KR102496720B1 - 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법 - Google Patents

티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102496720B1
KR102496720B1 KR1020210028826A KR20210028826A KR102496720B1 KR 102496720 B1 KR102496720 B1 KR 102496720B1 KR 1020210028826 A KR1020210028826 A KR 1020210028826A KR 20210028826 A KR20210028826 A KR 20210028826A KR 102496720 B1 KR102496720 B1 KR 102496720B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tyrosyl
trna synthetase
leu
microorganism
val
Prior art date
Application number
KR1020210028826A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220124989A (ko
Inventor
최종일
Original Assignee
전남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교 산학협력단 filed Critical 전남대학교 산학협력단
Priority to KR1020210028826A priority Critical patent/KR102496720B1/ko
Publication of KR20220124989A publication Critical patent/KR20220124989A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102496720B1 publication Critical patent/KR102496720B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
    • C12Y601/01001—Tyrosine-tRNA ligase (6.1.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)의 돌연변이체에 관한 것으로서, 상기 티로실-tRNA 합성효소는 기존에 보고된 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 대체하여 TAG 앰버 코돈(amber codon)이 포함된 단백질의 발현에 사용할 수 있으므로, 이를 효과적으로 단백질의 구조 분석 및 비천연 아미노산 함유 단백질의 생합성 등에 이용할 수 있다.

Description

티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법{Tyrosyl-tRNA synthetase mutant and method for producing protein using the same}
본 발명은 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 TAG 앰버 코돈(amber codon)을 억제하며 단백질의 특정 위치에 다양한 구조의 아미노산을 결합하여 단백질의 발현에 사용할 수 있는 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체에 관한 것이다.
단백질은 거의 모든 생물학적 물질에 관여하지만, 그들은 동일한 20개의 공통 아미노산에서 생합성되며 질소 염기, 카르복시산, 아미드, 알코올 및 티올과 같은 공통된 기능기만을 가지고 있다. 때문에, 단백질을 이루고 있는 아미노산에 비천연 기능기를 결합할 수 있다면 단백질의 기능기 치환이나 단백질 구조의 변화 등을 가능하게 하는 강력한 도구를 제공할 수 있다.
이에 따라, 최근 이와 같은 단백질을 이루고 있는 아미노산에 비천연 기능기를 결합시키기 위한 연구가 활발히 진행되었다. Chin 등은 일반적인 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase; TyrRS) 대신에 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체를 개발하여 특정 티로신(tyrosine) 부위에 선택적으로 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)이 결합된 단백질을 생산하는 기술을 개발하였다.
이렇게 비천연 기능기가 포함된 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 기존의 천연 아미노산만을 포함하는 단백질에 비하여 선택적 화학반응을 통하여 단백질의 안정성을 높일 수 있었다. Lim 등은 이러한 비천연 아미노산이 포함된 단백질을 이용하여 체내에서 안전성이 증가된 유레이트 옥시다제(Urate oxidase)를 생산할 수 있는 재조합 대장균을 개발하였다.
그러나 다양한 비천연 아미노산이 포함된 재조합 단백질의 생산을 위해서는 기존에 보고된 메타노코커스 자나쉬아이에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 이외의 새로운 균주로부터 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소들의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 대장균(Escherichia coli)에서 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)이 포함된 단백질을 생산하기 위하여 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)로부터 단백질의 TAG 앰버 코돈(amber codon) 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌을 결합할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들을 선별하고, 이를 이용하여 재조합 대장균에서 4-아지도-L-페닐알라닌이 결합된 재조합 단백질의 발현이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 4 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 발현에 있어서 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체에 의한, 단백질에 대한 비천연 아미노산 첨가 용도에 관한 것이다.
본 발명은 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase) 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들은 보통의 티로실-tRNA 합성효소 또는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 원래의 티로실-tRNA 합성효소와는 다르게 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)이 결합된 재조합 단백질을 발현할 수 있다. 이를 통하여 비천연 아미노산이 첨가된 재조합 단백질을 대장균에서 생산할 수 있다.
본 발명자들은 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 클로닝하여 기존에 사용하고 있는 돌연변이 tRNA와 결합함으로써 앰버 코돈(amber codon)을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다. 이로부터 비천연 아미노산을 재조합 단백질에 결합할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들을 선별하여 4-아지도-L-페닐알라닌이 선택적으로 결합된 단백질을 대장균에서 발현할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 4 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소이다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론(Error-prone) PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “에러프론 PCR”은, 실수유발 PCR이라고도 지칭되고, 특정 유전자의 염기서열을 PCR로 증폭시킬 때 생길 수 있는 점 돌연변이(point mutation)를 인위적으로 많이 일으킴으로써 특정 단백질의 아미노산서열을 무작위로 변경시키는 돌연변이 기법을 의미한다.
본 발명의 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈(amber codon), 오커 코돈(ochre codon), 오팔 코돈(opal codon), 특이 코돈(unique codon), 희귀 코돈(rare codon) 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 tRNA는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체에 의해 천연 또는 비천연 아미노산이 결합되는 것일 수 있고, 상기 비천연 아미노산은 예를 들어 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 “벡터(vector)”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 일 예에서, 재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이다.
본 발명에 있어서 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것일 수 있고, 상기 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
상기 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 형질전환된 미생물 내에서 발현함에 있어서, 동일한 하나의 벡터 상에서 발현하여 사용할 수 있고, 또는 각각의 벡터에서 독립적으로 발현하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법이다.
본 발명에 있어서 미생물은 대장균인 것일 수 있고, 상기 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.
상기 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 동일한 하나의 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있고, 또는 각각의 독립적인 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 티로실-tRNA 합성효소를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법이다.
본 발명에 있어서 미생물은 대장균인 것일 수 있고, 상기 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열은 대장균에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화가 진행된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 넌센스 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, TAG 앰버 코돈인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형질전환은 티로실-tRNA 합성효소 및 tRNA를 동일한 하나의 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있고, 또는 각각의 독립적인 재조합 벡터에 포함하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 티로실-tRNA 합성효소는 메타노사에타 콘실리에서 유래한 돌연변이체인 것일 수 있다.
상기 돌연변이체는 에러프론 PCR에 의하여 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단백질은 유레이트 옥시다제(urate oxidase), 형광단백질(superfolder green fluorescent protein, sfGFP) 또는 이의 재조합체인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단백질 발현 단계는 미생물에서 넌센스 코돈이 포함된 단백질 코딩 유전자가 발현되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단백질 발현 단계는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 비천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)의 돌연변이체에 관한 것으로서, 상기 티로실-tRNA 합성효소는 기존에 보고된 메타노코커스 자나쉬아이(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 대체하여 TAG 앰버 코돈(amber codon)이 포함된 단백질의 발현에 사용할 수 있으므로, 이를 효과적으로 단백질의 구조 분석 및 비천연 아미노산 함유 단백질의 생합성 등에 이용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)의 돌연변이체 106(좌)를 이용한 대장균(Escherichia coli; E. coli)에서의 대조군(우) 대비 형광단백질 발현 결과 사진이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소의 돌연변이체 107(좌)를 이용한 대장균에서의 대조군(우) 대비 형광단백질 발현 결과 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 제작
다양한 미생물에 존재하는 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 클로닝하여 기존의 보고된 돌연변이 tRNA와 함께 앰버 코돈(amber codon)을 억제할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소를 확인한 결과 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii)에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소가 앰버 코돈을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
앰버 코돈을 억제할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소로부터 선택적으로 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)을 결합할 수 있는 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들을 얻기 위하여 에러프론(error-prone) PCR 방법으로 돌연변이체들을 제작하였다.
에러프론 PCR 방법은 키트(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)를 사용하여 진행하였다. 먼저 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소를 주형으로 사용하여, 적절한 농도로 희석한 후 키트를 이용하여 PCR을 진행하였다. 주형으로 사용된 티로실-tRNA 합성효소 및 프라이머 관련 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 명칭 서열
1 정방향 프라이머 AGATCTATGGACAAACTGG
2 역방향 프라이머 CCTGCAGGTTACACT
얻어진 PCR 결과물은 제한효소 BglII와 PstI으로 절단하고, 같은 제한효소로 절단된 pEVOL-pAzF(Plasmid ID: 31186, Addgene(Cambridge, MA))에 라이게이즈(ligase)를 이용하여 재조합 벡터 pEVOL-Mc_Mut를 제작하고, 이를 형질전환하여 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 라이브러리를 표 2와 같이 제작하였다.
서열번호 명칭 서열
3 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 106 염기서열 ATGGACAAACTGGAACTGGTTATGCGTAACACCGAAGAAATTGTTACCGTGGATGAACTGAAAGGTCTGCTGGAAAAACCGAGCCGTCCGCGTGCCGGTGTTGGTTATGAAACCAGCGGTAAAGTTCATCTGGGTCACATGCTGACCGCAAATAAACTGCTGGATCTGCAACGTGCAGGTTTTGATGTTGTTGTTCTGCTGGCCGATCTGCACGCATTTCTGAATGAAAAAGGCACCCTGGAAGAAGTTCGTCAGATTGCAGATTATAACCGCGATTGTTTTATGGCCCTGGGTTTAGATCCGGAACGTACCGAATTTGTTTATGGCACCGATTATCAGCTGCAACCGGATTTTATGCTGAAAATTCTGCAAATGGCACGTAATACCAGCCTGAATCGTGCACGTCGTAGCATGGATGAAGTTAGCCGTAATGCAGAAAATCCGATGGTTAGCCAGATGATTTATCCGCTGATGCAGGCAGTTACCATTGCCGATCTGAAAATTGATCTGGCAGTTGGTGGTATTGATCAGCGTAAAATTCACATGTTAGCCCGTGAAGAACTGCCTCGTCTGGGTCTGCCTGCACCGGTTTGTCTGCATACACCGCTGATTCCGGGTCTGAATGGTGAAAAAATGAGCAGCAGCAAAGGTAATAACATTGCAGTTGATGAACCGGCACAGGATGTGGAAAAAAAGATTAAAAGCGCATTTTGCCCTGCCAAAGTGGTTGAAAACAACCCGGTTCTGGCAATCTGTAAATATCATGTTTTTCCGCGTATGGAAGTGGGTATGACCATTAGCCGTCCGGAAAAATTTGGTGGTGATGTTCATTATGCAAGCTATGAACAGCTGGAAGCAGATTTTGTTAGCGGTGCAATGCATCCGATGGACCTGAAAAAAAGCTGTGCAGAATGCATGATTGAAATTCTGGCACCGGTTCGTGAGAAAATGAAAGTGTAA
4 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 106 아미노산 서열 MDKLELVMRNTEEIVTVDELKGLLEKPSRPRAGVGYETSGKVHLGHMLTANKLLDLQRAGFDVVVLLADLHAFLNEKGTLEEVRQIADYNRDCFMALGLDPERTEFVYGTDYQLQPDFMLKILQMARNTSLNRARRSMDEVSRNAENPMVSQMIYPLMQAVTIADLKIDLAVGGIDQRKIHMLAREELPRLGLPAPVCLHTPLIPGLNGEKMSSSKGNNIAVDEPAQDVEKKIKSAFCPAKVVENNPVLAICKYHVFPRMEVGMTISRPEKFGGDVHYASYEQLEADFVSGAMHPMDLKKSCAECMIEILAPVREKMKV
5 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 107 염기서열 ATGGACAAACTGGAACTGGTTATGCGTAACACCGAAGAAATTGTTACCGTGGATGAACTGAAAGGTCTGCTGGAAAAACCGAGCCGTCCGCGTGCCCTGGTTGGTTATGAAACCAGCGGTAAAGTTCATCTGGGTCACATGCTGACCGCAAATAAACTGCTGGATCTGCAACGTGCAGGTTTTGATGTTGTTGTTCTGCTGGCCGATCTGCACGCATTTCTGAATGAAAAAGGCACCCTGGAAGAAGTTCGTCAGATTGCAGATTATAACCGCGATTGTTTTATGGCCCTGGGTTTAGATCCGGAACGTACCGAATTTGTTTATGGCACCGATTATCAGCTGCAACCGGATTTTATGCTGAAAATTCTGCAAATGGCACGTAATACCAGCCTGAATCGTGCACGTCGTAGCATGGATGAAGTTAGCCGTAATGCAGAAAATCCGATGGTTAGCCAGATGATTTATCCGCTGATGCAGGCAGTTCAGATTGCCGATAGCAAAATTGATCTGGCAGTTGGTGGTATTGATCAGCGTAAAATTCACATGTTAGCCCGTGAAGAACTGCCTCGTCTGGGTCTGCCTGCACCGGTTTGTCTGCATACACCGCTGATTCCGGGTCTGAATGGTGAAAAAATGAGCAGCAGCAAAGGTAATAACATTGCAGTTGATGAACCGGCACAGGATGTGGAAAAAAAGATTAAAAGCGCATTTTGCCCTGCCAAAGTGGTTGAAAACAACCCGGTTCTGGCAATCTGTAAATATCATGTTTTTCCGCGTATGGAAGTGGGTATGACCATTAGCCGTCCGGAAAAATTTGGTGGTGATGTTCATTATGCAAGCTATGAACAGCTGGAAGCAGATTTTGTTAGCGGTGCAATGCATCCGATGGACCTGAAAAAAAGCTGTGCAGAATGCATGATTGAAATTCTGGCACCGGTTCGTGAGAAAATGAAAGTGTAA
6 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 107 아미노산 서열 MDKLELVMRNTEEIVTVDELKGLLEKPSRPRALVGYETSGKVHLGHMLTANKLLDLQRAGFDVVVLLADLHAFLNEKGTLEEVRQIADYNRDCFMALGLDPERTEFVYGTDYQLQPDFMLKILQMARNTSLNRARRSMDEVSRNAENPMVSQMIYPLMQAVQIADSKIDLAVGGIDQRKIHMLAREELPRLGLPAPVCLHTPLIPGLNGEKMSSSKGNNIAVDEPAQDVEKKIKSAFCPAKVVENNPVLAICKYHVFPRMEVGMTISRPEKFGGDVHYASYEQLEADFVSGAMHPMDLKKSCAECMIEILAPVREKMKV
실시예 2: 4-아지도-L-페닐알라닌에 대한 선택성이 있는 돌연변이체의 선별
이러한 방법으로 얻어진 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 106 및 107 중에서 앰버 코돈이 있는 형광단백질(superfolder green fluorescent protein, sfGFP)의 발현을 확인함으로써 4-아지도-L-페닐알라닌에 선택성이 있는 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체를 선별하였다.
구체적으로, 앰버 코돈이 있는 형광단백질 sfGFP는 원래의 형광단백질 sfGFP의 204번 아미노산 자리에 앰버 코돈을 치환하여 제작하였다. 앰버 코돈이 있는 형광단백질 유전자는 pSEVA631(Silva-Rocha,R., Martinez-Garcia,E., Chavarria,M., Calles,B., Arce-Rodriguez,A., de las Heras,A., Paez-Espino,D., Durante-Rodriguez,G., Kim,J., Nikel,P.I., Platero,R. and de Lorenzo,V. The Standard European Vector Architecture (SEVA): a coherent platform for analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes, unpublished)의 EcoRI과 KpnI 자리에 삽입하여 발현 벡터 pSEVA631-sfGFP를 제작하였다.
대장균 DH10B(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 컴피턴트 셀(competent cell)에 먼저 앰버 코돈이 있는 형광단백질 sfGFP 유전자를 포함하는 pSEVA631-sfGFP를 형질전환하여 젠타마이신(gentamycin)이 함유된 배지에서 형질전환체를 얻었다.
얻어진 재조합 대장균을 컴피턴트 셀로 준비하고, 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들을 포함하는 pEVOL-Mc_Mut 벡터를 형질전환하여 두 개의 벡터가 있는 재조합 대장균을 앰피실린(ampicillin) 및 젠타마이신 혼합 배지에서 선별하여 얻었다. 얻어진 형질전환체들을 4-아지도-L-페닐알라닌이 첨가된 액체 배지에 접종하여 형광단백질의 발현 여부를 확인하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 기존 티로실-tRNA 합성효소를 대조군으로 하여 측정한 결과 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 106 또는 107을 갖고 있는 재조합 대장균에서만 형광단백질 sfGFP의 발현이 나타났다.
이러한 결과들로부터 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 106 및 107은 4-아지도-L-페닐알라닌을 형광단백질 sfGFP에 결합시킬 수 있다는 것이 확인되었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Tyrosyl-tRNA synthetase mutant and method for producing protein using the same <130> PN210059 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agatctatgg acaaactgg 19 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 cctgcaggtt acact 15 <210> 3 <211> 960 <212> DNA <213> Methanosaeta concilii <400> 3 atggacaaac tggaactggt tatgcgtaac accgaagaaa ttgttaccgt ggatgaactg 60 aaaggtctgc tggaaaaacc gagccgtccg cgtgccggtg ttggttatga aaccagcggt 120 aaagttcatc tgggtcacat gctgaccgca aataaactgc tggatctgca acgtgcaggt 180 tttgatgttg ttgttctgct ggccgatctg cacgcatttc tgaatgaaaa aggcaccctg 240 gaagaagttc gtcagattgc agattataac cgcgattgtt ttatggccct gggtttagat 300 ccggaacgta ccgaatttgt ttatggcacc gattatcagc tgcaaccgga ttttatgctg 360 aaaattctgc aaatggcacg taataccagc ctgaatcgtg cacgtcgtag catggatgaa 420 gttagccgta atgcagaaaa tccgatggtt agccagatga tttatccgct gatgcaggca 480 gttaccattg ccgatctgaa aattgatctg gcagttggtg gtattgatca gcgtaaaatt 540 cacatgttag cccgtgaaga actgcctcgt ctgggtctgc ctgcaccggt ttgtctgcat 600 acaccgctga ttccgggtct gaatggtgaa aaaatgagca gcagcaaagg taataacatt 660 gcagttgatg aaccggcaca ggatgtggaa aaaaagatta aaagcgcatt ttgccctgcc 720 aaagtggttg aaaacaaccc ggttctggca atctgtaaat atcatgtttt tccgcgtatg 780 gaagtgggta tgaccattag ccgtccggaa aaatttggtg gtgatgttca ttatgcaagc 840 tatgaacagc tggaagcaga ttttgttagc ggtgcaatgc atccgatgga cctgaaaaaa 900 agctgtgcag aatgcatgat tgaaattctg gcaccggttc gtgagaaaat gaaagtgtaa 960 960 <210> 4 <211> 319 <212> PRT <213> Methanosaeta concilii <400> 4 Met Asp Lys Leu Glu Leu Val Met Arg Asn Thr Glu Glu Ile Val Thr 1 5 10 15 Val Asp Glu Leu Lys Gly Leu Leu Glu Lys Pro Ser Arg Pro Arg Ala 20 25 30 Gly Val Gly Tyr Glu Thr Ser Gly Lys Val His Leu Gly His Met Leu 35 40 45 Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Leu Gln Arg Ala Gly Phe Asp Val Val 50 55 60 Val Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Phe Leu Asn Glu Lys Gly Thr Leu 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg Gln Ile Ala Asp Tyr Asn Arg Asp Cys Phe Met Ala 85 90 95 Leu Gly Leu Asp Pro Glu Arg Thr Glu Phe Val Tyr Gly Thr Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gln Pro Asp Phe Met Leu Lys Ile Leu Gln Met Ala Arg Asn 115 120 125 Thr Ser Leu Asn Arg Ala Arg Arg Ser Met Asp Glu Val Ser Arg Asn 130 135 140 Ala Glu Asn Pro Met Val Ser Gln Met Ile Tyr Pro Leu Met Gln Ala 145 150 155 160 Val Thr Ile Ala Asp Leu Lys Ile Asp Leu Ala Val Gly Gly Ile Asp 165 170 175 Gln Arg Lys Ile His Met Leu Ala Arg Glu Glu Leu Pro Arg Leu Gly 180 185 190 Leu Pro Ala Pro Val Cys Leu His Thr Pro Leu Ile Pro Gly Leu Asn 195 200 205 Gly Glu Lys Met Ser Ser Ser Lys Gly Asn Asn Ile Ala Val Asp Glu 210 215 220 Pro Ala Gln Asp Val Glu Lys Lys Ile Lys Ser Ala Phe Cys Pro Ala 225 230 235 240 Lys Val Val Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Ile Cys Lys Tyr His Val 245 250 255 Phe Pro Arg Met Glu Val Gly Met Thr Ile Ser Arg Pro Glu Lys Phe 260 265 270 Gly Gly Asp Val His Tyr Ala Ser Tyr Glu Gln Leu Glu Ala Asp Phe 275 280 285 Val Ser Gly Ala Met His Pro Met Asp Leu Lys Lys Ser Cys Ala Glu 290 295 300 Cys Met Ile Glu Ile Leu Ala Pro Val Arg Glu Lys Met Lys Val 305 310 315 <210> 5 <211> 960 <212> DNA <213> Methanosaeta concilii <400> 5 atggacaaac tggaactggt tatgcgtaac accgaagaaa ttgttaccgt ggatgaactg 60 aaaggtctgc tggaaaaacc gagccgtccg cgtgccctgg ttggttatga aaccagcggt 120 aaagttcatc tgggtcacat gctgaccgca aataaactgc tggatctgca acgtgcaggt 180 tttgatgttg ttgttctgct ggccgatctg cacgcatttc tgaatgaaaa aggcaccctg 240 gaagaagttc gtcagattgc agattataac cgcgattgtt ttatggccct gggtttagat 300 ccggaacgta ccgaatttgt ttatggcacc gattatcagc tgcaaccgga ttttatgctg 360 aaaattctgc aaatggcacg taataccagc ctgaatcgtg cacgtcgtag catggatgaa 420 gttagccgta atgcagaaaa tccgatggtt agccagatga tttatccgct gatgcaggca 480 gttcagattg ccgatagcaa aattgatctg gcagttggtg gtattgatca gcgtaaaatt 540 cacatgttag cccgtgaaga actgcctcgt ctgggtctgc ctgcaccggt ttgtctgcat 600 acaccgctga ttccgggtct gaatggtgaa aaaatgagca gcagcaaagg taataacatt 660 gcagttgatg aaccggcaca ggatgtggaa aaaaagatta aaagcgcatt ttgccctgcc 720 aaagtggttg aaaacaaccc ggttctggca atctgtaaat atcatgtttt tccgcgtatg 780 gaagtgggta tgaccattag ccgtccggaa aaatttggtg gtgatgttca ttatgcaagc 840 tatgaacagc tggaagcaga ttttgttagc ggtgcaatgc atccgatgga cctgaaaaaa 900 agctgtgcag aatgcatgat tgaaattctg gcaccggttc gtgagaaaat gaaagtgtaa 960 960 <210> 6 <211> 319 <212> PRT <213> Methanosaeta concilii <400> 6 Met Asp Lys Leu Glu Leu Val Met Arg Asn Thr Glu Glu Ile Val Thr 1 5 10 15 Val Asp Glu Leu Lys Gly Leu Leu Glu Lys Pro Ser Arg Pro Arg Ala 20 25 30 Leu Val Gly Tyr Glu Thr Ser Gly Lys Val His Leu Gly His Met Leu 35 40 45 Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Leu Gln Arg Ala Gly Phe Asp Val Val 50 55 60 Val Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Phe Leu Asn Glu Lys Gly Thr Leu 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg Gln Ile Ala Asp Tyr Asn Arg Asp Cys Phe Met Ala 85 90 95 Leu Gly Leu Asp Pro Glu Arg Thr Glu Phe Val Tyr Gly Thr Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gln Pro Asp Phe Met Leu Lys Ile Leu Gln Met Ala Arg Asn 115 120 125 Thr Ser Leu Asn Arg Ala Arg Arg Ser Met Asp Glu Val Ser Arg Asn 130 135 140 Ala Glu Asn Pro Met Val Ser Gln Met Ile Tyr Pro Leu Met Gln Ala 145 150 155 160 Val Gln Ile Ala Asp Ser Lys Ile Asp Leu Ala Val Gly Gly Ile Asp 165 170 175 Gln Arg Lys Ile His Met Leu Ala Arg Glu Glu Leu Pro Arg Leu Gly 180 185 190 Leu Pro Ala Pro Val Cys Leu His Thr Pro Leu Ile Pro Gly Leu Asn 195 200 205 Gly Glu Lys Met Ser Ser Ser Lys Gly Asn Asn Ile Ala Val Asp Glu 210 215 220 Pro Ala Gln Asp Val Glu Lys Lys Ile Lys Ser Ala Phe Cys Pro Ala 225 230 235 240 Lys Val Val Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Ile Cys Lys Tyr His Val 245 250 255 Phe Pro Arg Met Glu Val Gly Met Thr Ile Ser Arg Pro Glu Lys Phe 260 265 270 Gly Gly Asp Val His Tyr Ala Ser Tyr Glu Gln Leu Glu Ala Asp Phe 275 280 285 Val Ser Gly Ala Met His Pro Met Asp Leu Lys Lys Ser Cys Ala Glu 290 295 300 Cys Met Ile Glu Ile Leu Ala Pro Val Arg Glu Lys Met Lys Val 305 310 315

Claims (11)

  1. 서열번호 4 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase).
  2. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  3. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 미생물.
  5. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 미생물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 미생물의 제조방법.
  7. 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)를 코딩하는 서열번호 3 또는 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단백질 발현 단계를 포함하는 단백질 생산방법.
  8. 제7항에 있어서, 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 단백질 생산방법.
  9. 제7항에 있어서, 미생물은 넌센스 코돈에 대응하는 tRNA를 코딩하는 핵산 서열로 추가적으로 형질전환된 것인, 단백질 생산방법.
  10. 제7항에 있어서, 단백질 발현 단계는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 단백질 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, 비천연 아미노산은 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine)인 것인, 단백질 생산방법.
KR1020210028826A 2021-03-04 2021-03-04 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법 KR102496720B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210028826A KR102496720B1 (ko) 2021-03-04 2021-03-04 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210028826A KR102496720B1 (ko) 2021-03-04 2021-03-04 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220124989A KR20220124989A (ko) 2022-09-14
KR102496720B1 true KR102496720B1 (ko) 2023-02-06

Family

ID=83278675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210028826A KR102496720B1 (ko) 2021-03-04 2021-03-04 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102496720B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130130313A1 (en) 2006-02-22 2013-05-23 Riken METHOD OF SYNTHESIZING A SUPPRESSOR tRNA, DNA CONSTRUCT AND USE THEREOF FOR PRODUCING A NON-NATURAL AMINO ACID-INCORPORATED PROTEIN
US20160257946A1 (en) 2013-10-11 2016-09-08 Sutro Biopharma, Inc. NON-NATURAL AMINO ACID tRNA SYNTHETASES FOR PARA-METHYLAZIDO-L-PHENYLALANINE

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101668150B1 (ko) * 2014-05-26 2016-10-31 한국외국어대학교 연구산학협력단 앰버 서프레션 활성이 증가된 효모균의 티로실-티알엔에이 합성효소

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130130313A1 (en) 2006-02-22 2013-05-23 Riken METHOD OF SYNTHESIZING A SUPPRESSOR tRNA, DNA CONSTRUCT AND USE THEREOF FOR PRODUCING A NON-NATURAL AMINO ACID-INCORPORATED PROTEIN
US20160257946A1 (en) 2013-10-11 2016-09-08 Sutro Biopharma, Inc. NON-NATURAL AMINO ACID tRNA SYNTHETASES FOR PARA-METHYLAZIDO-L-PHENYLALANINE

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS Chem Biol.,9(4):874-879(2014.1.23.)
RSC Adv.,5(2):1274-1281(2014.12.2.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220124989A (ko) 2022-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8501454B2 (en) Homologous recombination-based DNA cloning compositions
CN111094561B (zh) 靶特异性crispr变体
US7528245B2 (en) Efficient protein expression system
EP1341808B1 (en) Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation
US20060084136A1 (en) Production of fusion proteins by cell-free protein synthesis
CN106244608B (zh) 诱导的t7 rna聚合酶
KR102496720B1 (ko) 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법
WO2009119862A2 (en) Method of modifying target region in host dna and selectable marker cassette
Kwon et al. Highly efficient protein expression and purification using bacterial hemoglobin fusion vector
JP3723240B2 (ja) 遺伝子発現の制御方法
US20090311747A1 (en) Vectors and methods for high throughput co-expressions
KR102655597B1 (ko) 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체 및 이를 이용한 4-아지도-L-페닐알라닌의 결합능이 향상된 단백질 생산방법
KR20230066933A (ko) 재조합 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산 방법
KR102557569B1 (ko) 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산방법
US20190330672A1 (en) Highly efficient and tunable system for the incorporation of unnatural amino acids into proteins in escherichia coli
Salim et al. Construction of a compatible Gateway-based co-expression vector set for expressing multiprotein complexes in E. coli
Keum et al. The presence of a common downstream box enables the simultaneous expression of multiple proteins in an E. coli extract
KR102077931B1 (ko) 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc22784 유래 펩타이드
EP2109671B1 (en) Expression cassette, use of the expression cassette, vector, host cell, a method for producing a polypeptide
CN112898434B (zh) 一种快速检测待测菌株生产e4p能力的方法及其使用的生物传感器
CN112851787B (zh) 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器
US7138515B2 (en) Translational activity-promoting higher-order structure
US20220235106A1 (en) Method for expressing and purifying protein by using csq-tag
Kulkarni et al. Selection of cloning and expression plasmid vectors
Huang et al. A small, high-copy-number vector suitable for both in vitro and in vivo gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant