KR101301577B1

KR101301577B1 - 니코티노일 펩타이드 유도체 및 그를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101301577B1
Application number: KR1020100080687A
Authority: KR
Inventors: 정대현; 모상현; 이정훈; 김수정; 김형식; 서효현; 임창일; 조문진; 성지연; 민지애
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2013-08-29
Also published as: KR20120017827A; EP2420510A1; EP2420510B1

Abstract

본 발명은 니코틴산에 특정 뉴로펩타이드가 결합된 니코티노일 펩타이드 유도체 및 그를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 우수한 콜라겐 생성 및 항염 효능을 통한 주름 개선 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없고 수용성이며 장시간 보관시에도 안정성이 우수하여 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

니코티노일 펩타이드 유도체 및 그를 포함하는 화장료 조성물 {Nicotinoyl Peptide Derivatives and Cosmetic Composition Comprising the Same}

본 발명은 니코티노일 펩타이드 유도체 및 그를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 우수한 콜라겐 생성 및 항염 효능을 통한 주름 개선 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없고 수용성이며 장시간 보관시에도 안정성이 우수한 니코티노일 펩타이드 유도체 및 그를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람들은 나이가 들어감에 따라 젊음을 유지하고자 하는 욕망을 가지고 있다. 하지만 생물학적인 노화의 진행은 막을 수 없는 것이 현실이다. 따라서, 미리 피부 노화의 진행 정도를 예측하고 이를 예방하고자 하는 노력이 진행되고 있다.

일반적으로 피부 노화는 내인적 노화(intrinsic aging)와 외인적 노화(extrinsic aging)로 나눌 수 있는데, 내인적 노화는 나이가 들어감에 따라 피부의 생리적 기능이 점차 저하되어 자연적으로 나타나는 노화 현상을 말하며, 임상학적으로 피부의 탄력이 감소하고, 피부결이 거칠어지며, 깊은 주름과 색소가 침착되는 특징이 있다[참고문헌: Arch Dermatol., 130: 87-95, 1994]. 한편, 외인적 노화는 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS) 및 스트레스 등의 외인적 요인에 의해 발생하는 노화 현상을 말하며, 이러한 요인들에 의해 피부의 노화가 급속히 진행되고, 그 결과 피부 표면에 거친 주름이 생성되고 탄력이 현저히 감소하게 된다.

피부 노화에 대한 일반적인 이론으로는 유전자 손상에 의한 세포의 기능 저하, 자유 유리기(free radical)에 의한 세포 손상, 독성 물질 축적, 그리고 면역체 이상 등의 다양한 이론들이 알려져 있다. 이러한 이론들 중에서 자유 유리기 이론이 피부 노화의 주요 원인으로 작용하고 있는 것으로 알려져 있다. 특히 자유 유리기 중에서 활성 산소는 세포 밖으로 유출되어 주변 조직에 염증을 유발시켜 세포의 노화를 촉진시킨다. 이러한 염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 회복시키려는 일련의 방어 목적으로 나타나는 것이며, 염증을 유발하는 원인으로 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산이나 염기와 같은 화학물질에 의한 화학적 요인, 항체 반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해서도 일어난다.

최근에 이러한 잔주름, 주름살 및 피부 표면 조직의 바람직하지 않은 형태를 조절하기 위한 다양한 화합물들이 개발되어 왔다. 그 중에서 비타민 B3 화합물, 특히 니아신아미드(niacinamide)는 나이가 들거나 자외선 등에 의한 손상으로 생성되는 주름이나 기타 고르지 않은 피부 조건을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 니아신아미드는 고농도에서 콜라겐 생성을 촉진함으로써 주름 개선 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

따라서, 저농도에서도 우수한 콜라겐 생성 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 항염 효능에 의해 노화 억제 효과를 나타낼 수 있는 새로운 물질의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

본 발명자들은 우수한 콜라겐 생성 및 항염 효능을 갖는 물질을 개발하기 예의 연구 검토한 결과, 니코틴산에 특정 뉴로펩타이드가 결합된 본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체가 피부자극이 적으면서도 콜라겐 생성 및 항염 효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 우수한 콜라겐 생성 및 항염 효능을 통한 주름 개선 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없고 수용성이며 장시간 보관시에도 안정성이 우수한 니코티노일 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 니코티노일 펩타이드 유도체를 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

한 관점에서, 본 발명은 기능성 화장품 원료로 사용될 수 있는 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 식에서,

A는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 및 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 포함하는 31개 이하의 아미노산 잔기로 구성된 뉴로펩타이드, 바람직하게는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-His-Lys, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys, Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr, Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu 또는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu, 보다 바람직하게는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro 또는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys이다.

본 명세서에서 펩타이드를 명명하는 일반적인 규칙은 구체적으로 지시된 예외사항이 없는 경우 3문자 또는 1문자 아미노산 코드 적용을 기초로 한다. 다시 말해서, 아미노산 구조의 중심부를 3문자 코드(예를 들어, Ala, Lys) 또는 1문자 코드(예를 들어, A, K)로 표시하며, 3문자 코드의 앞에 "D-"를 적음으로써 D-입체형태(예를 들어, D-Ala, D-Lys)를 구체적으로 지시하지 않은 경우에는 L-입체형태로 가정한다.

펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연아미노산 잔기가 모두 가능하다.

본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체는 목적하는 펩타이드를 합성한 다음, 니코틴산과 커플링 반응시켜 제조할 수 있다.

상기 목적하는 펩타이드는 생체 내의 단백질을 추출한 다음 단백질 분해효소로 처리하여 저분자량화하거나, 유전자 재조합과 단백질 발현시스템을 이용하여 제조할 수도 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학 합성 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 예를 들어,

(1) 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 NH₂-보호된 펩타이드-레진을 수득하는 단계;

(2) 수득된 NH₂-보호된 펩타이드-레진을 니코틴산과 반응시키는 단계; 및

(3) 레진을 제거하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

목적하는 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 작용기가 존재하는 경우에는 상기 단계 (1)에서 상기 작용기가 보호된 아미노산을 사용하여 펩타이드를 합성할 수 있으며, 상기 작용기에 결합된 보호기는 상기 단계 (3)에서 제거된다.

작용기가 보호된 아미노산을 사용한 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 제조과정의 한 구체예를 하기의 반응식 1에 간략히 나타내었다.

[반응식 1]

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체를 포함하는 화장료 조성물, 특히 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체는 우수한 콜라겐 생성 및 항염 효능을 통한 주름 개선 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없고 수용성이며 장시간 보관시에도 안정성이 우수하여 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체의 함량은 50 내지 10,000ppm 수용액의 중량으로서 0.005 내지 1중량%인 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로서 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들어 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.

니코틴산에 특정 뉴로펩타이드가 결합된 본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체는 우수한 콜라겐 생성 및 항염 효능을 통한 주름 개선 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없고 수용성이며 장시간 보관시에도 안정성이 우수한 효과를 갖는다. 따라서 본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체는 화장품 원료로서 화장료 조성물, 특히 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실시예 1: 니코티노일-펜타펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-메티오닌)의 제조

1.1: NH₂-보호된 펩타이드-레진의 합성

일반적으로 펩타이드는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl: Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 합성하였으며, N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole: HOBt)와 N,N‘-디시클로헥실카보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide: DCC)을 활성제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다[참고문헌: Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc solid phase peptide synthesis', Oxford].

1.2: 니코티노일-펜타펩타이드의 합성

상기한 방법으로 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-메티오닌)-레진에 20% 피페리딘/NMP 용액을 가하여 아미노기에 결합된 Fmoc를 제거하고, N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone: NMP)와 디클로로메탄(dichloromethane: DCM)으로 세척한 후 니코틴산(nicotinic acid) 5당량과 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 NMP와 DCM으로 수회 세척한 다음 건조시켰다.

건조된 니코티노일-펜타펩타이드-레진을 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올(82.5 : 5 : 5 : 5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 t-부틸옥시카르보닐(Boc)기를 제거하고 레진으로부터 니코티노일-펜타펩타이드를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 상기 펩타이드를 침전시켰다.

수득한 니코티노일-펜타펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography; column: Gemini, C18 110A 250×21.2mm)하여 정제하였다.

수율: 65 %

실시예 2: 니코티노일-펜타펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루신)의 제조

2.1: NH₂-보호된 펩타이드-레진의 합성

상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루신)-레진을 합성하였다.

2.2: 니코티노일-펜타펩타이드의 합성

상기에서 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루신)-레진에 20% 피페리딘/NMP 용액을 가하여 아미노기에 결합된 Fmoc를 제거하고, NMP와 DCM으로 세척한 후 니코틴산(nicotinic acid) 5당량과 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 NMP와 DCM으로 수회 세척한 다음 건조시켰다.

수율: 62 %

실시예 3: 니코티노일-노나펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닐-라이실-티로실-프롤린)의 제조

3.1: NH₂-보호된 펩타이드-레진의 합성

상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닐-라이실-티로실-프롤린)-레진을 합성하였다.

3.2: 니코티노일-노나펩타이드의 합성

상기에서 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닐-라이실-티로실-프롤린)-레진에 20% 피페리딘/NMP 용액을 가하여 아미노기에 결합된 Fmoc를 제거하고, NMP와 DCM으로 세척한 후 니코틴산(nicotinic acid) 5당량과 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 NMP와 DCM으로 수회 세척한 다음 건조시켰다.

건조된 니코티노일-노나펩타이드-레진을 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올(82.5 : 5 : 5 : 5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 t-부틸옥시카르보닐(Boc), t-부틸(t-Bu) 및 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐(Pbf)를 제거하고 레진으로부터 니코티노일-노나펩타이드를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 상기 펩타이드를 침전시켰다.

수득한 니코티노일-노나펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography; column: Gemini, C18 110A 250×21.2mm)하여 정제하였다.

수율: 57 %

실시예 4: 니코티노일-데카펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닐-라이실-티로실-프롤린-라이신)의 제조

4.1: NH₂-보호된 펩타이드-레진의 합성

상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닐-라이실-티로실-프롤릴-라이신)-레진을 합성하였다.

4.2: 니코티노일-데카펩타이드의 합성

상기에서 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(티로실-글리실-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닐-라이실-티로실-프롤릴-라이신)-레진에 20% 피페리딘/NMP 용액을 가하여 아미노기에 결합된 Fmoc를 제거하고, NMP와 DCM으로 세척한 후 니코틴산(nicotinic acid) 5당량과 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 NMP와 DCM으로 수회 세척한 다음 건조시켰다.

건조된 니코티노일-데카펩타이드-레진을 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올(82.5 : 5 : 5 : 5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 t-부틸옥시카르보닐(Boc), t-부틸(t-Bu) 및 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐(Pbf)을 제거하고 레진으로부터 니코티노일-데카펩타이드를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 상기 펩타이드를 침전시켰다.

수득한 니코티노일-데카펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography; column: Gemini, C18 110A 250×21.2mm)하여 정제하였다.

수율: 55 %

비교예 1: 니코티노일-트리펩타이드(감마-글루타밀-시스테이닐--글리신)의 제조

상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 표제 화합물을 제조하였다.

수율: 41 %

비교예 2: 니코티노일-펜타펩타이드(라이실-트레오닐-트레오닐-라이실-세린)의 제조

수율: 53 %

실험예 1: 세포배양을 이용한 세포독성 실험

본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체들에 대한 세포증식 및 독성효과를 알아보기 위하여, 인간 섬유아세포(fibroblast)를 1×10⁴cells/㎖의 농도로 하여 24웰 배양판에 접종하였다. 배지는 소태아혈청(fetal bovine serum: FBS) 10%를 함유한 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium, BRL, USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 25~30%만큼 배양되면, 상기 실시예 1 내지 4와 비교예 1 및 2에서 각각 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체의 100μM이 함유된 FBS 무함유 DMEM으로 교체하여 24시간 동안 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물(MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5㎎/㎖)을 50㎕ 첨가하고, 3시간 동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 웰당 200㎕의 디메틸설폭시드(DMSO, Sigma D2650, USA) 용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕씩 96웰로 취하여 병소 감염 진단 테스트법(ELISA)으로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포증식효과(세포독성정도)는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광도를 기준으로 하기 계산식 1에 의해 백분율로 산출하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[계산식 1]

