KR102255912B1

KR102255912B1 - 피토킬레틴을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102255912B1
Application number: KR1020190134788A
Authority: KR
Inventors: 김태곤; 이윤진; 최병훈
Original assignee: (주)파이온텍
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-05-25
Also published as: KR20210050316A

Abstract

피토킬레틴을 포함하는 화장료 조성물, 이를 포함하는 제품, 및 상기 조성물 및/또는 제품의 제조 방법이 제공된다.

Description

피토킬레틴을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition Comprising Phytochelatin}

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도 및 습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다.

급속한 산업화, 자동차 배출가스, 중국에서 유래한 중금속 및 미세먼지 등 외부 이물질은 피부를 오염시키며, 피부 노화 및 트러블 발생의 주요 원인으로 손꼽히고 있다.

세안을 통하여 중금속 및 미세먼지를 피부에서 제거하는 것이 피부 트러블을 예방하는 효과적인 방법이지만, 중금속 및 미세먼지는 세포 내에 흡착하여 쉽게 탈리되지 않는 문제가 있다.

따라서, 피부 내 이물질을 제거하고 피부 개선 효과를 구현하기 위한 다양한 소재에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 최근까지 개발된 화장품 원료들은 효능이 미흡하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.

또한 효능이 우수한 경우라도 현재의 화장품 원료들은 피부에 작용하는 범위가 제한적이고, 대부분 콜라겐 합성 촉진, 콜라겐 분해 억제, 활성산소 제거와 같이 피부에 미치는 효능이 유사한 문제가 있었다.

따라서, 이러한 문제점을 해결하는데 있어서 인체 적합성 원료를 사용하여 효과적으로 중금속 킬레이팅, 항산화, 항염증 등의 복합 기능을 가지면서 안전하게 사용될 수 있는 소재의 개발이 요구된다.

본 명세서는 환경오염 물질로부터 피부를 보호하고, 항산화 및/또는 항염 효능을 가지며, 피부 개선능이 우수한으로 피부 외용제 조성물 및 그 제조 방법을 제공한다.

일 예는 피토킬레틴을 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

다른 예는 피토킬레틴을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 피부 외용제 조성물 및 화장료 조성물은 항산화, 항염증, 피부 오염물질 제거 (anti-pollution; 예컨대, 중금속 제거), 피부 개선 등으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 효과를 갖는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 화장료 조성물을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 제품은 피부, 모발, 및/또는 두피에 적용하기 위한 제품일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

피토킬레틴(phytochelatin)은 글루탐산, 시스테인, 및 글리신을 포함하는 트리펩타이드인 글루타치온을 포함하는 올리고펩타이드이다. 일 예에서, 상기 피토킬레틴은 다음의 화학식 1로 표현될 수 있다:

[화학식 1]

상기 식에서, n은 [N-글루탐산-시스테인-C]로 이루어진 디펩타이드의 반복수로서, 1 또는 2이고, R은 -OH 또는 -NH₂이다. 예컨대, 상기 n은 1일 수 있다. 상기 피토킬레틴은 C-말단에 카르복실산을 포함하거나 (상기 화학식 1에서 R은 -OH) 아미드화된 카르복실산(상기 화학식 1에서 R은 -NH)을 포함할 수 있다. 상기 피토킬레틴은 식물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피토킬레틴은 우수한 항산화능을 가질 뿐 아니라, 피부 세포 독성을 보이지 않고 (피부 안전성이 우수하고), 수용성이며, 장시간 보관시에도 안정성이 우수하다는 이점을 갖는다. 또한, 피토킬레틴은 생체 내 유해인자 (예컨대, 자유라디칼, 염증, 등) 및/또는 환경적 유해인자 (예컨대, 중금속, 미세먼지, 담배연기, 다핵방향족탄화수소 등)의 제거능이 우수하여, 피부에 적용시 상기 유해인자들로부터 피부를 보호하고, 피부 손상 (예컨대, 상기 유해인자들로 인한 피부 손상)을 방지할 수 있다.

따라서, 본 명세서에서 제공되는 피토킬레틴을 포함하는 피부 외용제 조성물 및 화장료 조성물은 항산화, 항염증, 피부 오염 방지 또는 피부 오염물질 제거 (anti-pollution; 예컨대, 중금속 및/또는 미세먼지 등의 제거), 및/또는 피부 유해인자 (예, 자유라디칼, 염증, 중금속, 및/또는 미세먼지 등)로 인한 피부 손상 방지 효과를 가질 수 있고, 이러한 효과로 인하여, 피부 톤 개선, 피부 결 개선 등의 피부 개선 효과를 발휘할 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 피토킬레틴을 포함하는 피부 외용제 조성물은 항산화, 항염증, 피부 오염 방지, 및/또는 피부 오염물질 제거용 피부 외용제 조성물일 수 있다. 다른 예에서, 상기 피부 외용제 조성물은 자유라디칼, 염증, 중금속, 미세먼지 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유해물질에 의한 피부 손상 예방, 치료, 및/또는 개선용 피부 외용제 조성물일 수 있다. 본 명세서에서, 피부 외용제 조성물은 피부 표피, 예컨대, 생체 모든 부위의 피부 표피의 외부 표면 (각질층)에 적용하기 위한 조성물, 예컨대, 약학 조성물을 의미할 수 있다.

