaaa 840 gaactgcatc cgatgcgcct gaaaaacgcc gtggcggaag agctgataaa gattctggaa 900 ccaattcgca aacgtctgta a 921 <210> 7 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 7 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Met Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Val Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Gly Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu Gln Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 8 <211> 918 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 8 atggacgagt tcgaaatgat taaacgcaac accagcgaaa ttatctctga agaagagctg 60 cgcgaggtgc tgaagaaaga cgagaagagc gcgactattg gctttgagcc gtccggtaaa 120 attcacctgg gtcactacct gcaaatcaag aagatgattg atctgcaaaa cgctggtttt 180 gacatcatta tcctgatggc ggacctgcac gcctacctga atcaaaaggg cgagctggat 240 gagattcgca agatcggcga ctacaataag aaagtcttcg aagccatggg tttgaaggct 300 aaatacgtct acggtagcaa ttttcagctg gataaggatt acacgttgaa tgtgtaccgt 360 ctggcgctga aaaccacgct gaaacgcgcc cgtcgttcca tggagctgat tgcgcgcgag 420 gatgtgaatc caaaagttgc tgaggttatt taccctatta tgcaagttaa tccgttgcac 480 taccagggtg ttgatgttgc cgtcggtggt atggagcaac gcaaaataca catgctggca 540 cgtgaactgc tgccgaaaaa ggttgtctgt attcataatc cggtcctgac cggcctggat 600 ggcgagggta aaatgagcag cagcaagggt aactttattg cagttgacga tagcccggaa 660 gaaatccgtg cgaagatcaa gaaagcgtac tgcccggcag gcgtggttga gggtaacccg 720 atcatggaaa tcgccaagta ttttctggaa tacccactga cgattaaggg cccggagaaa 780 tttggtggcg acctgaccgt caacagctac gaggagctgg aaagcttgtt taagaacaaa 840 gaactgcaac cgatgcgcct gaaaaacgcc gtggcggaag agctgattaa gattctggaa 900 ccaattcgca aacgtctg 918 <210> 9 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 9 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Thr Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Gln Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Glu Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Gly Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 10 <211> 919 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 10 atggacgagt tcgaaatgat taaacgcaac accagcgaaa ttatctctga agaagagctg 60 cgcgaggtgc tgaagaaaga cgagaagagc gcgactattg gctttgagcc gtccggtaaa 120 attcacctgg gtcactacct gcaaatcaag aagatgactg atctgcaaaa cgctggtttt 180 gacatcatta tcctgctggc ggacctgcac gcctacctga atcaaaaggg cgagctggat 240 gagattcgca agatcggcga ctacaataag aaagtcttcg aagccatggg tttgaaggct 300 aaatacgtct acggtagcaa ttttcagctg gataaggatt acacgttgaa tgtgtaccgt 360 ctggcgctga aaaccacgct gaaacgcgcc cgtcgttcca tggagctgat tgcgcgcgag 420 gatgagaatc caaaagttgc tgaggttatt taccctatta tgcaagttaa tccgttgcac 480 taccagggtg ttgatgttgc cgtcggtggt atggagcaac gcaaaattca catgctggca 540 cgtgaacagc tgccgaaaaa ggttgtctgt attcataatc cggtcctgac cggcctggat 600 ggcgagggta aaatgagcag cagcaagggt aactttattg cagttgacga tagcccggaa 660 gaaatccgtg cgaagatcaa gaaagcgtac tgcccggcag gcgtggttga gggtaacccg 720 atcatggaaa tcgccaagta ttttctagaa tacccactga cgattaagcg cccggaggaa 780 tttggcggcg acctgaccgt caacagctac gaggagctgg aaagcttgtt taagaacaaa 840 gaactgcatc cgatgcgcct gaaaaacgcc gtggcgggag agctgattaa gattctggaa 900 ccaattcgca aacgtctgt 919

Claims (11)