구 분	시 료	분자량	세포증식효과(%)
대조군	정제수	-	100
실시예 1	니코티노일-YGGFM	678.7	102.1
실시예 2	니코티노일-YGGFL	660.7	101.3
실시예 3	니코티노일-YGGFLRKYP	1205.3	99.1
실시예 4	니코티노일-YGGFLRKYPK	1333.5	98.8
비교예 1	니코티노일-γ-ECG	412.4	98.3
비교예 2	니코티노일-KTTKS	668.7	97.6
	니코틴산	123.1	102.3
	니코틴아미드	122.1	103.2

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 세포성장 최적조건에서의 세포증식을 100%로 하였을 때, 상기 실시예 1 내지 4에서 각각 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체는 100μM 이하의 농도에서 세포에 대한 독성이 거의 없음을 확인할 수 있었고, 따라서 안전한 것임을 알 수 있었다.

실험예 2: 콜라겐 증식효과 실험

인간 섬유아세포(primary cell line, CCD-986sk)를 배양판의 바닥에 접종한 후 페니실린(100IU/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml) 및 10% FBS(fetal bovine serum)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다.

이렇게 배양한 섬유아세포를 48웰 배양판에 웰 당 5X10⁴개로 분주한 다음, 세포 배양조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지를 버리고 10% PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음, 상기 실시예 1 내지 4와 비교예 1 및 2에서 각각 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체의 100uM과 대조군을 처리하고 24시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 취하여 프로콜라겐 타입(procollagen type) I C-펩타이드(PIP)(Takara, MK101) ELISA법에 의해 콜라겐 생성량을 측정하였다.

항체-PoD 컨쥬게이트 용액 100㎕를 웰에 넣은 다음 1/5로 희석한 배양액 및 표준액 20㎕를 넣고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 웰에서 배양액을 제거한 다음 PBS 400㎕로 4회 세척하였다. 발색시약 100㎕를 넣고 상온에서 15분 동안 배양한 다음, 1N 황산 100㎕를 넣고 450nm에서 ELISA 리더(reader)로 측정하였다.

콜라겐 증식효과는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광도를 기준으로 하기 계산식 2에 의해 백분율로 산출하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[계산식 2]

구 분	시 료	분자량	콜라겐 증식효과(%)
대조군	정제수	-	100
실시예 1	니코티노일-YGGFM	678.7	123.3
실시예 2	니코티노일-YGGFL	660.7	119.5
실시예 3	니코티노일-YGGFLRKYP	1205.3	122.8
실시예 4	니코티노일-YGGFLRKYPK	1333.5	123.0
비교예 1	니코티노일-γ-ECG	412.4	99.5
비교예 2	니코티노일-KTTKS	668.7	100.5
	니코틴산	123.1	105.2
	니코틴아미드	122.1	108.8

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 4에서 각각 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체는 니코틴산 및 니코틴아미드 보다 콜라겐 증식효과가 현저히 증가되었을 뿐만 아니라, 비교예 1 및 2에서 각각 제조된 글루타치온 펩타이드가 결합된 니코티노일 펩타이드 유도체 및 콜라겐 유래 펩타이드가 결합된 니코티노일 펩타이드 유도체 보다 우수한 콜라겐 증식효과를 나타내었다.

실험예 3: 항염 효과 실험(iNOS 활성 저해 실험)

생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 이용하여 인위적으로 유발시킨 염증의 억제 효과를 알아보기 위하여, iNOS가 들어있지 않은 10% FBS-DMEM(fetal bovine serum-Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO사) 배지에 1×10⁵세포를 현탁시켜 24웰 플레이트에 접종하여 부착시켰다.

하루 후, 상기 실시예 1 내지 4에서 각각 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체의 100uM과 대조군을 처리하여 18시간 동안 배양한 후, 1㎍/ml의 LPS(lipopolysaccharide, Sigma사)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액을 회수하여 96웰 플레이트에 100㎕씩 넣고 그리스 시약(Griess reagent, Sigma사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분 동안 가볍게 흔들어준 다음, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(sodium nitrite)을 표준품으로 하여 검량선을 작성하고 각 시료에 따른 배양액 중의 산화질소(nitric oxide)의 생성량을 구하였다. LPS를 처리한 군의 산화질소의 생성량을 100%로 하여 각 시료의 수득율(%)을 구하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

구 분	시 료	분자량	수득률(%)
대조군	LPS	-	100
대조군	LPS 무처리(DMEM 배지)	-	30.5
실시예 1	LPS+니코티노일-YGGFM	678.7	78.5
실시예 2	LPS+니코티노일-YGGFL	660.7	80.9
실시예 3	LPS+니코티노일-YGGFLRKYP	1205.3	75.1
실시예 4	LPS+니코티노일-YGGFLRKYPK	1333.5	77.8
비교예 1	니코티노일-γ-ECG	412.4	94.5
비교예 2	니코티노일-KTTKS	668.7	95.1
	LPS+니코틴산	123.1	98.8
	LPS+니코틴아미드	122.1	96.1

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 4에서 각각 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체는 iNOS의 활성을 저해시킴을 알 수 있었다. 특히, 본 발명에 따른 니코티노일 펩타이드 유도체는 니코틴산 및 니코틴아미드와 비교예 1 및 2에서 각각 제조된 글루타치온 펩타이드가 결합된 니코티노일 펩타이드 유도체 및 콜라겐 유래 펩타이드가 결합된 니코티노일 펩타이드 유도체 보다 현저히 iNOS의 활성을 저해시킴을 확인할 수 있었다.

제형실시예 1: 니코티노일 펩타이드 유도체를 포함하는 화장수의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체를 포함하는 화장수(스킨로션)를 하기 표 4에 기재된 조성과 함량으로 제조하였다.

구체적으로, 성분 11번에 2, 3, 4, 8번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시켰다(용해물 1). 한편, 성분 5번을 60℃ 정도로 가열하여 용해시킨 후, 여기에 10번을 투입하여 용해시켰다(용해물 2). 그런 다음, 상기 용해물 2를 상기 용해물 1에 투입하고, 마지막으로 성분 1, 6, 7, 9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켜 화장수를 제조하였다.

번호	성분	함량(중량%)
1	실시예 1의 니코티노일 펩타이드 유도체(100ppm)의 수용액	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에틸렌 경화 피마자유	1.5
6	에탄올	8.5
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

제형실시예 2: 니코티노일 펩타이드 유도체를 포함하는 영양로션의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 니코티노일 펩타이드 유도체를 포함하는 영양로션을 하기 표 5에 기재된 조성과 함량으로 제조하였다.

구체적으로, 성분 10, 11, 13, 16번을 혼합 교반하면서 80~85℃에서 가열하여 제조부에 투입한 후 유화시키고, 성분 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번을 80~85℃에서 가열 용해한 후 투입시켜 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입한 다음, 35℃에서 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜 영양로션을 제조하였다.

번호	성분	함량(중량%)
1	실시예 1의 니코티노일 펩타이드 유도체(100ppm)의 수용액	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	2.0
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	9.5
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.2
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	2.5
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체:
[화학식 1]

상기 식에서,
A는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-His-Lys, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys, Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr, Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu 또는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu이다.
삭제
제1항에 있어서, A가 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro 또는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys인 것을 특징으로 하는 펩타이드 유도체.
제3항에 따른 펩타이드 유도체를 포함하는 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 피부 노화 방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.