WO2011095338A1 - Neue aminoalkyl-oxazol- und aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide als regenerationsfördernde substanzen für sinnesorgane und postmitotische gewebe - Google Patents

Neue aminoalkyl-oxazol- und aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide als regenerationsfördernde substanzen für sinnesorgane und postmitotische gewebe Download PDF

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oxazole
organ
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Holger Eickhoff
Hubert LÖWENHEIM
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Definitions

  • the present invention relates to novel aminoalkyl-oxazole and aminoalkyl-thiazolecarboxamides which stimulate the endogenous regeneration of terminally differentiated cells in highly specialized organs, tissues and sensory epithelia in the mammal in situ.
  • the claimed low molecular weight compounds are capable of inducing appropriate cell biological alterations such as dedifferentiation, proliferation and subsequent terminal redifferentiation of normally postmitotic tissue cells.
  • the invention relates to compounds with which a de novo formation of hair cells in the Corti organ can be achieved by induction of cell division of support cells of the inner ear and hearing after hair cell loss can be restored.
  • the invention furthermore relates to processes for the preparation of the compounds according to the invention, to their formulation as pharmaceutical preparations and to their use for the production of medicaments for regenerative medicine.
  • the ability to regenerate after injury is limited or absent.
  • organs and tissues such as the liver, bone, or skin, have the capacity for spontaneous regeneration through cell regeneration throughout the life of the organism.
  • the corresponding cells in the highly specialized organs and tissues e.g., heart, brain, skeletal muscle, or the sensory epithelia of the eye and inner ear
  • these tissues have also lost their ability to spontaneously regenerate upon the occurrence of harmful events. This leads accordingly to irreversible functional deficits.
  • a heart attack for the heart or a stroke for the brain often cause irreversible damage to the affected tissue components with correspondingly permanent loss of function.
  • tissue and organs as shown by the examples of retina or limbs, which, although terminally differentiated, are nevertheless capable of spontaneous in vivo regeneration (Tsonis, 2000, Tsonis, 2002 ).
  • the central cell biological event in these examples consists of cellular dedifferentiation, which allows the formation of multipotent progenitor cells, from which proliferation and redifferentiation can give rise to regenerated cells.
  • Dedifferentiation thus plays the decisive role in the regeneration of the terminally differentiated amphibian tissue.
  • other vertebrates show lower regeneration abilities.
  • the basic biological mechanism for hair cell regeneration in the avian cochlea has been described as the cell division of supporting cells adjacent to the destroyed hair cells (Corwin and Cotanche, 1988, Ryals and Rubel, 1988), producing a population of undifferentiated cells are to redifferentiate to newly formed hair cells and support cells. This results in almost complete morphological and functional recovery of sensory epithelium in birds (Cotanche, 1999, Smolders, 1999).
  • the regenerated tissues of amphibians can be used to extract an extract capable of inducing dedifferentiation in mammalian cells as well (McGann et al., 2001).
  • the dedifferentiation-based mechanism for the regeneration of terminally differentiated cells can be transferred from the amphibians to the mammal (Odelberg, 2002).
  • the regeneration extracts mentioned are "protein cocktails" whose composition is not known in detail.
  • it has also been possible to achieve a corresponding effect on muscle cells of the mammal with a defined low-molecular compound Choen et al., 2004).
  • these compounds are said to facilitate the restoration of hearing in the mammal by de novo formation of hair cells in the adult organ of Corti.
  • a causal treatment of inner ear hearing loss on the basis of a regenerative biologically active drug should be made possible for the first time.
  • the essential feature of the present invention is that with the compounds according to the invention structurally defined chemical agents are present for the first time, which can bring about a regeneration of terminally differentiated cells in the mammal, in particular hair cells in the inner ear of the mammal.
  • the present invention has to do with the identification of novel, previously unknown low molecular weight compounds that are able to stimulate regeneration biologically relevant processes such as dedifferentiation, proliferation and the resulting regeneration of cells from normally postmitotic tissues Unique selling point.
  • the invention further includes the use of the regeneration-promoting properties of the compounds according to the invention for the causative treatment of inner ear hearing loss after damage and loss of hair cells in the organ of Corti up to the complete restoration of hearing in humans and animals.
  • Target cells are the support cells that are directly adjacent to the damaged cells and can serve as potential precursors for the regeneration of hair cells.
  • the present invention therefore relates to aminoalkyl-oxazole and aminoalkyl-thiazolcarbon- acid amides according to the formulas (1) and (2)
  • Y is C or N, where both atoms must be different
  • R2 is hydrogen or acyl
  • R 1 and R 3 which may be the same or different, represent a substituent selected from the following groups:
  • alkylcycloalkyl groups alkylaryl groups, cycloalkyl groups, cycloalkylaryl groups, aryl groups and arylcycloalkyl groups,
  • R 1 is preferably (1H-indol-3-yl) -ethyl and R 3 is preferably cyclohexyl.
  • a preferred embodiment relates to aminoalkyl-oxazole and amino-alkyl-thiazolcarbonklaamide according to the invention according to the following formulas (3) to (8).
  • the potential of the low molecular weight aminoalkyl-oxazole and aminoalkyl-thiazolecarboxamides according to the invention to dedifferentiate already differentiated cells was determined in a cell culture assay on stem cells isolated from the mouse's inner ear with otic development potential, which in cell culture belong to the original sensory epithelium Epithelial islands, as different as possible, were detected.
  • the proportion of Sox2-expressing cells a stem cell marker which is also expressed during the ontogenesis of the organ of Corti and is regarded as a sign of cellular dedifferentiation, could more than be doubled by administration of the compounds according to the invention.
  • BrdU bromodeoxyuridine
  • the immunocytochemical analysis of the stem cell markers on the dedifferentiated epithelium confirmed the assumption that the compounds according to the invention after their accumulation in the cell nucleus first induce a dedifferentiation of differentiated cells in the sense of a reprogramming in order subsequently to enable their proliferation.
  • the concentration range for an effective activity with regard to proliferation within the range of 0.1 ⁇ to 100 ⁇ , preferably from 1 ⁇ to 3 ⁇ substance in the cell culture medium was defined by a dose-response analysis for the compounds according to the invention. Comparable effects as in the cell culture assay could also be achieved in the in vitro organ culture of a mouse's natural organ, ie in the complex, cellular association of the organ of Corti.
  • the application of the compounds of the invention for in situ proliferation of various support cells in the Corti'schen organ such as lying in the outer hair cell laterally oriented Deiterszellen (outer phalanxes) and outer border cells, in the area the inner hair cells lying inner phalangeal cells and inner border cells and other supporting cells, which are considered as potential precursor cells for the regeneration of inner hair cells.
  • individually labeled nuclei could be detected in different stages of mitosis up to complete cell division with duplicate cell nuclei.
  • the immunohistochemical findings also showed a regeneration of hair cells induced by the compounds of the invention on the basis of cell divisions of support cells, preferably in the damaged by noise trauma areas of the organ of Corti. In appropriate control animals and control organs without application of the compounds showed no spontaneously regenerated hair cells.
  • the invention further provides the preparation of the aminoalkyl oxazole and aminoalkylthiazolecarboxamides according to the invention, which are used according to the invention as active ingredients for stimulating the endogenous in situ regeneration of terminally differentiated cells in highly specialized organs and tissues, preferably the brain, the heart, skeletal muscle, and most preferably of sensory epithelia, can be used.
  • One possible route is the synthesis of the compounds of the invention on a solid phase starting from an amino acid amide.
  • the amino acid whose side chain represents the substituent R1
  • the cyclization of the amino acid amide to the oxazole or of the amino acid thioamide to the thiazole is carried out with bromobutyric acid and ⁇ , ⁇ -dimethylaniline.
  • Brombrenztraubenklathylester the resulting ester group must be subsequently saponified.
  • the amino acid amides are converted into the corresponding thioamides before the cyclization with Lawesson's reagent.
  • the resulting amino acid oxazole / thiazolecarboxylic acids are subsequently reacted with an amine which represents the substituent R3.
  • the acidic cleavage of the amino acid oxazole / thiazolecarboxamides from the synthetic resin and the subsequent chromatographic purification are carried out.
  • the synthesis of the compounds according to the invention is carried out in solution.
  • the synthesis is carried out using the protective group chemistry starting from a Boc-protected amino acid with the side chain R1.
  • the synthesis steps are in principle adequate to those described for the solid phase.
  • the acidic cleavage of the Boc protective group and the subsequent chromatographic purification are carried out.
  • salts of the compounds of the invention pharmaceutically acceptable salts are preferred.
  • examples of such salts are salts of inorganic or organic acids, salts of inorganic or organic bases and salts of basic or acidic amino acids.
  • the compounds of the invention may also be modified as prodrug compounds, preferably as prodrug esters or prodrug peptides, or the like.
  • coupling of cell penetration promoting molecules such as e.g. Biotin or maleimidopropionic, optionally via suitable spacer molecules, to the primary amino group or the acylation of this amino group, corresponding to the substituent R2, the bioavailability and thus the effectiveness of the compounds of the invention can be improved.
  • Another object of the invention is the use of Aminoalkyl- oxazole- and aminoalkyl-thiazolcarbonklaamide invention for the preparation of pharmaceutical preparations for the treatment of diseases in the mammal, which are associated with damaged postmitotic tissues, in particular for the treatment of damage and loss of Haarsinneszellen in the organ of Corti, caused by inner ear hearing loss
  • Mammal Mammal. These preparations, containing at least one active ingredient according to the invention alone or in combination, optionally contain further pharmaceutically suitable auxiliaries and additives, such as excipients, preservatives, stabilizers, emulsifiers, detergents, solvents, solubilizers, salts for regulating the osmotic pressure and buffer salts. In addition, they may contain other therapeutically relevant active ingredients, adjuvants and regeneration-promoting substances such as growth factors or anti-inflammatories. Pharmaceutically acceptable materials are the substances known to be useful in the pharmaceutical and food technology industries and in adjacent fields, in particular those listed in the relevant pharmacopoeias whose properties do not preclude physiological application.
  • auxiliaries and additives such as excipients, preservatives, stabilizers, emulsifiers, detergents, solvents, solubilizers, salts for regulating the osmotic pressure and buffer salts.
  • auxiliaries and additives such as excipients, preservatives
  • Suitable administration forms for the pharmaceutical preparations according to the invention containing at least one active compound of the formulas (1) and (2) may be, for example, solutions, suspensions, sprays, gels, hydrogels, lotions, emulsions, pastes, ointments or creams.
  • the preparation of the pharmaceutical preparations according to the invention is carried out in the usual way by methods known to those skilled in the art, as described in the relevant pharmacopoeias, e.g. by mixing, granulating or coating methods.
  • the pharmaceutical preparations according to the invention can additionally be sterilized.