  1. 서열번호 5 또는 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase).
  2. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 6 또는 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  3. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 6 또는 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 미생물.
  5. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 6 또는 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 미생물의 제조방법.
  7. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 6 또는 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법.
  8. 제7항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 단백질 생산방법.
  9. 제7항에 있어서, 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것인, 단백질 생산방법.
  10. 제7항에 있어서, 단백질 발현 단계는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 단백질 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, 비천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것인, 단백질 생산방법.
KR1020210076715A 2021-06-14 2021-06-14 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법 KR102655597B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210076715A KR102655597B1 (ko) 2021-06-14 2021-06-14 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210076715A KR102655597B1 (ko) 2021-06-14 2021-06-14 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220167578A KR20220167578A (ko) 2022-12-21
KR102655597B1 true KR102655597B1 (ko) 2024-04-08

Family

ID=84536563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210076715A KR102655597B1 (ko) 2021-06-14 2021-06-14 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102655597B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006180701A (ja) 2003-02-10 2006-07-13 Institute Of Physical & Chemical Research チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体及びその作製方法
WO2005003294A3 (en) 2003-06-18 2007-11-29 Scripps Research Inst Unnatural reactive amino acid genetic code additions

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101668150B1 (ko) * 2014-05-26 2016-10-31 한국외국어대학교 연구산학협력단 앰버 서프레션 활성이 증가된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006180701A (ja) 2003-02-10 2006-07-13 Institute Of Physical & Chemical Research チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体及びその作製方法
WO2005003294A3 (en) 2003-06-18 2007-11-29 Scripps Research Inst Unnatural reactive amino acid genetic code additions

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nat Chem Biol.,13(8):845-849(2017.6.12.)
NCBI PDB.,4HPW_A(2020.12.1.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220167578A (ko) 2022-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8501454B2 (en) Homologous recombination-based DNA cloning compositions
US20060084136A1 (en) Production of fusion proteins by cell-free protein synthesis
US20220290202A1 (en) Aminoacyl-trna synthetase efficiently introducing lysine derivatives
JP2002534059A (ja) 安定化された生物活性ペプチドおよび同定、合成および使用方法
WO2002008408A2 (en) Modular vector systems
US8008016B2 (en) Vectors and methods for high throughput co-expressions
CA2622710C (en) Hybrid portable origin of replication plasmids
KR102655597B1 (ko) 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법
JP3723240B2 (ja) 遺伝子発現の制御方法
KR102496720B1 (ko) 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법
KR20230066933A (ko) 재조합 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산 방법
KR102557569B1 (ko) 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산방법
Keum et al. The presence of a common downstream box enables the simultaneous expression of multiple proteins in an E. coli extract
Salim et al. Construction of a compatible Gateway-based co-expression vector set for expressing multiprotein complexes in E. coli
EP2109671B1 (en) Expression cassette, use of the expression cassette, vector, host cell, a method for producing a polypeptide
US7138515B2 (en) Translational activity-promoting higher-order structure
RU2790662C1 (ru) АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА, ЭФФЕКТИВНОЕ ВВЕДЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ЛИЗИНА
RU2799794C2 (ru) АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ЛИЗИНА В БЕЛОК
JPH11221080A (ja) 有機溶媒耐性を有する大腸菌およびその製造法
KR102067475B1 (ko) 3-히드록시프로피온산 반응 전사인자를 이용한 3-하이드록시프로피온산 선택성 유전자회로 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 생산 균주의 스크리닝 방법
Huang et al. A small, high-copy-number vector suitable for both in vitro and in vivo gene expression
WO2022178167A1 (en) Artificial dna replisome and methods of use thereof
JP2006514542A (ja) セファロスポリンｃの製造方法
CN115717130A (zh) 氨酰-tRNA合酶突变体及烯基酪氨酰-tRNA的制备方法
AU2019388420A1 (en) DNA-cutting agent

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant