CN107417770A - 一种艾替班特的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种艾替班特的制备方法,包括以下步骤:采用固相合成法,在偶联试剂2‑氰基‑2‑(2‑硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯存在下,以X‑Arg(pbf)‑Wang树脂为起始树脂,按照艾替班特氨基酸序列,逐一延伸偶联具有N端保护的氨基酸,每次延伸偶联后均得到对应的树脂肽,最终合成得到艾替班特‑Wang树脂肽,再经裂解、纯化得到艾替班特。本发明的方法减小了杂质D‑Thi6‑艾替班特和D‑Ser7‑艾替班特的生成,提高了产品的收率和纯度,且操作简单,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法,具体涉及一种艾替班特的制备方法。
背景技术
遗传性血管水肿(hereditary angioedema,HAE)是一种罕见的常染色体显性遗传病。多数患者的病因是位于染色体11q上的C1酯酶抑制基因发生变异,导致C1酯酶抑制因子减少或功能缺陷。这些抑制因子的作用是调节部分免疫系统和凝血途径的功能,其功能减弱可引起快速而严重的面部或身体其他部位肿胀,从而导致永久性面部损毁、残障或死亡。此外,消化道水肿可以引起剧烈腹痛、恶心和呕吐,而呼吸道水肿则有窒息危险。HAE在人群中的发病率为1/150000至1/10000。
醋酸艾替班特,英文名:Icatibant Acetate,商品名:Firazyr,是一种对缓激肽B2受体选择性的竞争性拮抗剂,亲和力与缓激肽相似,主要用于治疗遗传性血管水肿(HAE)的急性发作。该药物最初由Sanofi开发,2001年11月Jerini公司(Shire)获得艾替班特的开发权。2008年9月首次在德国和英国上市,2009年3月在欧盟上市,2011年10月在美国上市,其结构式如下:
氨基酸序列:H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH
结构式说明:
1)艾替班特氨基酸序列中Hyp代表L-羟脯氨酸,Thi代表3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸,Tic代表1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸,Oic代表L-八氢吲哚-2-羧酸;
2)序列中第1位和第8位氨基酸为D-构型,其余氨基酸为L-构型。现有的艾替班特的制备方法仍旧主要沿用1990年左右,由德国赫切斯特股份公司发明的固相合成方法,该方法制得的艾替班特产品纯度低、杂质含量高、收率低,不适合产业化生产,应用价值低。
申请号为201210028377.9专利报道了直接固相合成艾替班特的方法,采用2-氯三苯基氯树脂为起始载体,但由于该树脂在接肽过程中容易发生肽链脱落,直接影响艾替班特的总收率。
申请号为201410209368.9专利报道了一种通过液相合成片段Boc-D-Arg-Arg-OH.2HCl,然后采用固相合成法,以王树脂为起始树脂,按照艾替班特主链肽序依次偶联具有N段Fmoc保护且侧链保护的氨基酸,最后两个氨基酸采用偶联上述Boc保护的片段。该方法虽然使得粗品肽纯度有一定程度的提高,但合成方法相对复杂,且采用的偶联试剂均为常规偶联试剂,在氨基酸偶联过程中,不能更好地抑制氨基酸的消旋,导致消旋肽杂质D-Thi6-艾替班特和D-Ser7-艾替班特偏大。
有关杂质D-Thi6-艾替班特和D-Ser7-艾替班特的氨基酸序列分别如下:
D-Thi6-艾替班特:H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-D-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH
D-Ser7-艾替班特:H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-D-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH
这两个杂质在液相中的保留时间与主峰艾替班特相近,与主峰分离十分困难,该杂质的存在严重影响艾替班特含量以及使用安全。因此迫切需要开发一种可有效抑制氨基酸消旋的艾替班特制备方法,使其消旋肽杂质D-Thi6-艾替班特和D-Ser7-艾替班特达到优质标准级别0.2%以下。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种合成艾替班特的方法,该方法即可显著提高艾替班特的收率,又可降低消旋肽杂质D-Thi6-艾替班特和D-Ser7-艾替班特的生成。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种合成艾替班特的方法,包括以下步骤:
步骤1、采用固相合成法,在偶联试剂和有机溶剂存在下,以X-Arg(pbf)-Wang树脂为起始树脂,按照艾替班特氨基酸序列,逐一延伸偶联具有N端保护的氨基酸,每次延伸偶联后均得到对应的树脂肽,最终合成得到艾替班特-Wang树脂肽。
步骤2、将艾替班特-Wang树脂肽裂解得到艾替班特。
其中,步骤1中所述X是氨基酸N端保护基,优选Fmoc。
步骤1中每次延伸偶联时,所述N端保护的氨基酸和对应树脂肽的摩尔比为3-5:1,优选3:1。
步骤1中所述N端保护的氨基酸是指具有N端Fmoc保护的氨基酸,优选具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸,更优选Fmoc-Oic-OH、Fmoc-D-Tic-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thi-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH。
步骤1中所述偶联试剂为2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯或2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯与N,N’-二异丙基乙胺(DIPEA)的混合物。
步骤1中所述偶联试剂和对应树脂肽的摩尔比为3~5:1,优选3:1。
步骤1中所述有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)或其混合溶剂,优选DMF。
步骤1中所述树脂肽在参与偶联反应前,需先进行脱保护,优选在六氢吡啶/DMF混合溶液中进行脱保护,更优选在20%六氢吡啶/DMF混合溶液进行脱保护。脱保护反应的温度一般为20℃~40℃,优选27℃~33℃。
步骤1中所述偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点。
