CN114456234A - 抗氧化脂肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗氧化脂肽，其氨基酸序列为C16‑VVKCPK。本发明通过人工化学合成方法获得了一种分子量为910.63Da的抗氧化脂肽。该抗氧化脂肽含有六个氨基酸和修饰的脂肪酸，具有极强的抗氧化活性，在3mg/ml的浓度下，对DPPH自由基的清除率可达到60.1％；对ABTS自由基的清除率可达到98.9％。并且该抗氧化脂肽分子量小、结构简单，对小鼠皮的24h渗透效果达到207.48μg，具有高皮肤渗透性，对细胞生长具有促进作用。本发明的抗氧化脂肽制备方法简单，将其用在抗氧化有药物、食品或者化妆品添加剂中，可以提高药物、食物或者化妆品添加剂的抗氧化效果，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种抗氧化脂肽及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着生物工程领域的发展，很多的天然多肽被发现具有抗氧化的能力。虽然天然多肽拥有较低的副作用，但是天然多肽也存在一些缺陷，主要包括分子量过大、提取组分分离度不够。较大的分子量会降低抗氧化性的效果以及对皮肤的渗透性，从而导致低生物利用度，造成产物的浪费，不利于其医学和商业应用；天然提取多肽相比于人工合成的多肽来说，组成成分过于复杂，提纯困难，间接造成了高额的分离成本。
目前，关于人工合成抗氧化脂肽的研究层出不穷，但还存在一些问题亟待解决，如：合成纯度低，很多脂肽的纯度只能达到90％甚至更低；抗氧化能力弱，部分脂肽仅仅解决了透皮的问题，但是体内抗氧化的效果却十分微弱。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种抗氧化脂肽及其制备方法和应用，该方法合成的抗氧化脂肽氨基酸数目少，合成步骤快捷简单，透皮能力强，抗氧化活性高，还可以增加细胞内I型胶原蛋白的产生，具有良好的市场应用前景。
具体而言，包括以下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗氧化脂肽，所述抗氧化脂肽的氨基酸序列为C16-VVKCPK，所述抗氧化脂肽的分子结构如式(Ⅰ)，
第二方面，本发明实施例提供了一种抗氧化脂肽的制备方法，包括：
(1)将树脂放入溶剂中溶胀，根据所述抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，加入第一个氨基酸化合物N-芴甲氧羰基-N’-叔丁氧羰基-L-赖氨酸Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和第一缩合剂，然后加入用于溶解的N,N-二甲基甲酰胺DMF进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，都得到第一中间体；
(2)根据所述抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，所述第一中间体依次与多种氨基酸化合物进行多次缩合处理，得到第二中间体；
每次缩合处理的过程为：将所述氨基酸化合物加入到所述第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第二中间体；
所述单次缩合处理中的氨基酸化合物依次为N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸Fmoc-L-Pro-OH、芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、N-(9-芴甲氧羰基)-L-缬氨酸Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Val-OH；
(3)所述第二中间体与棕榈酸单体相连接：将所述棕榈酸单体加入到所述第二中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干得到第三中间体。
(4)所述第三中间体经切割、纯化、冷冻干燥后得到所述抗氧化脂肽。
优选的，步骤(1)中所述树脂为4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂Rink Amide-MBHA-Risin。
优选的，步骤(1)中所述第一缩合剂为二异丙基乙胺DIEA。
优选的，步骤(1)中所述第一个氨基酸化合物Fmoc-L-Lys(Boc)-OH的摩尔数是树脂的3倍，所述DIEA的摩尔数是树脂的10倍。
优选的，步骤(2)中，所述每次缩合处理的过程为：将所述氨基酸化合物加入到所述第一中间体中进行缩合反应，包括：向所述第一中间体中加入用DMF溶解的质量浓度20％的氨基酸化合物和用DMF溶解的质量浓度20％的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU后，立即加入N-甲基吗啉NMM，使所述第一中间体与所述氨基酸化合物进行缩合，反应温度10-60℃，反应时间40min；
所述氨基酸化合物的摩尔数是所述树脂的3倍，所述HBTU的摩尔数是树脂的3倍，所述NMM的摩尔数是树脂的10倍。
优选的，步骤(2)中，所述每次缩合处理的过程为：将所述氨基酸化合物加入到所述第一中间体中进行缩合反应，可以包括：向所述第一中间体中加入用DMF溶解的质量浓度20％的氨基酸化合物和用DMF溶解的质量浓度20％的1-羟基苯并三氮唑HOBt后，立即加入N,N'-二异丙基碳二亚胺DIC，使所述第一中间体与所述氨基酸化合物进行缩合，反应温度10-60℃，反应时间40min；
所述的氨基酸化合物的摩尔数是树脂的3倍，所述HOBt的摩尔数是树脂的3倍，所述DIC的摩尔数是树脂的3倍。
优选的，所述脱保护采用的脱保护剂为含有质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液。
第三方面，本发明提供了一种抗氧化脂肽作为抗氧化剂在药物、食品、化妆品中的应用。
本发明提供的技术方案的有益效果至少包括，本发明通过人工化学合成方法获得了一种分子量为910.63Da的抗氧化脂肽。该抗氧化脂肽含有六个氨基酸和修饰的脂肪酸，具有极强的抗氧化活性，在3mg/ml的浓度下，对DPPH自由基的清除率可达到60.1％；对ABTS自由基的清除率可达到98.9％。并且该抗氧化脂肽分子量小、结构简单，对小鼠皮的24h渗透效果达到207.48μg，具有高皮肤渗透性，对细胞生长具有促进作用。本发明的抗氧化脂肽制备方法简单，将其用在抗氧化有药物、食品或者化妆品添加剂中，可以提高药物、食物或者化妆品添加剂的抗氧化效果，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中抗氧化脂肽的色谱图；
图2是本发明实施例1中抗氧化脂肽的质谱图；
图3是本发明测试例1中实施例1中的抗氧化脂肽C16-VVKCPK、对比例1中多肽VVKCPK以及对比例2中脂肽C16-VVCPK在受体中的积累量随采样时间的变化对比图；
图4是本发明测试例2中DPPH自由基清除率随抗氧化脂肽浓度的变化图(A)和ABTS自由基清除率随抗氧化脂肽浓度的变化图(B)；
图5是本发明测试例3中实施例1中抗氧化脂肽C16-VVKCPK与对比例1中多肽VVKCPK的细胞存活率随脂肽浓度变化的对比图；
图6是本发明测试例4中ROS法测试原理图；
图7是本发明测试例4中不同浓度下实施例1中的抗氧化脂肽C16-VVKCPK体系和对比例1中的多肽VVKCPK体系的荧光强度随时间的变化曲线对比图。
通过上述附图，已示出本发明明确的实施例，后文中将有更详细的描述。这些附图和文字描述并不是为了通过任何方式限制本发明构思的范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
皮肤衰老是机体衰老最直观的体现，是内源性和外源性衰老共同作用的结果，皮肤细胞衰老后，身体各项生理功能将会发生改变，如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)增加、炎症反应加强、胶原蛋白合成减少，最后导致皮肤粗糙、干燥、暗沉、皱纹增多、弹性降低等，严重者甚至会出现皮肤开裂或者老年斑等现象。
抗氧化剂可以保护减少ROS对身体的氧化损伤，目前越来越多的抗氧化制剂被证实能够延缓皮肤衰老，如维生素C、果酸、烟酰胺、生育酚、维生素A和一些植物提取物等。但这些制剂还是存在一些不足，如维生素C易于氧气反应分解；类维生素A成分可能会对皮肤产生刺激感；一些植物提取物甚至会引起皮肤红肿、过敏，严重影响了其广泛使用。
随着生物工程领域的发展，更多的天然多肽被发现具有抗氧化的能力，但是天然多肽存在分子量过大大、提取组分分离度不够等缺陷。
目前，有很多关于人工合成抗氧化脂肽的研究报道，但是它们都存在：合成纯度低，抗氧化能力弱等问题。
为了解决相关技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种抗氧化脂肽，抗氧化脂肽的氨基酸序列为C16-VVKCPK，抗氧化脂肽的分子结构如式(Ⅰ)，
本发明实施例提供的抗氧化脂肽分子通过C和P氨基酸提供了抗氧化活性来源，通过V进行了与脂肪链的桥连，这种过渡，提高了脂肽的脂溶性，增强了渗透率。用K增加了脂肽的亲水性，为其水性配方研发提供帮助。该分子分子量小于1kDa，为910.63Da，结构接单，仅有六个氨基酸以及修饰的脂肪酸，但具有极强的抗氧化活性，在3mg/ml的浓度下，对DPPH自由基的清除率可达到60.1％；对ABTS自由基的清除率可达到98.9％，对皮肤的渗透性高，对小鼠皮的24h渗透效果达到207.48μg，对细胞生长也具有促进作用。对于以上产生的效果，这可能与其具有较高的活性氢位和官能团有关，羧基活性氢原子作为活性中心对抗氧化能力起着至关重要的作用。其较强的活性可能是由于阳离子-π相互作用的形成。由于脂肽的自组装引起分子内和分子间的折叠和聚集，在螯合过程中，某些基团被取代，或吸电子基团与其他物质发生反应，导致氢质子的位置和峰值发生变化。而C端的C16和抗氧化脂肽整体的疏水性可以更快的穿透细胞的脂质双分子层，使得更多的脂肽分子进入细胞内部发挥其抗氧化作用。
本发明实施例提供了一种抗氧化脂肽的制备方法，包括：
(1)将树脂放入溶剂中溶胀，根据抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，加入第一个氨基酸化合物Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和第一缩合剂，然后加入用于溶解的DMF进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第一中间体；
(2)根据抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，第一中间体依次与多种氨基酸化合物进行多次缩合处理，得到第二中间体；
每次缩合处理的过程为：将氨基酸化合物加入到第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第二中间体；
单次缩合处理中的氨基酸化合物依次为N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸Fmoc-L-Pro-OH、芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、N-(9-芴甲氧羰基)-L-缬氨酸Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Val(Boc)-OH；
(3)第二中间体与棕榈酸相连接：将氨基酸单体加入到第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第三中间体。
(4)第三中间体经切割、纯化、冷冻干燥后得到抗氧化脂肽。
优选的，步骤(1)中树脂是4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂Rink Amide-MBHA-Risin。
优选的，步骤(1)中用于树脂溶胀的溶剂是DMF。
优选的，步骤(1)中第一缩合剂是二异丙基乙胺DIEA。
优选的，步骤(1)中第一个氨基酸化合物Fmoc-L-Lys(Boc)-OH的摩尔数是树脂的3倍，DIEA的摩尔数是树脂的10倍。
优选的，步骤(1)-(3)中缩合反应的反应温度范围都是10-60℃，反应时间为40min。
优选的，步骤(2)中，每次缩合处理的过程为：将氨基酸化合物加入到第一中间体中进行缩合反应，包括：向第一中间体中加入用DMF溶解的质量浓度20％的氨基酸化合物和用DMF溶解的质量浓度20％的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU后，立即加入N-甲基吗啉NMM，使第一中间体与氨基酸化合物进行缩合，反应温度10-60℃，反应时间40min；
氨基酸化合物的摩尔数是树脂的3倍，HBTU的摩尔数是树脂的3倍，NMM的摩尔数是树脂的10倍。
优选的，步骤(2)中，每次缩合处理的过程为：将氨基酸化合物加入到第一中间体中进行缩合反应，还可以包括：向第一中间体中加入用DMF溶解的质量浓度20％的氨基酸化合物和用DMF溶解的质量浓度20％的1-羟基苯并三氮唑HOBt后，立即加入N,N'-二异丙基碳二亚胺DIC，使第一中间体与氨基酸化合物进行缩合，反应温度10-60℃，反应时间40min；
氨基酸化合物的摩尔数是树脂的3倍，HOBt的摩尔数是树脂的3倍，DIC的摩尔数是树脂的3倍。
优选的，脱保护采用的脱保护剂是含有质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液。
本发明实施例还提供了一种抗氧化脂肽作为抗氧化剂在药物、食品、化妆品中的应用。
上述所有可选技术方案，可以采用任意结合形成本发明公开的可选实施例，在此不再一一赘述。
以下将通过具体实施例进一步地描述本发明。
在下述具体实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
在下述具体实施例中所涉及的操作未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用原料未注明生产厂商及规格者均为可以通过市购获得的常规产品。
在以下具体实施例中：
本实验中所用的脂肽C16-VVCPK(纯度95.3％)、Fmoc-氨基酸化合物(N-芴甲氧羰基保护的氨基酸)、HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)、HOBt(1-羟基苯并三氮唑)、DIEA(N,N-二异丙基乙胺)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、MBHA树脂，以上试剂均购自吉尔生化(上海)有限公司；TFA(三氟乙酸)、乙腈(色谱纯)、EDT(1,2-乙二硫醇)、TIS(三异丙基硅烷)、过硫酸钾(K2S2O8)、MTT(噻唑蓝)、DPPH(2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基)、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、磷酸盐缓冲液等试剂均为上海麦克林生化科技有限公司，纯度为分析纯；茚三酮、DMSO(二甲基亚砜)、KCN(氰化钾)、苯酚、甲醇、哌啶、乙醇、DCM(二氯甲烷)等其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司，纯度为分析纯；氮气购买于青岛中石科域化工技术有限公司。昆明小鼠，雌性，体重大约20-24g,购自青岛守杰富城生物科技有限公司；脂肽C16-VVKCPK、VVKCPK由实验室合成，纯度为95.67％；ROS检测盒购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；HSF(皮肤成纤维细胞)由实验室保存。
在实施例中，K代表赖氨酸Lys,V代表缬氨酸Val，C代表半胱氨酸Cys，P代表脯氨酸Pro，C16代表棕榈酸，需要的氨基酸化合物共有4种，它们是：N-芴甲氧羰基-N’-叔丁氧羰基-L-赖氨酸Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,N-(9-芴甲氧羰基)-L-缬氨酸Fmoc-L-Val-OH,芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸Fmoc-L-Cys(Trt)-OH,N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸Fmoc-L-Pro-OH。
实施例1
抗氧化脂肽C16-VVKCPK的制备：
具体合成步骤如下：
(A)将一定量的Rink Amide-MBHA Risin树脂放入反应管中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺DMF(15ml/g),震荡30min，进行溶胀；再通过沙芯抽滤掉溶剂DMF，按照从C端到N端的顺序加入3倍树脂摩尔数的氨基酸化合物Fomc-L-Lys(Boc)-OH，再加入10倍树脂摩尔数的第一缩合剂N,N-二异丙基乙胺DIEA，最后加入DMF用于溶解，30℃，震荡30min，进行缩合反应；
除去DMF，加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液(15ml/g)，作用5min后去掉溶剂，再加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT DMF溶液，30℃作用15min，用于脱保护；
除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚、溶液各一滴，108℃下加热5min，若变深蓝色则为阳性反应；检测完后，将剩下未检测的反应物按照以下方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，以除去多余的哌啶，氮气吹干，得到第一中间体。
(B)根据抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，第一中间体依次与多种氨基酸化合物进行多次缩合处理，氮气吹干，得到第二中间体；
单次缩合处理中的氨基酸化合物依次为Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Val-OH；
每次缩合处理的过程为：将氨基酸化合物加入到第一中间体中进行缩合反应，反应温度30℃，反应时间40min；
缩合反应依照单次缩合处理中的顺序，向第一中间体内加入3倍树脂摩尔数的氨基酸化合物，3倍树脂摩尔数的HBTU,均用尽量少的DMF溶解，之后立刻加入10倍树脂摩尔数的NMM,反应温度10-60℃，反应时间40min，使第一中间体与氨基酸化合物进行缩合。
缩合反应后，除去DMF，加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液(15ml/g)，作用5min后去掉溶剂，再加入质量浓度20％哌啶DMF溶液，30℃作用15min，用于脱保护；
除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，108℃下加热5min，若变深蓝色则为阳性反应；检测完后，将剩下未检测的反应物按照以下方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，以除去多余的哌啶，氮气吹干，得到第二中间体；
(3)第二中间体与棕榈酸相连接的方法是：将氨基酸单体加入到第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第三中间体。按照下列的方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次,二氯甲烷DCM(10ml/g),洗涤后继续抽干溶剂10min。
(D)将第三中间体中加入切割液(三氟乙酸TFA94.5％；水2.5％；1,2-乙二硫醇EDT2.5％；三异丙基硅烷TIS1％)(10ml/g)，切割树脂120min；最后用氮气吹干，用乙醚洗涤6次，常温挥干，得到抗氧化脂肽粗品；然后采用制备型HPLC进行分离纯化，经冷冻干燥，得到抗氧化脂肽C16-VVKCPK样品。
将抗氧化脂肽样品用MS对其分子量进行鉴定。图1为抗氧化脂肽的色谱图，图中分析产物的含量为95.67％图2为抗氧化脂肽的质谱图，图中实际合成出来的脂肽分子量为911.8，与理论分子量910.67接近；同时也可以看出来图中峰数很少且主峰明显，所合成的脂肽分子经分离纯化后，可以得到纯度较高的产品。
实施例2
抗氧化脂肽C16-VVKCPK的制备：
具体合成步骤如下：
(A)将一定量的Rink Amide-MBHA Risin树脂放入反应管中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺DMF(15ml/g),震荡30min，进行溶胀；再通过沙芯抽滤掉溶剂DMF，按照从C端到N端的顺序加入3倍树脂摩尔数的氨基酸化合物Fomc-L-Lys(Boc)-OH，再加入10倍树脂摩尔数的第一缩合剂N,N-二异丙基乙胺DIEA，最后加入DMF用于溶解，60℃，震荡30min，进行缩合反应；
除去DMF，加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液作用5min后去掉溶剂，再加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT DMF溶液，60℃作用15min，用于脱保护；
除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚、溶液各一滴，110℃下加热5min，若变深蓝色则为阳性反应；检测完后，将剩下未检测的反应物按照以下方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，以除去多余的哌啶，氮气吹干，得到第一中间体。
(B)根据抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，第一中间体依次与多种氨基酸化合物进行多次缩合处理，氮气吹干，得到第二中间体；
单次缩合处理中的氨基酸化合物依次为Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Val-OH；
每次缩合处理的过程为：将氨基酸化合物加入到第一中间体中进行缩合反应，反应温度60℃，反应时间40min；
缩合反应依照单次缩合处理中的顺序，向第一中间体内加入3倍树脂摩尔数的氨基酸化合物，3倍树脂摩尔数的HBTU,均用尽量少的DMF溶解，之后立刻加入10倍树脂摩尔数的NMM,反应温度60℃，反应时间40min，使第一中间体与氨基酸化合物进行缩合。
缩合反应后，除去DMF，质量浓度加入20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液，作用5min后去掉溶剂，再加入质量浓度20％哌啶DMF溶液，60℃作用15min，用于脱保护；
除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃下加热5min，若变深蓝色则为阳性反应；检测完后，将剩下未检测的反应物按照以下方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，以除去多余的哌啶，氮气吹干，得到第二中间体；
(3)第二中间体与棕榈酸相连接：将氨基酸单体加入到第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第三中间体。按照下列的方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次,二氯甲烷DCM(10ml/g),洗涤后继续抽干溶剂10min。
(D)将第三中间体中加入切割液(三氟乙酸TFA94.5％；水2.5％；1,2-乙二硫醇EDT2.5％；三异丙基硅烷TIS1％)(10ml/g)，切割树脂120min；最后用氮气吹干，用乙醚洗涤6次，常温挥干，得到抗氧化脂肽粗品；然后采用制备型HPLC进行分离纯化，经冷冻干燥，得到抗氧化脂肽C16-VVKCPK样品。
实施例3
抗氧化脂肽C16-VVKCPK的制备：
具体合成步骤如下：
(A)将一定量的Rink Amide-MBHA Risin树脂放入反应管中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺DMF(15ml/g),震荡30min，进行溶胀；再通过沙芯抽滤掉溶剂DMF，按照从C端到N端的顺序加入3倍树脂摩尔数的氨基酸化合物Fomc-L-Lys(Boc)-OH，再加入10倍树脂摩尔数的第一缩合剂N,N-二异丙基乙胺DIEA，最后加入DMF用于溶解，10℃，震荡30min，进行缩合反应；
除去DMF，加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液，作用5min后去掉溶剂，再加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT DMF溶液，10℃作用15min，用于脱保护；
除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚、溶液各一滴，105℃下加热5min，若变深蓝色则为阳性反应；检测完后，将剩下未检测的反应物按照以下方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，以除去多余的哌啶，氮气吹干，得到第一中间体。
(B)根据抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，第一中间体依次与多种氨基酸化合物进行多次缩合处理，氮气吹干，得到第二中间体；
单次缩合处理中的氨基酸化合物依次为Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Val-OH；
每次缩合处理的过程为：将氨基酸化合物加入到第一中间体中进行缩合反应，反应温度10℃，反应时间40min；
缩合反应依照单次缩合处理中的顺序，向第一中间体内加入3倍树脂摩尔数的氨基酸化合物，3倍树脂摩尔数的HOBt,均用尽量少的DMF溶解，之后立刻加入3倍树脂摩尔数的DIC，反应30min，使第一中间体与氨基酸化合物进行缩合。
缩合反应后，除去DMF，加入质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液，作用5min后去掉溶剂，再加入质量浓度20％哌啶DMF溶液，10℃作用15min，用于脱保护；
除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃℃下加热5min，若变深蓝色则为阳性反应；检测完后，将剩下未检测的反应物按照以下方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，以除去多余的哌啶，氮气吹干，得到第二中间体；
(3)第二中间体与棕榈酸相连接的方法是：将氨基酸单体加入到第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第三中间体。按照下列的方法进行洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次,二氯甲烷DCM(10ml/g),洗涤后继续抽干溶剂10min。
(D)将第三中间体中加入切割液(三氟乙酸TFA94.5％；水2.5％；1,2-乙二硫醇EDT2.5％；三异丙基硅烷TIS1％)(10ml/g)，切割树脂120min；最后用氮气吹干，用乙醚洗涤6次，常温挥干，得到抗氧化脂肽粗品；然后采用制备型HPLC进行分离纯化，经冷冻干燥，得到抗氧化脂肽C16-VVKCPK样品。
测试例1体外经皮渗透试验(采用RJY-6B型药物透皮扩散试验仪进行试验)
对比例1：采用本申请的抗氧化脂肽制备方法制备得到的未经棕榈酸修饰的多肽VVKCPK，白色粉末，纯度96.0％；
对比例2：脂肽C16-VVCPK，购自于吉尔生化(上海)有限公司，纯度为95.7％。
取小鼠腹部皮肤，去除发毛和脂肪，裁剪3*3cm的皮肤圆片，保存于-20℃冰箱中备用。
使用时,取出保存的皮肤圆片,自然解冻,并用生理盐水浸泡0.5h，用脱脂棉擦干,固定在垂直透过试验扩散池中。用ddH2O(二次蒸馏水)分别将本发明实施例1制备的抗氧化脂肽C16-VVKCPK、对比例1制备的脂肽VVKCPK和对比例2的脂肽C16-VVCPK溶解，并配制成3mg/mL浓度的脂肽样品。
向Franz扩散池的接受室中加入接受液7.0mL(磷酸盐缓冲液pH 7.2-7.4)，将小鼠皮肤固定于供给室和接受室之间,光面朝向供给室,粗糙面朝向接受室；用取样器通过取样管将1mL接受液注入接受室,排净空气,使小鼠皮肤与接受液紧密接触,记录实际体积；向供给室中皮肤上分别加入上述实施例1、对比例1和对比例2的500μL(3mg/mL)脂肽样品，有效渗透面积S约为1.77cm2，采用一次性枪头将样品自膜中心部位辐射状向边缘均匀涂开,样品设置3个平行；开启电磁搅拌器以300rpm的速度搅拌，保持(32±1)℃恒温水浴,并确保水浴夹层无气泡；分别取2h、4h、8h、24h时间点的样液，采用一次性注射器通过取样管抽取接受液2mL,然后将其置于2mL离心管中,另外每次取样后均补加等量的接受液(磷酸盐缓冲液)。24h渗透结束后，分别对不同实验组各个时间点小鼠皮肤上以及膜下所含待测样品的含量进行检测，累积渗透量Q根据式(2)的公式计算：
Q＝Cn×V+∑Ci×V0(i＝1…n-1) 式(2)
注：Q：累积渗透量；V：接收室中接收液体积；V0：每次取样的体积；Ci：第1次至上次取样时接收液中药物浓度；Cn：第n个取样点测得的样品浓度，透过Franz扩散池原理在体外使用小鼠皮肤模拟各组分在人体皮肤上的渗透情况，结果如图3所示。
图3为本发明测试例1中实施例1中的抗氧化脂肽C16-VVKCPK、对比例1中多肽VVKCPK以及对比例2中脂肽C16-VVCPK在受体中的积累量随采样时间的变化对比图。通过对各个时间点的累积渗透量统计发现，随着时间的推移，各组分透过小鼠皮肤的量也随之增加。相比对比例1未经脂肪酸链(棕榈酸)修饰的多肽VVKCPK，本发明的抗氧化脂肽C16-VVKCPK渗透量明显更多，说明经过脂肪酸链修饰的脂肽更容易透过皮肤，棕榈酸C16能够更好的破坏角质层中脂质的堆积结构，增加皮肤和脂肽之间的分隔，以增强“流动性”；对比例2中的脂肽C16-VVCPK对皮肤的渗透量在24h时只有152.27μg,明显低于本发明的抗氧化脂肽C16-VVKCPK。这是由于本发明实施例1制备的抗氧化脂肽C16-VVKCPK通过调整氨基酸的种类和排序，在缬氨酸和半胱氨酸之间增添了亲水性氨基酸赖氨酸Lys，能够大大提高脂肽的亲水性，又由于本发明的脂肽的氨基酸链短、分子量小，脂肽在皮肤间的通透性好，因此更容易被皮肤吸收利用。
本发明的抗氧化脂肽通过分子设计达到了分子量小、氨基酸链短的结构特点，更容易被皮肤吸收利用，扩展了脂肽在水溶性配方中的应用领域，未来可以应用于化妆品原料等方面。
测试例2脂肽的抗氧化性
本试验通过检测抗氧化脂肽的ABTS自由基(ABTS·+)清除率以及DPPH自由基(DPPH·)清除率等2种体外抗氧化能力，进而分析各组分的抗氧化活性。首先将配制DPPH和ABTS溶液：
DPPH溶液配制：称量2.4mg的DPPH，用1mL甲醇将其溶解成淡紫色溶液，再稀释100倍至终浓度为6×10-5M(根据实验需要计算稀释总量)，该溶液需要先用现配，避光保存备用；
ABTS储存液配制：将ABTS溶于PBS缓冲液配成2mM的溶液。
ABTS·+溶液配制：将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K2S2O8)水溶液按体积比250：1混合，于室温避光放置15-16h。
用ddH2O(二次蒸馏水)将本发明实施例1制备得到的抗氧化脂肽配制成0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、和3mg/mL的浓度的脂肽样品，然后分别进行体外自由基清除能力的测定。
(1)DPPH自由基清除活性：
将48μlDPPH溶液和脂肽样品混合(最终样品与DPPH的质量比为3:1)，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。以样品溶解介质ddH2O(二次蒸馏水)为空白对照组。实验重复三次。DPPH清除率通过式(3)进行计算。
DPPH清除率(％)＝(A空白－A样品)/A空白×100％ (3)
(2)ABTS·+自由基正离子清除活性
试验开始前，将ABTS·+用PBS稀释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。
将2μl本发明制备的抗氧化脂肽样品和48μl上述校正过的ABTS·+溶液混合，室温放置6min后，于734nm波长处检测吸光值。样品溶解介质作为空白对照。ABTS清除率根据式(4)进行计算。
ABTS清除率(％)＝(A空白－A样品)/A空白×100％ (4)
结果显示如图4所示，图4(A)为DPPH自由基清除率随抗氧化脂肽浓度的变化图，图4(B)为ABTS自由基清除率随抗氧化脂肽浓度的变化图。由图中可以看出，随着各组分浓度的增加，ABTS+除能力和DPPH·清除能力也随之增加。两者都是在3mg/mL的时候清除效率能达到最大，分别为60.1％和98.9％。而现有技术中记载对比例2中脂肽C16-VVCPK，DPPH·和ABTS+清除能力分别为20.7％和80.2％，远远小于本发明中自由基的清除率。
结果表明，本发明通过电子转移的方式清除自由基的能力非常优异，ABTS和DPPH自由基的清除都是基于单电子配对来完成的，C16-VVKCPK在羧基端有着活跃的供氢基团，能够有效的清除多余的自由基，有利于其在抗氧化药物、食品及其化妆品添加剂领域中的进一步应用。
测试例3细胞毒性实验
为检测各组分对皮肤的刺激性，在细胞对数生长期时，取密度为2×105个/mL的HSF细胞(皮肤成纤维细胞)100μL，加入96孔板的各细胞孔中，在细胞培养箱中培养24h，以确保细胞贴壁后达到一个相对稳定的状态。将脂肽分以3倍稀释的方式配成4个浓度梯度的受试组，以完全培养基为细胞对照组，每孔上样100μL，培养24h后，用新鲜的PBS将细胞清洗一遍，加入MTT溶液20μL，置于细胞培养箱中孵育4小时后移去上清液，加入150uLDMSO震荡10分钟，然后酶标仪测定OD490，按照式(5)计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[A加药-A空白]/[A对照-A空白]×100 (5)
A加药：含细胞、药物和MTT作用后的吸光值；A空白：不含细胞，含培养基和的吸光值；A(对照)：不含药物，含细胞、培养基和MTT作用后的吸光值。检测结果如图5所示。
图5为本发明实施例1中抗氧化脂肽C16-VVKCPK与对比例1中多肽VVKCPK的细胞存活率随脂肽浓度变化的对比图。图中显示，本发明的经棕榈酸修饰的脂肽在低浓度下对HSF细胞基本没有毒性，并且，随着脂肽浓度的增加，HSF细胞还会随之增殖，在较高浓度3mg/mL下也会对HSF细胞产生较好的增殖效果，增殖率达到115％。而未经棕榈酸修饰的对比例1中的多肽VVKCPK，对HSF细胞具有一定的细胞毒性，并且随着脂肽浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，在3mg/mL浓度下，细胞的存活率仅仅只有67％。
因此棕榈酸修饰后的脂肽能够更好的渗透进细胞，在细胞内，赖氨酸Lys、脯氨酸Pro能够作为I型胶原蛋白的合成原料。本发明设计的抗氧化脂肽分子，通过特定的氨基酸组合排序，能更好的促进细胞的生长，增殖，在低浓度下，本发明的脂肽不会对细胞或者皮肤造成伤害，还会促进皮肤的增殖，因此十分有利于其在抗氧化药物、食品及其化妆品添加剂领域中的进一步应用。
测试例4抗氧化脂肽对细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的抑制作用实验。
本实验采用ROS试剂盒进行测定。ROS法测试原理如图6所示，用C16-VVKCPK及无荧光活性的指示剂DCFH-DA(活性氧荧光探针)共同处理HSF细胞，C16-VVKCPK和DCFH-DA穿过细胞膜进入细胞内部，其中DCFH-DA经细胞内酯酶(Esterase)分解为极性更强的还原型二氯荧光素(DCFH)。向体系中加入ABAP(2,2七偶氮二异丁基豚二盐酸盐，一种自由基诱导剂)，部分ABAP会直接扩散至细胞内，而ABAP会引发自由基链式反应产生过氧化自由基(ROO·)，进而产生ROS。细胞内的DCFH极易被ROS氧化成具有荧光活性的氧化型二氯荧光素(DCF)，故DCF的荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。若脂肽存在抗氧化活性，则可与DCFH竞争结合ROS，抑制DCFH转化为DCF，使体系的荧光强度减弱。因此可通过比较其与对照组荧光物质的减少量来评价脂肽的抗氧化能力。
取15-30代对数生长期的HSF细胞，以7500个/孔的密度接种于黑色96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2浓度下培养24h，待细胞贴壁后，移去孔中培养液。以含25μmol/LDCFH-DA的DMEM培养液为溶剂，将脂肽配制成质量浓度分别为200、500、1000、2000μg/mL的溶液，每孔加入100μL，以100μL含25μmol/L DCFH-DA的DMEM培养液代替样品作为对照，每组设置3个复孔，于培养箱中孵育1h。孵育结束后，移去培养液，PBS洗两次，每孔加入100μL浓度为0.6mmol/L的ABAP后，立即置于荧光酶标仪中，设置发射波长为535nm，激发波长为485nm，每5min测定一次荧光强度，持续1h。
图7为不同浓度下实施例1中的抗氧化脂肽C16-VVKCPK体系和对比例1中的多肽VVKCPK体系的荧光强度随时间的变化曲线对比图。由图7可以看出，不同浓度的抗氧化脂肽C16-VVKCPK对细胞作用一小时后，都能够有效的抑制细胞内的ROS产生，当浓度达到2mg/mL的时候，抑制效果最好，抑制率达到了95％以上。而未经棕榈酸修饰的对比例1中的多肽VVKCPK对ROS的抑制效果不是很理想，在2mg/mL的浓度下，抑制率仅为83％左右，和抗氧化脂肽C16-VVKCPK在0.2mg/mL浓度的效果相近。
说明本发明的抗氧化脂肽C16-VVKCPK对细胞内的活性氧有着非常好的清除能力，能够有效的保护细胞免受过量活性氧的伤害，十分有利于在抗氧化药物、食品和化妆品添加剂领域的进一步应用。
综上，本申请提供了一种抗氧化脂肽，其分子结构小，分子量小，该抗氧化脂肽含有六个氨基酸和修饰的脂肪酸，氨基酸数目较少，并且在N端进行了脂肪酸的修饰，大大提高了脂肽的透皮能力渗透性，对小鼠皮的24h渗透效果达到207.48μg，对细胞生长具有促进作用；我们使用强疏水氨基酸Val(V)，并通过调整合成顺序将其设置在脂肽的端部，以增强脂肽的抗氧化活性，同时选取了Pro(P)和Lys(K)为合成I型胶原蛋白提供了原料。通过对特定的氨基酸的选择和排列，使得脂肽的抗氧化活性更高，在3mg/ml的浓度下，对DPPH自由基的清除率可达到60.1％；对ABTS自由基的清除率可达到98.9％。在提高抗氧化能力的同时，还增加了细胞内I型胶原蛋白的产生。本发明的抗氧化脂肽制备方法简单，将其用在抗氧化有药物、食品或者化妆品添加剂中，可以提高药物、食物或者化妆品添加剂的抗氧化效果，尤其是作为化妆品原料中的抗氧化剂，用于保护H2O2氧化损伤，减少细胞内ROS的堆积，增加细胞内抗氧化酶的水平，具有很好的开发前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中国石油大学（华东）
<120> 抗氧化脂肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Val Lys Cys Pro Lys
1 5
Claims (9)
1.一种抗氧化脂肽，其特征在于，所述抗氧化脂肽的氨基酸序列为C16-VVKCPK，所述抗氧化脂肽的分子结构如式(Ⅰ)，
2.如权利要求1所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将树脂放入溶剂中溶胀，根据所述抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，加入第一个氨基酸化合物N-芴甲氧羰基-N’-叔丁氧羰基-L-赖氨酸Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和第一缩合剂，然后加入用于溶解的N,N-二甲基甲酰胺DMF进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，都得到第一中间体；
(2)根据所述抗氧化脂肽的氨基酸序列，按照从C端至N端的顺序，所述第一中间体依次与多种氨基酸化合物进行多次缩合处理，得到第二中间体；
每次缩合处理的过程为：将所述氨基酸化合物加入到所述第一中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干，得到第二中间体；
所述单次缩合处理中的氨基酸化合物依次为N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸Fmoc-L-Pro-OH、芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、N-(9-芴甲氧羰基)-L-缬氨酸Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Val-OH；
(3)所述第二中间体与棕榈酸单体相连接：将所述棕榈酸单体加入到所述第二中间体中进行缩合反应，然后进行脱保护，在采用茚三酮法检测自由氨基反应呈阳性后，洗涤，氮气吹干得到第三中间体；
(4)所述第三中间体经切割、纯化、冷冻干燥后得到所述抗氧化脂肽。
3.如权利要求2所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述树脂为4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂Rink Amide-MBHA-Risin。
4.如权利要求2所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一缩合剂为二异丙基乙胺DIEA。
5.如权利要求2所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一个氨基酸化合物Fmoc-L-Lys(Boc)-OH的摩尔数是树脂的3倍，所述DIEA的摩尔数是树脂的10倍。
6.如权利要求2所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述每次缩合处理的过程为：将所述氨基酸化合物加入到所述第一中间体中进行缩合反应，包括：向所述第一中间体中加入用DMF溶解的质量浓度20％的氨基酸化合物和用DMF溶解的质量浓度20％的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU后，立即加入N-甲基吗啉NMM，使所述第一中间体与所述氨基酸化合物进行缩合，反应温度10-60℃，反应时间40min；
所述氨基酸化合物的摩尔数是所述树脂的3倍，所述HBTU的摩尔数是树脂的3倍，所述NMM的摩尔数是树脂的10倍。
7.如权利要求2所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述每次缩合处理的过程为：将所述氨基酸化合物加入到所述第一中间体中进行缩合反应，可以包括：向所述第一中间体中加入用DMF溶解的质量浓度20％的氨基酸化合物和用DMF溶解的质量浓度20％的1-羟基苯并三氮唑HOBt后，立即加入N,N'-二异丙基碳二亚胺DIC，使所述第一中间体与所述氨基酸化合物进行缩合，反应温度10-60℃，反应时间40min；
所述的氨基酸化合物的摩尔数是树脂的3倍，所述HOBt的摩尔数是树脂的3倍，所述DIC的摩尔数是树脂的3倍。
8.如权利要求2所述的一种抗氧化脂肽的制备方法，其特征在于，所述脱保护采用的脱保护剂为含有质量浓度20％哌啶和0.1M HOBT的DMF溶液。
9.权利要求1所述的一种抗氧化脂肽作为抗氧化剂在药物、食品、化妆品中的应用。
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