  • the invention also relates to the use of the aminoalkyl-oxazole and aminoalkyl-thiazolcarbonklaamide invention as regeneration-promoting agents for the treatment of diseases in humans and animals associated with damaged postmitotic tissues, preferably for restoring hearing after loss or damage to the hair cells in the inner ear ,
  • a person or animal in need of such a treatment is administered a therapeutically effective amount of a preparation according to the invention which promotes regeneration, comprising at least one compound according to the invention of the formulas (1) and (2).
  • the active substance or the pharmaceutical preparation according to the invention are applied directly or indirectly (including systemically), preferably locally, directly on / to the damaged tissue structures.
  • the application to or in the inner ear for example, transtympanally by injection into the middle ear, by applying to the round or oval window of the inner ear or by injection into the inner ear.
  • Various systems for drug administration can be used.
  • the compounds according to the invention and pharmaceutical preparations can be used alone, in combination with other compounds according to the invention or in combination with one or more active substances which are relevant for the respective described therapeutic indication of the compounds according to the invention.
  • the temporal sequence of the application is not restricted.
  • a compound according to the invention can be administered either simultaneously, before or after the other active substances, as a separate drug or combination preparation and on the same or different administration routes.
  • the exact therapeutically effective amount for the treatment of sensorineural hearing loss in a subject will depend on various factors, including the extent of damage to the tissue, size, stature, age and health of the patient, route and form of administration, the particular compound used, and, where appropriate of other medicines used. Thus it does not make sense to specify the exact quantity at this time.
  • compositions according to the invention can in principle of a multiple application of the pharmaceutical compositions according to the invention over a period of up to 8 weeks at intervals of one to seven days to a continuous application by systems for drug dosing, which have a mechanism for permanent delivery "sustained release"
  • the amount of active ingredient used should be in the range from 0.5 pg to 1, 0 mg per inner ear and application.
  • Regeneration-biologically relevant compounds that are able to induce corresponding cell biological changes such as dedifferentiation, proliferation or terminal redifferentiation, and their formulations represent a new form of active ingredients, since it is a completely new therapeutic concept.
  • aminoalkyl-oxazole and aminoalkyl-thiazolecarboxamides according to the invention, it has been possible for the first time to detect a cell division of otic supporting cells induced by low molecular weight compounds and the resulting regeneration of hair cells in the highly differentiated postmitotic tissue of the Corti organ in the mammal. To date, no comparable methods have been described for the in vivo regeneration of hair cells based on pharmaceutical active ingredients.
  • the described syntheses allow the preparation of the compounds in stereochemically pure form. They are obtained either in free form or as a salt, if salt-forming groups are included.
  • N-Boc-D-Tryptophan (9) (1 equiv, 2.75 mmol, 1.00 g), hydroxybenzotriazolammonium salt (2 equiv, 5.50 mmol, 924 mg) and diisopropylcarbodiimide (DIC) (1.1 equiv , 3.03 mmol, 382 mg, 454 pL) were dissolved in molecular sieve-dried dimethylformamide (DMF) and stirred at room temperature for 18 hours. The solvent was then removed on a rotary evaporator under reduced pressure and the residue taken up in ethyl acetate.
  • DMF molecular sieve-dried dimethylformamide
  • the crude product (10) was taken up in a solution of 50% trifluoroacetic acid (TFA) in dichloromethane (DCM) and stirred at room temperature for 3 h. After evaporation of the solvents, the product (11) was recrystallized.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • DCM dichloromethane
  • Chloro (2'-chloro) trityl-polystyrene resin (12) (Rapp Polymere H 10033, loading 1.31 mmol / g) (1 equiv, 655 pmol, 500 mg) was washed twice with DMF (via molecular sieve) , a solution of the amino acid amide hydrochloride (13) (2 equiv; 1, 31 mmol) and diisopropylethylamine (DIPEA) (5 equiv, 3.28 mmol, 424 mg) in DMF and shaken for 18 h at room temperature , To cap the resin, methanol (MeOH) was then added to the suspension and shaken for another 15 minutes at room temperature. The reaction solution was filtered off with suction, the loaded resin (14) was washed (5 ⁇ DMF, 3 ⁇ MeOH, tetrahydrofuran (THF), diethyl ether) and dried in an oil pump vacuum.
  • DIPEA diisopropy
  • Amino acid amide resin (14) (1 equiv, 655 pmol, 500 mg) was added to a solution of Lawesson's reagent (3 equiv, 1.97 mmol, 797 mg) in dimethoxyethane (DME) (10 mL) and 18 h shaken at room temperature. The reaction solution was filtered off with suction, the resin (16) was washed (6 ⁇ DMF, 3 ⁇ MeOH, THF, DCM, diethyl ether each time) and dried in an evacuated desiccator.
  • DME dimethoxyethane
  • the amino acid-oxazole (15) or amino acid-thiazolecarboxylic acid ethyl ester resin (17) (1 equiv; 655 ⁇ ; 500 mg) was preswollen in THF (2.5 mL) and washed with a solution of lithium hydroxide monohydrate (5 equiv. 3.28 mmol, 137 mg) in water (1.25 mL) and MeOH (1.25 mL). After 3 h at room temperature, the reaction solution was filtered off with suction, the resin (18) or (19) was washed (3 ⁇ water, water / DMF 1: 1, DMF, dioxane, THF, DCM, diethyl ether) and dried in an evacuated desiccator.
  • amino acid-oxazole (18) or amino acid-thiazolecarboxylic acid resin (19) (1 equiv, 655 mol, 500 mg) was added a solution of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) (5 equiv, 3.28 mmol; 443 mg) and DIC (5 equiv, 3.28 mmol, 413 mg) in dry DMF (5 mL). After shaking at room temperature for 30 min, the R3 amine was added (10 equiv, 6.55 mmol) and the suspension further shaken for 16 h at room temperature. After aspirating the reaction solution, the resin was washed (3 times each DMF, MeOH, THF, DCM, diethyl ether) and sucked dry in a stream of air.
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • DIC equiv, 3.28 mmol, 413 mg
  • the product (20) or (21) was cleaved from the resin with a solution of 5% TFA in DCM for 1 h at room temperature.
  • the crude products can be recrystallized from ethyl acetate or ethyl acetate / petroleum ether or purified by flash chromatography on silica gel.
  • Boc-amino acid-thiazolecarboxylic acid (24) (1 equiv, 0.80 mmol) was treated with (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) (1:05 mmol, 0.84 mmol;
  • reaction solution was evaporated and the crude product was chromatographed on silica gel using a DCM-MeOH gradient.
  • the cultured otospheres were differentiated under adherent culture conditions on an ornithine / fibronectin surface to, the original sensory epithelium of similar single-layered epithelial islets.
  • Figure 2 shows a comparison of the situation in the native organ (in vivo) and in the differentiated epithelial islets of the cell culture (in vitro) using these markers.
  • the compound 2- [1-amino-2- (1H-indol-3-yl) -ethyl] -oxazole-4-carboxylic acid cyclohexylamide (3) according to the invention achieved both in terms of Sox2 expression and SrcfLZ incorporation. significantly positive results. Thus, it was demonstrated that it is capable of inducing the dedifferentiation and subsequent proliferation of otic supporting cells.
  • the optimal concentration range was determined, in which this compound unfolds its maximum regenerative biological effect in the cell culture.
  • the SroiLZ incorporation was detected in the stem cell-based in vitro cell culture assay at 4 concentrations between 0.3 ⁇ and 10 ⁇ in the culture medium. It was found that for the concentration 0.3 ⁇ no significant effect can be achieved. The mean at a concentration of 1 ⁇ but already increased. At a concentration of 3 ⁇ , the saturation level of approximately 9% BrdL / -positive cells is already reached ( Figure 5).
  • a form of organ culture was used in which the tissue to be cultured, in this case the entire inner ear of the mouse, in a rotating cylinder filled with culture medium (Hahn et al., 2008).
  • the Cochlea was previously opened basal and apical in the area of the scala tympani. This allowed the influence of gravity to be minimized, while at the same time achieving optimal gas and nutrient exchange between the tissue of the organ of Corti and the culture medium. Under these conditions, the explant could be maintained longer in culture compared to a stationary culture.
  • the support cells remaining after hair cell loss in the organ of Corti differentiate into progenitor cells and subsequently proliferate, a situation analogous to a hearing-impaired ear was created.
  • the ototoxic aminoglycoside antibiotic neomycin (1 mM) were cell death within 24 hours, 2/3 of all hair cells. Only in the apical areas of the cochlea survived some hair cells, whose number decreased in the course of the experiment by the initial damage on. After removing the neomycin from the medium, the remaining support cells could be further cultured.
  • Brdil was simultaneously administered with the compounds of the invention (5 ⁇ ) in the culture medium and the proliferation quantified by the SrdL-incorporation after 4 days.
  • the different morphology of the ßrdLZ-positive nuclei indicates different stages of mitosis, including complete cell division. Chromatin condensation was observed on different nuclei ( Figures 6D, E). At the same time, ßrdl / -positive nuclei were detected in immediate, relative proximity to each other ( Figures 6E, F).
  • BrdU was administered via drinking water or the miniosmotic pump to label proliferating cells in the organ of Corti.
  • Brc-labeled support cells and hair cells could be detected preferentially in the areas damaged by the noise trauma of the organ of Corti.
  • Example E Toxicity In the cell culture, organ culture and in vivo investigations, no evidence for a toxic effect of the aminoalkyl-oxazole and aminoalkyl-thiazolecarboxamides according to the invention was found for the investigated concentration range from 0.3 ⁇ to 200 ⁇ . pictures
  • Figure 1 Isolation and culture of stem cells from the mouse organ of Corti.
  • Stem cells from the inner ear can be obtained by isolating the cells of the postnatal Corti organ, isolated the stem cells still contained and cultured under selective conditions in a suspension culture. Under these conditions, spheres are formed that express the stem cell marker Sox2 ( ⁇ ' ), which is believed to play a major role in the pluripotency of embryonic stem cells and in the induction of pluripotent stem cells from differentiated cells (Takahashi and Yamanaka, 2006). In addition, the nuclei in the spheres incorporate BrdU (A " ), which indicates the proliferation of the cells.
  • Figure 2 In vivo and in vitro protein expression profile of hair and support cell markers.
  • p27 Kip1 is expressed in all the supporting cells of the organ of Corti. Neither inner nor outer hair cells are p27 K ' ; p, -positive. Within the epithelial islands a p27 K * "expression could be detected ( ⁇ ' ).
  • E-cadherin marks all support cells oriented laterally to the pillar cells. E-cadherin is also found in the membranes of the epithelial islands (C). Hair-sense cell markers such as myosin VIIA (D), myosin VI (E) and calretinin (F) in vivo reliably label inner and outer hair cells. All markers are also detectable in individual cells within the in vitro culture (D ' , E ' , F ' ).
  • the stars mark the outer 3 hair cells and the inner hair cell (always on the right).
  • Figure 4 Relative number of 8rdL positive cells in the screening assay.
  • the Brc / L / -positive cell nuclei were in different stages of mitosis or completely through cell division (D, E, F).
  • the BrdU label indicates regeneration based on cell division.
  • Tsonis PA (2002) Regenerative biology: the emerging field of tissue repair and restoration.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide, die die endogene Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen, Geweben und Sinnesepithelien beim Säuger in situ stimulieren. Die beanspruchten niedermolekularen Verbindungen sind in der Lage, entsprechende zellbiologische Veränderungen wie die Dedifferenzierung, die Proliferation und die nachfolgende terminale Redifferenzierung von Zellen des normalerweise postmitotischen Gewebes zu induzieren. Im Besonderen betrifft die Erfindung Verbindungen, mit denen durch eine Induktion der Zellteilung von Stützzellen des Innenohres eine de novo Bildung von Haarsinneszellen im Corti'schen Organ erreicht und das Hörvermögen nach Haarzellverlust wiederhergestellt werden kann. Die erfindungsgemäßen Verbindungen ermöglichen erstmals eine kausale Behandlung der beispielsweise durch Lärm, ototoxische Substanzen, Alterserscheinungen oder genetische Ursachen bedingten Innenohrschwerhörigkeit auf regenerationsbiologischer Grundlage. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, zu deren Formulierung (1) (2) als pharmazeutische Präparate sowie ihre Anwendung zur Herstellung von Arzneimitteln für die regenerative Medizin.

Description

Beschreibung
Neue Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide als regenerationsfördernde Substanzen für Sinnesorgane und postmitotische Gewebe
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäure- amide, die die endogene Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen, Geweben und Sinnesepithelien beim Säuger in situ stimulieren.
Die beanspruchten niedermolekularen Verbindungen sind in der Lage, entsprechende zellbiologische Veränderungen wie die Dedifferenzierung, die Proliferation und die nachfolgende terminale Redifferenzierung von Zellen des normalerweise postmitotischen Gewebes zu induzieren. Im Besonderen betrifft die Erfindung Verbindungen, mit denen durch eine Induktion der Zellteilung von Stützzellen des Innenohres eine de novo Bildung von Haarsinneszellen im Corti'schen Organ erreicht und das Hörvermögen nach Haarzellverlust wiederhergestellt werden kann.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, zu deren Formulierung als pharmazeutische Präparate sowie ihre Anwendung zur Herstellung von Arzneimitteln für die regenerative Medizin.
Stand der Technik
Einschränkungen in der Fähigkeit zu hören und somit zu kommunizieren, haben erhebliche Auswirkungen auf die Lebensqualität in nahezu allen beruflichen und sozialen Bereichen. Damit ist die Sinneserkrankung Schwerhörigkeit eines der vordringlichen gesundheitlichen Probleme in einer von Kommunikation abhängigen Gesellschaft.
Schwerhörigkeit betrifft im Durchschnitt etwa 10% der Bevölkerung in den Industrienationen. In Deutschland geht man heute von 16 Millionen Schwerhörigen, nahezu einem Fünftel der Gesamtbevölkerung, aus (ifo-lnstitut, 1986). Damit ist Schwerhörigkeit nicht nur die häufigste Erkrankung eines Sinnesorgans, sondern auch eine der häufigsten chronischen Erkrankungen überhaupt.
Betrachtet man die Ursachen für die Schwerhörigkeit, so leiden die Betroffenen in etwa 80% der Fälle an einer Schallempfindungsschwerhörigkeit. Einer der häufigsten Gründe hierfür ist der Verlust von sensorischen Haarsinneszellen im Corti'schen Organ, dem auditorischen Sinnesepi- thel, die aufgrund von Lärmexposition, Nebenwirkungen von ototoxischen Medikamenten, altersbedingter Degeneration oder genetischen Ursachen irreversibel durch Zelltod verloren gehen (Nadol, 1993). Für diese weitaus häufigste Form der Schwerhörigkeit kann bisher nur die prothetische Versorgung mit Hörgeräten angeboten werden. Das Ergebnis dieser Versorgung ist jedoch für die Betroffenen aufgrund der mangelnden Sprachverständlichkeit häufig unbefriedigend. Entsprechend werden Hörgeräte nur von einem relativ geringen Anteil der Schwerhörigen auch tatsächlich ge- nutzt.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existiert keine kurative medizinische Behandlungsmöglichkeit für die Hauptursache der Schallempfindungsschwerhörigkeit. Eine solche kausale Behandlung wäre nur durch den Ersatz bzw. die Regeneration der verlorenen Haarsinneszellen des Corti'schen Organs möglich.
In den meisten Organen und Geweben des Säugers ist die Fähigkeit zur Regeneration nach einer Schädigung eingeschränkt oder gar nicht vorhanden. Nur einige wenige Organe und Gewebe, wie beispielsweise die Leber, der Knochen oder die Haut besitzen über die gesamte Lebenszeit des Organismus die Fähigkeit zur spontanen Regeneration durch Neubildung von Zel- len. In vielen Fällen verlassen die entsprechenden Zellen in den hochspezialisierten Organen und Geweben (z.B. Herz, Gehirn, Skelettmuskel oder die Sinnesepithelien von Auge und Innenohr) den Zellzyklus irreversibel, um in einem terminal differenzierten Zustand zu verharren. Als Konsequenz haben diese Gewebe auch ihre Fähigkeit zu einer spontanen Regeneration beim Eintreten von schädigenden Ereignissen verloren. Dies führt entsprechend zu irreversiblen funk- tionellen Defiziten. So bedeuten beispielsweise ein Herzinfarkt für das Herz oder ein Schlaganfall für das Gehirn die häufig irreversible Schädigung der betroffenen Gewebeanteile mit entsprechend dauerhaften Funktionsverlusten.
Es gibt jedoch, beispielsweise bei Amphibien, Gewebe und Organe, wie die Beispiele von Retina oder Gliedmaßen zeigen, bei denen zwar eine terminale Differenzierung vorliegt, die aber trotz- dem zu einer spontanen in vivo Regeneration befähigt sind (Tsonis, 2000; Tsonis, 2002). Das zentrale zellbiologische Ereignis bei diesen Beispielen besteht in der zellulären Dedifferenzie- rung, die die Entstehung von multipotenten Vorläuferzellen erlaubt, aus denen durch Proliferation und Redifferenzierung regenerierte Zellen entstehen können.
Die Dedifferenzierung spielt also die entscheidende Rolle bei der Regeneration der terminal differenzierten Gewebe der Amphibien. Im Unterschied dazu zeigen andere Vertebraten geringere Fähigkeiten zur Regeneration.
Für das Hörorgan der Säuger und der Vögel ging man bis vor etwa 20 Jahren davon aus, dass die Haarsinneszellen im Innenohr nur während einer kurzen kritischen Phase der Embryonalentwicklung entstehen können (Rüben, 1967). Danach galten die Sinnesepithelien als postmito- tisch und damit nicht zur Regeneration ihrer Sinneszellen befähigt. Überraschenderweise wurde jedoch die Fähigkeit der Vogel-CocA?/ea zu spontaner Regeneration von Haarsinneszellen nach akustischem Trauma und ototoxischer Schädigung entdeckt (Cotanche 1987; Cruz etal., 1987).
Als grundlegender biologischer Mechanismus für die Haarsinneszellregeneration in der Vogel- Cochlea wurde die Zellteilung von direkt zu den zerstörten Haarsinneszellen benachbarten Stützzellen beschrieben (Corwin und Cotanche, 1988; Ryals und Rubel, 1988), wobei eine Population aus undifferenzierten Zellen entsteht, die in der Lage sind, sich zu neu gebildeten Haarsinneszellen und Stützzellen zu redifferenzieren. Hieraus resultiert die nahezu vollständige morphologische und funktionelle Erholung des Sinnesepithels beim Vogel (Cotanche, 1999; Smol- ders, 1999).
Obwohl zunächst naheliegend, ist es aufgrund grundsätzlicher zellbiologischer Unterschiede bis jetzt noch nicht gelungen, Erkenntnisse aus anderen Modellen auf den Säuger zu übertragen.
Entsprechende Experimente zur Haarsinneszellregeneration bei Säugern gaben keine (Rober- son und Rubel, 1994; Vago etal., 1998; Daudet etal., 1998; Daudet etal., 2002; Yamasoba et al., 2003) oder nur sehr geringe (Yamasoba und Kondo, 2006) Hinweise auf eine Fähigkeit zur spontanen Zellteilung von Stützzellen im Corti'schen Organ. Insbesondere gibt es, selbst nach der Anwendung von Wachstumsfaktoren, keinerlei Hinweise auf eine induzierbare Proliferation von Stützzellen im Corti'schen Organ (Staeckeret al., 1995; Daudet etal., 2002). Verschiedene Experimente an Kulturen von frühen Entwicklungsstadien des Corti'schen Organs embryonaler Mäuse zeigten nach definierter Laserschädigung ebenfalls nur einzelne proliferative Ereignisse (Kelley et al., 1995).
Dieses völlige Fehlen von Zellteilungen deutet darauf hin, dass die hochspezialisierten Stützzellpopulationen im normalen adulten Corti'schen Organ einen terminal differenzierten Zustand erreicht haben und nicht zum Wiedereintritt in den Zellzyklus befähig sind. Damit kann im Fall des Innenohres bereits ein einmaliges Schalltrauma zum Untergang von Haarsinneszellen füh- ren und den unausweichlichen sowie irreversiblen Verlust der Hörfunktion nach sich ziehen.
Seit kurzem ist bekannt, dass sich aus den in Regeneration befindlichen Geweben der Amphibien (z.B. Gliedmaßen) ein Extrakt gewinnen lässt, der in der Lage ist, auch bei Säugerzellen eine Dedifferenzierung zu induzieren (McGann etal., 2001 ). Damit lässt sich bei entsprechender Stimulation der auf der Dedifferenzierung basierende Mechanismus zur Regeneration terminal differenzierter Zellen von den Amphibien auf den Säuger übertragen (Odelberg, 2002). Bei den genannten Regenerationsextrakten handelt es sich jedoch um„Protein-Cocktails", deren Zusammensetzung nicht näher bekannt ist. Inzwischen ist es jedoch auch gelungen, mit einer definierten niedermolekularen Verbindung eine entsprechende Wirkung bei Muskelzellen des Säugers zu erzielen (Chen et al., 2004). Durch Screening-Untersuchungen konnten weiterhin mehrere niedermolekulare Verbindungen mit regenerationsbiologisch relevanten Effekten für verschiedene Zelltypen einschließlich Gliazellen identifiziert werden (Übersichten in Xu etal., 2008; Schugar etal., 2008; Feng etal., 2009; Li und Ding, 2009). Diese Effekte deuten darauf hin, dass auch bei weiteren Zelltypen durch geeignete niedermolekulare Verbindungen eine auf der Dedifferenzierung basierende Regeneration induziert werden kann (Tsonis, 2004; Kim etal., 2004; Odelberg, 2002).
Die Übertragung dieses Konzeptes auf regenerationsbiologische Untersuchungen im Innenohr ist bisher einzigartig. Es sind keine niedermolekularen Verbindungen bekannt oder patentiert, die eine Haarsinneszellregeneration im Innenohr bewirken könnten.
Auch andere Konzepte zur Regeneration von Haarsinneszellen im Corti'schen Organ, die nach dem heutigen Stand der Technik verfolgt werden, sind im Hinblick auf eine klinische Anwendung noch wenig erfolgversprechend.
Bei der Beeinflussung der Zellzyklusregulation von Stützzellen durch Ausschalten des Zellzyklusinhibitors p27Kip1 konnten in vivo zwar Zellteilungen erreicht werden (WO 99/42088). Die Differenzierung zu Haarsinneszellen wurde bisher jedoch nur unter in vitro Bedingungen außerhalb des Gewebekontextes beobachtet (White etal., 2006).
Die gentherapeutisch induzierte Transdifferenzierung von Stützzellen mit dem für die Haarsin- neszelldifferenzierung entscheidenden Transkriptionsfaktor Mathl führte in einem in vivo Modell mit induziertem Haarsinneszellverlust zur Konversion von Stützzellen zu Haarsinneszellen, sogar mit einer teilweisen funktionellen Erholung der Organfunktion (Izumikawa etal., 2005; Ka- wamoto etal., 2003). Allerdings resultierte die Reduzierung der Stützstellen in funktionellen Ein- schränkungen für das Corti'sche Organ, da ohne Stützzellen ein normaler Ablauf der komplexen Mikromechanik im Transduktionsprozess nicht denkbar ist.
Bei der Aktivierung endogener, im Organ residenter Progenitorstammzellen oder der exogenen Applikation heterologer Stammzellen in das Innenohr konnten vielversprechende Ergebnisse erzielt werden (Tateya etal., 2003; Naito etal., 2004; Martinez-Monedero etal., 2007a, b; Li etal., 2003). Eine gezielte oder funktionell relevante Transplantation von Stammzellen in das Innenohr konnte jedoch bisher noch nicht realisiert werden. Aufgabenstellung
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, niedermolekulare Verbindungen zu identifizieren, die eine endogene Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen, Geweben und Sinnesepithelien beim Säuger in situ stimulieren. Im Besonderen sollen diese Verbindungen die Wiederherstellung des Hörvermögens beim Säuger durch eine de novo Bildung von Haarsinneszellen im adulten Corti' sehen Organ ermöglichen. Auf der Basis dieser Verbindungen sollte erstmalig eine kausale Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit auf der Grundlage eines regenerationsbiologisch aktiven Arzneimittels ermöglicht werden.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Bekanntmachung neuer niedermolekularer Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide mit regenerationsfördernden Eigenschaften, wie sie im Anspruch 1 dargestellt sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verbindungen sind in Anspruch 2 deklariert. Die Ansprüche 3 bis 5 betreffen die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der medizinischen Therapie. Anspruch 6 betrifft Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäßen Verbindungen, und die Ansprüche 7 bis 8 betreffen pharmazeutische Präparate, enthaltend die erfindungsgemäßen Verbindungen sowie deren Herstellung. In den Ansprüchen 10 und 11 ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und pharmazeutischen Präparate zur Behandlung bestimmter Erkrankungen beim Säuger und in den An- Sprüchen 12 und 13 die entsprechenden Therapieverfahren offenbart.
Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass mit den erfindungs- gemäßen Verbindungen erstmals strukturell definierte chemische Wirkstoffe vorliegen, die eine Regeneration von terminal differenzierten Zellen beim Säuger, insbesondere von Haarsinneszellen im Innenohr des Säugers, bewirken können. Aus diesen Gründen hat die vorliegende Erfindung mit der Identifizierung von neuen, bisher nicht bekannten niedermolekularen Verbindungen, die in der Lage sind, regenerationsbiologisch relevante Vorgänge wie die Dedifferen- zierung, Proliferation und die daraus resultierende Regeneration von Zellen aus normalerweise postmitotischen Geweben zu stimulieren, ein Alleinstellungsmerkmal.
Die Erfindung beinhaltet weiterhin die Nutzung der regenerationsfördernden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen zur ursächlichen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit nach Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti'schen Organ bis hin zur vollstän- digen Wiederherstellung des Hörvermögens bei Mensch und Tier. Detaillierte Beschreibung
Aufgrund der komplexen Gewebestruktur im Innenohr erscheint unter den verschiedenen Verfahren der Regenerativen Medizin nur eine endogene Regeneration als Regeneration in situ denkbar. Voraussetzung für die Induktion dieser Regeneration bei den Haarsinneszellen ist die geeignete Stimulation des normalerweise hochdifferenzierten postmitotischen auditorischen Sinnesepithels. Zielzellen sind die Stützzellen, die den geschädigten Zellen direkt benachbart sind und als potentielle Vorläufer für eine Neubildung von Haarsinneszellen dienen können.
Obwohl aufgrund des aktuellen Standes der Technik anzunehmen ist, dass der regenerationsbiologische Mechanismus der Dedifferenzierung von Zellen durch bestimmte Wirkstoffe hervor- gerufen werden kann, ist es bisher nicht gelungen, entsprechende Verbindungen für die Regeneration im Innenohr zu identifizieren.
Die Fähigkeit organischer Verbindungen, eine regenerationsbiologisch relevante Wirkung im Innenohr auszulösen, ist zielstrukturabhängig und kann nicht präzise vorhergesagt werden. Ein entscheidender Faktor für die Erfolgsaussichten bei der biologischen Prüfung ist neben den potentiell wirksamen Strukturmerkmalen die Auswahl eines geeigneten Scaffolds mit Wirkstoffpotential in Abhängigkeit vom und mit Bezug zum Zielsystem.
Mittels umfangreicher Screening-Untersuchungen von Verbindungen mit potentiell regenera- tionsfördernden Eigenschaften aus verschiedenen Verbindungsklassen konnten überraschenderweise niedermolekulare Verbindungen identifiziert werden, die in der Lage sind, in vitro und in vivo entsprechende zellbiologische Veränderungen wie die Dedifferenzierung und die nachfolgende Proliferation otischer Stützzellen bis hin zur Regeneration von Haarsinneszellen zu induzieren. Mit einer Leitstrukturoptimierung konnten Strukturanaloga dieser Verbindungen entwickelt werden, die eine überragende regenerationsfördernde Wirksamkeit beim Säuger aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbon- säureamide nach den Formeln (1) und (2)
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sowie deren Verwendung als Wirkstoffe für die Stimulation der endogenen in situ Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen und Geweben, bevorzugt dem Gehirn, dem Herz, der Skelettmuskulatur, und besonders bevorzugt von Sinnesepithelien.
Dabei stehen
X für O oder S,
Y für C oder N, wobei beide Atome verschieden sein müssen,
R2 für Wasserstoff oder Acyl und
R1 und R3, die gleich oder verschieden sein können, für einen Substituenten aus den folgenden Gruppen:
verzweigte oder unverzweigte, substituierte oder unsubstituierte, optional Heteroatome enthaltende Alkylgruppen, Alkylcycloalkylgruppen, Alkylarylgruppen, Cycloalkylgruppen, Cycloalkylarylgruppen, Arylgruppen und Arylcycloalkylgruppen,
wobei R1 bevorzugt für (1 H-lndol-3-yl)-ethyl und R3 bevorzugt für Cyclohexyl steht. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft erfindungsgemäße Aminoalkyl-oxazol- und Amino- alkyl-thiazolcarbonsäureamide entsprechend den folgenden Formeln (3) bis (8).
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(3) (4)
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Diese Definitionen schließen pharmazeutisch akzeptable Salze (vorzugsweise nicht toxische und physiologisch verträgliche Salze), die Stereoisomere, Stereoisomeren-Gemische, alle Tautomere, Prodrug-Verbindungen, bevorzugt Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide, und Ge- mische der erfindungsgemäßen Verbindungen nach den Formeln (1) bis (8) ein.
Das Potential der erfindungsgemäßen niedermolekularen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl- thiazolcarbonsäureamide, bereits differenzierte Zellen zu dedifferenzieren, wurde in einem Zell- kultur-Assay an aus dem Innenohr der Maus isolierten Stammzellen mit otischem Entwicklungs- potential, die in Zellkultur zu, dem ursprünglichen Sinnesepithel möglichst ähnlichen Epithelinseln, differenziert wurden, nachgewiesen. Gegenüber der Kontrolle konnte durch Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen der Anteil Sox2-exprimierender Zellen, ein Stammzell- marker der auch während der Ontogenese des Corti'schen Organs exprimiert wird und als Zeichen zellulärer Dedifferenzierung gilt, mehr als verdoppelt werden. Mit einem Anteil von bis zu 7,4% BrdU (Bromdesoxyuridin) -positiven Zellen, als Zeichen für die zelluläre Proliferation, unterscheidet sich die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen signifikant von der der Diffe- renzierungs- und DMSO-Kontrollen, bei denen kein BrdU inkorporiert wird.
Somit konnte die überraschende biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, im Sinne der Stimulation von Dedifferenzierung und nachfolgender Proliferation differen- zierter otischer Zellen, im in vitro Modell nachgewiesen werden.
Die immuncytochemische Analyse der Stammzellmarker auf dem dedifferenzierten Epithel bestätigte die Annahme, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen nach ihrer Anreicherung im Zellkern zuerst eine Dedifferenzierung von differenzierten Zellen im Sinne einer Reprogrammie- rung induzieren, um anschließend deren Proliferation zu ermöglichen.
In dem Zellkulturmodell wurde durch eine Dosis-Wirkungs-Analyse für die erfindungsgemäßen Verbindungen der Konzentrationsbereich für eine effektive Wirksamkeit bezüglich der Proliferation im Rahmen von 0,1 μΜ bis 100 μΜ, bevorzugt von 1 μΜ bis 3 μΜ Substanz im Zellkulturmedium definiert. Vergleichbare Effekte wie im Zellkultur-Assay konnten auch in der in vitro Organkultur eines na- tiven Organs der Maus, d.h. im komplexen, zellulären Verband des Corti'schen Organs, erzielt werden. Nach ototoxischer Haarsinneszellschädigung durch das Aminoglykosid-Antibiotikum Neomycin führte die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen zur in situ Proliferation von verschiedenen Stützzellen im Corti'schen Organ, wie den im Bereich der äußeren Haarzellen liegenden lateral orientierten Deiterszellen (äußere Phalangenzellen) und äußeren Grenzzellen, den im Bereich der inneren Haarzellen liegenden inneren Phalangenzellen und inneren Grenzzellen sowie anderen Stützzellen, die als potentielle Vorläuferzellen für die Regeneration innerer Haarsinneszellen gelten. Im Detail konnten einzeln markierte Zellkerne in verschiedenen Stadien der Mitose bis hin zur vollständig durchlaufenen Zellteilung mit doppelt vorliegenden Zellkernen nachgewiesen werden.
Im in vivo Modell des adulten Meerschweinchens zeigten die immunhistochemischen Befunde darüber hinaus eine durch die erfindungsgemäßen Verbindungen induzierte Regeneration von Haarsinneszellen auf der Basis von Zellteilungen von Stützzellen, vorzugsweise in den durch Lärmtraumata geschädigten Bereichen des Corti'schen Organs. Bei entsprechenden Kontrolltieren und Kontrollorganen ohne Applikation der Verbindungen zeigten sich keine spontan regenerierten Haarzellen.
Toxische Effekte oder Unverträglichkeiten der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden bei den bisherigen in vitro und in vivo Tests in den relevanten Konzentrationsbereichen nicht be- obachtet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl- oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide, die erfindungsgemäß als Wirkstoffe für die Stimulation der endogenen in situ Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezi- alisierten Organen und Geweben, bevorzugt dem Gehirn, dem Herz, der Skelettmuskulatur, und besonders bevorzugt von Sinnesepithelien, eingesetzt werden können.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt in mehreren Stufen. Detaillierte Synthesevorschriften können dem Anwendungsbeispiel A entnommen werden. Die Ausgangsstoffe zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind bekannt und können im Fach- handel bezogen oder nach bekannten Vorschriften hergestellt werden.
Ein möglicher Weg ist die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen an einer festen Phase ausgehend von einem Aminosäureamid. Dazu wird die Aminosäure, deren Seitenkette den Substituenten R1 repräsentiert, an einem polymeren Träger mit aktivierter Kohlensäureester- Gruppe immobilisiert und anschließend ihre Säuregruppe amidiert. Die Cyclisierung des Amino- säureamides zum Oxazol bzw. des Aminosäurethioamides zum Thiazol erfolgt mit Brombrenz- traubensäure und Ν,Ν-Dimethylanilin. Bei Verwendung von Brombrenztraubensäureethylester muss die entstandene Ester-Gruppe nachträglich verseift werden. Für die Synthese der Thia- zole werden die Aminosäureamide vor der Cyclisierung mit Lawessons Reagenz in die entsprechenden Thioamide überführt. Die erhaltenen Aminosäure-oxazol-/Thiazolcarbonsäuren werden anschließend mit einem Amin, welches den Substituenten R3 repräsentiert, umgesetzt. Ab- schließend erfolgen die saure Abspaltung der Aminosäure-oxazol-/ Thiazolcarbonsäureamide vom Syntheseharz und die nachfolgende chromatographische Aufreinigung.
Bei einer weiteren Herstellungsvariante wird die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen in Lösung durchgeführt. Die Synthese erfolgt unter Anwendung der Schutzgruppen-Chemie ausgehend von einer Boc-geschützen Aminosäure mit der Seitenkette R1. Die Synthesestufen sind prinzipiell zu den für die feste Phase beschriebenen adäquat. Am Ende der Synthese erfolgen die saure Abspaltung der Boc-Schutzgruppe und die nachfolgende chromatographische Aufreinigung.
Beide Herstellungsverfahren erlauben sowohl die Synthese von racemischen als auch von enantiomerenreinen Verbindungen. Die Verbindungen werden entweder in freier Form oder als Salz, sofern salzbildende Gruppen enthalten sind, erhalten. Als Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind pharmazeutisch akzeptable Salze bevorzugt. Beispiele solcher Salze sind Salze anorganischer oder organischer Säuren, Salze anorganischer oder organischer Basen sowie Salze basischer oder saurer Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch als Prodrug-Verbindungen, vorzugsweise als Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide, oder ähnliches modifiziert werden. In bestimmten Fällen kann durch die Kupplung von die Zellpenetration fördernden Molekülen wie z.B. Biotin oder Maleimidopropionsäure, optional über geeignete Spacermoleküle, an die primäre Aminogruppe oder die Acylierung dieser Aminogruppe, entsprechend dem Substituenten R2, die Bioverfügbarkeit und damit die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen verbessert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl- oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide zur Herstellung pharmazeutischer Präparate für die Behandlung von Erkrankungen beim Säuger, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, insbesondere für die Behandlung der durch Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti'schen Organ bedingten Innenohrschwerhörigkeit beim
Säuger. Diese Präparate, enthaltend wenigstens einen erfindungsgemäßen Wirkstoff allein oder in Kombination, enthalten optional weitere pharmazeutisch geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe wie z.B. Trägersubstanzen, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Detergentien, Lösemittel, Lösevermittler, Salze zur Regulation des osmotischen Druckes und Puffersalze. Zusätzlich können sie weitere therapeutisch relevante Wirkstoffe, Adjuvantien sowie regenera- tionsfördernde Substanzen wie z.B. Wachstumsfaktoren oder Entzündungshemmer enthalten. Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in den einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
Die Effekte, die durch die erfindungsgemäßen Verbindungen hervorgerufen werden, sind auch abhängig von deren Formulierung. Entsprechende pharmazeutische Präparate sollten die direkte Applikation des Arzneimittels in die Cochlea des Säugers ermöglichen. Geeignete Applikationsformen für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate, enthaltend mindestens einen Wirkstoff nach den Formeln (1) und (2), können beispielsweise Lösungen, Suspensionen, Sprays, Gele, Hydrogele, Lotionen, Emulsionen, Pasten, Salben oder Cremes sein.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie in den einschlägigen Arzneibüchern beschrieben, z.B. durch Mischen, Granulieren oder Beschichtungsmethoden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate können zusätzlich sterilisiert werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide als regenerationsfördernde Wirkstoffe zur Behandlung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, bevorzugt zur Wiederherstellung des Hörvermögens nach Verlust oder Schädigung der Haarsinneszellen im Innenohr. Hierzu verabreicht man einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine therapeutisch effektive Menge eines erfindungsgemäßen regenerationsfördernd wirkenden Präparates, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung nach den Formeln (1.) und (2). Der Wirkstoff oder das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat werden dabei direkt oder indirekt (einschließlich sys- temisch), vorzugsweise lokal, unmittelbar auf/an die geschädigten Gewebestrukturen aufgetragen. Die Applikation an oder in das Innenohr erfolgt beispielsweise transtympanal durch Injektion in das Mittelohr, durch Auftragen an das runde oder ovale Fenster des Innenohres oder durch Injektion in das Innenohr. Hierbei können verschiedene Systeme zur Wirkstoffapplikation (Gelformulierungen, Pumpen) verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen und pharmazeutischen Präparate können allein, in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Verbindungen oder in Kombination mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die für die jeweilige beschriebene therapeutische Indikation der erfindungsgemäßen Verbindungen relevant sind, angewendet werden. Die zeitliche Abfolge der Applikation ist dabei nicht eingeschränkt. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann entweder zeit- gleich, vor oder nach den anderen Wirkstoffen, als separates Arzneimittel oder Kombinationspräparat und auf demselben oder unterschiedlichen Applikationswegen verabreicht werden. Die exakte therapeutisch effektive Menge für die Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit bei einem Subjekt hängt von verschiedenen Faktoren, unter anderem vom Umfang der Schädigung des Gewebes, von Größe, Statur, Alter und Gesundheitszustand des Patienten, von Applikationsweg und -form, der angewandten konkreten Verbindung und gegebenenfalls weiteren ver- wendeten Arzneimitteln ab. Somit ist es zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll, die exakte Menge zu spezifizieren. Jedoch kann man prinzipiell von einer mehrfachen Applikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate über einen Zeitraum von bis zu 8 Wochen in Abständen von einem bis sieben Tagen bis hin zu einer kontinuierlichen Applikation durch Systeme zur Wirkstoffdosierung, die über einen Mechanismus zur dauerhafte Abgabe verfügen„sustained release", ausgehen. Die eingesetzte Wirkstoffmenge sollte im Bereich von 0,5 pg bis 1 ,0 mg pro Innenohr und Applikation liegen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Regenerationsbiologisch relevante Verbindungen, die in der Lage sind, entsprechende zellbiologische Veränderungen wie Dedifferenzierung, Proliferation oder terminale Redifferenzierung zu induzieren, sowie deren Formulierungen stellen eine neue Form von Wirkstoffen dar, da es sich um ein völlig neues Therapiekonzept handelt.
Mit den erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamiden ist es erstmals gelungen, eine durch niedermolekulare Verbindungen induzierte Zellteilung von otischen Stützzellen und die daraus resultierende Regeneration von Haarsinneszellen im hoch- differenzierten postmitotischen Gewebe des Corti'schen Organs beim Säuger nachzuweisen. Bisher sind keine vergleichbaren Verfahren zur in vivo Regeneration von Haarsinneszellen auf der Basis von pharmazeutischen Wirkstoffen beschrieben.
Aufgrund der beobachteten Wirkprofile der erfindungsgemäßen Verbindungen sind diese als pharmazeutische Wirkstoffe zur kausalen therapeutischen Behandlung der Schallempfindungs- Schwerhörigkeit auf regenerationsbiologischer Grundlage geeignet. Dieser Behandlungsansatz ist allen anderen bisher diskutierten Verfahren wie Gentherapie oder Stammzelltransplantation grundsätzlich überlegen. Negative Einflüsse wurden in den bisherigen in vitro und in vivo Modellen nicht beobachtet. Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind.
Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Breite der Erfindung nicht ein. Ausführungsbeispiele
Beispiel A- Synthese von 2-[1-Amino-alkyl]-oxazol-4-carbonsäureamiden und
der entsprechenden 2-[1-Amino-alkyl]-thiazol-4-carbonsäureamide
Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte ausgehend von den Aminosäure- amiden unter Nutzung relevanter Publikationen zur Herstellung ähnlicher Verbindungen (Vide- nov et al., 1996; Stanchev etal., 1999; Stankova etal., 1999; Kaiser etal; 2000).
Sowohl die Zwischenstufen als auch die Endprodukte wurden mit HPLC und Massenspektrome- trie bezüglich ihrer Reinheit und Identität überprüft. Zusätzlich erfolgte die Charakterisierung der Endprodukte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Alle Ausgangsstoffe und Reagenzien sind kom- merziell erhältlich.
Im Folgenden ist ein Syntheseweg an einer festen Polymer-Phase, ausgehend von einem Ami- nosäureamid, beschrieben. Da ein Großteil der Synthesevorschriften identisch ist, wurden für die Oxazole und die Thiazole keine separaten Syntheseverfahren verwendet. Vorangestellt wurde exemplarisch die Synthese des Tryptophanamides (11) als Ausgangsstoff für die besonders bevorzugten Verbindungen (3) und (4).
Anschließend wurde ein alternativer Syntheseweg in Lösung, lediglich für die Thiazole, beschrieben. Für den geübten Fachmann stellt es jedoch keine Schwierigkeit dar, die Synthesebedingungen auf die Oxazole zu übertragen.
Für die variablen Substituenten wurden in den Versuchsbeschreibungen die Abkürzungen X, R1 und R3, die die gleiche Bedeutung wie in den Patentansprüchen haben, verwendet.
Die beschriebenen Synthesen ermöglichen die Darstellung der Verbindungen in stereochemisch reiner Form. Sie werden entweder in freier Form oder als Salz, sofern salzbildende Gruppen enthalten sind, erhalten.
Darstellung von D-Tryptophanamid (11)
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(9) (10) (11) N-Boc-D-Tryptophan (9) (1 Äquiv.; 2,75 mmol; 1 ,00 g), Hydroxybenzotriazolammoniumsalz (2 Äquiv.; 5,50 mmol; 924 mg) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) (1 ,1 Äquiv.; 3,03 mmol; 382 mg; 454 pL) wurden in über Molsieb getrocknetem Dimethylformamid (DMF) gelöst und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Nach Abfiltrieren von unlöslichen Rückständen wurde die organische Phase gewaschen (1 x 1 M KHS04-Lösung, 2 x gesättigte wässrige Natriumcarbonat-Lösung, 1 x gesättigte wässrige Natriumchlorid-Lösung), über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurde das Rohprodukt (10) in einer Lösung von 50% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) aufgenommen und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel wurde das Produkt (11) umkristallisiert.
Beladung von Chloro-(2'-chloro)trityl-Polystyrol-Harz (12) mit Aminosäureamid (13)
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Chloro-(2'-chloro)trityl-Polystyrol-Harz (12) (Rapp Polymere H 10033; Beladung 1 ,31 mmol/g) (1 Äquiv.; 655 pmol; 500 mg) wurde zweimal mit DMF (über Molsieb) gewaschen, mit einer Lösung des Aminosäureamid Hydrochlorids (13) (2 Äquiv.; 1 ,31 mmol) und von Diisopropyl- ethylamin (DIPEA) (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 424 mg) in DMF versetzt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Capping des Harzes wurde anschließend Methanol (MeOH) zu der Suspension gegeben und nochmals 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das beladene Harz (14) gewaschen (5 x DMF, je 3 x MeOH, Tetrahydrofuran (THF), Diethylether) und im Ölpumpenvakuum getrocknet.
Cyclisierung des immobilisierten Aminosäureamides (14) zum Oxazol (15)
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Brombrenztraubensäureethylester (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 640 mg; 412 pL) und N,N-Dimethyl- anilin (10 Äquiv.; 6,55 mmol; 794 mg; 832 pL) wurden in Dioxan (5 mL) gelöst und zu dem Ami- nosäureamid-Harz (14) (1 Äquiv.; 655 pmol; 500 mg) gegeben. Die Suspension wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt und dann 2 h auf 60°C erwärmt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt und das Harz mit trockenen Lösungsmitteln gewaschen (5 x DMF, 5 x DCM).
Eine auf -20°C gekühlte Lösung von Pyridin (10Äquiv.; 6,55 mmol; 520 mg; 530 pL) in trockenem DCM (5 mL) wurde mit Trifluoressigsäureanhydrid (5Äquiv.; 3,28 mmol; 688 mg; 456 pL) gemischt und zu dem gewaschenen Harz gegeben. Nach 30 min bei -20°C wurde die Suspension auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das Harz (15) gewaschen (je 3 x DMF, MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet.
Darstellung von immobilisierten Thioamiden (16) mit Lawessons Reagenz
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(14) (16)
Das Aminosäureamid-Harz (14) (1 Äquiv.; 655 pmol; 500 mg) wurde mit einer Lösung von Lawessons Reagenz (3 Äquiv.; 1 ,97 mmol; 797 mg) in Dimethoxyethan (DME) (10 mL) versetzt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das Harz (16) gewaschen (6 x DMF, je 3 x MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet.
Cyclisierung des immobilisierten Thioamides (16) zum Thiazol (17)
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Brombrenztraubensäureethylester (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 640 mg; 412 pL) und N,N-Dimethyl- anilin (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 397 mg; 416 pL) wurden in DMF (4 mL) gelöst und zu dem Amino- säure-Thioamid-Harz (16) (1 Äquiv.; 655 pmol; 500 mg) gegeben. Die Suspension wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das Harz Q7) gewaschen (je 3 x DMF, MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet. Die Identität und Reinheit des Reaktionsproduktes (17) wurden nach einer Testabspaltung mit 5% TFA in DCM über 1 h bei Raumtemperatur chromatographisch und massenspektrome- trisch überprüft. Verseifung der immobilisierten Ethylester (15) und (17)
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X=0, S
(15) / (17) (18) / (19)
Das Aminosäure-oxazol- (15) bzw. Aminosäure-thiazolcarbonsäureethylester-Harz (17) (1 Äquiv.; 655 μιηοΙ; 500 mg) wurde in THF (2,5 mL) vorgequollen und mit einer Lösung von Lithiumhydroxid Monohydrat (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 137 mg) in Wasser (1 ,25 mL) und MeOH (1 ,25 mL) versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung abgesaugt, das Harz (18) bzw. (19) gewaschen (je 3 x Wasser, Wasser/ DMF 1 :1 , DMF, Dioxan, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet.
Amidierung der Carbonsäuren (18) und (19) und Abspaltung vom Harz
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X= O, S (18) / (19) (20) / (21)
Zu dem Aminosäure-oxazol- (18) bzw. Aminosäure-thiazolcarbonsäure-Harz (19) (1 Äquiv.; 655 mol; 500 mg) wurde eine Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 443 mg) und DIC (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 413 mg) in trockenem DMF (5 mL) gegeben. Nach 30 min Schütteln bei Raumtemperatur wurde das R3-Amin zugegeben (10 Äquiv.; 6,55 mmol) und die Suspension 16 h bei Raumtemperatur weiter geschüttelt. Nach Absaugen der Reaktionslösung wurde das Harz gewaschen (je 3 x DMF, MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im Luftstrom trocken gesaugt.
Anschließend wurde das Produkt (20) bzw. (21) mit einer Lösung von 5% TFA in DCM über 1 h bei Raumtemperatur vom Harz abgespalten.
Nach dem Eindampfen der Abspaltlösungen wurde das Rohprodukt aus tBuOH / Wasser 4:1 lyophilisiert und über Kieselgel mit einem DCM-MeOH-Gradienten chromatographiert. Darstellung der Thioamide (23) mit Lawessons Reagenz in Lösung
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(22) (23)
Zu einer Lösung des Boc-Aminosäureamides (22) (1 Äquiv.; 1 ,00 mmol) in trockenem DME (7,5 mL) wurde unter Rühren Lawessons Reagenz (0,75 Äquiv.; 750 μπιοΙ; 305 mg) gegeben. Die Reaktionslösung wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel nachfolgend am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (30 mL) aufgenommen und mit 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (15 mL) 30 min kräftig gerührt. Nach Trennung der Phasen wurde die wässrige Phase zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden dreimal mit 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösungsmittel abdestilliert und das Produkt (23) im Ölpumpen- vakuum getrocknet.
Die Rohprodukte können aus Ethylacetat bzw. Ethylacetat / Petrolether umkristallisiert oder per Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt werden.
Cyclisierung der Thioamide (23) zum Thiazol (24) in Lösung
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(23) (24)
Zu einer Lösung des Boc-Aminosäurethioamides (23) (1 Äquiv.; 0,80 mmol) in wasserfreiem Ethanol (6 mL) wurde Calciumcarbonat (2 Äquiv.; 1 ,60 mmol; 161 mg) gegeben und die Suspension 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Brombrenztraubensäure (1 ,5 Äquiv.; 1 ,20 mmol; 201 mg) zugegeben. Nach 4 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert und der Rückstand mit Ethanol nachgewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat (10 mL) aufgenommen und dreimal mit 10 mL 5%iger Kaliumhydrogensulfat- Lösung sowie einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösungsmittel abdestilliert und das Produkt (24) im Ölpumpenvakuum getrocknet.
Die Rohprodukte wurden per Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Amidierung des Thiazols (24) und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe in Lösung
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(24) (25)
Die Boc-Aminosäure-thiazolcarbonsäure (24) (1 Äquiv.; 0,80 mmol) wurde mit (Benzotriazol- 1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphat (PyBOP) (1 ,05 Äquiv.; 0,84 mmol;
437 mg) und Triethylamin (TEA) (3 Äquiv.; 2,40 mmol; 242 mg; 330 μΙ_) in THF versetzt und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das R3-Amin (1 ,3 Äquiv.; 1 ,04 mmol) zugegeben und 18 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktionslösung wurde eingedampft und das Rohprodukt mit einem DCM-MeOH-Gra- dienten über Kiesegel chromatographiert.
Zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurden das Amid in 25% TFA in DCM über 1 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingedampft. Zu dem Rohprodukt wurde mehrfach Heptan zugegeben und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck wieder abdestilliert. Das Produkt (25) wurde anschließend aus tBuOH / Wasser 4:1 lyophilisiert.
N-Acetylierung von 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3)
Figure imgf000020_0002
(3)
(4)
Das Aminoalkyl-oxazolcarbonsäureamid (3) (1 Äquiv.; 28 pmol; 10 mg) wurde mit Acetanhydrid (5 Äquiv.; 140 pmol; 14 mg; 13 μΐ_) und TEA (2Äquiv.; 56 pmol; 6 mg; 8 μΙ_) in DCM (0,5 mL) versetzt und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde anschließend eingedampft und das Rohprodukt (4) aus tBuOH / Wasser 4:1 lyophilisiert. Beispiel B - Nachweis der regenerativen Eigenschaften im in vitro Zellkultur-Assay
Zunächst wurden in einer Suspensionskultur typische zelluläre Cluster„Sphären", ausgehende von aus dem postnatalen Corti'schen Organ der Maus isolierten Stammzellen mit otischem Entwicklungspotential, gezüchtet. Unter im Vergleich zu bekannten Verfahren (Oshima et al., 2007; Senn et al., 2007) optimierten Kulturbedingungen in einem mit B27 und N2 supplementierten DMEM I F12-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium), konnten aus der Stammzellkultur unter Zugabe von FGF (fibroblast growth factor) und IGF (insulin-like growth factor) ca. 1.600 solide Sphären pro Corti'sches Organ generiert werden (Abbildung 1 C).
Durch Markierungen auf Proteinebene (Abbildung 1A) und den Nachweis von mehreren Stamm- zellmarkern auf mRNA-Ebene (Abbildung 1 B) wurde gezeigt, dass sich die unter diesen Kulturbedingungen gebildeten Otosphären in einem dedifferenzierten Zustand befinden, der einem früheren Zustand während der Ontogenese im Corti'schen Organ entspricht. Darüber hinaus können Zellteilungen in den Otosphären nachgewiesen werden. Stützzellen sind in situ die potentiellen Vorläufer für eine Regeneration von Haarsinneszellen und damit die eigentlichen Zielzellen für die Induktion einer Haarsinneszellregeneration. Zu diesem Zweck war es erforderlich, in vitro eine gemeinsame Kultur von Haar- und Stützzell-ähnlichen Zellen zu etablieren, die das Corti'sche Organ in seiner zellulären Zusammensetzung möglichst gut repräsentiert.
Dazu wurden in einem zweiten Schritt die kultivierten Otosphären unter adhärenten Kulturbedingungen auf einer Ornithin / Fibronektin Oberfläche zu, dem ursprünglichen Sinnesepithel möglichst ähnlichen, einschichtigen Epithelinseln differenziert.
Durch immuncytochemischen Nachweis konnten auf Proteinebene je drei geeignete Stütz- und Haarsinneszellmarker identifiziert werden. In Abbildung 2 ist ein Vergleich der Situation im nati- ven Organ (in vivo) und in den differenzierten Epithelinseln der Zellkultur (in vitro) anhand dieser Marker zum dargestellt.
Diese mit den bisher bekannten Methoden und ohne Zusatz der erfindungsgemäßen Verbindungen durchgeführten Voruntersuchungen zeigten, dass die kultivierten otischen Epithelinseln als zelluläre Basis für den Nachweis des regenerativen Potentials der erfindungsgemäßen Verbindungen bei Stützzell-ähnlichen Zellen des Innenohrs geeignet sind. Zum Nachweis der Effekte, die durch die applizierten Substanzen vermittelt werden, kann die Veränderung der Protein- Expression von Stütz-, Haar-, und Stammzellmarkern herangezogen werden. Für das Screening wurde zum einen der Anteil Sox2-positiver Zellen in der in vitro Kultur bestimmt. Sox2 ist ein Stammzellmarker, der auch während der Ontogenese des Corti'schen Or- gans exprimiert wird. Ihm wird eine tragende Rolle in der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen und bei der Induktion von pluripotenten Stammzellen aus differenzierten Zellen zugeschrieben (Takahashi und Yamanaka, 2006). Dies macht Sox2, insbesondere im Kontext einer induzierten Dedifferenzierung/ Reprogrammierung von Zellen, zu einem wichtigen Marker. Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4- carbonsäure-cyclohexylamid (3) zu der Zellkultur konnte der Anteil Sox2-exprimierender Zellen gegenüber der Differenzierungs-Kontrolle mehr als verdoppelt werden (Abbildung 3).
Ob die durch die Verbindungen induzierte Expression von Stammzellmarkern letztlich auch mit einer erhöhten Proliferation der Zellen in Kultur einhergeht, wurde durch die Quantifizierung der erdü-positiven Zellen geprüft. Dabei wurde die Kultur während der Substanzapplikation für 5 h mit dem Thymidin-Analogon BrdU inkubiert. Zellteilung führt während der S-Phase des Zellzyklus zur Inkorporation von BrdU. Regt eine der Substanzen zu Zellteilungen an, lässt sich dies mit einem gegen BrdU gerichteten Antikörper detektieren und visualisieren.
Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1 -Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4- carbonsäure-cyclohexylamid (3) zu der Zellkultur konnte bei 4,8% der zuvor differenzierten Zellen eine Proliferation induziert werden (Abbildung 4).
Die erfindungsgemäße Verbindung 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure- cyclohexylamid (3) erzielte sowohl bezüglich der Sox2-Expression als auch der SrcfLZ-lnkorpora- tion signifikant positive Ergebnisse. Damit wurde der Nachweis erbracht, dass sie in der Lage ist, die Dedifferenzierung und nachfolgende Proliferation von otischen Stützzellen zu induzieren.
In einer Dosis-Wirkungs-Analyse wurde der optimale Konzentrationsbereich ermittelt, in dem diese Verbindung ihre maximale regenerationsbiologische Wirkung in der Zellkultur entfaltet. Hierzu wurde die SroiLZ-lnkorporation in dem Stammzell-basierten in vitro Zellkultur-Assay bei 4 Konzentrationen zwischen 0,3 μΜ und 10 μΜ im Kulturmedium erfasst. Es zeigte sich, dass für die Konzentration 0,3 μΜ kein signifikanter Effekt erzielt werden kann. Der Mittelwert bei einer Konzentration von 1 μΜ aber bereits erhöht ist. Ab einer Konzentration von 3 μΜ wird bereits das Sättigungsniveau von ca. 9% BrdL/-positiven Zellen erreicht (Abbildung 5). Beispiel C - Nachweis der regenerativen Eigenschaften im in vitro Organkulturmodell
Zur Bestätigung der im Zellkultur-Assay beobachteten Effekte im nativen Organ, d.h. in situ im komplexen zellulären Verband des Corti'schen Organs, wurde eine Form der Organkultur genutzt, bei der sich das zu kultivierende Gewebe, in diesem Fall das gesamte Innenohr der Maus, in einem rotierenden, mit Kulturmedium gefüllten Zylinder befindet (Hahn etal., 2008). Die Cochlea wurde zuvor basal und apikal im Bereich der scala tympani eröffnet. Dadurch konnte der Einfluss der Schwerkraft minimiert und gleichzeitig ein optimaler Gas- und Nährstoffaustausch zwischen dem Gewebe des Corti'schen Organs und dem Kulturmedium erreicht werden. Unter diesen Bedingungen konnte das Explantat im Vergleich zu einer stationären Kultur länger in Kultur erhalten werden.
Zum Nachweis, dass durch die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen die nach Haarsinneszellverlust im Corti'schen Organ verbleibenden Stützzellen zu Vorläuferzellen de- differenzieren und nachfolgend proliferieren, wurde eine Situation analog einem schwerhörigen Ohr geschaffen. Nach Applikation des ototoxischen Aminoglykosid-Antibiotikums Neomycin (1 mM) fanden innerhalb von 24 Stunden 2/3 aller Haarsinneszellen den Zelltod. Lediglich in den apikalen Bereichen der Cochlea überlebten einige Haarsinneszellen, deren Anzahl im Versuchsverlauf durch die initiale Schädigung weiter abnahm. Nach Entfernung des Neomycins aus dem Medium, konnten die verbliebenen Stützzellen weiter kultiviert werden.
Anschließend wurde Brdil gleichzeitig mit den erfindungsgemäßen Verbindungen (5 μΜ) in das Kulturmedium appliziert und die Proliferation durch die SrdL-lnkorporation nach 4 Tagen quantifiziert.
Nach Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4- carbonsäure-cyclohexylamid (3) zu der Organkultur konnte in den am weitesten lateral orientier- ten Deiterszellen eine ßrdL/-lnkorporation nachgewiesen werden (Abbildung 6B). Dies traf auch für einzelne innere Phalangen- und Grenzzellen zu (Abbildung 6C), die mit der inneren Haarsinneszelle assoziiert sind und als potentielle Vorläuferzellen für deren Regeneration angesehen werden können. In Kontrollexperimenten ohne Substanzapplikation erfolgte keine spontane Inkorporation von Brdil innerhalb der Deiters-, inneren Phalangen- und inneren Grenzzellen (Abbildung 6A).
Die unterschiedliche Morphologie der ßrdLZ-positiven Zellkerne deutet auf verschiedene Stadien der Mitose, bis hin zur vollständig durchlaufenen Zellteilung, hin. An verschiedenen Kernen konnte eine Chromatin-Kondensation beobachtet werden (Abbildungen 6D, E). Gleichzeitig wurden ßrdl/-positive Kerne in unmittelbarer, relativer Nähe zueinander nachgewiesen (Ab- bildungen 6E, F).
Dies bedeutet, dass im Sinnesepithel des Corti'schen Organs durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) neue Zellen im Sinne einer Regeneration durch Zellteilung von Stützzellen entstanden sind. Beispiel D - Nachweis der regenerativen Eigenschaften nach in vivo Applikation
Die regenerationsbiologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde ebenfalls im in vivo Modell des adulten Meerschweinchens nachgewiesen. Durch Impulslärm wurde eine akute Lärmschädigung verursacht, die in einem Verlust von Haarsinneszellen des Corti'schen Organs, insbesondere im Bereich der äußeren Haarsinneszellen resultierte. Anschließend erfolgte die kontinuierliche lokale Applikation der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2- (1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) aus einer subkutan implantierten miniosmotischen Pumpe (Alzet®) via Choleostomie direkt in die scala tympani der Cochlea. Die Substanz in der Pumpe wurde mit 200 μΜ entsprechend höher dosiert, da ein Verdünnungs- effekt in der Perilymphe zu erwarten war.
Die Applikation erfolgte über einen Zeitraum von 6 Wochen mit einem sich anschließenden Warteintervall von 2 Wochen. Parallel wurde BrdU über das Trinkwasser oder die miniosmo- tische Pumpe verabreicht, um proliferierende Zellen im Corti'schen Organ zu markieren.
Nach Entnahme des Corti'schen Organs erfolgte die immunhistochemische Dreifach-Markierung mit BrdU (Zellteilung), Myosin VI (Haarsinneszellen) und DAPI (Kernfärbung) (Abbildung 7) sowie mit Sox2 (pluripotente Stützzellen).
ßrc y-markierte Stützzellen und Haarsinneszellen konnten vorzugsweise in den durch das Lärmtrauma geschädigten Bereichen des Corti'schen Organs nachgewiesen werden. In Kontrollorganen der Gegenseite mit/ohne Lärmschädigung und ohne Substanzapplikation waren keine BrdL/-markierten Haarsinneszellen und insgesamt, entsprechend den bekannten Befunden zur Spontanproliferation, nur wenige SrdU-markierte Zellen nachweisbar.
Die in vivo Befunde zeigen eindeutig, dass durch die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) eine Re- generation von Haarsinneszellen auf der Basis von Zellteilungen auch im adulten Tier induziert werden kann. Dies unterstreicht das überraschend große Potential der erfindungsgemäßen Verbindungen als Wirkstoff zur kausalen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit durch die Regeneration von Haarsinneszellen.
Beispiel E -Toxizität In den Zellkultur-, Organkultur- und in vivo Untersuchungen ergaben sich für den untersuchten Konzentrationsbereich von 0,3 μΜ bis 200 μΜ, keine Hinweise auf eine toxische Wirkung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide. Abbildungen
Abbildung 1 Isolation und Kultivierung von Stammzellen aus dem Corti'schen Organ der Maus.
(A) Stammzellen aus dem Innenohr lassen sich gewinnen, indem man die Zellen des postnatalen Corti'schen Organs vereinzelt, die noch enthaltenen Stammzellen isoliert und unter selektiven Bedingungen in einer Suspensionskultur kultiviert. Unter diesen Bedingungen bilden sich Sphären aus, die den Stammzellmarker Sox2 exprimieren (Α'), dem eine tragende Rolle in der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen und bei der Induktion von pluripotenten Stammzellen aus differenzierten Zellen zugeschrieben wird (Takahashi und Yamanaka, 2006). Außerdem inkorporieren die Zellkerne in den Sphären BrdU (A"), das die Proliferation der Zellen anzeigt.