步骤2中所述裂解是采用由三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、余量为水组成的混合酸解液;优选由体积百分比为90-97%的三氟乙酸(TFA)、体积百分比为1-5%的三异丙基硅烷(TIS)、余量为水组成的混合酸解液酸解;更优选采用由体积百分比为95%的三氟乙酸(TFA)、体积百分比为2.5%的三异丙基硅烷(TIS)、余量为水组成的混合酸解液。
所述混合酸解液用量为每克艾替班特树脂需要10ml~20ml,优选15ml~20ml。
所述裂解的时间优选为室温条件下1~6小时,更优选为3~4小时。
进一步地,本发明所述合成艾替班特的方法,还包括将艾替班特进行纯化、换盐、冻干的步骤。
其中,所述纯化采用高效液相色谱纯化,具体为高效液相色谱的色谱填料为10μm的反相C18,流动相为0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH3.0)-乙腈溶液,流速为280ml/min,采用梯度系统洗脱,循环进样纯化。
所述换盐采用高效液相色谱换盐,具体为高效液相色谱法的色谱填料为10μm的反相C18,流动相为0.1%乙酸水溶液-乙腈-0.1mol/L乙酸铵水溶液,流速为300ml/min,采用梯度洗脱,循环上样方法。
本发明的另一目的在于提供一种偶合试剂2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯的制备方法。
2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯的结构式如下:
本发明所述偶合试剂2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯的制备方法,包括,在卤代烃作反应溶剂,叔胺作碱条件下,将2-肟氰乙酸乙酯与2-硝基苯磺酰氯反应制得。
其中,所述卤代烃选自二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷,优选二氯甲烷。
所述叔胺选自三乙胺、吡啶、N,N’-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP),优选N,N’-二异丙基乙胺。
所述2-肟氰乙酸乙酯与2-硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1.0~1.2,优选1:1.05~1.10。
所述2-肟氰乙酸乙酯与叔胺的摩尔比为1:1.0~1.3,优选1:1.1~1.2。
本发明所述2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯偶合试剂的制备方法,包括将2-肟氰乙酸乙酯溶于二氯甲烷,降温至-10℃~0℃,加入DIPEA;然后在0℃以下,将2-硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液滴加至上述溶液中,滴毕,室温反应1~6小时,二氯甲烷/正己烷(2:1)混合液重结晶。
本发明的有益效果如下:
1)可显著提高艾替班特的收率,收率达到70%以上。
2)可有效降低消旋肽杂质D-Thi6-艾替班特和D-Ser7-艾替班特的产生,使其控制在0.2%以下。
3)偶合试剂2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯安全高效,使用后可再生利用,绿色环保,环境友好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明,但决非限制本发明,本发明也并非仅局限于实施例的内容。
在本发明具体实施方式中,所述2-肟氰乙酸乙酯和2-硝基苯磺酰氯购自于国药医药集团,所用氨基酸购自于苏州天马生物有限公司,所用树脂购自于天津南开和成有限公司。
说明书和权利要求书中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1 英文缩写释义
实施例1:偶合试剂2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯(o-NosylOXY)的合成
称取56.8g 2-肟氰乙酸乙酯(0.4mol)加入到盛有600ml二氯甲烷的2L三口瓶中,氮气保护下开启搅拌,降温至-10℃~0℃,加入56.8g DIPEA(0.44mol)。称取92.6g 2-硝基苯磺酰氯(0.42mol),用200ml二氯甲烷溶解,然后控温在0℃以下,将其缓慢滴加至上述溶液中,滴毕,转至室温,继续搅拌反应1小时,TLC检测反应完全(展开剂:正己烷/乙酸乙酯=2:1),饱和食盐水洗3次(500ml*3次),有机层用无水硫酸钠干燥2小时,过滤,滤液旋干,二氯甲烷/正己烷(2:1)混合液重结晶,过滤得白色固体82g,产率144%。
实施例2:树脂肽2的合成(Fmoc-Oic-OH偶联)
称10g Fmoc-Arg(Pbf)-Wang Resin(取代度0.5mmol/g)投入到500ml玻璃反应瓶中,加入100ml DMF,溶胀树脂,氮气鼓泡30~35分钟,抽干溶剂。向玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行茚三酮法检测,树脂呈蓝色。
称6.22g Fmoc-Oic-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100ml DMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。茚三酮法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽2,Fmoc-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例3:树脂肽3的合成(Fmoc-D-Tic-OH偶联)
向盛放有树脂肽2的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行二级胺法检测,树脂呈蓝色。
称6.35g Fmoc-D-Tic-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100ml DMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应2-2.5小时。二级胺法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽3,Fmoc-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例4:树脂肽4的合成(Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联)
向盛放有树脂肽3的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行二级胺法检测,树脂呈蓝色。
称6.10g Fmoc-Ser(tBu)-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100mlDMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应2-2.5小时。二级胺法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽4,Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例5:树脂肽5的合成(Fmoc-Thi-OH偶联)
向盛放有树脂肽4的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行茚三酮法检测,树脂呈蓝色。
称6.26g Fmoc-Thi-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100ml DMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。茚三酮法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽5,Fmoc-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例6:树脂肽6的合成(Fmoc-Gly-OH偶联)
向盛放有树脂肽5的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行茚三酮法检测,树脂呈蓝色。
称4.73g Fmoc-Gly-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100ml DMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。茚三酮法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽6,Fmoc-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例7:树脂肽7的合成(Fmoc-Hyp(tBu)-OH偶联)
向盛放有树脂肽6的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行茚三酮法检测,树脂呈蓝色。
称6.51g Fmoc-Hyp(tBu)-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100mlDMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。茚三酮法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽7,Fmoc-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例8:树脂肽8的合成(Fmoc-Pro-OH偶联)
向盛放有树脂肽7的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行二级胺法检测,树脂呈蓝色。
称5.36g Fmoc-Pro-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100ml DMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。二级胺法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽8,Fmoc-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例9:树脂肽9的合成(Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联)
向盛放有树脂肽8的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行二级胺法检测,树脂呈蓝色。
称10.32g Fmoc-Arg(Pbf)-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100mlDMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。二级胺法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽9,Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例10:树脂肽10的合成(Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH偶联)
向盛放有树脂肽9的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,脱保护反应过程中水浴温度控制在27℃~33℃。反应结束后向玻璃反应瓶中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行茚三酮法检测,树脂呈蓝色。
称10.32g Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、5.25g o-NosylOXY和3.4g DIPEA,用100mlDMF溶解,于室温环境中搅拌反应20分钟,得到活化后的氨基酸溶液,将上述活化液加入到玻璃反应瓶中,氮气鼓泡下反应1.5-2小时。茚三酮法检测反应终点,树脂不变色即视为偶合完全。反应结束后,抽干溶剂,树脂依次用100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml异丙醇、100ml DMF、100ml DMF、100ml DMF洗涤。每次洗涤,保持氮气鼓泡4~5分钟后再抽干溶剂。洗涤完毕后得树脂肽10,Fmoc-D-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-Wang树脂。
实施例11:艾替班特树脂肽的合成
向盛放有树脂肽10的玻璃反应瓶中加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应5~6分钟,抽干溶剂,再加入100ml 20%六氢吡啶/DMF混合溶液,氮气鼓泡下反应20~25分钟,抽干溶剂,向反应器中加入100ml DMF,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂并将此步骤再重复三次。取样进行茚三酮法检测,茚三酮检测试剂呈蓝色。再向反应瓶中加入100ml无水乙醚,氮气鼓泡下洗涤4~5分钟,抽干溶剂,将此步骤再重复三次,得艾替班特树脂肽。
实施例12:艾替班特粗品的合成
取实施例11制得的艾替班特树脂肽,加入体积百分比为95%的TFA、体积百分比为2.5%的TIS、余量为水组成的混合酸解液(混合酸解液15ml/g艾替班特树脂),搅拌均匀,室温搅拌反应3小时,反应混合物使用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量TFA洗涤3次,合并滤液后,控温在0℃以下,滴加至1.5L无水乙醚中,滴毕,转至室温,静止沉淀过夜,抽干,固体用无水乙醚洗涤,得类白色粉末即为艾替班特粗品,粗品纯度81.7%,其中,消旋肽杂质D-Thi6-艾替班特含量0.03%、D-Ser7-艾替班特含量0.02%。
实施例13:艾替班特粗品纯化
将制得的艾替班特粗品10g溶解后配制成约20mg/ml的乙腈和水的混合液(乙腈:水=15:85,v:v),溶液用0.45μm微孔滤膜过滤,纯化备用;
采用高效液相色谱法进行纯化,纯化用色谱填料为10μm的反相C18,流动相系统为0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH3.0)-乙腈溶液,100mm*250mm的色谱柱流速为280ml/min,采用梯度系统洗脱,循环进样纯化,取粗品溶液上样于色谱柱中,启动流动相洗脱,收集主峰蒸去乙腈后,得艾替班特纯化中间体浓缩液。
取艾替班特纯化中间体浓缩液,用0.45μm滤膜滤过备用;
采用高效液相色谱法进行换盐,流动相系统为0.1%乙酸水溶液-乙腈-0.1mol/L乙酸铵水溶液,色谱填料为10μm的反相C18,100mm*250mm的色谱柱流速为300ml/min,采用梯度洗脱,循环上样方法,取滤膜过滤后的样品上样于色谱柱中,启动流动相洗脱,采集图谱,观测吸收度的变化,收集换盐主峰并用分析液相检测纯度,合并换盐主峰溶液,减压浓缩,得到艾替班特醋酸水溶液,冷冻干燥,得艾替班特纯品7.5g,收率为75%,分子量:653.25(100%[M+2H]2+),纯度:99.7%,最大单杂0.05%。
Claims (15)
1.一种艾替班特的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:采用固相合成法,在偶联试剂和有机溶剂存在下,以X-Arg(pbf)-Wang树脂为起始树脂,按照艾替班特氨基酸序列C端到N端的顺序,逐一延伸偶联具有N端保护的氨基酸,每次延伸偶联后均得到对应的树脂肽,最终合成得到艾替班特-Wang树脂肽;
步骤2:将艾替班特-Wang树脂肽裂解得到艾替班特。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中所述X是氨基酸N端保护基,优选Fmoc。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中每次延伸偶联时,所述N端保护的氨基酸和对应树脂肽的摩尔比为3~5:1,优选3:1。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中所述N端保护的氨基酸是指具有N端Fmoc保护的氨基酸,优选具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸,更优选Fmoc-Oic-OH、Fmoc-D-Tic-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thi-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH。
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中所述偶联试剂为2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯或2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯与N,N’-二异丙基乙胺的混合物。
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中所述偶联试剂和对应树脂肽的摩尔比为3~5:1,优选3:1。
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或其混合溶剂,优选二甲基甲酰胺。
8.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1中所述树脂肽在参与偶联反应前,先进行脱保护,优选在六氢吡啶/DMF混合溶液中进行脱保护,更优选在20%六氢吡啶/DMF混合溶液进行脱保护;脱保护反应的温度为20℃~40℃,优选27℃~33℃。
9.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤2中所述裂解是采用由三氟乙酸、三异丙基硅烷、余量为水组成的混合酸解液;优选由体积百分比为90-97%的三氟乙酸、体积百分比为1-5%的三异丙基硅烷、余量为水组成的混合酸解液酸解;更优选采用由体积百分比为95%的三氟乙酸、体积百分比为2.5%的三异丙基硅烷、余量为水组成的混合酸解液。
10.根据权利要求1所述方法,其特征在于,还包括将艾替班特进行纯化、换盐、冻干的步骤,优选采用高效液相色谱进行纯化和换盐。
11.根据权利要求5所述方法,其特征在于,所述偶联试剂2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧亚胺)乙酸乙酯是在卤代烃作反应溶剂,叔胺作碱条件下,将2-肟氰乙酸乙酯与2-硝基苯磺酰氯进行反应制得。
12.根据权利要求11所述方法,其特征在于,所述卤代烃选自二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷,优选二氯甲烷。
13.根据权利要求11所述方法,其特征在于,所述叔胺选自三乙胺、吡啶、N,N’-二异丙基乙胺或4-二甲氨基吡啶,优选N,N’-二异丙基乙胺。
14.根据权利要求11所述方法,其特征在于,所述2-肟氰乙酸乙酯与2-硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1.0~1.2,优选1:1.05~1.10。
15.根据权利要求11所述方法,其特征在于,所述2-肟氰乙酸乙酯与叔胺的摩尔比为1:1.0~1.3,优选1:1.1~1.2。
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