CN114790228B - 一种抗皮肤衰老环六肽类化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗皮肤衰老环六肽类化合物及其制备方法，涉及多肽及其衍生物合成技术领域。该环六肽类化合物其结构通式如式I或式II所示：
式中n独立选自0或自然数。本发明制备的抗皮肤衰老环六肽类化合物具有更佳的皮肤修复功效，其抗皱效果显著增强；同时具有更优的皮肤屏障增强功效，能够更好地应用于化妆品领域。
Description
技术领域
本发明属于多肽及其衍生物合成技术领域，具体涉及一种抗皮肤衰老环六肽类化合物及其制备方法。
背景技术
皮肤是覆盖于整个体表的一个重要的而且是最大的一个器官，它是人体内部器官和组织的保护者，同时，也是内部器官、精神与周围环境的效应器官，对人体的健康和美丽起着尤为重要的作用。在皮肤自然老化的防御和护理过程中，活性生物多肽也起着独特而重要的生理作用，如皮肤组织细胞的增殖、细胞趋化与迁移、修复与再生、血管形成与重建、色素形成与清除以及蛋白合成与分泌、代谢与调控等。
多肽，尤其是一些小分子多肽由于无毒、易被皮肤吸收、吸收后所具有的特殊生理活性作用，能由表及里在本质上改善皮肤的某些问题，现已被广泛应用于美容化妆品配方中。目前市面上具有各种各样的化妆品或护肤品，但大多数护肤品只添加某一类功效的多肽作为护肤品的功效活性物，因此皮肤获得的效果较单一，且见效慢；再者，目前市面上的大部分以多肽为活性功效物的护肤品，都是将多肽或者多肽原液直接添加在常规护肤品基质中，基于对整个配方的制作和稳定性考虑，多肽的添加量会受到局限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗皮肤衰老环六肽类化合物及其制备方法，该六肽类化合物具有更佳的皮肤修复功效，其抗皱效果显著增强；同时具有更优的皮肤屏障增强功效，能够更好地应用于化妆品领域。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种抗皮肤衰老环六肽类化合物，其结构通式如式I所示：
式中，
n独立选自0或自然数；
R1、R2独立选自H、(CH2)mCOOA1、(CH2)mCONA2A3，(CH2)mSA4中的一种，m独立选自0或自然数；所述A1、A2、A3、A4独立选自H，未取代或取代的C6-30芳基、C2-18杂芳基、C1-24烷基、C3-24环烷基、C3-10杂环烷基、C2-24链烯基、C5-24环烯基、C2-24炔基、C8-24环炔基中的一种；所述取代是被OH、NH2、COOH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基、杂芳基中任一个或任多个所取代；
R3、R4、R5、R6、R7、R8独立选自H，OH，未取代或取代的C6-30芳基、C2-18杂芳基、C1-24烷基、C3-24环烷基、C3-10杂环烷基、C2-24链烯基、C5-24环烯基、C2-24炔基、C8-24环炔基中的一种；所述取代是被OH、NH2、COOH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基、杂芳基中任一个或任多个所取代。本发明先制备得到一系列的链状六元多肽，具有良好的皮肤修复效果，均具能够促进collalb基因的表达，提升I型胶原蛋白生成量，进而增强皮肤的光滑度，抗皱效果显著；并且具有良好的促进FLG基因表达的功效，能够促进丝聚蛋白的形成，提升角质层水分维持能力，改善皮肤角质层状态，从而有效增强皮肤屏障功能。接着将链状六元多肽通过成环反应得到相应系列环六肽类化合物，其皮肤修复效果更佳，具有更优的促collalb基因表达能力，显著提升其促胶原蛋白形成的功效，能够更好地改善皮肤状态，起到更佳的抗皱效果；同时制备的系列环状六肽类化合物具有更优的促FLG基因表达能力，显著提升其促相关蛋白形成的功效，能够更好地改善皮肤角质层状态，起到更佳的增强皮肤屏障的功效。本发明制备的抗皮肤衰老环六肽类化合物在化妆品领域具有巨大的应用前景。
本发明还公开了一种抗皮肤衰老环六肽类化合物，其结构通式如式II所示：
式中，
n独立选自0或自然数；
R1、R2独立选自H、(CH2)mCOOA1、(CH2)mCONA2A3，(CH2)mSA4中的一种，m独立选自0或自然数；所述A1、A2、A3、A4独立选自H，未取代或取代的C6-30芳基、C2-18杂芳基、C1-24烷基、C3-24环烷基、C3-10杂环烷基、C2-24链烯基、C5-24环烯基、C2-24炔基、C8-24环炔基中的一种；所述取代是被OH、NH2、COOH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基、杂芳基中任一个或任多个所取代；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10独立选自H，OH，未取代或取代的C6-30芳基、C2-18杂芳基、C1-24烷基、C3-24环烷基、C3-10杂环烷基、C2-24链烯基、C5-24环烯基、C2-24炔基、C8-24环炔基中的一种；所述取代是被OH、NH2、COOH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基、杂芳基中任一个或任多个所取代。
进一步的，n选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12中的一种。
需要说明的是，当n为0代表羰基直接与五元环或六元环连接。
进一步的，m选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24中的一种。
进一步的，R1与R2相同。
进一步的，R1与R2选自选自H、(CH2)mCOOH、(CH2)mCONH2中的一种，m独立选自0或自然数。
进一步的，m选自1或2；n选自0或1。
进一步的，R3与R8相同，和/或R4与R7相同，和/或R5与R6相同。
优选地，R3与R8相同，R4与R7相同，R5与R6相同。
进一步的，R4与R7选自H或OH。
进一步的，R3与R10相同和/或R4与R9相同，和/或R5与R8相同，和/或R6与R7相同。
优选地，R3与R10相同，R4与R9相同，R5与R8相同，R6与R7相同。
优选地，抗皮肤衰老环六肽类化合物结构如式IV所示：
更优选地，抗皮肤衰老环六肽类化合物结构如式V所示：
本发明还公开了上述抗皮肤衰老环六肽类化合物的制备方法，包括：先合成链状六元多肽，然后通过成环反应制得环六肽类化合物。
进一步的，上述抗皮肤衰老环六肽类化合物的制备方法，具体包括：
采用多肽域常规合成方法制备得到链状的全保护六元多肽；
取全保护六元多肽溶于有机溶剂中，在催化体系条件下搅拌反应形成环六肽；
取环六肽进行切割、纯化即得抗皮肤衰老环六肽类化合物。
进一步的，上述多肽域常规合成方法包括固相合成法或液相合成法，涉及操作均为本领域技术人员常规理解。
进一步的，所述催化体系包括DIC、HOBt和DIEA。
本发明的又一目的在于，提供了上述抗皮肤衰老环六肽类化合物在制备化妆品中的用途。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明制备的一系列抗皮肤衰老环六肽类化合物，具有更优的皮肤修复效果，在化妆品领域具有巨大的应用前景。该抗皮肤衰老环六肽类化合物促collalb基因表达能力显著提升，能够显著增强胶原蛋白的形成，起到更佳的抗皱效果；同时制备的系列环状六肽类化合物具有更优的促进FLG基因表达的能力，进而显著提升其促相关蛋白形成的功效，更好地改善皮肤角质层状态，表现出更佳的增强皮肤屏障的功效。
因此，本发明提供了一种抗皮肤衰老环六肽类化合物及其制备方法，该六肽类化合物具有更佳的皮肤修复功效，其抗皱效果显著增强；同时具有更优的皮肤屏障增强功效，能够更好地应用于化妆品领域。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的环六肽类化合物E1的高效液相色谱图；
图2为本发明实施例1制备的环六肽类化合物E1的质谱图；
图3为本发明实施例1～8制备的环六肽类化合物促collalb基因表达的测试结果；
图4为本发明实施例9～16制备的环六肽类化合物促collalb基因表达的测试结果；
图5为本发明实施例1～8制备的环六肽类化合物促FLG基因表达的测试结果；
图6为本发明实施例9～16制备的环六肽类化合物促FLG基因表达的测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E1的合成：
S1：将CTC树脂(6.3g，6.25mmol)置于125mL的固相合成反应器中，加入氨基酸Fmoc-Gly-OH(3.72g，12.5mmol)，加入二氯甲烷(DCM)60mL，在加入DIEA(4.35mL)，25℃条件下反应3小时，加入甲醇6.25mL，反应5分钟；过滤，将树脂用二氯甲烷(DCM)60mL洗涤2次，甲醇60mL洗涤2次，DMF 60mL洗涤2次；加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待用；
S2：取Fmoc-Pro-OH(5.06g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待用；
S3：取Fmoc-Gln(Trt)-OH(9.16g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待用；
S4：取Fmoc-Gly-OH(4.46g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待用；
S5：取Fmoc-Pro-OH(5.06g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，甲醇65mL洗涤2次，DCM溶液65mL洗涤2次，甲醇65mL洗涤2次；
S6：取Fmoc-Gln(Trt)-OH、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，进行下一步反应；加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待进行下一步；
S7：真空干燥，加入1％的TFA/DCM溶液200mL，30℃条件下搅拌反应30分钟，过滤，除去树脂，得到滤液；滤液拉干得到全保护多肽H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH；
S8：将全保护多肽用二氯甲烷(DCM)1.4L溶解，加入DIC(1.54mL，10mmol)，HOBt(1.35g，10mmol)，DIEA(1.74mL，10mmol)，在30℃条件下搅拌反应14小时，形成Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，浓缩除去DCM，进行下一步；
S9：将Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))用TFA/TIS/H2O＝90/5/5(70mL)切割2.5
小时，将切割液加入到700mL叔丁基甲醚(4℃)溶液中，析出白色固体，离心，得到白色固体粗肽；将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)；经过反相C18制备色谱纯化，冻干后得到精品Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)(高效液相色谱如图1所示)，其化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.50、4.39(m，4H，CH)，4.10～4.15(dd，4H，CH2)，3.62、3.45、2.27、1.98～2.15(12H，CH2)，2.01～2.10(8H，CH2)。如图2所示，HRMS(ESI):Calcd forC24H36N8O8，m/z[M+H]+，565.0。
实施例2：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E2的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pro-Asn-Gly-Pro-Asn)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.72、4.34(m，4H，CH)，4.05～4.10(dd，4H，CH2)，3.57、3.48、2.35、1.90～2.10(12H，CH2)，2.75、2.43(m，4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd forC22H32N8O8，m/z[M+H]+，537.2。
实施例3：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E3的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pro-Glu-Gly-Pro-Glu)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.45、4.40(m，4H，CH)，4.13～4.18(dd，4H，CH2)，3.57、3.40、2.34、2.01～2.19(12H，CH2)，2.41、2.09(，8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd forC24H34N6O10，m/z[M+H]+，567.0。
实施例4：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E4的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Asp)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.87、4.46(m，4H，CH)，4.09～4.13(dd，4H，CH2)，3.55、3.41、2.33、1.92～2.10(12H，CH2)，2.94、2.59(m，4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd forC22H30N6O10，m/z[M+H]+，539.2。
实施例5：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E5的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Hyp-Gln-Gly-Hyp-Gln)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.47、4.41、4.10(m，6H，CH)，4.11～4.17(dd，4H，CH2)，3.79、3.50、2.52、2.28(8H，CH2)，2.00～2.05(8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C24H36N8O10，m/z[M+H]+，597.3。
实施例6：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E6的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Hyp-Asn-Gly-Hyp-Asn)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.85、4.44、4.13(m，6H，CH)，4.09～4.13(dd，4H，CH2)，3.75、3.48、2.49、2.25(8H，CH2)，2.74、2.50(4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C22H32N8O10，m/z[M+H]+，569.2。
实施例7：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E7的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Hyp-Glu-Gly-Hyp-Glu)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.41、4.37、4.08(m，6H，CH)，4.08～4.11(dd，4H，CH2)，3.74、3.52、2.51、2.24(8H，CH2)，2.37、2.04(8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C24H34N6O12，m/z[M+H]+，599.2。
实施例8：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E8的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Hyp-Asp-Gly-Hyp-Asp)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.85、4.42、4.11(m，6H，CH)，4.05～4.09(dd，4H，CH2)，3.70、3.54、2.46、2.21(8H，CH2)，2.98、2.63(4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C22H30N6O12，m/z[M+H]+，571.1。
实施例9：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E9的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pip-Gln-Gly-Pip-Gln)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.49、4.38(4H，CH)，4.09～4.12(dd，4H，CH2)，3.62、3.53、2.05、1.54～1.80(16H，CH2)，2.01～2.07(8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C26H40N8O8，m/z[M+H]+，593.3。
实施例10：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E10的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pip-Asn-Gly-Pip-Asn)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.89、4.35(4H，CH)，4.10～4.14(dd，4H，CH2)，3.60、3.47、2.00、1.60～1.85(16H，CH2)，2.85、2.53(4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C24H36N8O8，m/z[M+H]+，565.3。
实施例11：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E11的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pip-Glu-Gly-Pip-Glu)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.41、4.35(4H，CH)，4.08～4.12(dd，4H，CH2)，3.55、3.46、1.98、1.45～1.74(16H，CH2)，2.42、2.01(8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C26H38N6O10，m/z[M+H]+，595.3。
实施例12：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E12的氨基酸序列为：Cycle(Gly-Pip-Asp-Gly-Pip-Asp)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.90、4.30(4H，CH)，4.07～4.11(dd，4H，CH2)，3.54、3.44、2.07、1.60～1.88(16H，CH2)，2.99、2.71(4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C24H34N6O10，m/z[M+H]+，567.2。
实施例13：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E13的氨基酸序列为：
Cycle(Gly-β-HomoPro-Gln-Gly-β-HomoPro-Gln)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.48、3.79(4H，CH)，4.12～4.16(dd，4H，CH2)，3.57、3.42、2.00～2.06、1.96、1.81(12H，CH2)，2.58、2.30(m，4H，CH2)，2.03～2.09(8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C26H40N8O8，m/z[M+H]+，593.3。
实施例14：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E14的氨基酸序列为：
Cycle(Gly-β-HomoPro-Asn-Gly-β-HomoPro-Asn)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.79、3.71(4H，CH)，4.10～4.15(dd，4H，CH2)，3.48、3.39、2.05～2.10、1.93、1.77(12H，CH2)，2.51、2.26(m，4H，CH2)，2.86、2.57(4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C24H36N8O8，m/z[M+H]+，565.3。
实施例15：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E15的氨基酸序列为：
Cycle(Gly-β-HomoPro-Glu-Gly-β-HomoPro-Glu)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.45、3.76(4H，CH)，4.04～4.09(dd，4H，CH2)，3.46、3.38、2.03～2.08、1.87、1.74(12H，CH2)，2.48、2.27(m，4H，CH2)，2.35、2.11(8H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C26H38N6O10，m/z[M+H]+，595.3。
实施例16：
抗皮肤衰老环六肽类化合物E16的氨基酸序列为：
Cycle(Gly-β-HomoPro-Asp-Gly-β-HomoPro-Asp)；
合成方法根据实施例1所示的合成程序，选择需要的氨基酸或化合物进行合成即可。化学结构如下所示：
1H NMR(500MHz，D2O)，δppm∶4.90、3.81(4H，CH)，4.07～4.12(dd，4H，CH2)，3.51、3.41、2.04～2.07、1.92、1.77(12H，CH2)，2.50、2.22(m，4H，CH2)，2.89、2.65(4H，CH2)。HRMS(ESI):Calcd for C24H34N6O10，m/z[M+H]+，567.2。
对比例1：
一种链状六肽化合物D1的制备方法：
将实施例1中步骤S7得全保护多肽H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH用TFA/TIS/H2O＝90/5/5(70mL)切割2.5小时，将切割液加入到700mL叔丁基甲醚(4℃)溶液中，析出白色固体，离心，得到白色固体粗肽，将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln，然后经过反相C18制备色谱纯化，冻干后得到精品Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln。
对比例2：
一种链状六肽化合物D2的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例2中步骤S7得全保护多肽。
对比例3：
一种链状六肽化合物D3的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例3中步骤S7得全保护多肽。
对比例4：
一种链状六肽化合物D4的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例4中步骤S7得全保护多肽。
对比例5：
一种链状六肽化合物D5的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例5中步骤S7得全保护多肽。
对比例6：
一种链状六肽化合物D6的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例6中步骤S7得全保护多肽。
对比例7：
一种链状六肽化合物D7的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例7中步骤S7得全保护多肽。
对比例8：
一种链状六肽化合物D8的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例8中步骤S7得全保护多肽。
对比例9：
一种链状六肽化合物D9的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例9中步骤S7得全保护多肽。
对比例10：
一种链状六肽化合物D10的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例10中步骤S7得全保护多肽。
对比例11：
一种链状六肽化合物D11的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例11中步骤S7得全保护多肽。
对比例12：
一种链状六肽化合物D12的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例12中步骤S7得全保护多肽。
对比例13：
一种链状六肽化合物D13的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例13中步骤S7得全保护多肽。
对比例14：
一种链状六肽化合物D14的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例14中步骤S7得全保护多肽。
对比例15：
一种链状六肽化合物D15的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例15中步骤S7得全保护多肽。
对比例16：
一种链状六肽化合物D16的制备方法
本实施例所用原料、制备方法与对比例1基本相同，区别在于：所用全保护多肽为实施例16中步骤S7得全保护多肽。
试验例1：
1、抗皱功效测定
1.1检测试剂
无水乙醇(批号20200302，国药集团化学试剂有限公司，China)；iTaq UniversalSYBR Green Supermix(货号1725124，Bio-rad，USA)；FastQuant RT Kit(With gDNase)试剂盒(KR106，天根生化科技(北京)有限公司，China)；RNA-Quick Purification Kit(RNA快速提取试剂盒)(RN001，上海奕杉生物科技有限公司，China)。
1.2检测动物
斑马鱼品系：野生型AB品系；斑马鱼鱼龄：受精后4d(4dpf)；成鱼饲养及繁殖方法：符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
1.3检测方法
(1)用鱼准备：随机选取尾斑马鱼以每组30尾进行分组，分组数目依据测定样品数目设定，之后置于6孔板中；
(2)添加样品：以0.003％的浓度样品添加到6孔板中，每孔定容3mL，设置正常对照组，共设置三次生物学重复；
(3)孵育：将各实验组于28℃条件下避光孵育24h；
(4)RNA提取：使用RNA快速提取试剂盒提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定；
(5)q-PCR检测：取2.00μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μL cDNA，用q-PCR检测β-actin和collalb的基因表达；
(6)数据处理：用β-actin作为基因表达的内参，计算collalb基因的RNA相对表达量：
RNA相对表达量＝2^ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin
对实施例1-16制备的环六肽以及对比例1-16制备的对应的链状六肽进行上述测试，结果如图3-4所示。从图3-4中可以看出，相比于正常对照组，采用本发明实施例1-16制备的链状六肽处理后collalb基因相对表达量明显提升，表明得到的系列链状六肽化合物均具有良好的促collalb基因表达的功效，能够促进I型胶原蛋白的形成，减少胶原蛋白的流失，进而提升皮肤的光滑度，抗皱效果显著增强。同时，实施例1-16制备的环六肽类化合物处理后collalb基因相对表达量明显高于链状六肽的，表明本发明制备得到的系列环状六肽类化合物具有更优的促collalb基因表达能力，显著提升其促胶原蛋白形成的功效，能够更好地改善皮肤状态，起到更佳的抗皱效果。
2、增强皮肤屏障功效测定
2.1检测试剂
DMEM基础培养基(批号8121012，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，China)；D-Hanks(不含钙镁，不含酚红)(批号20210830，北京索莱宝科技有限公司，China)；双抗溶液(货号SV30010，Hyclone，USA)；胎牛血清(批号12J098，ExCellBio，China)；iTaq UniversalSYBR Green Supermix(货号1725124，Bio-rad，USA)；FastQuant RT Kit(With gDNase)试剂盒(KR116-02，天根生化科技(北京)有限公司，China)；RNA-Quick Purification Kit(RNA快速提取试剂盒)(RN001，上海奕杉生物科技有限公司，China)。
2.2检测细胞
细胞类型：人化角质形成细胞HaCaT，为贴壁细胞；
培养基：DMEM，含10％胎牛血清以及1％双抗(青霉素和链霉素)；
培养条件：于37℃、含5％CO2、湿度95％恒温培养箱中，细胞复苏连续培养两代后进行实验。
2.3检测方法
(1)细胞接种：将2.00mL密度为6×105细胞/孔的细胞悬浮液接种于6孔板内，实验设置正常对照组；于37℃、含5％CO2、湿度95％恒温培养箱中培养24h；
(2)添加样品：以0.5％浓度将样品添加到相应的6孔板中，正常对照组用培养基代替；
(3)培养：将6孔板于37℃、含5％CO2、湿度95％恒温培养箱中培养24h；
(4)RNA提取：使用RNA快速提取试剂盒提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定；
(5)q-PCR检测：取1.00μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μL cDNA，用q-PCR检测FLG的基因表达；
(6)数据处理：用β-actin作为基因表达的内参，计算FLG基因的RNA相对表达量：
RNA相对表达量＝2^ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin
对实施例1-16制备的环六肽以及对比例1-16制备的对应的链状六肽进行上述测试，结果如图5-6所示。从图5-6中可以看出，相比于正常对照组，采用本发明实施例1-16制备的链状六肽处理后FLG基因相对表达量明显提升，表明得到的系列链状六肽化合物均具有良好的促FLG基因表达的功效，能够促进丝聚蛋白的形成，提升角质层水分维持能力，改善皮肤角质层状态，从而有效增强皮肤屏障功能。同时，实施例1-16制备的环六肽类化合物处理后FLG基因相对表达量明显高于链状六肽的，表明本发明制备得到的系列环状六肽类化合物具有更优的促FLG基因表达能力，显著提升其促相关蛋白形成的功效，能够更好地改善皮肤角质层状态，起到更佳的增强皮肤屏障的功效。
试验例2：
抗皱环六肽化合物的皮肤刺激性测试
受试人群资料及分组：选择皮肤健康、无皮肤病过敏史的女性受试志愿者，35-55岁，随机分组，每组10人。测试方法：选用合格的斑试器，以封闭式斑贴实验方式，将约0.02mL抗皮肤衰老环六肽类化合物样品滴于斑试器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，24h后去除样品，分别于去除后0.5h、6h、12h、24h、48h观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。
从皮肤刺激性测试实验结果可以看出，各组受试者通过上述实验，在0.5h、6h、12h、24h、48h观察受试者皮肤的反应，皮肤均无出现红斑、疱疹、水肿等不良反应，说明本发明抗皮肤衰老环六肽类化合物E1-E16对皮肤的刺激性小，使用安全。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (3)
1.一种抗皮肤衰老环六肽类化合物，其结构通式如式II所示：
II；
式II中，
n独立选自0；
R1、R2独立选自 (CH2)mCOOA1、(CH2)mCONA2A3中的一种，所述m选自1或2；所述A1、A2、A3独立选自H；所述R1与R2相同；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10独立选自H。
2.权利要求1所述的一种抗皮肤衰老环六肽类化合物的制备方法，包括：先合成链状六元多肽，然后通过成环反应制得环六肽类化合物。
3.权利要求1所述的一种抗皮肤衰老环六肽类化合物在制备化妆品中的用途。
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