KR20220116243A - 락토오스 전환 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소 - Google Patents

락토오스 전환 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소 Download PDF

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나우시카아 란누
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아넬리에스 베르카테렌
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인바이오스 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 2'푸코실락토오스(2'-FL)의 생산 방법, 뿐만 아니라 새롭게 확인된 푸코실트랜스퍼라제, 보다 구체적으로 새롭게 확인된 락토오스 결합 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드, 및 이들의 적용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 새롭게 확인된 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 이용하여 2-푸코실락토오스(2'FL)를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

락토오스 전환 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소
본 발명은 2'푸코실락토오스(2'-FL)의 생산 방법, 뿐만 아니라 새롭게 확인된 푸코실트랜스퍼라제, 보다 구체적으로 새롭게 확인된 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드, 및 이들의 적용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 새롭게 확인된 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 이용하여 2-푸코실락토오스(2'FL)를 생산하는 방법을 제공한다.
인간 모유 올리고당(Human Milk Oligosaccharides)은 락토오스와 지질 다음으로 인간 모유에서 세 번째로 많은 고형 성분이다. 지금까지 200개 이상의 유리 올리고당 구조가 인간 모유 샘플에서 확인되었다. 오늘날 80개 이상의 HMO 관련 화합물이 구조적으로 특성화되었다. 이들 HMO는 프리바이오틱스로 작용하는 복합 올리고당의 한 종류를 나타낸다. 또한, 상피 에피토프에 대한 HMO의 구조적 상동성은 박테리아 병원체에 대한 보호 특성을 설명한다. 유아 위장관 내에서 HMO는 선택된 박테리아 균주의 성장에 선택적으로 영양을 공급하므로 모유를 먹는 유아에서 고유한 장내 미생물의 발달을 촉진한다.
모유에는 세 가지 주요 HMO 카테고리: 푸코실화 중성 HMO, 푸코실화되지 않은 중성 HMO 및 시알릴화 산성 HMO가 존재한다. 2'푸코실락토오스(2'FL)는 HMO의 푸코실화된 군의 일부이다. "분비자"인 여성에서 2'FL은 단연코 가장 풍부한 HMO이며 모든 HMO의 거의 30%를 구성한다.
푸코실화 올리고당의 생산은 푸코실트랜스퍼라제의 작용을 필요로 한다. 글리코실트랜스퍼라제의 효소 패밀리에 속하는 이러한 푸코실트랜스퍼라제는 척추동물, 무척추동물, 식물, 균류, 효모 및 박테리아에서 널리 발현된다. 이들은 공여체, 일반적으로 구아노신-이인산 푸코오스(GDP-푸코오스)로부터 이당류, 올리고당, (당)단백질 및 (당)지질을 포함하는 수용체로의 푸코오스 잔기의 전달을 촉매한다. 그리하여 푸코실화된 수용체 기질은 다양한 생물학적 및 병리학적 과정에 관여한다.
여러 푸코실트랜스퍼라제가 식물뿐만 아니라 예를 들어, 박테리아 Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella enterica, Yersinia, Enterococcus, Shigella, Klebsiella, Bacteroides, 포유류, Drosophila, Caenorhabditis elegans 및 Schistosoma mansoni에서 확인되었다. 푸코실트랜스퍼라제는 푸코오스 부가 부위에 따라 예를 들어 알파-1,2, 알파-1,3, 알파-1,4 및 O-푸코실트랜스퍼라제로 분류된다.
여러 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제(2'-FTs)가 이미 설명되어 있다. 첫 번째 보고서는 GDP-푸코오스 합성을 위해 변형된 E. coli 균주에서 락토오스를 2'FL로 전환시키기 위해 H.pylori로부터의 HpFucT2(Lee et al., 2012, Microb Cell Fact 11:48; Chin et al., 2016, Biotechnol Bioeng.113:11, 2443-52) 또는 HpFutC(Baumgartner et al., 2013, Microb Cell Fact12:40; Chin et al., 2015, J. Biotechnol 210, 107-115; Wang et al., 1999, Microbiology 145, 3245-3253)의 사용을 설명한다. Bacteroides fragilis에서 유래한 WcfB를 사용한 테스트는 HpFucT2와 비교할 때 조작된 E.coli 숙주에서 개선된 2'FL 생산을 보여주었다(Chin et al., 2017, J Biotechnol 257, 192-198). 기타 2'FL, 예컨대 E. coli O128로부터의 WbsJ, E. coli O126으로부터의 WbgL, E. coli O86로부터의 WbnK 및 WbwK, E. coli O127로부터의 WbiQ, H. Mustelae로부터의 FutL, C.jejuni로부터의 FutG, B. vulgatus ATCC 8482로부터의 FutN, B.fragilis로부터의 WcfW, 및 Thermosynechococcus elongatus(Te2FT)로부터의 Te2FT도 조작된 E.coli 숙주에서 2'FL을 생성하는 것으로 보고되었다(Chin et al., 2017, J Biotechnol 257, 192-198; Huang et al., 2017, Metab Eng 41 , 23-38; Seydametova et al., 2019, Microbiol Res 222, 35-42; US20170081353; US20140024820). 일부 2FT는 또한 GDP-푸코오스를 락토오스로 전달하여 예컨대 Corynebacterium glutamicum(WO2017188684) 또는 Saccharomyces cerevisiae(Liu et al., 2018, ACS Synth Biol 7:11; Yu et al., 2018, Microb Cell Fact 17, 101)와 같이 다른 조작된 세포 내에서 푸코실락토오스 합성을 초래하는 것으로 보고되었다.
그러나 2'푸코실락토오스를 생성하는데 필요한 2-푸코실트랜스퍼라제 또는 2-푸코실트랜스퍼라제 효소로도 알려진 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제는 일반적으로 락토오스에 대한 친화도가 낮은 것으로 알려져 있다. 낮은 친화도는 2'푸코실락토오스의 생산성에 부정적인 영향을 미친다. 전환율과 생산성을 향상시키기 위해서는 락토오스 친화도가 높은 트랜스퍼라제가 필요하다. 나아가 H.pylori로부터의 HpFutC와 같은 일부 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제는 1:5의 높은 디푸코실락토오스 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로 2'FL 합성 동안 원하지 않는 부산물로서 디푸코실락토오스(diFL)를 생성하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 2'푸코실락토오스를 효과적이고 시간 및 비용 효율적인 방식으로 생산 또는 합성할 수 있는 도구 및 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 원하는 생성물을 다량으로, 더욱 바람직하게는 바람직하지 않은 부산물 diFL 없이, 또는 diFL이 생성된다면 1:5보다 낮은 디푸코실락토오스 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로 생성하는 방법 및 도구를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명의 새롭게 확인된 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소는 현재 알려진 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소와 유사하거나 더 높은 락토오스 결합 및/또는 트랜스퍼라제 특성을 갖는 트랜스퍼라제를 제공한다는 것이 이제 밝혀졌다. 또한, 새로 확인된 이러한 트랜스퍼라제는 2'푸코실락토오스를 합성할 때 디-푸코실락토오스(diFL)의 원치 않는 부산물 형성을 초래하는, 현재 알려진 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소에 비해 효소적 부작용 활성을 갖지 않거나 덜 갖는다. diFL이 새로 확인된 트랜스퍼라제에 의해 형성될 때 diFL 농도 대 2'FL 농도의 비율은 1:5보다 작고, 보다 구체적으로 diFL 농도 대 2'FL 농도 비율은 1:10보다 낮다.
따라서, 본 발명은 새롭게 확인된 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 사용하여 2'푸코실락토오스(2'FL)를 생산하는 방법을 제공한다. 2'FL은 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제의 존재하에 락토오스를 반응시켜 얻을 수 있으며, 이는 락토오스와 GDP-푸코오스로부터 2'푸코실락토오스 올리고당의 형성을 촉매할 수 있다. 대안적으로는, 본 발명에 따른 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생산하는 미생물로부터 그것을 얻을 수도 있다.
도 1은 실시예 2에 기재된 바와 같이 20g/L 락토오스가 보충된 최소 배지에서 72시간 배양 후 프로모터-UTR 조합 P12U2(De Mey et al., BMC Biotechnology, 2007)로 구축된 전사 단위로부터 상이한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제(서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5)를 발현하는 돌연변이 균주의 상대 백분율로 g 생성물/g바이오매스에서의 2'FL(상단 패널) 및 diFL (하단 패널)의 정규화된 생산을 보여준다. 각 균주에서 2'FL 및 diFL 생산은 서열번호 71(파선 수평선으로 표시됨)을 갖는 선행 기술의 HpFutC 유전자를 발현하는 참조 균주에서 얻은 2'FL 및 diFL 생산 수준에 대해 각각 정규화된다.
도 2는 실시예 2에 기재된 바와 같이 20g/L 락토오스가 보충된 최소 배지에서 72시간 배양 후 프로모터-UTR 조합 P12U2(De Mey et al., BMC Biotechnology, 2007)로 구축된 전사 단위로부터 상이한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제(서열번호 1 또는 4)를 발현하는 돌연변이 균주의 상대 백분율(%)로 정규화된 2'FL 생산(2FL) 및 성장속도(mu)를 보여준다. 각 균주의 2'FL 생산 수준 및 성장 속도는 서열번호 71(파선 수평선으로 표시됨)을 갖는 선행 기술의 HpFutC 유전자를 발현하는 참조 균주에서 얻은 2'FL 생산 수준 및 성장 속도에 대해 정규화된다.
도 3은 실시예 2에 기재된 바와 같이 다양한 농도의 락토오스(2.5, 5, 10, 20, 45 및 70g/L)이 보충된 최소 배지에서 72시간 배양한 후 프로모터-UTR 조합 P12U2(De Mey et al., BMC Biotechnology, 2007)로 구축된 전사 단위로부터 서열번호 3을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 돌연변이 균주에서 얻은 2'FL 타이터(g/L)을 보여준다.
도 4는 실시예 2에 기재된 바와 같이 20g/L 락토오스가 보충된 최소 배지에서 72시간 배양 후 4개의 상이한 전사 단위(TU)로부터 서열번호 3을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 돌연변이 균주의 상대 백분율(%)로 정규화된 2'FL 생산(2FL) 및 성장 속도(mu)를 나타낸다. 전사 단위는 De Mey et al. (De Mey et al., BMC Biotechnology, 2007)에 기재된 프로모터-UTR 조합 P05U14 (TU 01), P05U38 (TU 02), P10U13 (TU 03) 및 P31U17 (TU 04)로 구성된다. 시험된 각 TU에 대해, 각 균주의 2'FL 생산 수준 및 성장 속도는 동일한 전사 단위(파선 수평선으로 표시됨)로부터의 서열번호 71을 갖는 선행 기술의 HpFutC 유전자를 발현하는 참조 균주에서 얻은 2'FL 생산 수준 및 성장 속도 각각에 대해 정규화된다.
도 5는 실시예 2에 기재된 바와 같이 서열번호 1, 2 또는 71을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 균주를 사용한 유가 발효(fed-batch fermentation) 과정의 마지막에 전체 브로스 샘플에서 얻은 diFL 농도 대 2'FL 농도 비율을 보여준다.
도 6은 실시예 2에 기재된 바와 같이 서열번호 1, 3, 4 또는 71을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 균주를 사용한 발효 과정 동안 다양한 시점에서의 상대적인 2'FL, diFL 및 락토오스 농도(%)를 보여준다.
정의
본 명세서에서 본 발명 및 그 다양한 구체예를 설명하기 위해 사용된 단어는 일반적으로 정의된 의미의 뜻으로 이해되어야 할 뿐만 아니라, 본 명세서에서 특별한 정의에 의해 일반적으로 정의된 범위를 넘어서는 구조, 물질 또는 작용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 만약 요소가 본 명세서의 맥락에서 하나 이상의 의미를 포함하는 것으로 이해될 수 있다면, 청구항에서의 그 사용은 명세서에 의해 및 단어 자체에 의해 지지되는 모든 가능한 의미에 대해 포괄적인 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 본 발명의 구체예의 다양한 구체예 및 양상은 본 명세서에 구체적으로 기재된 순서 및 맥락에서 뿐만 아니라 임의의 순서 및 임의의 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 문맥이 요구할 때마다 단수에 사용된 모든 단어는 복수를 포함하는 것으로 간주되며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 본원에 기재된 혼성화에서의 실험실 절차는 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것들이다. 핵산 및 펩티드 합성에는 표준 기술이 사용된다. 일반적으로 효소 반응 및 정제 단계는 제조업체의 사양에 따라 수행된다.
도면 및 명세서에는 본 발명의 구체예가 개시되어 있으며, 특정한 용어가 사용되었지만, 그 용어는 단지 설명적인 의미로 사용되었으며 제한을 위한 것은 아니고, 본 발명의 범위는 하기 특허청구범위에 기재되어 있다. 예시된 구체예는 예시의 목적으로만 설명되었으며 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 변경, 다른 구체예, 개선, 세부사항 및 사용이 본 명세서의 개시내용의 문자 및 정신과 일치하게 그리고, 균등의 원칙을 포함하여 특허법에 따라 해석되는 청구범위에 의해서만 제한되는 본 개시내용의 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 후속되는 청구범위에서 청구 단계를 지정하는 데 사용되는 참조 문자는 설명의 편의를 위해 제공되며 그 단계를 수행하기 위한 특정 순서를 의미하지 않는 것으로 의도된 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드(들)"에는 무제한적으로 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역 또는 단일, 이중 및 삼중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥, 또는 보다 일반적으로, 이중 가닥, 또는 삼중 가닥 영역일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 또는 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물을 포함한다. 또한, 본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역의 가닥은 동일한 분자 또는 다른 분자 유래일 수 있다. 상기 영역은 하나 이상의 분자 모두를 포함할 수 있지만, 보다 일반적으로 분자 중 일부의 영역만 포함한다. 삼중 나선 영역의 분자 중 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 상기 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA는 본 발명에 따른 "폴리뉴클레오티드(들)"이다. 또한, 이노신과 같은 특이한 염기 또는 트리틸화된 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 관련분야 통상의 기술자에게 공지된 많은 유용한 목적을 수행하는 DNA 및 RNA에 대해 매우 다양한 변형이 이루어졌다는 것이 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 폴리뉴클레오티드의 그러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 예를 들어 단순 세포 및 복합 세포를 포함하는 바이러스 및 세포에 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 또한 종종 올리고뉴클레오티드(들)로 지칭되는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"폴리펩티드(들)"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 지칭한다. "폴리펩티드(들)"은 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 짧은 사슬과 일반적으로 단백질로 지칭되는 보다 긴 사슬을 둘다 지칭한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자 암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. "폴리펩티드(들)"에는 프로세싱 및 기타 번역 후 변형(post-translational modifications)과 같은 자연적 과정뿐만 아니라 화학적 변형 기술에 의해 변형된 것이 포함된다. 이러한 수정은 기본 텍스트와 더 자세한 논문, 방대한 연구 문헌에 잘 설명되어 있으며 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩티드의 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 변형은 예를 들어 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화, 셀레노일화, 아르기닐화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질에 대한 t-RNA 매개의 아미노산 추가를 포함한다. 폴리펩티드는 분지되거나 가지가 없는 분지형 또는 고리형일 수 있다. 고리형, 분지형 및 분지형 원형 폴리펩티드는 번역 후 자연적 프로세싱에서 발생할 수 있으며 완전히 합성 방법으로도 만들 수 있다.
"단리된(isolated)"은 자연 상태에서 "사람의 손에 의해" 변경된 것을 의미한다. 즉, 자연에서 발생하는 경우 원래 환경에서 변경되거나 제거되었거나 둘 다이다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니라, 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 본 명세서에 사용된 바와 같이 "단리된" 것이다. 유사하게, 용어가 본원에 사용된 "합성" 서열은 합성적으로 생성되고 천연 공급원으로부터 직접적으로 단리되지 않은 임의의 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "합성된"은 천연 공급원으로부터 직접적으로 단리되지 않은 임의의 합성적으로 생성된 서열을 의미한다.
"재조합"은 한 종의 유전자를 다른 종의 숙주 유기체의 세포에 이식하거나 스플라이싱하여 제조된 유전적으로 조작된 DNA를 의미한다. 그러한 DNA는 숙주의 유전적 구성의 일부가 되고 복제된다. 본 개시내용의 맥락 내에서 사용되는 "돌연변이" 세포 또는 미생물은 유전적으로 조작되거나 변경된 유전 구성을 갖는 세포 또는 미생물을 지칭한다.
본 개시내용의 맥락 내에서 "2'-푸코실락토오스의 생산을 위해 유전적으로 변형된 세포"라는 용어는 i) 상기 2'-푸코실락토오스의 합성에 필요한 α1,2푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 재조합 유전자, ii) 상기 푸코실트랜스퍼라제에 의해 락토오스로 전달되기에 적합한 GDP-푸코오스를 생성하기 위한 생합성 경로, 및/또는 iii) 락토오스를 생성하기 위한 생합성 경로 또는 배양 배지로부터, 락토오스가 전달되어 그것이 푸코실화되어 2'-푸코실락토오스를 생성하는 세포로의 락토오스의 내재화 메카니즘 중 적어도 하나를 포함하도록 유전적으로 조작된 미생물의 세포를 지칭한다.
용어 "2'푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 핵산 서열"은 2'-푸코실락토오스로의 합성 경로에 필요한 효소, 예를 들어 GDP-푸코오스 공여체 기질의 푸코오스 잔기를 락토오스의 갈락토오스 모이어티의 2' 하이드록실기에 전달시켜 2'푸코실락토오스를 생성하도록 할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
본 개시내용의 맥락 내에서 용어 "내인성(endogenous)"은 세포의 천연 부분이고 세포 염색체의 자연적 위치에서 발생하는 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열을 지칭한다. "외인성"이라는 용어는 세포의 자연적인 부분이 아니라 연구 중인 세포 외부에서 유래하거나 세포 염색체 또는 플라스미드의 자연적인 위치에서 발생하지 않는 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열을 지칭한다.
폴리뉴클레오티드, 유전자, 핵산, 폴리펩티드, 또는 효소와 관련하여 사용될 때 용어 "이종(heterologous)"은 숙주 유기체 종 이외의 공급원으로부터 유래한 또는 공급원으로부터 파생된 폴리뉴클레오티드, 유전자, 핵산, 폴리펩티드, 또는 효소를 지칭한다. 대조적으로, "동종(heterologous)" 폴리뉴클레오티드, 유전자, 핵산, 폴리펩티드, 또는 효소는 숙주 유기체로부터 파생된 폴리뉴클레오티드, 유전자, 핵산, 폴리펩티드, 또는 효소를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 유전자 조절 서열 또는 유전자 서열을 유지하거나 조작하는데 사용되는 보조 핵산 서열을 언급할 때(예를 들어, 프로모터, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 폴리 A 부가 서열, 인트론 서열, 스플라이스 부위, 리보솜 결합 부위, 내부 리보솜 진입 서열, 게놈 상동성 부위, 재조합 부위 등), "이종"은 조절 서열 또는 보조 서열이 구성체, 게놈, 염색체, 또는 에피솜에서 조절 또는 보조 핵산 서열이 병치되어 있는 유전자와 자연적으로 연관되지 않음을 의미한다. 따라서, 자연 상태에서(즉, 비유전적으로 조작된 유기체의 게놈에서) 작동 가능하게 연결되지 않은 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 비록 그 프로모터가 연결된 유전자와 동일한 종(또는 경우에 따라 동일한 유기체)에서 파생될 수 있다 할지라도 본원에서는 "이종 프로모터"라고 칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 75, 76, 77, 78 또는 79에 제시된 아미노산 서열을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 명확성을 위해 서열번호 71의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 정의에 포함되는 폴리뉴클레오티드이지만, 서열번호 71의 폴리뉴클레오티드는 참조로 사용되는 선행 기술의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제이다. 이 용어는 또한 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 또한 함유할 수 있는 추가 영역과 함께 폴리펩티드를 코딩하는 단일 연속 영역 또는 불연속 영역(예를 들어, 통합 파지 또는 삽입 서열 또는 편집에 의해 중단됨)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "변이체(들)"은 각각 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 다르지만 필수적인 특성을 유지하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다. 폴리뉴클레오티드의 전형적인 변이체는 뉴클레오티드 서열이 다른 참조 폴리뉴클레오티드와 상이하다. 변이체의 뉴클레오티드 서열의 변화는 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다. 뉴클레오티드 변화는 아래에서 논의되는 바와 같이 참조 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에서 아미노산 치환, 추가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 다른 참조 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다르다. 일반적으로는 참조 폴리펩티드와 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 차이는 제한적이다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 임의의 조합에서 하나 이상의 치환, 추가, 결실에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화된 것일 수도 있고 아닐 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비천연 변이체는 돌연변이초래(mutagenesis) 기술, 직접 합성, 및 관련 분야 통상의 기술자에게 공지된 다른 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용은 본 발명에서 사용되는 막 단백질의 구조를 변형함으로써 기능적 변이체를 만드는 것을 고려한다. 변이체는 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 류신을 이소류신이나 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 단리적인 대체를 기대하는 것이 합리적이고, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산(예: 보존적 돌연변이)는 생성된 분자의 생물학적 활성에 큰 영향을 미치지 않는다. 보존적 대체는 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 내에서 발생하는 대체이다. 본 개시내용의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화가 기능적 상동체(homolog)를 생성하는지 여부는 야생형 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포에서 반응을 생성하는 변이 폴리펩티드의 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있고, 본 발명의 경우 변이체가 없는 세포보다 더 나은 수율, 생산성 및/또는 성장 속도를 제공하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "기능적 상동체"는 서열 유사성을 갖고 또한 생화학적 활성과 같은 적어도 하나의 기능적 특성을 공유하는 분자를 기술한다. 기능적 상동체는 일반적으로 유사한 정도로 동일한 특성을 나타내지만 반드시 동일한 것은 아니다. 기능적으로 상동성인 단백질은 한 상동체에 의해 생성된 정량적 측정이 다른 상동체의 10% 이상; 보다 전형적으로, 20% 이상, 약 30% 내지 약 40%; 예를 들어, 약 50% 내지 약 60%; 약 70% 내지 약 80%; 또는 약 90% 내지 약 95%; 약 98% 내지 약 100%, 또는 원래 분자에 의해 생성된 것의 100% 초과인 경우 동일한 특성을 제공한다. 따라서, 분자가 효소 활성을 갖는 경우 기능적 상동체는 원래의 효소와 비교하여 위에서 언급한 백분율의 효소 활성을 가질 것이다. 분자가 DNA-결합 분자(예를 들어, 폴리펩티드)인 경우, 상동체는 원래 분자와 비교하여 결합된 분자의 중량으로 측정할 때 상기 언급된 결합 친화도 백분율을 가질 것이다.
기능적 상동체 및 참조 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드일 수 있으며, 서열 유사성은 수렴 또는 발산 진화 사건으로 인한 것일 수 있다. 기능적 상동체는 때때로 이종상동체(ortholog)로 지칭되며, 여기서 "이종상동체"는 다른 종의 참조된 유전자 또는 단백질의 기능적 균등물인 상동성 유전자 또는 단백질을 지칭한다.
기능적 상동체는 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 정렬의 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 데이터베이스에 대한 쿼리(query)를 수행하면 바이오매스-조절 폴리펩티드의 상동체를 확인할 수 있다. 서열 분석은 바이오매스-조절 폴리펩티드의 아미노산 서열을 참조 서열로 사용하는 비중복(non-redundant) 데이터베이스의 BLAST, Reciprocal BLAST 또는 PSI-BLAST 분석을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 어떤 경우에는 뉴클레오티드 서열에서 추론된다. 일반적으로, 데이터베이스에서 40%보다 큰 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드는 바이오매스-조절 폴리펩티드로서의 적합성에 대한 추가 평가를 위한 후보이다. 아미노산 서열 유사성은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로 치환하거나 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것과 같은 보존적 아미노산 치환을 허용한다. 원하는 경우 추가적으로 평가할 후보자 수를 줄이기 위해 이러한 후보자에 대한 수동 검사를 수행할 수 있다. 수동 검사는 생산성-조절 폴리펩티드에 존재하는 도메인, 예를 들어 보존된 기능 도메인을 갖는 것으로 보이는 이들 후보를 선택하여 수행할 수 있다.
폴리뉴클레오티드와 관련하여 "단편"은 폴리뉴클레오티드 분자의 클론 또는 임의의 부분, 특히 사용 가능한 기능적 특성을 유지하는 폴리뉴클레오티드의 일부를 의미한다. 유용한 단편에는 혼성화 또는 증폭 기술 또는 복제, 전사 또는 번역의 조절에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "폴리뉴클레오티드 단편"은 폴리뉴클레오티드의 임의의 하위서열, 일반적으로 본원에서 제공되는 임의의 서열의 약 9개 이상의 연속 뉴클레오티드, 예를 들어 약 30개 이상의 뉴클레오티드 또는 약 50개 이상의 뉴클레오티드를 지칭한다. 예시적인 단편은 추가로 또는 대안적으로 폴리펩티드의 보존된 패밀리 도메인을 코딩하는 영역을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는 단편을 포함할 수 있다. 예시적인 단편은 추가로 또는 대안적으로 폴리펩티드의 보존된 도메인을 포함하는 단편을 포함할 수 있다.
단편은 추가로 또는 대안적으로 폴리펩티드 및 단백질 분자의 서브서열, 또는 폴리펩티드의 서브서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 단편 또는 도메인은 손상되지 않은 폴리펩티드가 수행하는 것과 실질적으로 동일한 방식으로, 또는 유사한 정도로 손상되지 않은 폴리펩티드의 생물학적 기능 중 하나 이상을 수행하는 폴리펩티드의 부분서열이다. 예를 들어, 폴리펩티드 단편은 인식 가능한 구조적 모티프 또는 기능적 도메인, 예를 들어 DNA 프로모터 영역에 결합하는 DNA-결합 부위 또는 도메인, 활성화 도메인, 또는 단백질-단백질 상호작용을 위한 도메인을 포함할 수 있고, 전사를 개시할 수 있다. 단편은 크기가 3개 이하 아미노산 잔기와 같이 작은 것으로부터 온전한 폴리펩티드의 전체 길이까지, 예를 들어 길이가 약 20개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 약 30개 이상의 아미노산 잔기 길이로 다양할 수 있다. 바람직하게는 단편은 그것이 파생된 폴리펩티드의 적어도 하나의 특성 또는 활성을 갖는 기능적 단편이며, 예를 들어 상기 단편은 폴리펩티드의 기능적 도메인 또는 보존된 도메인을 포함할 수 있다. 도메인은 예를 들어 Pfam(El-Gebali et al., Nucleic Acids Res. 47 (2019) D427-D432) 또는 보존 도메인 데이터베이스(CDD)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)(Lu et al., Nucleic Acids Res. 48 (2020) D265-D268) 지정에 의해 특성 규명이 가능하다. 각 데이터베이스의 내용은 각 출시 시점에서 고정되며 변경되지 않는다. 특정 데이터베이스의 내용이 변경되면 이 특정 데이터베이스는 새로운 출시 날짜의 새로운 출시 버전을 받는다. 해당 출시 날짜 및 이러한 특정 출시 날짜에 주석이 달린 특정 콘텐츠가 있는 각 데이터베이스에 대한 모든 출시 버전이 이용 가능하고 통상의 기술자에게 알려져 있다. 본 명세서에서 사용된 PFAM 데이터베이스(https://pfam.xfam.org/)는 2018년 9월에 출시된 Pfam 버전 32.0이다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제", "알파 1,2 푸코실트랜스퍼라제", "2-푸코실트랜스퍼라제, "α-1,2-푸코실트랜스퍼라제", "α 1,2-푸코실트랜스퍼라제", "2 푸코실트랜스퍼라제, "2-FT" 또는 "2FT"는 상호교환적으로 사용되며 공여체 기질 GDP-L-푸코오스로부터 알파-1,2-링키지 내에 있는 수용체 분자 락토오스로 푸코오스의 전달을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제를 지칭한다. "알파-1,2-푸코실트랜퍼라제" 또는 상기 용어 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공여체 기질 GDP-L-푸코오스로부터 알파-1,2-링키지 내에 있는 수용체 분자 락토오스로 푸코오스의 전달을 촉매하는 그러한 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "2'푸코실락토오스", "2'-푸코실락토오스", "알파-1,2-푸코실락토오스", "알파 1,2 푸코실락토오스", "α-1,2-푸코실락토오스", "α 1,2 푸코실락토오스", "Galβ-4(Fucα1-2)Glc", 2FL" 또는 "2'FL"은 상호교환적으로 사용되며 GDP-L-푸코오스로부터 α-1,2-결합내의 락토오스로의 푸코오스 잔기를 전달하는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제의 촉매작용에 의해 얻어진 생성물을 지칭한다. 본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "디푸코실락토오스", "di-푸코실락토오스", "락토디푸코테트라오스", "2',3-디푸코실락토오스", "2',3 디푸코실락토오스", "α-2',3-푸코실락토오스", "α 2',3 푸코실락토오스, "Fucα1-2Galβ 1-4(Fucα1-3)Glc", "DFLac", 2',3 diFL", "DFL", "DiFL" 또는 "diFL"은 상호교환적으로 사용된다. 바람직한 구체예에서, 이들 용어는 바람직한 알파-1,2 푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 푸코실트랜스퍼라제의 촉매작용에 의해 수득된 생성물을 지칭하는 것으로서, 이는 푸코오스 잔기를 락토오스 코어의 글루코오스 모이어티의 3개의 탄소로 전달하여 최종적으로 글루코오스 모이어티에서 락토오스 또는 2'프코실락토오스로 알파 α1,3 결합된 푸코오스의 형성을 초래하고, 최종적으로 3-푸코실락토오스 또는 2',3-디푸코실락토오스를 각각 초래하거나, 또는 푸코오스 잔기를 3 푸코실락토오스로 전달하여 2', 3 디푸코실락토오스를 초래하는 알파 1,2-푸코실트랜스퍼라제의 촉매작용에 의해 수득되는 생성물을 지칭한다. 용어 "올리고당"은 본 명세서에서 사용되고 일반적으로 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 적은 수, 전형적으로 3 내지 10개의 단순한 당, 즉 단당류를 함유하는 당류 중합체를 지칭한다.
"정제된"이라는 용어는 생물학적 분자의 활성을 방해하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 세포, 당류, 핵산 및 폴리펩티드의 경우, 용어 "정제된"은 천연 상태에서 발견되는 물질에 통상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 정제된 당류, 올리고당류, 단백질 또는 핵산은 순도를 결정하기 위한 은 염색 젤 또는 기타 방법에서 밴드 강도로 측정한 경우 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 순도, 일반적으로 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도이다. 순도 또는 균질성은 단백질 또는 핵산 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 당업계에 잘 알려진 다수의 수단에 의해 표시될 수 있으며, 이어서 염색 시 시각화될 수 있다. 특정 목적을 위해서는 고분해능이 필요하고 HPLC 또는 이와 유사한 정제 수단이 사용된다. 올리고당, 예를 들어 2-푸코실락토오스의 경우, 순도는 박층 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, NMR, HPLC, 모세관 전기영동 또는 질량 분광법과 같은 방법을 사용하여 결정할 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성" 또는 % "동일성"이라는 용어는 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 육안 검사에 의해 측정된 최대 일치성을 위해 비교 및 정렬될 때 동일하거나 또는 동일한 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드의 특이적 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열이다. 서열 비교를 위해 하나의 서열은 시험 서열이 대비되는 참조 서열로서 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우 시험 서열과 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열에 상대적인 시험 서열(들)의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 퍼센트 동일성은 BLAST 및 PSI-BLAST를 사용하여 결정할 수 있다(Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402). 본 발명의 목적을 위해, 퍼센트 동일성은 MatGAT2.01을 사용하여 결정된다(Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4:29). 단백질에 대해 다음과 같은 디폴트 매개변수가 사용된다. (1) 갭 비용 존재: 12 및 확장: 2; (2) 사용된 Matrix는 BLOSUM65이다.
용어 "제어 서열"은 폴리뉴클레오티드 서열의 폴리펩티드로의 전사 및 번역을 허용하는 숙주 세포 전사 및 번역 시스템에 의해 인식되는 서열을 지칭한다. 따라서 이러한 DNA 서열은 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요하다. 이러한 제어 서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 서열, Shine Dalgarno 서열, Kozak 서열, 전사 종결자 서열일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다. 전서열(presequence) 또는 분비 리더(secretory leader)에 대한 DNA는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있고; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있거나; 또는 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 상기 제어 서열은 유도성 프로모터를 통해 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 폴리펩티드로의 전사 또는 번역을 유도하거나 억제하는 유전 회로를 통해 IPTG, 아라비노오스, 락토오스, 알로-락토오스, 람노오스 또는 푸코오스와 같은 외부 화학물질로 더욱 제어될 수 있다.
일반적으로 "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우 인접하고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접할 필요가 없다.
발명의 상세한 설명
제1 구체예에 따르면, 본 발명은 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법을 제공한다. 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는
i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는
ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하는 것인 단계,
b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 그 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하고, 이에 의해 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계.
상기 도메인을 모두 포함하고, 및/또는 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76, 또는 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편으로 구성된 목록에서 선택된 새로이 확인된 폴리펩티드는 현재 알려진 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제에 대한 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 가진 대안적인 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 제공한다. 상기 도메인을 모두 포함하고, 및/또는 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76, 또는 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편으로 구성된 목록에서 선택된 폴리펩티드는 현재 알려진 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제과 동일한 또는 그 보다 더 높은 락토스 결합 및/또는 동일한 또는 그 보다 더 높은 트랜스퍼라제 특성을 갖는 트랜스퍼라제를 제공한다.
락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 갖고 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 것으로 새롭게 확인된 일부 폴리펩티드를 사용하는 것의 또 다른 이점은 2-푸코실락토오스가 원하지 않는 디-푸코실락토오스의 생성이 적거나 전혀 생성되지 않고, 보다 구체적으로 디-푸코실락토오스 농도 대 2-푸코실락토오스 농도 비율이 1:5 미만, 바람직하게는 1:10 미만, 더욱 바람직하게는 1:20 미만, 최적으로는 1:40 미만으로 된다는 사실에 있다.
본 발명에 따르면, α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법은 무세포 시스템 또는 세포를 포함하는 시스템에서 수행될 수 있다. 기질 GDP-푸코오스 및 락토오스는 효소 생성물의 형성을 허용하기에 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드와 반응하도록 허용된다. 이러한 조건은 기질과 효소의 양과 순도, 및 시스템이 무세포 또는 세포 기반 시스템인식에 의존적이다. 이들 변수는 관련분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 조정될 것이다.
무세포 시스템에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 수용체 기질(들), 공여체 기질(들) 및 경우에 따라 다른 글리코실트랜스퍼라제 및 보조 효소를 포함하는 다른 반응 혼합물 성분이 효소 반응을 수행하기 위한 수성 반응 배지에서 혼합에 의해 조합된다. 효소는 용액에서 자유로이 이용될 수 있거나, 또는 폴리머와 같은 지지체에 결합되거나 고정될 수 있고 기질이 지지체에 추가될 수 있다. 지지체는 예를 들어 컬럼에 패킹될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 2-푸코실락토오스 합성을 위한 세포 함유 시스템 또는 세포 기반 시스템은 유전적으로 변형된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양상에 따르면, 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드는 폴리펩티드를 생산하는 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포에 의해 생산된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, GDP-푸코오스 및/또는 락토오스는 상기 GDP-푸코오스 및/또는 락토오스를 생산하는 세포에 의해 제공된다. 세포는 또한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생산하는 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생산하는 숙주 세포가 아닌 다른 세포일 수 있으며, 이 경우 통상의 기술자는 세포 커플링에 대해 이야기할 것이다. 이러한 GDP-푸코오스를 생산하는 세포는 예를 들어, 숙주 세포에 첨가될 푸코오스를 GDP-푸코오스로 전환시키는 효소를 발현할 수 있다. 이 효소는 예를 들어 Bacteroides fragilis의 Fkp와 같은 이중기능성 푸코오스 키나제/푸코오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제, 또는 Homo sapiens, Sus scrofa 및 Rattus norvegicus를 포함하는 여러 종에서 알려진 것처럼 하나의 개별 푸코오스 키나아제와 하나의 개별 푸코오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제의 조합일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법에 관한 것이다:
i) α-1,2-푸코실락토오스 생산을 위해 유전적으로 변형된 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 α-1,2-푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고, 상기 세포는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 상기 폴리펩티드의 발현을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 a) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는 b) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하고, 및
ii) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하는 조건 하에 배지에서 세포를 배양하는 단계.
추가적인 구체예에서,
본 발명은 하기 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법에 관한 것이다:
a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 a) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는 ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하고, 및
b) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하고 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적합한 영양 조건 하에 단계 a)의 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계;
c) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드가 GDP-푸코오스로부터 푸코오스 잔기의 락토오스로의 전달을 촉매하기 위해, 단계 b)와 동시에 또는 그 다음에 공여체 기질 GDP-푸코오스 및 수용체 기질 락토오스를 제공함으로써, α-1,2-푸코실락토오스를 생산하는 단계.
또 다른 구체예에 따르면, 본원에 기재된 방법에서 상기 2'-푸코실락토오스의 생성은 세포에 의한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이종성 또는 상동성 (과)발현에 의해 수행된다.
본원에 기술된 본 발명의 방법에서 숙주 세포는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력으로 본원에 기술된 바와 같은 외인성 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포를 사용하여 알파-1,2-푸코실락토오스를 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 외인성 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 성장시키는 단계(여기서 폴리펩티드는 본원에 기술됨); 및
b) 단계 a)와 동시에 또는 후속적으로 공여체 기질 GDP-푸코오스 및 수용체 기질 락토오스를 제공하는 단계로서, 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 푸코오스 잔기의 공여체 기질로부터 수용체 기질로의 전달을 촉매하고, 이에 따라서 알파-1,2-푸코실락토오스를 생성하는 단계.
바람직하게는 본원에 사용된 바와 같이 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 외인성 폴리펩티드는 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'FL 농도 비율로 디푸코실락토오스를 생성하지 않거나 더 적은 디푸코실락토오스를 생성한다.
diFL 농도 대 2'FL 농도의 비율은 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 , 1:100, 1:110, 1:120, 1:130, 1:140, 1:150, 1:160, 1:170, 1:180, 1:190, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000 미만일 수 있다.
바람직한 구체예에서 2'FL 농도에 대한 diFL 농도의 비율이 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1: 38, 1:39, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:110, 1:120, 1:130, 1:140, 1:150, 1:160, 1:170, 1:180; 1:190, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000 미만으로 생산과정에서 얻어지고 결과적으로 최종 락토오스 농도가 25g/L, 20g/L, 15g/L 10g/L, 9g/L, 8g/L, 7g/L, 6g/L, 5g/L, 4g 미만의 농도 /L, 3g/L, 2g/L, 1g/L, 0.5g/L, 0.25g/L, 0.1g/L 미만 또는 0g/L이 된다.
또다른 구체예에서 2'FL 농도에 대한 diFL 농도의 비율이 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:110, 1:120, 1:130, 1:140, 1:150, 1:160, 1:170, 1:180; 1:190, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000 미만으로 생산과정에서 얻어지고 여기서 락토오스 농도가 기질 제한 조건(substrate limiting conditions)에서 공급되며, 기질 제한은 기질의 전환율을 결정하는 생물반응기 내의 농도로 정의된다.
또다른 구체예에서 2'FL 농도에 대한 diFL 농도의 비율이 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:110, 1:120, 1:130, 1:140, 1:150, 1:160, 1:170, 1:180; 1:190, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000 미만으로 생산과정에서 얻어지고 여기서 락토오스는 속도 제한 조건(rate limiting conditions)에서 형성된다.
또 다른 구체예에서, 브로스(broth) 중 2'푸코실락토오스 순도는 브로스 중 약 80% 초과, 예를 들어 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 2'-푸코실락토오스 순도는 2'FL 농도 대 2'FL 농도, diFL 농도 및 락토오스 농도의 합의 비율로 정의된다([2'FL]/([2'FL ]+[diFL]+[락토오스])).
본 발명에 따르면, GDP-푸코오스 및/또는 락토오스는 발효 배지 또는 수성 배양 배지에서 숙주 세포에 공급될 수 있다. 대안적으로, GDP-푸코오스 및/또는 락토오스는 숙주 세포에서 동시에 발현되는 효소에 의해 또는 숙주 세포의 대사에 의해 제공될 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 또한 GDP-푸코오스 및/또는 락토오스 다음으로 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생성할 것이다. 또 다른 구체예에서, GDP-푸코오스 및/또는 락토오스는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생산하는 숙주 세포가 아닌 다른 세포인 세포에 의해 생산될 수 있으며, 이 경우 통상의 기술자는 세포 커플링에 대해 이야기할 것이다. 이러한 GDP-푸코오스를 생산하는 세포는 예를 들어, 숙주 세포에 첨가될 푸코오스를 GDP-푸코오스로 전환시키는 효소를 발현할 수 있다. 이 효소는 예를 들어 Bacteroides fragilis의 Fkp와 같은 이중기능성 푸코오스 키나제/푸코오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제, 또는 Homo sapiens, Sus scrofa 및 Rattus norvegicus를 포함하는 여러 종에서 알려진 것처럼 하나의 개별 푸코오스 키나아제와 하나의 개별 푸코오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제의 조합일 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산은 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이종성 또는 상동성 (과)발현을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포에 의해 수행된다.
추가적인 양상에서 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 알파-1,2-푸코실락토오스를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 숙주 세포 또는 그것의 성장 배지로부터 상기 알파-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
"분리하는"이라는 용어는 반응 혼합물 및/또는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생산하는 세포, 숙주 세포, 이의 성장 배지 및/또는 또는 본원에 설명된 반응 혼합물, 본 발명에 따라 새로 확인된 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제의 사용에 의해 생성된 2-푸코실락토오스로부터 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 수확, 수집 또는 회수하는 것을 의미한다.
α-1,2-푸코실락토오스가 세포나 발효를 이용하여 제조되는 경우, 2'FL은 혼합물이 제조된 수성 배양 배지로부터 통상적인 방법으로 분리될 수 있다. 알파-1,2-푸코실락토오스가 알파-1,2-푸코실락토오스를 생성하는 세포에 여전히 존재하는 경우, 세포로부터 알파-1,2-푸코실락토오스를 유리시키거나 추출하기 위한 통상적인 방식, 예컨대 높은 pH, 열 충격, 초음파 처리, 프렌치 프레스, 균질화, 효소적 가수분해, 화학적 가수분해, 용매 가수분해, 세제, 가수분해,... 가 사용될 수 있다. 배양 배지, 반응 혼합물 및/또는 세포 추출물은 함께 그리고 별도로 2'FL 함유 혼합물로 지칭되며, 2'FL을 분리하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 이것은 바람직하게는 2'FL 함유 혼합물을 정화하여 현탁된 미립자 및 오염물, 특히 세포, 세포 성분, 불용성 대사산물 및 유전자 변형된 세포를 배양하고/하거나 효소 반응을 수행함으로써 생성된 파편을 제거하는 것을 포함한다. 이 단계에서, 2'FL 함유 혼합물은 통상적인 방식으로 정화될 수 있다. 바람직하게는, 2'FL 함유 혼합물은 원심분리, 응집, 경사분리 및/또는 여과에 의해 정화할 수 있다. 2'FL 함유 혼합물로부터 2'FL을 분리하는 두 번째 단계는 바람직하게는 2'FL 함유 혼합물, 바람직하게는 정화된 후에도 실질적으로 모든 단백질, 뿐만 아니라 펩티드, 아미노산, RNA 및 DNA 및 후속 분리 단계를 방해할 수 있는 임의의 내독소 및 당지질을 제거하는 것을 포함한다. 이 단계에서, 단백질 및 관련 불순물은 통상적인 방식으로 2'FL 함유 혼합물로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는, 단백질, 염, 부산물, 색상 및 기타 관련 불순물은 한외여과, 나노여과, 역삼투, 정밀여과, 활성탄 또는 탄소 처리, 접선 흐름 고성능 여과, 접선 흐름 한외여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피(예: 양이온 교환, 음이온 교환, 혼합층 이온 교환을 포함하나 이에 제한되지 않음), 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 겔 여과(즉, 크기 배제 크로마토그래피), 특히 크로마토그래피, 보다 특별히 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 리간드 교환 크로마토그래피에 의해 2'FL 함유 혼합물로부터 제거된다. 크기 배제 크로마토그래피를 제외하고 단백질 및 관련 불순물은 크로마토그래피 매질 또는 선택된 멤브레인에 의해 유지되는 반면 2'FL은 2'FL 함유 혼합물에 남아 있다.
2'FL은 증발, 동결건조, 결정화, 침전 및/또는 건조, 분무 건조에 의한 추가 정제 단계가 있거나 없는 반응 혼합물 및/또는 배양 배지 및/또는 세포로부터 추가로 분리된다.
더욱 추가적인 양상에서, 본 발명은 또한 알파-1,2-푸코실락토오스의 추가 정제를 제공한다. 상기 2-푸코실락토오스의 추가 정제는 예를 들어 (활성화된) 목탄 또는 탄소, 나노여과, 한외여과 또는 이온 교환을 사용하여 잔류하는 DNA, 단백질, LPS, 내독소, 또는 기타 불순물을 제거함으로써 달성될 수 있다. 에탄올과 같은 알코올 및 수성 알코올 혼합물도 사용할 수 있다. 또 다른 정제 단계는 제품의 결정화, 증발 또는 침전에 의해 수행된다. 또 다른 정제 단계는 알파-1,2-푸코실락토오스를 건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이다.
분리되고 바람직하게는 정제된 2'FL은 유아용 조제유의 보충제로 사용될 수 있고 신생아의 다양한 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 본원에 기재된 수용체 기질로서 락토오스 및 바람직하게는 또한 2'FL을 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드가 진균, 효모, 박테리아, 곤충, 동물 또는 식물 발현 시스템 또는 본원에 기재된 세포내에서 및/또는 이들에 의해 생성되는 방법을 제공한다. 발현 시스템 또는 세포는 박테리아, 효모, 또는 진균(fungus)을 포함하는 목록으로부터 선택되거나, 식물 또는 동물 세포를 지칭한다. 후자의 박테리아는 바람직하게는 프로테오박테리아의 문(phylum) 또는 Firmicutes의 문 또는 시아노박테리아의 문 또는 Deinococcus-Thermus의 문에 속한다. 프로테오박테리아 문에 속하는 후자의 박테리아는 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae)과, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 종에 속한다. 후자의 박테리아는 바람직하게는 Escherichia coli B, Escherichia coli C, Escherichia coli W, Escherichia coli K12, Escherichia coli Nissle와 같은(이에 국한되지 않음) Escherichia coli 종에 속하는 임의의 균주에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 후자는 실험실 환경에 잘 적응하고 야생형 균주와 달리 장에서 번성하는 능력을 상실한 배양된 대장균 균주(E. coli K12 균주로 지정됨)에 관한 것이다. E. coli K12 균주의 잘 알려진 예는 K12 야생형, W3110, MG1655, M182, MC1000, MC1060, MC1061, MC4100, JM101, NZN111 및 AA200이다. 따라서, 본 발명은 구체적으로 상기 E. coli 균주가 K12 균주인 것으로 상기 표시된 바와 같은 돌연변이 및/또는 형질전환된 대장균 숙주 세포 또는 균주에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 대장균 K12 균주는 대장균 MG1655이다. Firmicutes 문에 속하는 후자의 박테리아는 바람직하게는 Bacilli, 바람직하게는 Lactobacillus lactis, Leuconostoc mesenteroides과 같은 구성원을 가진 Lactobacilliales, 또는 Bacillus subtilis, 또는 B. amyloliquefaciens와 같은 Bacillus 속과 같은 구성원을 가진 Bacillales에 속한다. 후자의 박테리아는 악티노박테리아 문에 속하며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 C. afermentans와 같은 구성원을 가진 Corynebacteriaceae의 과에 속하고, 또는 Streptomyces griseus 또는 S. fradiae의 구성원을 가진 Streptomycetaceae의 과에 속한다. 후자의 효모는 바람직하게는 자낭균(Ascomycota)문 또는 담자균(Basidiomycota)문 또는 신생균(Deuteromycota)문 또는 접합균(Zygomycetes)문에 속한다. 후자의 효모는 바람직하게는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Komagataella, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Yarrowia 또는 Starmerella 속에 속한다. 후자의 진균류(fungus)는 바람직하게는 Rhizopus, Dictyostelium, Penicillium, Mucor 또는 Aspergillus 속에 속한다.
본 발명의 추가적인 양상에 따르면, 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 세포 또는 발현 시스템의 코돈 사용에 적합화되어 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 포함하는 숙주 세포 또는 미생물의 성장을 위한 배양 배지를 사용하며, 여기서 배양 배지 중 락토오스 농도는 50 내지 150g/L 범위이다. 배양 배지에서 이러한 락토오스 농도는 50g/L, 55g/L, 60g/L, 65g/L, 70g/L, 75g/L, 80g/L, 85g/L, 90g/L, 95g/L, 100g/L, 105g/L, 110g/L, 115g/L, 120g/L, 125g/L, 130g/L, 135g/L, 140g /L, 145g/L 또는 150g/L일 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 포함하는 숙주 세포 또는 미생물의 성장을 위한 배양 배지를 사용하며, 여기서 배양 배지 중 GDP-푸코오스는 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로 숙주 세포가 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 존재한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 포함하는 숙주 세포 또는 미생물의 성장을 위한 배양 배지를 사용하며, 여기서 배양 배지 중 GDP-푸코오스는 순도 80% 이상으로 숙주 세포가 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 존재한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 포함하는 숙주 세포 또는 미생물의 성장을 위한 배양 배지를 사용하는데 여기서는 탄소계 기질이 숙주 세포로 하여금 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도에서 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 존재한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 포함하는 숙주 세포 또는 미생물의 성장을 위한 배양 배지를 사용하는데 여기서는 탄소계 기질이 숙주 세포로 하여금 순도 80% 이상의 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적의 농도에서 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 존재한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 70g/L 내지 200g/L 범위의 2-푸코실락토오스의 최종 농도를 생산한다. 이러한 2'FL 농도는 70g/L, 75g/L, 80g/L, 85g/L, 90g/L, 95g/L, 100g/L, 105g/L, 110g/L, 115g/L, 120g/L, 125g/L, 130g/L, 135g/L, 140g/L, 145g/L, 150g/L, 155g/L, 160g/L, 165g/L, 170g/L, 175g/L, 180g/L, 185g/L, 190g/L, 195g/L, 또는 200g/L이다. 배양 배지에서 더 높은 락토오스 농도는 생산 방법에서 훨씬 더 높은 2'FL 최종 농도가 얻어지도록 제공할 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 설명된 바와 같이 70g/L 내지 200g/L 범위에서 2'FL의 최종농도를 생산하고, 여기서 diFL 농도 대 2'FL 농도 비율은 1:5 미만, 보다 바람직하게는 1:10, 훨씬 더 바람직하게는 1:40이다.
본 발명의 또 다른 측면은 증가된 GDP-푸코오스 공급에 의한 락토오스의 개선된 푸코실화 속도를 위한 방법을 제공하며, 여기서 2'FL 농도에 대한 diFL 농도 비율은 1:5 미만이다. 본 발명의 대안적인 측면은 증가된 GDP-푸코오스 공급에 의한 락토오스의 개선된 푸코실화 속도를 위한 방법을 제공하며, 여기서 최종 2'FL은 80% 이상의 순도를 갖는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 가지며 본 발명의 서열번호 71을 갖는 H.pylori의 HpFutC에 비하여 2'FL에 대해 푸코실트랜스퍼라제 활성을 덜 가지는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 GDP-푸코오스에 대해 개선된 친화도를 갖는다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에서 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드는
i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는 ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속한다.
본 발명의 범위 내에서, 이러한 폴리펩티드는 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 것으로 입증되었으며, 바람직하게는 현재 알려진 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소와 비교하여 2-푸코실락토오스에 대한 효소적 부작용 활성이 적거나 전혀 없다.
본원에 사용된 아미노산 서열은 첨부된 서열 목록 중 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76으로부터 선택된 서열일 수 있다. 상기 아미노산 서열은 또한 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 내에서, 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 변이체일 수 있다.
N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 스트레치에 의해 임의로 추가로 변형된 본원에 기재된 알파 1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드가 본 발명의 범위에 추가로 포함된다. 이러한 아미노산 스트레치는 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에서 폴리펩티드 서열의 부가로서 이해되어야 한다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열은 추가적인 효소 활성을 달성하기 위해 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이러한 아미노산 스트레치는 특정 태그 및/또는 HQ-태그일 수 있으며; 최대 20개 아미노산의 연장, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산일 수 있고; 이러한 확장은 또한 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 선택적 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 스트레치는 또한 정제를 위한 태그, 폴리펩티드의 용해도를 증가시키기 위한 태그, 대사 형성을 위한 태그 또는 아미노산 스트레치, 단백질 대사체학(metabolomics)을 위한 태그, 기질 결합을 위한 태그, 유전자 융합에서 동일하거나 상이한 기능을 갖는 또 다른 폴리펩티드, 예를 들어 GDP-푸코오스 합성효소, 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 이기능성 푸코오스 키나제/푸코오스-1-포스페이트 구아닐일트랜스퍼라제 또는 푸코오스- 1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라제일 수 있으며 이제 제한되지 않고, 여기서 상기 다른 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드에 선택적으로 융합된다. 예를 들어, 본원에 기술된 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 외인성 친화성 태그, 예를 들어 정제 또는 기질 결합 태그, 예를 들어 6 His 태그 서열, GST 태그, HQ 태그, HA 태그 서열, 복수의 6 His 태그 서열, 복수의 GST 태그, 복수의 HA 태그 서열, SNAP-태그, SUMOstar 태그를 포함한다. 다른 예로는 단백질 분해 절단 부위, 보유 부위, 절단 부위, 폴리히스티딘 태그, 비오틴, 아비딘, BiTag 서열, S 태그, 엔테로키나제 부위, 트롬빈 부위, 항체 또는 항체 도메인, 항체 단편, 항원, 수용체, 수용체 도메인, 수용체 단편, 리간드, 염료, 수용체, 소광제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또한, 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 기능적으로 균등한 폴리펩티드를 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 균등한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 본원에 기술된 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열 내에 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 포함할 수 있지만, 이는 침묵적 변화를 초래하므로, 기능적으로 균등한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 생성한다. 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성을 기반으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 평면 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 본 발명의 맥락 내에서, 본원에 사용된 "기능적으로 균등한"은 효소 활성을 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 기준 중 임의의 것에 의해 판단되는 본 발명의 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 생체내(in vivo) 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 번역 동안 또는 번역 후에 차등적으로 변형되는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 단백질, 폴리펩티드, 및 유도체(단편 포함)가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 나아가, 비고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드 서열에 대한 치환 또는 부가로서 도입될 수 있다.
알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 관련 분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 폴리뉴클레오티드에 의한 발현에 의해 생성될 수 있다. 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 코딩 서열 및 적절한 전사 및/또는 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관내(in vitro) 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내(in vivo) 유전자 재조합이 포함된다. 예를 들어 Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: a lab manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1989년 및 매년 업데이트)에 설명된 기술을 참조할 것.
대안적으로, 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 자연에서 또는 무세포 및/또는 시험관내 시스템 내에서 폴리펩티드를 생성하는 세포의 추출에 의해, 직접 합성에 의해 생성될 수 있다. 디푸코실락토오스 부산물 형성이 적거나 전혀 없고, 바람직하게는 2'FL 농도에 대한 디푸코실락토오스 농도의 비율이 1:5 미만이고, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상의 2'FL 순도를 갖는, 2-푸코실락토오스 생산에 사용되는 락토오스 결합 능력을 갖는 새로 확인된 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제의 적합성은 매우 놀랍고, 따라서 이들의 사용은 2'-푸코실락토오스를 쉽고 효율적이며 비용-효율적으로 생산하기 위한 우수한 도구를 나타낸다.
알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관련 업계에 잘 알려진 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술을 통해 생산될 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 코딩 서열 및 적절한 전사 및/또는 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 예를 들어 Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1989년 및 매년 업데이트)에 설명된 기술을 참조할 것.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 제공될 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터로 형징전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동적으로 링크된다. 특히 바람직한 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이고, 본 발명의 또다른 양상에 따르면 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 리포솜, 또는 바이러스의 형태로 존재할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 숙주 세포 내로 안정적으로 형질전환/형질감염될 벡터에 포함될 수 있다. 벡터에서, 본원에 기술된 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 제어 하에 있다. 프로모터는 예를 들어 유도성 프로모터일 수 있어, 유전자/폴리뉴클레오티드의 발현이 특이적으로 표적화될 수 있고, 원하는 경우 유전자가 그러한 방식으로 과발현될 수 있다. 프로모터는 또한 구성적 프로모터일 수 있다.
매우 다양한 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 벡터는 무엇보다도 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대 코스미드 및 파지미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소로부터 유래된 것을 포함한다. 이들 벡터는 항생제 마커, 영양요구성 마커, 독소-항독소 마커, RNA 센스/안티센스 마커와 같은 선택 마커를 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 발현 시스템 구축물은 발현을 조절할 뿐만 아니라 초래하는 제어 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현하고/하거나 숙주에서 폴리펩티드를 발현하기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터가 이와 관련하여 발현을 위해 사용될 수 있다. 적절한 DNA 서열은 예를 들어 Sambrook et al.(상기 참조)에 기재된 것과 같은 다양한 공지되고 일상적인 기술에 의해 발현 시스템에 삽입될 수 있다.
재조합 생산을 위해, 숙주 세포는 발현 시스템 또는 이의 부분 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입은 Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) 및 상기 Sambrook et al., 1989와 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 설명된 방법에 의해 유효화할 수 있다.
추가적인 양상에 따르면, 본 발명은 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위해 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 2'-푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 세포는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드의 발현을 포함한다.
상기 폴리펩티드는
i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는
ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 형질전환 또는 형질감염되었거나 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환 또는 형질감염될 수 있어 상기 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 서열을 함유하는 세포로 현재로서는 정의된다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 그러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 현장에서(in situ) 본 발명의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 유전자 생성물을 나타내는 세포를 또한 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 2-푸코실락토오스 생산을 위한 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 외래인 서열이고, 여기서 상기 서열은 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 링크된다.
본 발명의 대안적인 양상에 따르면, 2-푸코실락토오스 생산을 위한 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 본원에 기재된 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 링크되어 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 또한 a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포를 제공하는 단계, 및 b) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하는 조건 하에 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 α-1,2-푸코실락토오스는 본원에 기재된 바와 같이 배양물로부터 분리된다. 바람직하게는, 또한 정제가 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 2-푸코실락토오스의 생산을 위한 본원에 기재된 바와 같은 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 추가적인 양상에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 미생물이 제공된다.
본원에 사용된 용어 미생물 또는 유기체 또는 세포 또는 숙주 세포는 박테리아, 효모, 또는 진균(fungus)을 포함하는 목록으로부터 선택된 미생물을 지칭되거나, 식물 또는 동물 세포를 지칭한다. 후자의 박테리아는 바람직하게는 프로테오박테리아의 문(phylum) 또는 Firmicutes의 문 또는 시아노박테리아의 문 또는 Deinococcus-Thermus의 문에 속한다. 프로테오박테리아 문에 속하는 후자의 박테리아는 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae)과, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 종에 속한다. 후자의 박테리아는 바람직하게는 Escherichia coli B, Escherichia coli C, Escherichia coli W, Escherichia coli K12, Escherichia coli Nissle와 같은(이에 국한되지 않음) Escherichia coli 종에 속하는 임의의 균주에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 후자는 실험실 환경에 잘 적응하고 야생형 균주와 달리 장에서 번성하는 능력을 상실한 배양된 대장균 균주(E. coli K12 균주로 지정됨)에 관한 것이다. E. coli K12 균주의 잘 알려진 예는 K12 야생형, W3110, MG1655, M182, MC1000, MC1060, MC1061, MC4100, JM101, NZN111 및 AA200이다. 따라서, 본 발명은 구체적으로 상기 E. coli 균주가 K12 균주인 것으로 상기 표시된 바와 같은 돌연변이 및/또는 형질전환된 대장균 숙주 세포 또는 균주에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 대장균 K12 균주는 대장균 MG1655이다. Firmicutes 문에 속하는 후자의 박테리아는 바람직하게는 Bacilli, 바람직하게는 Lactobacillus lactis, Leuconostoc mesenteroides과 같은 구성원을 가진 Lactobacilliales, 또는 Bacillus subtilis, 또는 B. amyloliquefaciens와 같은 Bacillus 속과 같은 구성원을 가진 Bacillales에 속한다. 후자의 박테리아는 악티노박테리아 문에 속하며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 C. afermentans와 같은 구성원을 가진 Corynebacteriaceae의 과에 속하고, 또는 Streptomyces griseus 또는 S. fradiae의 구성원을 가진 Streptomycetaceae의 과에 속한다. 후자의 효모는 바람직하게는 자낭균(Ascomycota)문 또는 담자균(Basidiomycota)문 또는 신생균(Deuteromycota)문 또는 접합균(Zygomycetes)문에 속한다. 후자의 효모는 바람직하게는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Komagataella, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Yarrowia 또는 Starmerella 속에 속한다. 후자의 진균류(fungus)는 바람직하게는 Rhizopus, Dictyostelium, Penicillium, Mucor 또는 Aspergillus 속에 속한다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 숙주 세포의 코돈 사용에 적합화된다.
본 발명의 추가적인 양상은 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 추가적인 양상은 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 본원에 기재된 바와 같은 벡터의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 2-푸코실락토오스, 뿐만 아니라 2-푸코실락토오스의 생산을 위한 상기 기재된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 미생물 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 알파-1,2-푸코실락토오스는 유아식, 성인 식품 또는 공급물의 보충을 위한 식품 첨가물, 프리바이오틱, 공생체로서, 또는 치료학적 또는 약학적 활성 화합물로서 사용될 수 있다. 새로운 방법을 사용하면 복잡하고 시간과 비용이 많이 드는 합성 과정 없이 알파-1,2-푸코실락토오스를 쉽고 효과적으로 제공할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에 사용된 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 상기 및 하기 기재된 혼성화에서의 실험실 절차는 관련 업계에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 핵산 및 펩티드 합성에는 표준 기술이 사용된다. 일반적으로 효소 반응 및 정제 단계는 제조업체의 사양에 따라 수행된다.
추가적인 이점은 특정 구체예, 실시예 및 첨부된 도면에 나온다.
물론, 상술한 특징 및 이하에서 설명할 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위에서 각각 특정된 조합으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 다른 조합으로 또는 단독으로 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 다음의 특이적인 구체예에 관한 것이다:
1. 하기 단계들을 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는
i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고 및/또는
ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하고,
b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계로서, 이에 의해 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하고,
c) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
2. 구체예 1에 있어서, α-1,2-푸코실락토오스의 생산이 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율을 1:5 미만, 바람직하게는 α-1,2-푸코실락토오스 순도를 80% 이상으로 초래하는 것인 방법.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는 무세포 시스템으로 제공되는 것인 방법.
4. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 의해 생산되는 것인 방법.
5. 구체예 1, 구체예 2 또는 구체예 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDP-푸코오스 및/또는 락토오스가 상기 GDP-푸코오스 및/또는 락토오스를 생산하는 세포에 의해 제공되는 것인 방법.
6. 구체예 1, 구체예 2, 구체예 4 또는 구체예 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 것인 방법:
i) α-1,2-푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, α-1,2-푸코실락토오스 생산을 위해 유전적으로 변형된 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 상기 폴리펩티드의 발현을 포함하고,
ii) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하는 조건 하에 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계,
iii) 선택적으로 배양물로부터 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
7. 구체예 4항에 있어서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 것인 방법:
a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하고 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적합한 영양 조건 하에 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계;
c) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드가 푸코오스 잔기의 GDP-푸코오스로부터 락토오스로의 전달을 촉매하기 위해 b) 단계와 동시에 또는 그에 후속적으로 공여체 기질에 GDP-푸코오스 및 수용체 기질에 락토오스를 제공함으로써, α-1,2-푸코실락토오스를 생산하는 단계;
d) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 분리하는 단계.
8. 구체예 6 또는 구체예 7에 있어서, 숙주 세포가 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 외인성 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환 또는 형질감염되는 것인 방법.
9. 구체예 4 내지 구체예 8 중 어느 한 항에 있어서, GDP-푸코오스 및/또는 락토오스가 숙주 세포에서 동시에 발현되는 효소에 의해 또는 숙주 세포의 대사에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 구체예 1 내지 구체예 9 중 어느 한 항에 있어서, α-1,2-푸코실락토오스의 정제를 더 포함하는 것인 방법.
11. 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 2'-푸코실락토오스의 생산 방법:
i) 초기 반응기 부피의 리터당 50 그램 이상, 보다 바람직하게는 75 그램 이상, 더욱 바람직하게는 100 그램 이상, 더욱 바람직하게는 120 그램 이상, 더욱 바람직하게는 150 그램 이상의 락토오스를 포함하는 락토오스 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 여기서 총 반응기 부피는 250mL(밀리리터) 내지 10,000m3(입방 미터) 범위이고, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 락토오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
ii) 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 바람직하게는 연속 방식으로 숙주 세포가 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농도에서 GDP-푸코오스 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 GDP-푸코오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
iii) 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 바람직하게는 연속 방식으로, 숙주 세포가 2'-푸코실락토오스 합성의 최적 농도로 GDP-푸코오스를 합성할 수 있는 농도에서 탄소계 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
iv) 숙주 세포가 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도에서 락토오스를 내부적으로 합성할 수 있는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
v) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 하나 이상의 공급 용액에 의하여 락토오스 공급물, GDP-푸코오스 공급물 및/또는 탄소계 기질 공급물를 배양 배지에 연속 방식으로 첨가하는 단계;
vi) 공급 용액에 의하여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 배양 배지에 연속 방식으로 락토오스 공급물을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 락토오스 공급 용액의 농도는 50g/L, 바람직하게는 75g/L, 더 바람직하게는 100g/L, 더 바람직하게는 125g/L, 더 바람직하게는 150g/L, 더 바람직하게는 175g/L, 더 바람직하게는 200g/L, 더 바람직하게는 225g/L, 더 바람직하게는 250g/L, 더 바람직하게는 275g/L, 더 바람직하게는 300g/L, 더 바람직하게는 325g/L, 더 바람직하게는 350g/L, 더 바람직하게는 375g/L, 더 바람직하게는 400g/L, 더 바람직하게는 450g/L, 더 바람직하게는 500g/L, 더욱 더 바람직하게는 550g/L, 가장 바람직하게는 600g/L이고; 바람직하게는 상기 용액의 pH는 3 내지 7로 설정되고 바람직하게는 상기 공급 용액의 온도는 20℃ 내지 80℃로 유지되는 단계;
vii) 상기 방법이 상기 배양 배지의 최종 부피에 있어서 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90g/L 이상, 보다 바람직하게는 100g/L 이상, 보다 바람직하게는 125g/L 이상, 보다 바람직하게는 150g/L 이상, 보다 바람직하게는 175g/L 이상, 더욱 바람직하게는 200g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 농도를 초래하는 단계.
12. 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위해 유전적으로 변형된 숙주 세포로서, 여기서 상기 숙주 세포는 α-1,2-푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고; 상기 세포는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드의 발현을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는
i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는
ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편이고,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하는 것인 세포.
13. 구체예 12에 있어서, 숙주 세포는
i) 락토오스 결합 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열로서, 여기서 상기 서열은 숙주 세포에 대해 외래이고 숙주 세포의 게놈에 통합된 것을 포함하거나, 또는
ii) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 세포.
14. 구체예 12 또는 구체예 13에 있어서, 상기 세포는 미생물, 식물 또는 동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 진균 또는 효모이고, 바람직하게는 상기 식물은 벼, 목화, 유채, 대두, 메이즈 또는 옥수수(corn) 식물이고, 바람직하게는 상기 동물은 곤충, 물고기, 새 또는 인간이 아닌 포유동물이고; 바람직하게는 세포는 대장균(Escherichia coli) 세포인 것인 세포.
15. 구체예 12 내지 구체예 14 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 박테리아, 바람직하게는 대장균 균주, 보다 바람직하게는 K12 균주인 대장균 균주의 세포이고, 훨씬 더 바람직하게는 대장균 K12 균주는 대장균 MG1655인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
16. 구체예 12 내지 구체예 14 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
17. 구체예 12 내지 구체예 16 중 어느 한 항에 있어서, 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 각각의 숙주 세포의 코돈 사용에 적응되어 있는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
18. 하기 단계들을 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
a) 구체예 12 내지 구체예 17 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하는 단계,
b) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하는 조건 하에 배지에서 세포를 배양하는 단계,
c) 선택적으로, 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 배양물로부터 분리하는 단계.
19. α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 구체예 12 내지 구체예 17 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 용도.
20. 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 이종적으로(heterologously) 발현하는 미생물로서, 상기 폴리펩티드는
i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고 및/또는
ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
iii) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
iv) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
v) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편이고,
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하는 것인 미생물.
21. 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 구체예 20에 따른 미생물의 용도.
22. 구체예 1 내지 구체예 11, 구체예 18, 구체예 19 또는 구체예 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-1,2-푸코실락토오스를 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
23. 구체예 1 내지 구체예 11, 구체예 18, 구체예 19, 구체예 21 또는 구체예 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리가 정화, 한외여과, 나노여과, 역삼투, 정밀여과, 활성탄 또는 탄소 처리, 접선 유동 고성능 여과, 접선 유동 한외여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 겔 여과, 리간드 교환 크로마토그래피의 단계 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
24. 구체예 1 내지 구체예 11, 구체예 18, 구체예 19, 구체예 21 내지 구체예 23 중 어느 한 항에 있어서, 알파-1,2-푸코실락토오스의 정제를 더 포함하는 것인 방법.
25. 구체예 24에 있어서, 상기 알파-1,2-푸코실락토오스의 정제가 활성탄 또는 탄소의 사용, 목탄의 사용, 나노여과, 한외여과 또는 이온 교환, 알코올의 사용, 수성 알코올 혼합물의 사용, 결정화, 증발, 침전, 건조, 분무 건조 또는 동결건조의 단계 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
26. 구체예 1 내지 구체예 11, 구체예 21 내지 구체예 25 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 진균, 효모, 박테리아, 곤충, 동물 또는 식물 발현 시스템에서 생산되는 것인 방법.
27. 구체예 26에 있어서, 숙주 세포가 박테리아, 바람직하게는 대장균 균주, 보다 바람직하게는 K12 균주인 대장균 균주의 세포이고, 더욱 더 바람직하게는 대장균 K12 균주는 대장균 MG1655인 것인 방법.
28. 구체예 26에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포인 방법.
29. 구체예 1 내지 구체예 11, 구체예 18, 구체예 19, 구체예 21 내지 구체예 28 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 중 락토오스 농도가 50 내지 150g/L의 범위인 것인 방법.
30. 구체예 1 내지 구체예 11, 구체예 18, 구체예 19, 구체예 21 내지 구체예 29 중 어느 한 항에 있어서, 2'-푸코실락토오스의 최종 농도가 70g/L 내지 200g/L 범위인 것인 방법.
31. α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 구체예 1 또는 구체예 10의 방법에 기재된 폴리펩티드의 용도.
32. 하기 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계로서, 이에 의해 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하고,
c) 상기 촉매 작용은 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율을 초래하는 단계,
d) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
33. 하기 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계로서, 이에 의해 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하고,
c) 상기 촉매 작용은 80% 이상의 2'푸코실락토오스 순도를 초래하는 단계,
d) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
34. 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 2'-푸코실락토오스의 생산 방법:
i) 초기 반응기 부피의 리터당 50 그램 이상, 보다 바람직하게는 75 그램 이상, 더욱 바람직하게는 100 그램 이상, 더욱 바람직하게는 120 그램 이상, 더욱 바람직하게는 150 그램 이상의 락토오스를 포함하는 락토오스 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 여기서 총 반응기 부피는 250mL(밀리리터) 내지 10,000m3(입방 미터) 범위이고, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 락토오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
ii) 숙주 세포가 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농로 GDP-푸코오스 공급물을 상기 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 GDP-푸코오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
iii) 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 2'-푸코실락토오스를 합성하기 위한 최적 농도로 숙주 세포가 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계;
iv) 숙주 세포가 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 락토오스를 내부적으로 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
v) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 하나 이상의 공급 용액에 의하여 락토오스 공급물, GDP-푸코오스 공급물 및/또는 탄소계 기질 공급물를 배양 배지에 연속 방식으로 첨가하는 단계;
vi) 공급 용액에 의하여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 배양 배지에 연속 방식으로 락토오스 공급물을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 락토오스 공급 용액의 농도는 50g/L, 바람직하게는 75g/L, 더 바람직하게는 100g/L, 더 바람직하게는 125g/L, 더 바람직하게는 150g/L, 더 바람직하게는 175g/L, 더 바람직하게는 200g/L, 더 바람직하게는 225g/L, 더 바람직하게는 250g/L, 더 바람직하게는 275g/L, 더 바람직하게는 300g/L, 더 바람직하게는 325g/L, 더 바람직하게는 350g/L, 더 바람직하게는 375g/L, 더 바람직하게는 400g/L, 더 바람직하게는 450g/L, 더 바람직하게는 500g/L, 더욱 더 바람직하게는 550g/L, 가장 바람직하게는 600g/L이고; 바람직하게는 상기 용액의 pH는 3 내지 7로 설정되고 바람직하게는 상기 공급 용액의 온도는 20℃ 내지 80℃로 유지되는 단계;
vii) 상기 방법이 상기 배양 배지의 최종 부피에 있어서 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90g/L 이상, 보다 바람직하게는 100g/L 이상, 보다 바람직하게는 125g/L 이상, 보다 바람직하게는 150g/L 이상, 보다 바람직하게는 175g/L 이상, 더욱 바람직하게는 200g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 농도를 초래하고 바람직하게는 diFL 농도 대 2'FL 농도 비율 1:5 미만, 보다 바람직하게는 1:20, 더욱 더 바람직하게는 1:40인 것인 단계.
35. 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 2'-푸코실락토오스의 생산 방법:
i) 초기 반응기 부피의 리터당 50 그램 이상, 보다 바람직하게는 75 그램 이상, 더욱 바람직하게는 100 그램 이상, 더욱 바람직하게는 120 그램 이상, 더욱 바람직하게는 150 그램 이상의 락토오스를 포함하는 락토오스 공급물을 배양 배지에 첨가하는 바람직하게는 연속 방식으로 단계로서, 여기서 총 반응기 부피는 250mL(밀리리터) 내지 10,000m3(입방 미터) 범위이고, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 락토오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
ii) 숙주 세포가 바람직하게는 연속적인 방식으로, 80% 이상의 순도의 2'-푸코실락토오스 합성할 수 있도록 하는 농도로 GDP-푸코오스 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 GDP-푸코오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 더욱 바람직하게는 2배 미만인 단계;
iii) 숙주 세포가 80% 이상의 순도의 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계;
iv) 숙주 세포가 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 락토오스를 내부적으로 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
v) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 하나 이상의 공급 용액에 의하여 락토오스 공급물, GDP-푸코오스 공급물 및/또는 탄소계 기질 공급물를 배양 배지에 연속 방식으로 첨가하는 단계;
vi) 공급 용액에 의하여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 배양 배지에 연속 방식으로 락토오스 공급물을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 락토오스 공급 용액의 농도는 50g/L, 바람직하게는 75g/L, 더 바람직하게는 100g/L, 더 바람직하게는 125g/L, 더 바람직하게는 150g/L, 더 바람직하게는 175g/L, 더 바람직하게는 200g/L, 더 바람직하게는 225g/L, 더 바람직하게는 250g/L, 더 바람직하게는 275g/L, 더 바람직하게는 300g/L, 더 바람직하게는 325g/L, 더 바람직하게는 350g/L, 더 바람직하게는 375g/L, 더 바람직하게는 400g/L, 더 바람직하게는 450g/L, 더 바람직하게는 500g/L, 더욱 더 바람직하게는 550g/L, 가장 바람직하게는 600g/L이고; 바람직하게는 상기 용액의 pH는 3 내지 7로 설정되고 바람직하게는 상기 공급 용액의 온도는 20℃ 내지 80℃로 유지되는 단계;
vii) 상기 방법이 상기 배양 배지의 최종 부피에 있어서 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90g/L 이상, 보다 바람직하게는 100g/L 이상, 보다 바람직하게는 125g/L 이상, 보다 바람직하게는 150g/L 이상, 보다 바람직하게는 175g/L 이상, 더욱 바람직하게는 200g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 농도 및 바람직하게는 80% 이상의 2'FL 순도를 초래하는 것인 단계.
하기 도면 및 구체예는 본 발명의 추가적인 예시 및 설명의 역할을 할 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
실 시 예
구체예 1: 글리코실 트랜스퍼라제 11 단백질의 확인
HMM은 프로필 은닉 마르코프 모델이라고 불리는 확률 모델이다. 정렬된 단백질 세트를 위치별 스코어링 시스템으로 특성화한다. 아미노산은 발생 빈도에 따라 서열 정렬의 각 위치에 점수가 부여된다(Eddy, SR1998. Profile hidden Markov models. Bioinformatics. 14: 755-63). HMM은 Pfam, InterPro, SMART, TIGRFAM, PIRSF, PANTHER, SFLD, Superfamily 및 Gene3D를 포함하여 단백질 분류에 이 방법을 사용하는 수많은 데이터베이스에서 알 수 있듯이 광범위한 유용성을 가지고 있다. HMMER 패키지(http://hmmer.org/)의 HMMsearch는 이 HMM을 사용하여 서열 상동체에 대한 서열 데이터베이스를 검색할 수 있다. 사용될 수 있는 서열 데이터베이스는 예를 들어 NCBI nr 단백질 데이터베이스(NR; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein), UniProt 지식베이스(UniProtKB, https://www.uniprot.org/help/uniprotkb) 및 SWISS-PROT 데이터베이스(https://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html)이지만 이에 한정되지 않는다. 글리코실 트랜스퍼라제 11 PF01531 도메인은 'Curation & model'의 https://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1을 통해 2018년 9월에 발매된 Pfam v 32.0 데이터베이스에서 얻었다. 이 모델을 사용하여 단백질 데이터베이스에 대한 HMMsearch는 새로운 패밀리 구성원을 식별했다(표 1 참조). EMBOSS Backtranseq(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)를 사용하여 얻어진 아미노산 서열을 염기서열로 번역할 수 있다.
표 1: H.pylori(서열번호 71)의 선행 기술 알파 1,2-푸코실트랜스퍼라제 HpFutC와 함께 알파 1,2-푸코실트랜스퍼라제의 목록, 여기서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 및 76은 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호: 72) 및 보존 도메인(X, K/V 없음)XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74) 둘다를 가지고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있음.
서열번호 유기체 원산지
1 아커만시아 뮤시니필라 인간
2 포르피로모나스 카토니아에 알려지지 않음
3 헬리코박터 종 MIT 01-6242 미국
4 카프노사이토파가 카니스 알려지지 않음
5 카프노사이토파가 납베테리 핀란드
6 헬리코박터 종 MIT 01-6242 미국
7 킹겔라 데니트리피칸스 인간
8 슈도알테로모나스 디스팅크타 알려지지 않음
9 포르피로모나스 카토니아에 F0037 알려지지 않음
10 캄필로박터 뮤코살리스 영국
11 페도박터 경힌시스 대한민국
12 노비허바스피릴룸 오토트로피쿰 일본
13 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 알려지지 않음
14 칸디다투스 심비오트릭스 디네님파에 일본
15 페도박터 종 스위스
16 크리세오박테리움 종 스위스
17 마이크로박테리움 종 독일
18 라마조티우스 바리에오르나투스 일본
19 칸디다투스 울페박테리아 박테리움 미국
20 칸디다투스 야노프스키박테리아 박테리움 미국
21 스피로카에테스 박테리움 미국
22 페도박터 솔리 대한민국
23 박테리오달레스 박테리움 KHT7 알려지지 않음
24 부티리비브리오 종 TB 알려지지 않음
25 부티리비브리오 피브리솔벤스 알려지지 않음
26 칸디다투스 마가사닉박테리아 박테리움 미국
27 부티리비브리오 피브리솔벤스 알려지지 않음
28 크리세오박테리움 스코프탈뭄 영국
29 아커만시아 종 54_46 알려지지 않음
30 링굴라 웅기스 일본
31 링굴라 웅기스 일본
32 [플렉시박터] 종 ATCC 35103 미국
33 박테리오데테스 박테리움 ADurb.Bin174 미국
34 페도박터 종 AJM 미국
35 칸디다투스 플랑크토필라 라쿠스 스위스
36 리조비알레스 박테리아 PAR1 영국
37 헬리코박터 종 11S02629-2 네덜란드
38 칸디다투스 마가사닉박테리아 박테리움 미국
39 칸디다투스 마가사닉박테리아 박테리움 미국
40 디아미노부티리시모나스 아에릴라타 대한민국
41 플라보박테리움 매그넘 대한민국
42 리토레이박터 폰티 대한민국
43 디스고노모나스 알기나틸리티카 일본
44 캄필로박터 히오인테스티날리스 아종 로소니 미국
45 피시스파에랄레스 박테리움 알려지지 않음
46 아커만시아 종 알려지지 않음
47 헬리코박터 종 MIT 17-337 미국
48 페도박터 종 G11 미국
49 엠페도박터 브레비스 알려지지 않음
50 아커만시아 뮤시니필라 대한민국
51 아커만시아 뮤시니필라 인간
52 아커만시아 뮤시니필라 미국
53 키티노파가세아에 박테리움 영국
54 키티노파가세아에 박테리움 영국
55 프로테오박테리아 박테리움 영국
56 플라비아에스투라리박터 종 17J68-12 대한민국
57 페도박터 종 AR-2-6 노르웨이
58 헬리코박터 자아치 미국
59 헬리코박터 자포니쿠스 미국
60 클렙시엘라 뉴모니아에 알려지지 않음
61 디스고노모나스 카프노사이토파고이데스 미국
62 플라보박테리움 종 영국
63 페도박터 종 영국
64 호에플레아 포코트로피카 독일
65 수브돌리그라눌룸 바리아빌레 덴마크
66 크라소스트레아 기가스 알려지지 않음
67 크라소스트레아 기가스 알려지지 않음
68 미배양 박테리움 미국
69 클로스트리디움 종 CAG:510 알려지지 않음
70 헬롭델라 로부스타 미국
71 헬리코박터 파일로리 호주
75 아커만시아 종 KLEI798 알려지지 않음
76 아커만시아 뮤시니필라 네덜란드
77 카프노사이토파가 긴기발리스 ATCC 33624 알려지지 않음
78 헬리코박터 종 클로-3 미국
79 헬리코박터 종 MIT 17-337 미국
실시예 2: 재료 및 방법 대장균(Escherichia coli)
배지
Luria Broth(LB) 배지는 1% 트립톤 펩톤(Difco, Erembodegem, Belgium), 0.5% 효모 추출물(Difco) 및 0.5% 염화나트륨(VWR, Leuven, Belgium)으로 구성되었다. 성장 실험을 위한 최소 배지는 2.00g/L NH4Cl, 5.00g/L (NH4)2SO4, 2.993g/L KH2PO4, 7.315g/L K2HPO4, 8.372g/L MOPS, 0.5g/L NaCl, 0.5g/L MgSO4.7H2O, 14.26g/L 슈크로스 또는 실시예에 명시된 경우 기타 탄소원, 1ml/L 비타민 용액, 100μl/L 몰리브덴산염 용액, 및 1mL/L 셀레늄 용액을 포함했다. 배지는 1M KOH를 사용하여 pH 7로 설정되었다. 비타민 용액은 3.6g/L FeCl2.4H2O, 5g/L CaCl2.2H2O, 1.3g/L MnCl2.2H2O, 0.38g/L CuCl2.2H2O, 0.5g/L CoCl2.6H2O, 0.94g/L ZnCl2, 0.0311g/L H3BO4, 0.4g/L Na2EDTA.2H2O 및 1.01g/L 티아민.HCl로 구성되었다. 몰리브덴산염 용액은 0.967g/L NaMoO4.2H2O를 함유했다. 셀레늄 용액은 42g/L Seo2를 함유했다.
발효를 위한 최소 배지는 6.75g/L NH4Cl, 1.25g/L (NH4)2SO4, 2.93g/L KH2PO4 및 7.31g/L KH2PO4, 0.5g/L NaCl, 0.5g/L MgSO4.7H2O, 14.26g/L 슈크로오스, 1mL/L 비타민 용액, 100μL/L 몰리브덴산염 용액, 및 1mL/L 셀레늄 용액을 위에서 설명한 것과 동일한 조성으로 을 함유했다. 복합 배지는 오토클레이브(121℃, 21')으로 멸균하고 최소 배지는 여과(0.22μm Sartorius)로 멸균했다. 필요한 경우, 배지는 항생제(예: 클로람페니콜(20mg/L), 카르베니실린(100mg/L), 스펙티노마이신(40mg/L) 및/또는 카나마이신(50mg/L))를 첨가하여 선택적으로 만들었다.
플라스미드
pKD46(Red 헬퍼 플라스미드, 암피실린 저항성), pKD3(FRT-flanked 클로람페니콜 저항성(cat) 유전자 함유), pKD4(FRT-flanked 카나마이신 저항성(kan) 유전자 함유), 및 pCP20(FLP 재조합 효소 활성 발현) 플라스미드들을 R.Cunin 교수(Vrije Universiteit Brussel, Belgium in 2007)로부터 얻었다.
플라스미드는 Invitrogen에서 구입한 숙주 E. coli DH5알파(F-, phi80d/acZ△M15, △(lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, lambda-, thi-1, gyrA96, relA1) 내에 유지했다.
균주 및 돌연변이
E. coli K12 MG1655 [lambda-, F-, rph-1]는 2007년 3월에 Coli Genetic Stock Center(미국), CGSC Strain#: 7740에서 입수했다. 유전자 파괴, 유전자 도입 및 유전자 교체는 Datsenko 및 Wanner에 의해 공개된 기술을 사용하여 수행되었다(PNAS 97(2000), 6640-6645). 이 기술은 람다 레드 재조합 효소에 의해 수행된 상동 재조합 후 항생제 선택을 기반으로 한다. 플립파제 재조합 효소의 후속 촉매작용은 최종 생산 균주에서 항생제 선택 카세트의 제거를 보장한다.
레드 헬퍼 플라스미드 pKD46을 운반하는 형질전환체를 30℃에서 암피실린(100mg/L) 및 L-아라비노스(10mM)가 포함된 10mL LB 배지에서 OD600nm이 0.6이 되도록 성장시켰다. 세포를 처음에는 50mL의 빙냉수로 세척하고 두 번째로는 1mL의 얼음 빙냉수로 세척하여 세포를 전기 적격 상태(electrocompetent)로 만들었다. 그런 다음, 세포를 50 μL의 빙냉수에 재현탁했다. Gene Pulser™(BioRad)(600Ω, 25μFD 및 250볼트)를 사용하여 50μL의 세포와 10-100ng의 선형 이중 가닥 DNA 생성물로 전기천공을 수행했다.
전기천공 후, 세포를 37℃에서 1시간 인큐베이트된 1ml LB 배지에 첨가하고, 최종적으로 25mg/L의 클로람페니콜 또는 50mg/L의 카나마이신을 함유하는 LB-한천에 펼쳐서 항생제 내성 형질전환체를 선택하였다. 선택된 돌연변이체는 변형된 영역의 상류 및 하류 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하고 헬퍼 플라스미드의 손실을 위해 42℃에서 LB-한천에서 성장시켰다. 돌연변이체는 암피실린 감수성에 대해 테스트되었다.
선형 ds-DNA 앰플리콘은 pKD3, pKD4 및 이들의 유도체를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 얻었다. 사용된 프라이머는 주형에 상보적인 서열의 일부와 재조합이 일어나야 하는 염색체 DNA 상의 측면에 상보적인 다른 부분을 가졌다. 게놈 녹아웃을 위해, 상동성 영역은 관심 유전자의 시작 및 종료 코돈의 50-nt 상류 및 50-nt 하류로 설계되었다. 게놈 녹-인(knock-in)의 경우 전사 시작점(+1)이 존중되어야 했다. PCR 생성물을 PCR 정제하고 Dpnl로 분해하고 아가로스 겔에서 재정제하고 용출 완충액(5mM Tris, pH 8.0)에 현탁시켰다.
선택된 돌연변이체(클로람페니콜 또는 카나마이신 내성)는 FLP 합성의 온도 민감성 복제 및 열 유도를 나타내는 암피실린 및 클로람페니콜 내성 플라스미드인 pCP20 플라스미드로 형질전환되었다. 암피실린 내성 형질전환체는 30℃에서 선택되었으며, 그 후 일부는 42℃에서 LB에서 콜로니 정제된 다음 모든 항생제 내성 및 FLP 헬퍼 플라스미드의 손실에 대해 테스트되었다. 유전자 녹아웃 및 녹인은 대조군 프라이머(Fw/Rv-gene-out)로 확인한다.
2'FL 생산을 위해 E. coli K12 MG1655에서 파생된 돌연변이 균주는 lacZ, lacY, lacA, glgC, agp, pfkA, pfkB, pgi, arcA, iclR, wcaJ, pgi, lon 및 thyA 유전자의 녹아웃과 E. coli lacY 유전자, Zymomonas mobilis에서 유래한 fructose kinase 유전자(frk) 및 Bifidobacterium adolescentis에서 유래한 수크로스 포스포릴라제(SP)를 함유하는 구성적 발현 구조의 추가적 게놈 녹인(knock-in)을 가지고 있다. 이러한 유전적 변형은 WO2016075243 및 WO2012007481에도 기술되어 있다. E. coli 유전자 manA, manB, manC, gmd 및 fcl에 대한 구성적 전사 단위의 게놈 녹인을 포함하여 GDP-푸코오스 생산을 추가로 최적화할 수 있다. GDP-푸코오스 생산은 또한 E. coli fucK 및 fucI 유전자의 게놈 녹아웃과 E. coli로부터의 푸코오스 투과효소(fucP) 및 Bacteroides fragilis로부터의 이기능성 푸코오스 키나제/푸코오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제(fkp)를 함유하는 구성적 전사 단위의 게놈 녹인에 의해 수득할 수 있다. 또한, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 71에 대한 구성적 전사 단위를 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 발현 플라스미드가 균주에 첨가된다.
모든 구성적 프로모터와 UTR은 De Mey et al. (BMC Biotechnology, 2007) 및 Mutalik et al. (Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360)로부터 유래한다. 모든 유전자는 Twist Bioscience(twistbioscience.com) 또는 IDT(eu.idtdna.com)에서 합성 주문되었으며 코돈 사용은 공급자의 도구를 사용하여 조정되었다.
모든 균주는 -80℃에서 저온유리병에 저장된다(70% 글리세롤과 1:1 비율로 혼합되어 밤새 LB 배양).
재배 조건
96웰 마이크로타이터 플레이트 실험의 전배양은 150 μL LB의 저온유리병에서 시작되었고 800 rpm의 오비탈 진탕기에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 이 배양액은 400x를 희석하여 400μL 최소 배지와 함께 96웰 사각형 미세역가 플레이트의 접종물로서 사용되었다. 이 최종 96-웰 배양 플레이트를 72시간 또는 그 이하 또는 이상 동안 800rpm으로 오비탈 진탕기에서 37℃로 인큐베이션했다. 배양 실험이 끝나면 각 웰에서 샘플을 채취하여 브로쓰 상등액의 당 농도(세포 외 당 농도, 세포 회전 후)를 측정하거나 세포를 회전시키기 전에 배양 브로스를 90℃에서 15분 동안 끓여서 측정했다. 세포(= 전체 브로스 측정, 세포내 및 세포외 당 농도의 평균).
생물반응기의 전배양(preculture)은 특정 균주의 전체 1mL 저온유리병에서 시작되었으며 1L 또는 2.5L 쉐이크 플라스크 내 250mL 또는 500mL 최소 배지에 접종하고 오비탈 진탕기에서 200rpm으로 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 이어서, 5L 생물반응기에 접종하고(2L 배치 배지 중 250mL 접종물); 공정은 MFCS 제어 소프트웨어(Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany)에 의해 제어되었다. 배양 조건은 37℃로 설정하고, 최대 교반; 압력 가스 유속은 균주 및 생물 반응기에 따라 다르다. 0.5M H2SO4 및 20% NH4OH를 사용하여 pH를 6.8로 제어하였다. 배기 가스를 냉각시켰다. 발효 중 기포가 발생하면 실리콘 소포제 10% 용액을 첨가하였다.
광학 밀도
배양물의 세포 밀도는 600 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 자주 모니터링하였다(Implen Nanophotometer NP80, Westburg, Belgium 또는 Spark 10M microplate reader, Tecan, Switzerland).
성장률/속도 측정
최대 성장 속도(μMax)는 R 패키지 그로핏을 사용하여 600nm에서 관찰된 광학 밀도를 기반으로 계산하였다.
액체 크로마토그래피
2'푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스에 대한 표준은 사내에서 합성되었다. 락토오스, 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 푸코오스와 같은(이에 국한되지 않음) 다른 표준은 Sigma에서 구입했다.
탄수화물은 HPLC-RI(Waters, USA) 방법으로 분석하였으며, RI(Refractive Index)는 시료를 담았을 때 이동상의 굴절률 변화를 감지하였다. X-Bridge 컬럼(Waters X-bridge HPLC 컬럼, USA)과 75ml 아세토니트릴 및 25ml 초순수 및 0.15ml 트리에틸아민을 함유하는 이동상을 사용하여 등용매 흐름에서 당을 분리하였다. 컬럼 크기는 4.6 x 150mm이고 입자 크기는 3.5μm이다. 컬럼의 온도는 35℃로 설정되었고 펌프 유속은 1mL/분이었다.
실시예 3: 재료 및 방법 Saccharomyces cerevisiae
배지
균주는 완전 보충 혼합물(SD CSM) 또는 아미노산이 없는 6.7g/L 효모 질소 염기(YNB w/o AA, Difco), 20g/L 한천(Difco)(고체 배양), 22g/L 포도당 일수화물 또는 20g/L 락토오스 및 0.79g/L CSM 또는 0.77g/L CSM-Ura(MP Biomedicals)을 포함하는 CSM 드롭아웃(SD CSM-Ura)이 있는 합성 정의 효모 배지에서 성장시킨다.
균주
Brachmann et al.에 의해 생성된 Saccharomyces cerevisiae BY4742. (Yeast (1998) 14:115-32)는 Euroscarf 배양 컬렉션에서 입수가능한 것을 사용하였다. 모든 돌연변이 균주는 Gietz 방법(Yeast 11:355-360, 1995)을 사용하여 상동 재조합 또는 플라스미드 형질전환에 의해 생성되었다. Kluyveromyces marxianus lactis는 LMG 배양 컬렉션(Ghent, Belgium)에서 구할 수 있다.
플라스미드
효모 발현 플라스미드 p2a_2μ(Chan 2013(Plasmid 70 (2013) 2-17))는 Saccharomyces cerevisiae에서 외래 유전자의 발현을 위해 사용되었다. 이 플라스미드는 암피실린 내성 유전자와 E. coli에서 선택 및 유지를 허용하는 박테리아 복제 기점을 포함한다. 플라스미드에는 2μ 효모 ori와 효모의 선택 및 유지 관리를 위한 Ura3 선택 마커가 추가로 포함되어 있다. 다음으로, 이 플라스미드는 락토오스 투과효소(예: Kluyveromyces lactis의 LAC12), GDP-만노스 4,6-탈수효소(예: E. coli의 Gmd) 및 GDP-L-푸코오스 합성효소(예: E. coli의 fcl)을 함유하는 p2a_2μ_fl으로 변형할 수 있다.
효모 발현 플라스미드 p2a_2μ_fl_2ft는 p2a_2μ_fl에 기초하지만 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 또는 71도 발현되는 방식으로 변형되었다. 바람직하지만 필수적인 것은 아닌 것으로, 푸코실트랜스퍼라제 단백질은 푸코실트랜스퍼라제 효소의 용해도를 향상시키기 위해 SUMOstar 태그(예를 들어, pYSUMOstar, Life Sensors, Malvern, PA로부터 입수)에 N-말단 융합된다.
플라스미드는 Invitrogen에서 구입한 숙주 E. coli DH5alpha(F-, phi80dlacZdeltaM15, delta(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, lambda-, thi-1, gyrA96, relA1) 내에 유지되었다.
유전자 발현 프로모터
유전자는 Blazeck(Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 11, 2012)에 기재된 바와 같이 합성의 구성적 프로모터를 사용하여 발현된다.
이종 및 상동 발현
플라스미드든 게놈이든 발현되어야 하는 유전자는 Twist Biosciences(미국 샌프란시스코)에 의해 합성되었다. 발현 숙주의 코돈 사용에 대한 코돈 사용을 최적화함으로써 발현이 더욱 촉진될 수 있다. 유전자는 공급자의 도구를 사용하여 최적화되었다.
재배 조건
일반적으로, 효모 균주는 초기에 SD CSM 플레이트에서 성장하여 단일 콜로니를 얻었다. 이 플레이트는 30℃에서 2-3일 동안 성장되었다.
단일 콜로니에서 시작하여 전배양물을 200rpm에서 진탕하면서 30℃로 5mL내에서 밤새 성장시켰다. 후속 125mL 진탕 플라스크 실험에 25mL 배지에서 이 전배양물의 2%를 접종했다. 이 진탕 플라스크를 200rpm의 오비탈 진탕으로 30℃에서 인큐베이션했다. 모든 유전자가 구성적으로 발현되기 때문에 인듀서의 사용은 요구되지 않는다.
실시예 4: E. coli에 통합된 잠재적인 락토오스-결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소의 평가
실시예 1에서 확인된 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 돌연변이 E. coli 균주에서 GDP-푸코오스 및 락토오스로부터 2-푸코실락토오스(2'FL)를 생산하는 것으로 평가하였다. 프로모터-UTR 조합 P12U2(De Mey et al., BMC Biotechnology, 2007)로 구축된 전사 단위로부터 상기 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 돌연변이 균주를 실시예 2에 제공된 배양 조건에 따른 성장 실험에서 분석하였다. 각각의 돌연변이 E. coli 균주를 96-웰 플레이트의 다중 웰에서 성장시켰다. 도 1(상단 패널)은 최소배지 중 20g/L 락토오스의 동일한 전사 단위에서 다양한 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 성공적으로 발현하는 균주의 성장 실험에서 얻은 2'FL의 정규화된 생산(상대 백분율로 g 생산물/g 바이오매스)을 보여준다. 모든 데이터 포인트는 동일한 P12U2 프로모터-UTR 조합을 갖는 전사 단위로부터 서열번호 71을 갖는 선행 기술 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 HpFutC를 발현하는 참조 균주로 얻은 2'FL 생산으로 정규화되었으며, 이는 수평 파선으로 표시된다. 실험은 새로 확인된 모든 폴리펩티드가 락토오스 결합 2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 것을 확인했다. 놀랍게도, 서열번호 1, 2 및 4를 갖는 폴리펩티드는 시험된 이러한 조건에서 서열번호 71을 갖는 선행 기술의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 HpFutC보다 더 나은 락토오스 결합 2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 실험은 또한 서열 1, 3, 4 및 5를 갖는 폴리펩티드가 서열 71을 갖는 선행 기술 효소와 달리 diFL을 생성하지 않는다는 것을 입증하였다. 서열번호 2를 갖는 폴리펩티드는 diFL을 생산했지만 이 diFL 생산은 서열번호 71을 갖는 선행 기술 HpFutC 효소로 측정된 diFL 생산과 비교하여 매우 최소였다(도 1, 하부 패널). 서열번호 2의 폴리펩티드를 발현하는 균주에서 측정된, diFL 농도 대 2'FL 농도비는 1:40이었다.
실험은 또한 서열번호 1 또는 4를 갖는 폴리펩티드를 발현하는 돌연변이 균주에서 2'FL의 더 높은 생산이, 서열번호 71을 갖는 선행 기술의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 HpFutC를 발현하는 참조 균주와 비교할 때 이들 균주의 성장 속도에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다(도 2).
실시예 5: 다양한 락토오스 농도에서 시험했을 때 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하는 E,coli 균주의 평가
다음 실험에서, P12U2 프로모터-UTR 조합으로 구축된 전사 단위로부터 서열번호 3의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하는 돌연변이 E.coli 균주(De Mey et al., BMC Biotechnology, 2007)에 대해 실시예 4에 기재된 바와 같이 저농도 내지 고농도의 락토오스를 함유하는 최소 배지에서 2'FL 및 diFL 생산성을 평가하였다. 실시예 2에 기재된 배양 조건에 따라 생육 실험을 수행하였다. 각 조건에 대해 돌연변이 E. coli 균주를 96-웰 플레이트의 다중 웰에서 성장시켰다.
도 3은 이 실험에서 얻은 2'FL 역가(g/L)를 보여준다. 이 도면은 서열번호 3을 갖는 폴리펩티드가, 시험된 모든 조건에서 락토오스 결합 2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖고 또한 다양한 락토오스 농도로부터 2'FL을 생성할 수 있음을 입증한다. 시험된 모든 조건에서 균주는 diFL을 생성하지 않았다(결과는 표시되지 않음).
실시예 6: 상이한 전사 단위로부터 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하는 E.coli 균주의 평가
다음 실험에서, 이전 실시예에서 사용된 것과 비교하여 다른 전사 단위(TU)로부터 서열번호 3을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 발현하는 여러 돌연변이 E. coli 균주가 2'FL 및 diFL 생산성에 대해 평가되었다. 사용된 전사 단위는 De Mey et al. (BMC Biotechnology, 2007)에 기재된 바와 같이 각각 프로모터-UTR 조합 P05U14 (TU 01), P05U38 (TU 02), P10U13 (TU 03) and P31U17 (TU 04)으로 구성되었다. 실시예 2에 기재된 배양 조건에 따라 생육 실험을 수행하였다. 각각의 돌연변이 E. coli 균주를 96-웰 플레이트의 다중 웰에서 성장시켰다.
도 4는 정규화된 2'FL 생산(g 생성물/g 바이오매스) 및 이 실험에서 얻은 상대 백분율에서의 성장 속도를 보여준다. 각 균주에 대해, 따라서 시험된 각 전사 단위에 대해, 2'FL 생산 또는 성장 속도에 대한 데이터 포인트는 동일한 전사 단위로부터의 서열번호 71의 선행기술 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 HpFutC를 발현하는 참조 균주로부터 각각 수득된 2'FL 생산 또는 성장 속도에 대해 정규화되었다(가로 파선으로 표시). 이 실험은 모든 시험 조건에서 균주들이 전부 diFL 생산 없이 2'FL을 생산한 것을 보여주었다. 또한 사용되는 전사 단위에 따라 돌연변이 균주에서 2'FL 생산을 증가시킬 수 있지만 균주의 성장 속도에 미치는 영향은 제한적이다. 서열번호 3을 갖는 폴리펩티드를 발현하기 위한 돌연변이 균주에 있어서 여기에서 사용된 4개의 전사 단위는 또한 실시예 4에서 사용된 바와 같이 P12U2로 구축된 전사 단위를 사용할 때와 비교하여 상기 폴리펩티드의 더 높은 발현을 초래하여 더 많은 2'FL 생산을 유도한다.
실시예 7: 락토오스-결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소의 조합을 발현하는 E.coli 균주로의 2'푸코실락토오스의 생산
또 다른 실험에서, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 9를 갖는 2개 이상의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드의 조합을 발현하는 여러 돌연변이 E. coli 균주에 대해 2 'FL 및 diFL 생산성을 평가하였다. 실시예 2에 기재된 배양 조건에 따라 생육 실험을 수행하였다. 각각의 돌연변이 E. coli 균주를 96-웰 플레이트의 다중 웰에서 성장시켰다. 실험은 적어도 2개의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드의 조합을 발현하는 단일 균주가 2'FL을 생성할 수 있고 균주당 단일 폴리펩티드만 발현될 때보다 더 높은 농도로 생성할 수 있음을 보여주었다.
실시예 8: 다양한 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 이용한 사카로마이세스 세레비지애에서 2'푸코실락토오스의 생산
또다른 실시예는 본 발명을 위한 사카로마이세스 세레비지애 형태로 진핵 유기체의 용도를 제공한다. 실시예 3에 기술된 균주, 플라스미드 및 방법을 사용하여 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 또는 71을 발현하는 균주를 생성한다. 나아가 2'푸코실락토오스를 생산하기 위해 추가 변형이 이루어진다. 이러한 변형은 락토오스 투과효소, GDP-만노스 4,6-탈수효소 및 GDP-L-푸코오스 합성효소의 추가를 포함한다. 바람직한 락토오스 투과효소는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로부터의 KlLAC12 유전자이다(WO 2016/075243). 바람직한 GDP-만노스 4,6-탈수효소 및 GDP-L-푸코오스 합성효소는 각각 E.coli의 gmd 및 fcl이다.
이들 균주는 탄소원으로서 글루코스 또는 글리세롤 상에서 성장할 수 있고, 탄소원을 GDP-L-푸코오스로 전환시키고, 락토오스를 흡수하고, 참조로서 서열번호 71과 함께 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 및 71서열에 의해 나타내어지는 효소에 대한 기질로서 GDP-L-푸코오스 및 락토오스를 사용하여 2'푸코실락토오스를 생산할 수 있다. 상기 균주의 사전 배양은 22g/L 글루코스를 함유하는 합성 정의 배지 SD-CSM의 5mL에서 이루어지고 실시예 3에 기술된 바와 같이 30℃에서 성장된다. 이러한 전배양물은 유일한 탄소원으로 10g/L 자당이 있는 진탕 플라스크의 25mL 배지에 접종되고 30℃에서 성장한다. 정규적인 샘플을 채취하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 2'푸코실락토오스 및 디-푸코실락토오스의 생산을 측정한다.
실시예 9: 회분식 발효에서 다양한 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하는 E. coli 균주의 평가
실시예 2에 기술된 바와 같이 돌연변이 E. coli K12 MG1655 균주 배경으로부터 유래된 균주를 평가하기 위해 생물반응기 규모에서의 배치 발효를 수행하였고, 참조로서 서열번호 71을 갖는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 또는 71를 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하였다. 생물반응기 가동은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이들 예에서 자당은 탄소원으로 사용되었다. 2'FL 형성을 위한 전구체로서 락토오스를 90g/L로 배치 배지에 첨가하였다. 정규적인 샘플을 채취하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 2'푸코실락토오스 및 디-푸코실락토오스의 생산을 측정한다.
실시예 10: 상이한 락토오스 농도로 2'푸코실락토오스 생산
실시예 2에 기재된 바와 같은 발효 과정을 수행하였으며, 여기서 배양 배지 중 락토오스 농도는 50 내지 150g/L 범위였다. 상기 락토오스은 소량의 락토오스가 남을 때까지 공정 동안 2'푸코실락토오스로 전환된다. 2'푸코실락토오스에 대한 최종 비율의 락토오스는 이 공정 동안 더 일찍(2'푸코실락토오스에 대한 더 높은 락토오스 비율) 또는 더 나중에(2'푸코실락토오스에 대한 더 낮은 락토오스 비율) 프로세스를 중지하여 조작할 수 있다. 다른 탄소 공급원이 있거나 없는 고농도의 락토오스 용액을 생물반응기에 공급함으로써 용기에서 락토오스 농도를 증가시킬 수 있다. 상기 락토오스 공급물은 100 내지 700g/L의 락토오스 농도를 함유하고, 낙농 산업에서 사용되는 표준 방법인, 공정 동안 락토오스의 형성을 피하기 위해 락토오스가 pH 6 이하에서 용해되도록 하는 온도에서 유지된다. 이러한 생산 공정에서 도달된 2'푸코실락토오스의 최종 농도는 더 낮은 락토오스 농도가 사용될 때의 70g/L 내지 높은 락토오스 농도가 전술한 바와 같은 공정에서 사용될 때의 200g/L 이상 범위이다. 이러한 유가식 발효 공정에서 얻을 수 있는 2'FL 역가는 진탕 플라스크 또는 멀티웰 플레이트에서의 회분식 성장 실험에 비해 훨씬 더 높다. 잘 제어된 생물반응기에서 추가 탄소원은 유가식(fed-batch) 동안 지속적으로 추가되며 훨씬 더 높은 바이오매스 농도를 얻을 수 있다(멀티웰 플레이트 배치 실험에 비해 더 나은 통기 및 더 적은 산성화). 서열번호 1 또는 2로부터 2'FL을 생산하는 균주를 사용하여 이러한 과정에서 얻은 최종 디푸코실락토오스 농도 대 2'FL 농도 비율은 각각 예를 들어 0 또는 1:55이며, 이는 서열번호 71로부터 2'FL을 생산하는 참조 균주와 유사한 공정에서 얻은 0g/L에 가까운 락토오스 농도에서 1:6(0,164의 비율)의 diFL 대 2'FL 비율보다 훨씬 더 작다. 이 참조 균주의 경우 비율은 다양한 잔류 락토오스 농도에서 측정되었으며 이 균주는 3g/L 잔류 락토오스에서 1:8, 5g/L 잔류 락토오스에서 1:9, 8g/L 잔여 락토오스에서 1:11, 14g/L 잔여 락토오스에서 1:12 및 21g/L 잔여 락토오스에서 1:22의 diFL 대 2'FL 비율에 도달한다. 생성된 2'FL 순도 범위는 76%와 86% 사이이며, 여기서 diFL은 각각 나머지 24%에서 14%의 상당한 부분을 형성한다. 서열번호 1 또는 2에 대한 2FL, diFL 및 락토오스 농도의 합에서, 얻은 2'푸코실락토오스의 순도는 80% 내지 99.9% 범위였으며 나머지 탄수화물(20% 내지 1%)은 주로 락토오스이었고, 이는 락토오스의 불완전한 전환의 결과이다.
실시예 11: 2'푸코실락토오스의 효소적 생산
또다른 실시예는 본 발명의 서열번호 1 및 2를 갖는 효소의 용도를 제공한다. 이들 효소는 PURExpress 시스템(NEB)(이에 국한되지 않음)과 같은 무세포 발현 시스템에서, 또는 E. coli 또는 Saccharomyces cerevisiae(이에 국한되지 않음)와 같은 숙주 유기체에서 생산되며, 그 후 위에 나열된 효소가 분리되고 선택적으로는 더욱 정제될 수 있다.
상기 효소 추출물 또는 정제된 효소 각각은 GDP-푸코오스 및 Tris-HCl 또는 HEPES과 같은 완충 성분 및 락토오스 또는 2'FL과 함께 반응 혼합물에 첨가된다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 특정 온도(예: 37℃)에서 특정 시간(예: 24시간) 동안 인큐베이션하고, 그 동안 락토오스 또는 2'FL은 GDP-푸코오스를 사용하는 효소에 의해 2'푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스 각각으로 전환되는데, 후자의 반응은 2-푸코실트랜스퍼라제가 2'FL에 대해 부활성을 가질 때에만 가능하다. 이어서, 2'푸코실락토오스 및 디-푸코실락토오스를 당업계에 공지된 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리된다. 원하는 경우 2'FL 및/또는 diFL의 추가 정제를 수행할 수 있다. 반응 종료 시 또는 분리 및/또는 정제 후, 실시예 2에 기재된 바와 같이 2'푸코실락토오스 및 디-푸코실락토오스의 생성을 측정하였다.
실시예 12: 생물반응기에서 2'푸코실락토오스 생산
실시예 2에 기재된 바와 같은 유가식 발효 공정을 수행하였으며, 여기서 배양 배지의 락토오스 농도는 120g/L로 설정하였다. 서열번호 1, 3, 4 또는 71을 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 갖는 발현 플라스미드를 함유하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 상이한 2'푸코실락토오스 생산 균주로 동일한 공정을 수행하였다. 상기 락토오스는 소량의 락토오스가 남을 때까지 공정 동안 2'푸코실락토오스로 전환된다. 2'푸코실락토오스에 대한 최종 비율의 락토오스는 이 공정 동안 더 일찍(2'푸코실락토오스에 대한 더 높은 락토오스 비율) 또는 더 나중에(2'푸코실락토오스에 대한 더 낮은 락토오스 비율) 공정을 중지하여 조작할 수 있다. 또한 최종 비율 diFL 대 2'푸코실락토오스는 2'FL을 생성하는 1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하는 균주에 대해 유사하게 조작할 수 있으며, 이 공정을 더 일찍(더 낮은 diFL 대 2'푸코실락토오스 비율) 또는 더 나중에 중단함으로써 diFL을 형성하는 부작용을 가질 수 있다(더 높은 diFL 대 2'푸코실락토오스 비율).
도 6은 이들 발효 동안 락토오스가 2'푸코실락토오스 및 diFL로 전환되는 것을 보여준다. x축은 발효 시작(100% 락토오스 존재)부터 종료(락토오스가 더 이상 검출되지 않거나 거의 검출되지 않을 때)동안의 다양한 시점을 나타낸다. y축은 발효 브로스에 존재하는 락토오스, 2'FL 및 diFL의 백분율을 나타내며, 각각의 당을 3개의 당의 합으로 나누어 결정한다. 서열번호 1, 3 또는 4의 균주를 사용한 발효의 마지막에 매우 높은 2'FL 순도(거의 100%)에 도달할 수 있었다. 락토오스가 완전히 고갈된 경우에도 더 이상 락토오스가 검출되지 않았고 diFL이 형성되지 않았다. 이에 대조적으로, 서열번호 71을 포함하는 균주를 사용한 유사한 발효에서는 발효 종료시에 소량의 락토오스가 남아 있었다. 동시에 락토오스 농도가 5% 미만으로 떨어지면 발효 브로스에 diFL이 나타나기 시작했다(이 실시예에서는 총 당 농도의 최대 19%).
따라서 서열번호 71을 갖는 효소와 비교하여 서열번호 1, 3 또는 4를 갖는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 효소를 사용하여 훨씬 더 높은 2'푸코실락토오스 순도를 얻을 수 있음이 명백하다.
실시예 13: 2'푸코실락토오스 및 디-푸코실락토오스의 효소적 생산
또다른 실시예는 본 발명의 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 71을 갖는 효소의 용도를 제공한다. 이 효소는 E. coli에서 생성된 후 세포를 수확하고 초음파 처리를 사용하여 Tris-HCl 완충액에서 용해한다. 가용성 단백질 분획은 세포 파편에서 분리되어 하류의 효소 반응에 사용된다. 상기 효소 추출물 각각은 공여체 기질로서 GDP-L-푸코오스(5mM), 완충 성분(Tris-HCl) 및 수용체 기질로서 락토오스 또는 2'FL(5mM)과 함께 반응 혼합물에 첨가된다. 공여체 기질과 수용체 기질은 둘다 생리학적으로 가능한 것보다 더 높은 농도로 과도하게 존재한다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 락토오스, 2'푸코실락토오스 및 디-푸코실락토오스를 분리하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 액체 크로마토그래피를 사용하여 검출하였다.
실험은 락토오스를 기질로 사용하는 경우 서열번호 71의 효소(HpFutC)는 2'FL과 diFL을 모두 생성할 수 있는 반면 서열번호 1, 2, 3 및 4의 효소는 2'FL만 생성하고 diFL은 생성할 수 없었다. 유사하게, 2'FL을 기질로 사용하여, 서열번호 71을 갖는 효소(HpFutC)만이 diFL을 생성할 수 있는 반면, 서열번호 1, 2, 3 및 4를 갖는 효소에 대해서는 2'FL에서 diFL로의 더 이상의 전환이 관찰되지 않았다. 따라서, 서열번호 71을 갖는 효소(HpFutC)는 부산물로서 diFL을 생성한 반면, 다른 시험된 효소는 그렇지 않았다(또는 적어도 검출 한계 미만으로 훨씬 더 적은 정도). HpFutC가 있는 균주의 경우, 생체 내에서 생성된 diFL 대 2'FL 비율은 GDP-L-푸코오스 공여체 공급을 제한함으로써 낮게 유지될 수 있었지만, 이 낮은 GDP-푸코오스 공여체 공급은 동시에 2'FL 생산성을 제한했다. 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 효소를 포함하는 균주의 경우 공급된 생체내 GDP-L-푸코오스 농도는 diFL 대 2'FL 비율과 관련이 없었으므로 훨씬 더 높은 2'FL 생산성이 달성될 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Inbiose N.V. <120> Lactose converting alpha-1,2-fucosyltransferase enzymes <130> 009-PCT <150> BE 2019/5929 <151> 2019-12-17 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Akkermansia muciniphila <400> 1 Met Asn Met Glu Arg Lys Thr Gly Leu Met Asn Lys Lys Tyr Val Ser 1 5 10 15 Pro Cys Phe Leu Pro Gly Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Arg Val 35 40 45 Pro Trp Ala Tyr Asn Asp Ala Ser Leu Met Leu Arg Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Gly Trp Val Leu Pro Ser Thr Pro Cys Gly Thr Asn Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Trp Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr Cys Pro Val Pro Ser Arg Ile Arg 85 90 95 Thr Gly Gly Leu Arg Gly Tyr Phe Gln Ser Ala Arg Tyr Phe Glu Gly 100 105 110 Gln Glu Ala Phe Ile Arg Ala Leu Phe Ala Pro Leu Thr Ala Glu Lys 115 120 125 Glu Pro Gly Ala Val Gly Ile His Ile Arg Leu Gly Asp Tyr Arg Arg 130 135 140 Leu Arg Asp Lys His Arg Ile Leu Asp Pro Gly Phe Leu Arg Arg Ala 145 150 155 160 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283 <212> PRT <213> Litoreibacter ponti <400> 42 Met Ile Ile Ala Arg Ile Phe Gly Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Thr Ala Arg Ala Leu Ala Lys Arg Ala Cys Ala Pro Leu Trp 20 25 30 Leu Asp Ile Arg Leu Ala Pro Pro Gly Asp His Trp Glu Phe Ala Leu 35 40 45 Asn His Phe Ala Ile Glu Ala Lys Ile Ala Gln Pro Gly Glu Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Lys Asn Ser Lys Leu Arg Tyr Ala Ala Trp Arg Tyr Leu Gly 65 70 75 80 Gly Ser Pro Lys Phe Thr Arg Glu Arg Gly Leu Gly Phe Asn Glu Asn 85 90 95 Ile Leu Ser Leu Arg Gly Asp Val Tyr Leu His Gly Tyr Phe Gln Ser 100 105 110 Glu Arg Tyr Phe Glu Asp Phe Pro Gly Leu Arg Gln Glu Leu Thr Ile 115 120 125 Lys Thr Pro Pro Ser Asp Glu Asn Arg Arg Trp Ala Asp Asp Ile Arg 130 135 140 Ala Val Pro Ser Val Ser Leu His Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Thr 145 150 155 160 Ala Lys Gly Ala Gly Ser His Ala Ser Cys Asp Ala Ala Tyr Tyr Glu 165 170 175 Arg Ala Leu Asn His Val Ala Glu Lys Met Asp Ala Glu Pro Lys Val 180 185 190 Phe Val Phe Ser Asp Asp Pro Asp Trp Ala Arg Asp 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85 90 95 Glu Asn Glu Phe Ile Asp Leu Ala Ser Cys Lys Asn Tyr Thr Leu Ile 100 105 110 Tyr Leu Asp Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Lys Tyr Phe Ser His Ile Arg 115 120 125 Lys Gln Leu Leu Lys Glu Phe Glu Phe Pro Gln Leu Asp Thr Glu Asn 130 135 140 Thr Ala Ile Arg Asn Lys Ile Ile Arg Ser Glu Asn Thr Val Ser Leu 145 150 155 160 His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Ile Ile His Asn Ile 165 170 175 His Gly Val Leu Pro Leu Thr Tyr Tyr His Gln Ala Ile Thr Ala Leu 180 185 190 Thr Leu Lys Tyr Gly Lys Leu Ser Ile Tyr Ile Phe Ser Asp Asp Met 195 200 205 Lys Trp Ala Lys Glu His Leu Leu Ile Asn Asp Gln Glu Val His Tyr 210 215 220 Val Asp Leu Asn His Lys Lys Lys His Trp Gln Asp Met Ala Leu Met 225 230 235 240 Ser Ala Cys Lys His His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp 245 250 255 Gly Ala Trp Leu Ala Asp Thr Gly Gly Asp Thr Phe Ala Pro Leu Lys 260 265 270 Trp Phe Asn Ser Asp Ala Thr Lys Phe Glu Ile Asn Asp Phe Ile Pro 275 280 285 Gln Asn Trp Thr Ile Val Asn Tyr Gly 290 295 <210> 49 <211> 285 <212> PRT <213> Empedobacter brevis <400> 49 Met Ile Ala Val Glu Ile Ile Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Thr Ala Lys Ala Met Ala Leu His Arg Arg Asp Asp Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Lys Arg Pro Phe Glu Ser Tyr Ser Leu His Ser Phe Ser Leu 35 40 45 Pro His Phe Asn Val Thr Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Asp Ile Val Leu 50 55 60 Asp Leu Lys Ser Thr Ser Asp Lys Leu Lys Ala Phe Ile Lys Gly Gln 65 70 75 80 Lys Asn Tyr Thr Leu Tyr Gln Glu Asn Gly Leu Gly Tyr Asp Ala Ser 85 90 95 Leu Phe Asp Leu Gln Ala Lys Asn Val Tyr Leu Lys Gly Tyr Phe Gln 100 105 110 Ser Glu Lys Tyr Phe Ile Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Arg Asn Asp Phe 115 120 125 Glu Ile Val Thr Pro Leu Gln Glu Lys Thr Val Glu Met Leu Thr Ile 130 135 140 Ile Asn Glu Val Asn Ala Val Ser Leu His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr 145 150 155 160 Val Thr Asn Pro Glu Ala Asn Ser Val His Gly Thr Cys Asn Leu Asp 165 170 175 Tyr Tyr Gln Arg Ala Ile Ser His Ile Arg Glu Val Val Glu Asn Pro 180 185 190 Ile Phe Phe Ile Phe Ser Asp Asp Ile Gln Trp Ala Lys Glu Asn Leu 195 200 205 Thr Ile Pro Glu Thr Thr His Phe Ile Asp Phe Thr Asp Ala Ser Thr 210 215 220 Asn Tyr Glu Asp Ile Lys Leu Met Ser Thr Cys Lys His Asn Ile Ile 225 230 235 240 Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn Lys Asn Lys 245 250 255 Ser Lys Ile Val Ile Ala Pro Ser Lys Trp Phe Asn Val Asp Tyr His 260 265 270 Asn Ala Asp Asp Ile Ile Pro Glu Ser Trp Met Lys Ile 275 280 285 <210> 50 <211> 261 <212> PRT <213> Akkermansia muciniphila <400> 50 Met Asn Met Glu Arg Lys Thr Gly Leu Met Asn Lys Lys Tyr Val Ser 1 5 10 15 Pro Cys Phe Leu Pro Gly Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Arg Val 35 40 45 Pro Trp Ala Tyr Asn Asp Ala Ser Leu Met Leu Arg Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Gly Trp Val Leu Pro Ser Thr Pro Cys Gly Thr Asn Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Trp Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr Cys Pro Val Pro Phe Arg Ile Arg 85 90 95 Thr Gly Gly Leu Arg Gly Tyr Phe Gln Ser Ala Arg Tyr Phe Glu Gly 100 105 110 Gln Glu Ala Phe Ile Arg Ala Leu Phe Ala Pro Leu Thr Ala Glu Lys 115 120 125 Glu Pro Gly Ala Val Gly Ile His Ile Arg Leu Gly Asp Tyr Arg Leu 130 135 140 Leu Arg Asp Lys His Arg Ile Leu Asp Pro Gly Phe Leu Arg Arg Ala 145 150 155 160 Ala Gly His Leu Ser Ser Gly Lys Asn Arg Leu Val Leu Phe Ser Asp 165 170 175 Glu Pro Asp Glu Ala Ala Glu Met Leu Ala Cys Val Pro Ala Phe Gly 180 185 190 Arg Phe Ala Leu Glu Ile Asp Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ser Leu Arg 195 200 205 Arg Met Thr Ala Met Glu Glu Leu Val Met Ser Cys Ser Ser Phe Ser 210 215 220 Trp Trp Gly Ala Trp Leu Gly Asn Thr Arg Lys Val Ile Val Pro Arg 225 230 235 240 Asp Trp Phe Val Gly Gly Val Glu Asp Tyr Arg Asp Ile Tyr Leu Pro 245 250 255 His Trp Val Thr Leu 260 <210> 51 <211> 261 <212> PRT <213> Akkermansia muciniphila <400> 51 Met Asn Met Glu Arg Lys Thr Gly Leu Met Asn Lys Lys Tyr Val Ser 1 5 10 15 Ser Cys Phe Leu Pro Gly Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Arg Val 35 40 45 Pro Trp Ala Tyr Asn 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52 <211> 261 <212> PRT <213> Akkermansia muciniphila <400> 52 Met Asn Met Glu Arg Lys Thr Gly Leu Met Asn Lys Lys Tyr Val Ser 1 5 10 15 Pro Cys Phe Leu Pro Gly Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Arg Val 35 40 45 Ser Trp Ala Tyr Asn Asp Ala Ser Leu Met Leu Arg Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Gly Trp Val Leu Pro Ser Thr Pro Cys Gly Thr Asn Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Trp Gln Glu Pro Ser Phe Ser Tyr Cys Pro Val Pro Ser Arg Ile Arg 85 90 95 Thr Gly Gly Leu Arg Gly Tyr Phe Gln Ser Ala Arg Tyr Phe Glu Gly 100 105 110 Gln Glu Ala Phe Ile Arg Ala Leu Phe Ala Pro Leu Thr Ala Glu Lys 115 120 125 Glu Pro Gly Ala Val Gly Ile His Ile Arg Leu Gly Asp Tyr Arg Arg 130 135 140 Leu Arg Asp Lys His Arg Ile Leu Asp Pro Gly Phe Leu Arg Arg Ala 145 150 155 160 Ala Gly His Leu Ser Ser Gly Lys Asn Arg Leu Val Leu Phe Ser Asp 165 170 175 Glu Pro Asp Glu Ala Ala Glu Met Leu Ala Arg Val Pro Ala Phe Gly 180 185 190 Arg Phe Ala Leu Glu Ile Asp Arg Gly 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Leu Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Ala Arg Thr Leu Ala Ile Arg Gln His Thr Glu Val Leu 20 25 30 Leu Asp Thr Ser His Tyr Arg Glu Asp Gln Leu Arg Asp Phe Asp Leu 35 40 45 Phe His Leu Asn Val Lys Ala Arg Ile Ala Thr Ala Ser Gln Ile Asp 50 55 60 Glu Ile Arg Pro Thr Gly Thr Val Gly Arg Ala Leu Ser His Ile Ala 65 70 75 80 Pro Tyr Arg Phe Lys Arg Ile Tyr Gln Gln Pro Phe Tyr His Tyr Asp 85 90 95 Ala Gly Phe Val Arg Leu Arg Gly Pro Val Tyr Leu Lys Gly Tyr Phe 100 105 110 Gln Ser Glu Ala Tyr Phe Arg Pro Val Ala Ala Glu Ile Arg Arg Glu 115 120 125 Leu Thr Phe Arg Glu Leu Pro Leu Pro Gln Ile Gln Ala Leu Gly Ala 130 135 140 Arg Leu Arg Gln Glu Gln Ser Val Ser Leu His Ile Arg Arg Gly Asp 145 150 155 160 Tyr Lys Asn Pro Glu Thr Leu Arg Val His Gly Ile Leu Pro Leu Glu 165 170 175 Tyr Tyr Arg Ala Ala Val Lys Arg Ile Thr Asp Ser Arg Pro Asp Ala 180 185 190 Arg Phe Tyr Val Phe Thr Asp Asp Leu Glu Trp Val Arg Gln His Leu 195 200 205 Ala Met Pro Glu Ala Met Leu Val Ser Gly Glu Ile Thr Lys Thr His 210 215 220 Phe Glu Asp Leu Tyr Leu Met Gln His Cys Arg Asn His Ile Leu Ala 225 230 235 240 Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn Pro Asp Lys Glu 245 250 255 Lys Ile Val Val Ala Pro Lys Ala Trp Phe Asn Glu Gly Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Gln Asp Leu Ile Pro Arg Ser Trp Ile Arg Leu 275 280 <210> 55 <211> 245 <212> PRT <213> Proteobacteria bacterium <400> 55 Met Asp Lys Phe Ser Val Leu Thr Ser Gln Ala Ser Pro Ala Glu Val 1 5 10 15 Glu Lys Arg Phe Pro Leu Leu Ser Phe Arg Ser Leu Ile Lys Ile Tyr 20 25 30 Arg Arg Leu Leu Arg Ile Leu Pro Lys Leu Ser Arg Lys Tyr Tyr Phe 35 40 45 Glu Lys Ser Met Ala Phe Asp His Ser Leu Phe Glu Thr Asn Pro Glu 50 55 60 Cys Phe Ile Asp Gly Tyr Phe Gln Ser Tyr Lys Tyr Phe Glu Gly Val 65 70 75 80 Asn Asp Ile Ile Leu Gln Glu Phe Gln Pro Lys Glu Ala Pro Asp Glu 85 90 95 Val Asn His His Leu Ile Arg Val Met Gln Val Ala Asn Ser Val Ser 100 105 110 Leu His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Ile Ser Ser Ala Glu Ala Asn Lys 115 120 125 Val His Gly Ile Cys Gly Leu Glu Tyr Tyr Arg 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<210> 65 <211> 305 <212> PRT <213> Subdoligranulum variabile <400> 65 Met Ile Tyr Ala Glu Leu Ala Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Ile 1 5 10 15 Tyr Ala Phe Ala Arg Ala Leu Gly Leu Arg Cys Gly Glu Ala Val Thr 20 25 30 Leu Leu Asp Arg Gln Asp Trp Arg Asp Gly Ala Pro Ala His Thr Ala 35 40 45 Cys Ala Leu Glu Gly Leu Asn Leu Val Pro Glu Val Lys Ile Leu Ala 50 55 60 Glu Pro Gly Phe Ala Lys Arg His Leu Pro Arg Gln Asn Thr Ala Lys 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Lys Tyr Glu Gln Arg Gln Gly Leu Met Ala Arg Asp 85 90 95 Trp His Asp Trp Glu Arg Arg Cys Ala Pro Val Leu Asn Leu Leu Gly 100 105 110 Leu His Phe Ala Thr Asp Gly Tyr Thr Pro Val Arg Arg Gly Pro Ala 115 120 125 Arg Asp Phe Leu Ala Trp Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Ala Tyr Phe Ala 130 135 140 Asp Phe Ala Pro Thr Ile Arg Ala Glu Leu Arg Ala Lys Gln Ala Pro 145 150 155 160 Ala Gly Val Trp Ala Glu Lys Ile Arg Ala Ala Ala Cys Pro Val Ala 165 170 175 Leu His Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Cys Arg Pro Glu Asn Glu Ile Leu 180 185 190 Gln Val Cys Ser Pro Ala Tyr 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240 Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr 245 250 255 Leu Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu 260 265 270 Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser 275 280 285 His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala 290 295 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> domain 1 <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Asn or Ser <400> 72 Gly Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> domain 2 <220> <221> UNSURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any distinct amino acid excluding a valine residue <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Arg or Leu <400> 73 Xaa His Xaa Arg Xaa Gly Asp 1 5 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> new domain 2 <220> <221> UNSURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occcurring amino acid except Lys and Val <220> <221> UNSURE <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occcurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Ile or Leu <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Ile or Leu <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Arg or Leu <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Phe or Tyr <220> <221> UNSURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occcurring amino acid except Cys and Met <400> 74 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Arg Xaa Gly Asp Xaa Xaa 1 5 10 <210> 75 <211> 239 <212> PRT <213> Akkermansia sp. KLE1798 <400> 75 Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu Ala Ala Ala Cys Ser His 1 5 10 15 Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Gln Val Pro Trp Thr Tyr Asn Asp 20 25 30 Ala Ser Leu Met Leu Arg Ser Trp Leu Gly Gly Trp Val Leu Pro Ser 35 40 45 Thr Pro Cys Gly Thr Asn Glu Pro Pro Ser Trp Gln Glu Pro Ser Phe 50 55 60 Ser Tyr Cys Pro Ile Pro Ser Asn Ile Arg Glu Gly Gly Leu Cys Gly 65 70 75 80 Tyr Phe Gln Ser Val Arg Tyr Phe Glu Glu Gln Glu Ala Phe Ile Arg 85 90 95 Ala Leu Phe Ala Pro Phe Ile Ala Glu Lys Glu Ser Gly Thr Leu Gly 100 105 110 Val His Ile Arg Leu Gly Asp Tyr Lys Arg Leu Arg Asp Lys His Arg 115 120 125 Val Leu Asp Leu Asp Phe Leu Arg Arg Ala Ala Gly His Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Val Arg His Leu Val Leu Phe Ser Asp Glu Pro Asp Glu Ala Ala 145 150 155 160 Asp Met Leu Ala Arg Val Pro Glu Phe Gly Arg Phe Thr Leu Glu Ile 165 170 175 Asp Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ser Leu His Arg Met Thr Ala Met Glu 180 185 190 Glu Leu Val Ile Ser Cys Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Arg Lys Val Ile Val Pro His Asp Trp Phe Val Gly Gly 210 215 220 Met Glu Asp Tyr Arg Asp Ile Tyr Leu Pro His Trp Ile Lys Leu 225 230 235 <210> 76 <211> 252 <212> PRT <213> Akkermansia muciniphila <400> 76 Met Asp Arg Leu His Val Ser Pro Cys Phe Leu Pro Gly Thr Arg Leu 1 5 10 15 Gly Asn Val Met Phe Thr Leu Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Leu Arg 20 25 30 Val Gly Val Pro Cys His Val Pro Trp Asn Tyr Asn Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Leu Leu Arg Ser Arg Leu Gly Asp Trp Val Leu Pro Ser Thr Pro Cys 50 55 60 Gly Val Asn Glu Pro Ala Ala Trp Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr His 65 70 75 80 Pro Ile Pro Leu His Ile Thr Arg Gly Gly Val Cys Gly Tyr Phe Gln 85 90 95 Ser Ala Arg Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Pro Phe Ile Arg Ser Leu Phe 100 105 110 Ala Pro Phe Ile Ala Glu Lys Glu Pro Arg Thr Ala Gly Ile His Ile 115 120 125 Arg Leu Gly Asp Tyr Lys Gln Leu Arg His Lys His Arg Val His Gly 130 135 140 Ile Asp Phe Leu Gln Arg Ala Phe Thr His Ile Ser Pro Asp Val Asn 145 150 155 160 Arg Leu Ile Leu Phe Ser Asp Glu Pro Glu Ala Ala Ala Asp Met Leu 165 170 175 Val His Leu Pro Glu Phe Arg Arg Leu Pro Leu Glu Ile Asp Arg Asn 180 185 190 Asn Thr Cys Glu Ala Leu Arg Arg Met Thr Ala Met Glu Glu Leu Ile 195 200 205 Ile Ser Cys Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Gly Gln Thr 210 215 220 Arg Lys Val Ile Val Pro Arg His Trp Phe Ser Gly Val Ile Glu Asp 225 230 235 240 Tyr Gln Asp Val Tyr Leu Pro His Trp Val Lys Leu 245 250 <210> 77 <211> 289 <212> PRT <213> Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624 <400> 77 Met Lys Gln Lys His Tyr Ile Tyr Gln Gln Gly Gly Leu Gly Asn Gln 1 5 10 15 Leu Tyr Ile Leu Ala Tyr Ala Phe Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Val Gly 20 25 30 Pro Leu Cys Met Tyr Ser Ala Asp Arg Gln Lys Lys Asp Thr Lys Asp 35 40 45 Lys Lys Lys Arg Asn Val Tyr Ser Gln Ile Thr Glu Lys Leu Gly Phe 50 55 60 Pro Ile Ser Gly Leu Ser Tyr Phe Phe Phe Ser Met Ala Lys Lys Met 65 70 75 80 Ala Lys Lys Ser Phe Phe Lys Asn Tyr Ile Ala Leu Gln Val Glu Lys 85 90 95 Glu Gly Gln Phe Ala Val Phe Gln Glu Pro Ala Thr Gln Tyr Glu Ser 100 105 110 Lys Ile Tyr Leu His Met Gly Trp Tyr Gln Ser Tyr Leu Tyr Gln Thr 115 120 125 Pro Glu Phe Ile Glu Arg Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Glu Leu Ala Gly 130 135 140 Asn Thr Arg Gln Phe Ser Ile Thr Glu Asn Asp Val Val Leu His Ile 145 150 155 160 Arg Arg Gly Asp Phe Leu Lys Glu Lys Asn Arg Ala Leu Phe His Ile 165 170 175 Ile Glu Thr Pro His Tyr Leu Glu Gly Leu Ala Lys Leu Ser Gln Gly 180 185 190 Ile Asn Leu Glu Lys Val Tyr Ile Leu Ser Asp Asp Phe Glu Gly Ile 195 200 205 Glu Asp Ile Ile Thr Thr Leu Ser Lys Gln Tyr Glu Val Val Leu Val 210 215 220 Lys Gly Asn Thr Val Leu Gln Asp Leu Tyr Leu Leu Thr Gln Phe Lys 225 230 235 240 Asn Tyr Val Ile Gly Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Gly Ala Tyr Leu 245 250 255 Ser Lys Tyr Lys Glu Arg Ala Asn Ile Ile Val Pro Lys Glu Pro Trp 260 265 270 Lys Ile Pro Met Pro Glu Lys Ser Pro Tyr Pro Pro Tyr Trp Val Gln 275 280 285 Ile <210> 78 <211> 340 <212> PRT <213> Helicobacter sp. CLO-3 <400> 78 Met Thr Ile Ile Asn Ile Arg Asp Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Phe Ala Lys Val Leu Glu Ser Lys Gly Glu Ser Val Val Leu 20 25 30 Asp Thr Ser Trp Tyr Ser Glu Glu Pro Asp Ser Val Ser Lys Asn Ile 35 40 45 Ala Asn Lys Lys Asn Ile Arg Asn Leu Glu Ile Thr Arg Phe Asp Ile 50 55 60 Lys Ile Val Pro Tyr Met Glu Ile Glu Thr Met Leu Gln Thr Gln Asp 65 70 75 80 Lys Phe Tyr His Phe Phe Ser Phe Ile His Lys Leu Ile Ala Tyr Ala 85 90 95 Pro Lys Glu Cys Leu Arg Val Gly Leu Lys Ser Phe Leu Pro Lys Thr 100 105 110 Arg Arg Phe His Pro Tyr Lys Tyr His Ile Lys Glu Val Tyr Asp Ser 115 120 125 Arg Asp Leu Ser Ala Leu Pro His Asp Ile Leu Lys Asn Ala Leu Ile 130 135 140 Phe Gly Phe Phe Gln Lys Leu Ser Tyr Phe Lys His Ile Asp Ser Glu 145 150 155 160 Ile Arg Ala Asp Phe Thr Leu Cys Thr Pro Leu Ser Pro Ala Asn Glu 165 170 175 Ala Met Lys Lys Arg Ile Leu Ser Thr Pro Asn Ala Ala Phe Ile His 180 185 190 Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Asn Val Trp Gln Val Ile Lys Leu Gly 195 200 205 Lys Ala Tyr Tyr Ala Ser Ala Ile Lys Glu Ile Leu Thr His Val Lys 210 215 220 Asn Pro Lys Phe Phe Ile Phe Ser Asn Asp Ile Glu Trp Cys Lys Asn 225 230 235 240 Asn Phe Ile Asn Leu Ile Asp Ser Ser Val Phe Ala Gly Lys Glu Tyr 245 250 255 Glu Phe Val Glu Gln Asn Gly Glu Gly Asp Ala Ile Glu Glu Leu Glu 260 265 270 Leu Met Arg Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe Ser 275 280 285 Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Met Glu Asn Pro Lys Lys Thr Val Ile Ala 290 295 300 Pro Ser Lys Phe Phe Leu Ile Pro Pro Pro Gln Glu Pro Asn His Ile 305 310 315 320 Asp Asp Ile Leu Pro Glu Gly Trp Ile Lys Thr Asp Pro Thr Trp Gly 325 330 335 Asn Val Glu Ser 340 <210> 79 <211> 320 <212> PRT <213> Helicobacter sp. MIT 17-337 <400> 79 Met Leu Ile Val Arg Leu Asp Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Phe Ala Lys Lys Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Val Gly Ile 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Tyr Ala Asp Lys Lys Asn Thr Asn Pro Thr Ile Ala 35 40 45 Asn Phe Ala Gln Asn Gln His Ala Thr Ile Arg Asn Leu Glu Ile Ser 50 55 60 His Tyr Asn Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ser Asp Phe Asn Pro Tyr Asp 65 70 75 80 Phe Phe Ile Leu His Asp Arg Phe Tyr Val Leu Arg Asn Lys Ile Asn 85 90 95 Arg Phe Leu Pro Arg Pro Leu Arg Met Lys Asn Tyr Lys Phe Phe Ile 100 105 110 Pro Asp Asp Val Lys Leu Cys Lys Ile Ile Gln Glu Asn Lys Pro Tyr 115 120 125 Phe Pro Asp Tyr Ala Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Gln Asn Leu Ser Cys 130 135 140 Ile Val Glu Pro Gln Asp Ile Ser Gly Asp Phe Ser Leu Lys Asn Pro 145 150 155 160 Leu Ser Gln Ala Asn Gln Ala Leu Lys Glu Gln Ile Ala Ser Phe Gln 165 170 175 Asp Ser Val Phe Leu His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Ala Phe Glu 180 185 190 Arg Tyr Ile His Leu Thr Glu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ala Leu Tyr Met 195 200 205 Met Lys Thr Lys Lys Asp Ser Phe His Val Phe Val Phe Ser Asn Asp 210 215 220 Ile Gln Trp Cys Lys Glu Tyr Phe Ile Lys Gln Leu Asp Asn Thr Leu 225 230 235 240 Met Gln Asn Leu Thr Phe Glu Phe Ile Gly Asn Asn Asp Glu Gly Asn 245 250 255 Ala Ile Ile Asp Met Glu Leu Met Arg Thr Cys Lys His Gly Ile Ile 260 265 270 Ala Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Leu Lys Ser Lys 275 280 285 Asp Lys Ile Ile Ile Ala Pro Ser Arg Phe Leu Gln Asp Ser Thr Ile 290 295 300 Glu Arg Met Lys Leu Leu Tyr Pro Gln Glu Trp Thr Leu Ile Glu Val 305 310 315 320

Claims (35)

  1. 하기 단계들을 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
    a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는
    i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는
    ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
    i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
    ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    iii) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
    iv) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
    v) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편,
    바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하는 것인 단계,
    b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 그 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하고, 이에 의해 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계,
    c) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, α-1,2-푸코실락토오스의 생산이 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율을 1:5 미만, 바람직하게는 α-1,2-푸코실락토오스 순도를 80% 이상으로 초래하는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는 무세포 시스템으로 제공되는 것인 방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 의해 생산되는 것인 방법.
  5. 청구항 1, 청구항 2 또는 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDP-푸코오스 및/또는 락토오스가 상기 GDP-푸코오스 및/또는 락토오스를 생산하는 세포에 의해 제공되는 것인 방법.
  6. 청구항 1, 청구항 2, 청구항 4 또는 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 것인 방법:
    i) α-1,2-푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, α-1,2-푸코실락토오스 생산을 위해 유전적으로 변형된 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 상기 폴리펩티드의 발현을 포함하고,
    ii) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하는 조건 하에 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계,
    iii) 선택적으로 배양물로부터 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
  7. 청구항 4항에 있어서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 것인 방법:
    a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 제공하는 단계,
    b) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하고 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적합한 영양 조건 하에 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계;
    c) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드가 GDP-푸코오스로부터 푸코오스 잔기의 락토오스로의 전달을 촉매하기 위해, b) 단계와 동시에 또는 그 다음에 공여체 기질 GDP-푸코오스 및 수용체 기질 락토오스를 제공함으로써, α-1,2-푸코실락토오스를 생산하는 단계;
    d) 선택적으로 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
  8. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서, 숙주 세포가 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 외인성 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환 또는 형질감염되는 것인 방법.
  9. 청구항 4 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, GDP-푸코오스 및/또는 락토오스가 숙주 세포에서 동시에 발현되는 효소에 의해 또는 숙주 세포의 대사에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, α-1,2-푸코실락토오스의 정제를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 2'-푸코실락토오스의 생산 방법:
    i) 초기 반응기 부피의 리터당 50 그램 이상, 보다 바람직하게는 75 그램 이상, 더욱 바람직하게는 100 그램 이상, 더욱 바람직하게는 120 그램 이상, 더욱 바람직하게는 150 그램 이상의 락토오스를 포함하는 락토오스 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 여기서 총 반응기 부피는 250mL(밀리리터) 내지 10,000m3(입방 미터) 범위이고, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 락토오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
    ii) 숙주 세포가 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 GDP-푸코오스 공급물을 상기 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 GDP-푸코오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
    iii) 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 2'-푸코실락토오스를 합성하기 위한 최적 농도로 숙주 세포가 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계;
    iv) 숙주 세포가 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 락토오스를 내부적으로 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
    v) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 하나 이상의 공급 용액에 의하여 락토오스 공급물, GDP-푸코오스 공급물 및/또는 탄소계 기질 공급물를 배양 배지에 연속 방식으로 첨가하는 단계;
    vi) 공급 용액에 의하여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 배양 배지에 연속 방식으로 락토오스 공급물을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 락토오스 공급 용액의 농도는 50g/L, 바람직하게는 75g/L, 더 바람직하게는 100g/L, 더 바람직하게는 125g/L, 더 바람직하게는 150g/L, 더 바람직하게는 175g/L, 더 바람직하게는 200g/L, 더 바람직하게는 225g/L, 더 바람직하게는 250g/L, 더 바람직하게는 275g/L, 더 바람직하게는 300g/L, 더 바람직하게는 325g/L, 더 바람직하게는 350g/L, 더 바람직하게는 375g/L, 더 바람직하게는 400g/L, 더 바람직하게는 450g/L, 더 바람직하게는 500g/L, 더욱 더 바람직하게는 550g/L, 가장 바람직하게는 600g/L이고; 바람직하게는 상기 용액의 pH는 3 내지 7로 설정되고 바람직하게는 상기 공급 용액의 온도는 20℃ 내지 80℃로 유지되는 단계;
    vii) 상기 방법이 상기 배양 배지의 최종 부피에 있어서 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90g/L 이상, 보다 바람직하게는 100g/L 이상, 보다 바람직하게는 125g/L 이상, 보다 바람직하게는 150g/L 이상, 보다 바람직하게는 175g/L 이상, 더욱 바람직하게는 200g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 농도를 초래하는 단계.
  12. 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위해 유전적으로 변형된 숙주 세포로서, 여기서 상기 숙주 세포는 α-1,2-푸코실락토오스 합성을 위한 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고; 상기 세포는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 수용체 기질로서 락토오스를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드의 발현을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는
    i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는
    ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
    i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
    ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    iii) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
    iv) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
    v) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편이고,
    바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하는 것인 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 숙주 세포는
    i) 락토오스 결합 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열로서, 여기서 상기 서열은 숙주 세포에 대해 외래이고 숙주 세포의 게놈에 통합되는 것인 서열을 포함하거나, 또는
    ii) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 벡터를 함유하는 세포.
  14. 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서, 상기 세포는 미생물, 식물 또는 동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 진균 또는 효모이고, 바람직하게는 상기 식물은 벼, 목화, 유채, 대두, 메이즈 또는 옥수수(corn) 식물이고, 바람직하게는 상기 동물은 곤충, 물고기, 새 또는 인간이 아닌 포유동물이고; 바람직하게는 세포는 대장균(Escherichia coli) 세포인 것인 세포.
  15. 청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 박테리아, 바람직하게는 대장균 균주, 보다 바람직하게는 K12 균주인 대장균 균주의 세포이고, 훨씬 더 바람직하게는 대장균 K12 균주는 대장균 MG1655인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  16. 청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  17. 청구항 12 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 각각의 숙주 세포의 코돈 사용에 맞춰져 있는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  18. 하기 단계들을 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
    a) 청구항 12 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하는 단계,
    b) α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 허용하는 조건 하에 배지에서 세포를 배양하는 단계,
    c) 선택적으로, 배양물로부터 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
  19. α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 청구항 12 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 용도.
  20. 락토오스 결합 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 이종 발현하는 미생물로서, 상기 폴리펩티드는
    i) 보존 도메인 GY-[F/Y]-Q-[N/S](서열번호 72)를 코딩하는 아미노산 서열 및 보존 도메인(X, K/V 없음) XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X, C/M 없음)(서열번호 74)을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 상기 도메인의 첫 번째 위치에서 라이신 및 발린 잔기를 제외하고 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 상기 도메인의 마지막 위치에서 시스테인 및 메티오닌 잔기를 제외한 임의의 별개의 아미노산일 수 있고, 및/또는
    ii) 다음으로 구성된 군에서 선택되고:
    i) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62, 63, 66, 67 또는 76 중 어느 하나, 또는
    ii) 첨부된 서열 목록의 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 전장 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    iii) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 대립형질 변이체(allelic variant)의 아미노산 서열 또는
    iv) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 오르토로그의 아미노산 서열, 및
    v) 서열번호 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 70, 75, 76, 77, 78 또는 79 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 단편이고,
    바람직하게는 상기 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 11(GT11) 패밀리에 속하는 것인 미생물.
  21. 알파-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 청구항 20에 따른 미생물의 용도.
  22. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 18, 청구항 19 또는 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-1,2-푸코실락토오스를 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 18, 청구항 19, 청구항 21 또는 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리가 정화, 한외여과, 나노여과, 역삼투, 정밀여과, 활성탄 또는 탄소 처리, 접선 유동 고성능 여과, 접선 유동 한외여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 겔 여과, 리간드 교환 크로마토그래피의 단계 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 18, 청구항 19, 청구항 21 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 알파-1,2-푸코실락토오스의 정제를 더 포함하는 것인 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 알파-1,2-푸코실락토오스의 정제가 활성탄 또는 탄소의 사용, 목탄의 사용, 나노여과, 한외여과 또는 이온 교환, 알코올의 사용, 수성 알코올 혼합물의 사용, 결정화, 증발, 침전, 건조, 분무 건조 또는 동결건조의 단계 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 21 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 진균, 효모, 박테리아, 곤충, 동물 또는 식물 발현 시스템에서 생산되는 것인 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 숙주 세포가 박테리아, 바람직하게는 대장균 균주, 보다 바람직하게는 K12 균주인 대장균 균주의 세포이고, 더욱 더 바람직하게는 대장균 K12 균주는 대장균 MG1655인 것인 방법.
  28. 청구항 26에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포인 방법.
  29. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 18, 청구항 19, 청구항 21 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 중 락토오스 농도가 50 내지 150g/L의 범위인 것인 방법.
  30. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 18, 청구항 19, 청구항 21 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 2'-푸코실락토오스의 최종 농도가 70g/L 내지 200g/L 범위인 것인 방법.
  31. α-1,2-푸코실락토오스의 생산을 위한 청구항 1 또는 청구항 10의 방법에 기재된 폴리펩티드의 용도.
  32. 하기 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
    a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계,
    b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시켜 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하는 단계,
    c) 상기 촉매 작용은 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율을 초래하고,
    d) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
  33. 하기 단계를 포함하는 α-1,2-푸코실락토오스의 생산 방법:
    a) α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성 및 락토오스를 수용체 기질로 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계,
    b) 단계 a)의 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코오스 잔기의 전달을 촉매하는 조건 하에 공여체 기질로서 GDP-푸코오스 및 수용체 기질로서 락토오스를 포함하는 혼합물과 접촉시켜 α-1,2-푸코실락토오스를 생성하는 단계,
    c) 상기 촉매 작용은 80% 이상의 2'푸코실락토오스 순도를 초래하고,
    d) 선택적으로 상기 α-1,2-푸코실락토오스를 분리하는 단계.
  34. 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 2'-푸코실락토오스의 생산 방법:
    i) 배양 배지에, 초기 반응기 부피의 리터당 50 그램 이상, 보다 바람직하게는 75 그램 이상, 더욱 바람직하게는 100 그램 이상, 더욱 바람직하게는 120 그램 이상, 더욱 바람직하게는 150 그램 이상의 락토오스를 포함하는 락토오스 공급물을 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 여기서 총 반응기 부피는 250mL(밀리리터) 내지 10,000m3(입방 미터) 범위이고, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 락토오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
    ii) 상기 배양 배지에, 숙주 세포가 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 GDP-푸코오스 공급물을 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 GDP-푸코오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
    iii) 1:5 미만의 diFL 농도 대 2'푸코실락토오스 농도 비율로, 바람직하게는 연속 방식으로, 2'-푸코실락토오스를 합성하기 위한 최적 농도로 숙주 세포가 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
    iv) 숙주 세포가 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 락토오스를 내부적으로 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
    v) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 하나 이상의 공급 용액에 의하여 락토오스 공급물, GDP-푸코오스 공급물 및/또는 탄소계 기질 공급물를 배양 배지에 연속 방식으로 첨가하는 단계;
    vi) 공급 용액에 의하여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 배양 배지에 연속 방식으로 락토오스 공급물을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 락토오스 공급 용액의 농도는 50g/L, 바람직하게는 75g/L, 더 바람직하게는 100g/L, 더 바람직하게는 125g/L, 더 바람직하게는 150g/L, 더 바람직하게는 175g/L, 더 바람직하게는 200g/L, 더 바람직하게는 225g/L, 더 바람직하게는 250g/L, 더 바람직하게는 275g/L, 더 바람직하게는 300g/L, 더 바람직하게는 325g/L, 더 바람직하게는 350g/L, 더 바람직하게는 375g/L, 더 바람직하게는 400g/L, 더 바람직하게는 450g/L, 더 바람직하게는 500g/L, 더욱 더 바람직하게는 550g/L, 가장 바람직하게는 600g/L이고; 바람직하게는 상기 용액의 pH는 3 내지 7로 설정되고 바람직하게는 상기 공급 용액의 온도는 20℃ 내지 80℃로 유지되는 단계;
    vii) 상기 방법이 상기 배양 배지의 최종 부피에 있어서 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90g/L 이상, 보다 바람직하게는 100g/L 이상, 보다 바람직하게는 125g/L 이상, 보다 바람직하게는 150g/L 이상, 보다 바람직하게는 175g/L 이상, 더욱 바람직하게는 200g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 농도를 초래하고 바람직하게는 diFL 농도 대 2'FL 농도 비율 1:5 미만, 보다 바람직하게는 1:20, 더욱 더 바람직하게는 1:40인 것인 단계.
  35. 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 2'-푸코실락토오스의 생산 방법:
    i) 배양 배지에, 초기 반응기 부피의 리터당 50 그램 이상, 보다 바람직하게는 75 그램 이상, 더욱 바람직하게는 100 그램 이상, 더욱 바람직하게는 120 그램 이상, 더욱 바람직하게는 150 그램 이상의 락토오스를 포함하는 락토오스 공급물을 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계로서, 여기서 총 반응기 부피는 250mL(밀리리터) 내지 10,000m3(입방 미터) 범위이고, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 락토오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 보다 바람직하게는 2배 미만이 되도록 한 단계;
    ii) 숙주 세포가 바람직하게는 연속적인 방식으로, 80% 이상의 순도의 2'-푸코실락토오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 GDP-푸코오스 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 바람직하게는 배양 배지의 최종 부피가 상기 GDP-푸코오스 공급물의 첨가 전 배양 배지 부피의 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하, 더욱 바람직하게는 2배 미만인 단계;
    iii) 숙주 세포가 80% 이상의 순도의 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 GDP-푸코오스를 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 바람직하게는 연속 방식으로 첨가하는 단계;
    iv) 숙주 세포가 2'푸코실락토오스 합성을 위한 최적 농도로 락토오스를 내부적으로 합성할 수 있도록 하는 농도로 탄소계 기질 공급물을 배양 배지에 첨가하는 단계;
    v) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 하나 이상의 공급 용액에 의하여 락토오스 공급물, GDP-푸코오스 공급물 및/또는 탄소계 기질 공급물를 배양 배지에 연속 방식으로 첨가하는 단계;
    vi) 공급 용액에 의하여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일에 걸쳐 배양 배지에 연속 방식으로 락토오스 공급물을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 락토오스 공급 용액의 농도는 50g/L, 바람직하게는 75g/L, 더 바람직하게는 100g/L, 더 바람직하게는 125g/L, 더 바람직하게는 150g/L, 더 바람직하게는 175g/L, 더 바람직하게는 200g/L, 더 바람직하게는 225g/L, 더 바람직하게는 250g/L, 더 바람직하게는 275g/L, 더 바람직하게는 300g/L, 더 바람직하게는 325g/L, 더 바람직하게는 350g/L, 더 바람직하게는 375g/L, 더 바람직하게는 400g/L, 더 바람직하게는 450g/L, 더 바람직하게는 500g/L, 더욱 더 바람직하게는 550g/L, 가장 바람직하게는 600g/L이고; 바람직하게는 상기 용액의 pH는 3 내지 7로 설정되고 바람직하게는 상기 공급 용액의 온도는 20℃ 내지 80℃로 유지되는 단계;
    vii) 상기 방법이 상기 배양 배지의 최종 부피에 있어서 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90g/L 이상, 보다 바람직하게는 100g/L 이상, 보다 바람직하게는 125g/L 이상, 보다 바람직하게는 150g/L 이상, 보다 바람직하게는 175g/L 이상, 더욱 바람직하게는 200g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 농도 및 바람직하게는 80% 이상의 2'FL 순도를 초래하는 것인 단계.
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