(B) In den Sphären werden mehrere Stammzellmarker exprimiert, die sich auch während der Ontogenese im Corti'schen Organ nachweisen lassen. Als Positiv- Kontrolle (pos) wurde die mRNA aus einem Corti'schen Organ vom embryonalen Entwicklungstag 14,5 aufgetragen. Normiert auf das Haushaltsgen GAPDH konnte gezeigt werden, dass sowohl im entstehenden Innenohr als auch in den daraus isolierten Stammzellen Jag1, Nestin, Sox2 und Nanog exprimiert werden.
(C) Mit optimierten Methoden konnte, im Vergleich zur aktuell publizierten Literatur (Oshima et al., 2007; Senn et al., 2007), der Anteil der aus der Primärkultur gebildeten Sphären verdoppelt werden.
Abbildung 2 In vivo und in vitro Protein-Expressionsprofil von Haar- und Stützzellmarkern.
(A) p27Kip1 wird in allen Stützzellen des Corti'schen Organs exprimiert. Weder innere noch äußere Haarsinneszellen sind p27K';p,-positiv. Innerhalb der epithelialen Inseln konnte eine p27K*"-Expression nachgewiesen werden (Α').
(B) G P-Markierung bei Stützzellen im Corti'schen Organ unmittelbar unter den Kernen der Deiterszellen sowie im Bereich der inneren Phalangenzellen. Auch in vitro wurde das Muster der Filamente nachgewiesen (Β').
(C) E-Cadherin markiert alle Stützzellen, die lateral zu den Pfeilerzellen orientiert sind. E-Cadherin befindet sich auch in den Membranen der epithelialen Inseln (C). Haarsinneszellmarker wie Myosin VIIA (D), Myosin VI (E) und Calretinin (F) markieren in vivo zuverlässig innere und äußere Haarsinneszellen. Alle Marker sind auch in einzelnen Zellen innerhalb der in vitro Kultur nachweisbar (D', E', F').
Die Sterne markieren im nativen Organ jeweils die 3 äußeren Haarsinneszellen und die innere Haarsinneszelle (immer rechts).
Skalierung: 20 μπι in den Bildern des naiven Corti'schen Organs (A-F),
10 pm in der Zellkultur (A'-F'). Abbildung 3 Relative Anzahl von Zellen mit Sox2-Expression im Screening-Assay.
Es wurde untersucht, welche der niedermolekularen Verbindungen eine Erhöhung des Anteils Sox2-positiver Zellen (als Marker für die Dedifferenzierung von Zellen, normiert auf das Niveau der Differenzierungs-Kontrolle) induzieren konnten.
Sieben Verbindungen unterscheiden sich signifikant von der Kontrolle (p < 0,05, n = 10).
Abbildung 4 Relative Anzahl 8rdL-positiver Zellen im Screening-Assay.
Durch den Nachweis von Brdil kann quantifiziert werden, wie viele Zellen innerhalb eines bestimmten Zeitraums in die S-Phase des Zellzyklus eingetreten sind. Im Screening wurden die Zellen für fünf Stunden mit Brdil inkubiert.
Dargestellt ist der Anteil von Zellen in der Gesamtpopulation, die durch Substanzapplikation zur Proliferation angeregt wurden.
Acht Verbindungen konnten eine signifikante Proliferation induzieren (p < 0,05, n = 10).
Abbildung 5 Dosis-Wirkungs-Analyse für 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbon- säure-cyclohexylamid (3) (Substanz 33).
In der Adhäsionskultur wurde die Dosis-Abhängigkeit des induzierten ßrdl -Effek- tes überprüft. Bei Erhöhung der Substanzkonzentration im Kulturmedium von 0,3 μΜ auf 3 μΜ stieg die ßrc/LZ-lnkorporation auf ein signifikant höheres Niveau (p < 0,05, n = 10). Mit höheren Konzentrationen konnte die BrdU-\ nkorporation nicht weiter gesteigert werden. Die Kontrolle, eine Population von Zellen aus der in vitro Kultur mit einer vergleichbaren Menge DMSO ohne Substanzapplikation, vermittelte keinen Effekt.
Abbildung 6 Durch 2-[1-Amino-2-(1 H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3)
(Substanz 33) induzierte BrdU nkorporation im Organkultur-Modell.
Durch ß«/L/-lnkorporation wurde der Umfang der induzierten Proliferation von Stützzellen nachgewiesen.
In der Kontrolle ohne Substanzapplikation wurde in den Deiters-, den inneren Phalangen- und den Grenzzellen keine BrdUA nkorporation festgestellt (A). Nach Appli- kation der erfindungsgemäßen Verbindung (3) (Substanz 33, 5 μΜ) wurde in lateral orientierten Deiterszellen (B) sowie in einzelnen inneren Phalangen- sowie inneren Grenzzellen (C) BrdU inkorporiert.
Die Brc/L/-positiven Zellkerne befanden sich in verschiedenen Stadien der Mitose bzw. hatten die Zellteilung vollständig durchlaufen (D, E, F).
Skalierung: 20 pm. Abbildung 7 Dreifach-Markierung nach intracochleärer Applikation von 2-[1-Amino-2-(1 H-indol- 3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) in vivo.
Im in vivo Experiment am adulten Meerschweinchen wurde die regenerative Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen unter realen Bedingungen nachgewiesen (Applikation über 6 Wochen durch Alzet®-Pumpe (200 μΜ) parallel mit SrdL/ (100 mg/mL), Organentnahme und Färbung nach 8,5 Wochen). Dargestellt sind mit Myosin VI (Marker für Haarsinneszellen) und BrdU (Marker für Zellteilung) markierte innere Haarsinneszellen. Der Zellkern ist mit DAPI (Kernfärbung) markiert.
Die Markierung mit BrdU zeigt die Regeneration auf Basis einer Zellteilung an.
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Claims

Patentansprüche
1. Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide nach den Formeln
Figure imgf000030_0001
wobei
X für O oder S,
Y für C oder N, wobei beide Atome verschieden sein müssen,
R2 für Wasserstoff oder Acyl und
R1 und R3, die gleich oder verschieden sein können, für einen Substituenten aus den folgenden Gruppen stehen:
verzweigte oder unverzweigte, substituierte oder unsubstituierte, optional Heteroatome enthaltende Alkylgruppen, Alkylcycloalkylgruppen, Alkylarylgruppen, Cycloalkyl- gruppen, Cycloalkylarylgruppen, Arylgruppen und Arylcycloalkylgruppen,
wobei R1 bevorzugt für (1 H-lndol-3-yl)-ethyl und R3 bevorzugt für Cyclohexyl steht, oder
ein pharmazeutisch akzeptables Salz, ein Stereoisomer, ein Stereoisomeren-Gemisch, ein Tautomer oder eine Prodrug-Verbindung, bevorzugt ein Prodrug-Ester oder ein Prodrug-Peptid, davon.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 ausgewählt aus der Gruppe
Figure imgf000031_0001
oder
ein pharmazeutisch akzeptables Salz, ein Stereoisomer, ein Stereoisomeren-Gemisch, ein Tautomer oder eine Prodrug-Verbindung, bevorzugt ein Prodrug-Ester oder ein Prodrug-Peptid, davon.
3. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 zur Verwendung für jedweden medizinischen Zweck, bevorzugt als Medikament für verschiedene Indikationen in der Human- und Veterinärmedizin.
4. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 als regenerationsför- dernder Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei Einwirkung einer therapeutisch effektiven Menge auf das geschädigte Gewebe von hochspezialisierten Organen und Geweben, bevorzugt dem Gehirn, dem Herz, der Skelettmuskulatur, und besonders bevorzugt von Sinnesepithelien, die endogene in situ Regeneration des normalerweise postmitotischen Gewebes durch regenerationsbiologische Wirkungen wie Dedifferenzierung, Proliferation und nachfolgende Redifferenzierung von terminal differenzierten Zellen stimuliert.
5. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 als regenerationsför- dernder Wirkstoff zur Regeneration der otischen Sinnesepithelien beim Säuger, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei Einwirkung einer therapeutisch effektiven Menge die endogene in situ Regeneration geschädigter und verlorener Haarsinneszellen im Corti'schen Organ durch regenerationsbiologische Wirkungen wie Dedifferenzierung, Proliferation und nachfolgende Redifferenzierung von Stützzellen im Innenohr stimuliert.
6. Verfahren zur Herstellung der Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäure- amide nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Cyclisierung zum Oxazol bzw. Thiazol und deren nachfolgende Amidierung ausgehend von einer natürlichen oder unnatürlichen zu amidierenden Aminosäure an fester Phase oder unter Verwendung der Boc-Schutzgruppen-Chemie in Lösung erfolgt.
7. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine therapeutisch effektive Menge mindestens eines Aminoalkyl-oxazol- oder Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamides nach einem der Ansprüche 1 und 2 allein oder in Kombination, optional weitere regenerationsfördernde oder anderweitig therapierelevante Wirkstoffe sowie weitere pharmazeutisch geeignete Inhaltsstoffe wie z.B. Trägersubstanzen, Hilfs- und Zusatzstoffe, Detergentien, Adjuvantien und andere.
8. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer für die direkte (lokale) oder indirekte (einschließlich der systemischen) Applikation auf/an das geschädigte Gewebe bzw. auf/in die Cochlea des Säugers geeigneten Formulierung, bevorzugt als Lösung, Suspension, Spray, Gel, Hydrogel, Lotion, Emulsion, Paste, Salbe oder Creme vorliegt.
9. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates nach den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestandteile vermischt und/oder in Lösung bringt und/oder mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert.
10. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur kausalen Behandlung von Erkrankungen beim Säuger, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, auf regenerationsbiologischer Grundlage durch unmittelbare oder mittelbare Applikation einer therapeutisch effektiven Menge auf/an die geschädigten Gewebestrukturen.
11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur kausalen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit und Wiederherstellung des Hörvermögens beim Säuger nach Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti'schen Organ auf regenerationsbiologischer Grundlage durch unmittelbare oder mittelbare Applikation einer therapeutisch effektiven Menge auf/an die geschädigten Gewebestrukturen in der Cochlea.
12. Verfahren zur kausalen Behandlung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, auf regenerationsbiologischer Grundlage, dadurch gekennzeichnet, dass eine therapeutisch effektive Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 unmittelbar, vorzugsweise lokal, auf/an die geschädigten Gewebestrukturen aufgetragen oder mittelbar, vorzugsweise systemisch, verabreicht wird.
13. Verfahren zur kausalen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit und zur Wiederherstellung des Hörvermögens von Menschen und Tieren nach Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti'schen Organ auf regenerationsbiologischer Grundlage, dadurch gekennzeichnet, dass eine therapeutisch effektive Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 unmittelbar oder mittelbar auf/an die geschädigten Gewebestrukturen in der Cochlea, vorzugsweise transtympanal durch Injektion in das Mittelohr, durch Auftragen an das runde oder ovale Fenster des Innenohres oder durch Injektion in das Innenohr appliziert wird.
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