다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 피토킬레틴을 포함하는 화장료 조성물은 항산화, 항염증, 피부 오염 방지, 및/또는 피부 오염물질 제거용 화장료 조성물일 수 있다. 다른 예에서, 상기 화장료 조성물은 자유라디칼, 염증, 중금속, 미세먼지 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유해물질에 의한 피부 손상 예방 및/또는 개선용 화장료 조성물일 수 있다. 본 명세서에서, 화장료 조성물은 얼굴, 손, 발을 포함한 신체의 모든 피부, 두피, 및/또는 모발 등에 적용하기 위한 것일 수 있다.

상기 자유라디칼(free radical)은 짝지어지지 않은(unpaired) 전자를 가지고 있어서 반응성이 매우 큰 원자 또는 복합 화합물을 총칭하며, 일 예에서 활성 산소일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 조성물은 피부에 적용시 활성 산소를 제거하여 항산화 효과를 가질 수 있다. 상기 중금속은 비중이 4 내지 5 이상인 금속을 총칭하는 것으로, 일 예에서, Ag, Al, B, Ba, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ga, In, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Sr, Tl, Zn　등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개), 2종 이상, 또는 3종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 중금속은 납 (Pb) 또는 카드뮴 (Cd)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 피토킬레틴을 포함하는 항산화, 항염증, 또는 오염물질 제거(anti-pollution; 예컨대, 중금속 및/또는 미세먼지 등의 제거)를 위한 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 제공되는 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물에 포함되는 피토킬레틴 펩타이드의 함량은, 상기 조성물의 총 중량 기준으로, 0.00000001 내지 3 중량%, 0.00000001 내지 2.5 중량%, 0.00000001 내지 2 중량%, 0.00000001 내지 1.5 중량%, 0.00000001 내지 1 중량%, 0.00000001 내지 0.5 중량%, 0.00000001 내지 0.1 중량%, 0.0000001 내지 3 중량%, 0.0000001 내지 2.5 중량%, 0.0000001 내지 2 중량%, 0.0000001 내지 1.5 중량%, 0.0000001 내지 1 중량%, 0.0000001 내지 0.5 중량%, 0.0000001 내지 0.1 중량%, 0.000001 내지 3 중량%, 0.000001 내지 2.5 중량%, 0.000001 내지 2 중량%, 0.000001 내지 1.5 중량%, 0.000001 내지 1 중량%, 0.000001 내지 0.5 중량%, 0.000001 내지 0.1 중량%, 0.00001 내지 3 중량%, 0.00001 내지 2.5 중량%, 0.00001 내지 2 중량%, 0.00001 내지 1.5 중량%, 0.00001 내지 1 중량%, 0.00001 내지 0.5 중량%, 또는 0.00001 내지 0.1 중량%일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물의 제형에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 용액, 현탄액, 유탁액(에멀젼), 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 연고, 패치 또는 분무제 등으로 제형화 될 수 있다.

일 예에서, 상기 조성물은 통상적인 계면활성제(유화제)를 포함하고, O/W (oil in water; 수중유), W/O (water in oil; 유중수), W/O/W, 또는 O/W/O 제형의 유화 또는 가용화 형태의 성상을 갖는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 피부외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 모든 계면활성제들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예컨대, 비이온 계면활성제 및 음이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비이온 계면활성제는 폴리옥시에틸렌계 계면활성제, 폴리글리세린계 계면활성제, 슈가 에스테르계 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 폴리글리세릴-메칠글루코오스디스테아레이트, 폴리글리세릴-메칠글루코오스스테아레이트, 폴리글리세릴-디스테아레이트 (예컨대, 폴리글리세릴-10 디스테아레이트 등), 폴리글리세릴-스테아레이트, 하이드로제네이티드레시틴, 세테아릴올리베이트, 소르비탄올리베이트,　PEG(poly(ethylene glycol))-스테아레이트류 (예컨대, PEG-100 스테아레이트, PEG-40 스테아레이트 등), 글리세릴스테아레이트, 글리세릴스테아레이트에스이, 데실글루코사이드, 코코-글루코사이드, 라우릴글루코사이드, 카프릴릴/카프릴글루코사이드, 아라키딜글루코사이드, C12-20 (직쇄 또는 분지형) 알킬 글루코사이드, 세테아릴글루코사이드, 세테아레스류 (예컨대, 세테아레스-20 등),　스테아레스류 (예컨대, 스테아레스-2, 스테아레스-21, 등), 올레일 알코올의 폴리에틸렌글리콜에테르 (예컨대, 올레스-20, 등), 메칠글루코스세스퀴스테아레이트, 소르비탄스테아레이트, 슈크로스코코에이트, 폴리소르베이트류 (예컨대, 폴리소르베이트60 등), 소르비탄세스퀴올리에이트, 소르비탄올리베이트, 기름야자오일, 기름야자커넬오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온 계면 활성제는 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산암모늄, 라우릴 황산마그네슘, 라우릴 황산트리에탄올아민, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산나트륨, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산암모늄, 소듐코코암포아세테이트, 암모늄라우레스설페이트, 암모늄라우릴설페이트, 코카마이드엠이에이, 디소듐라우레스설포석시네이트, 티이에이-코코일글루타메이트, 소듐코코일애플아미노산, 코카마이드디이에이, 소듐라우레스설페이트, 소듐라우릴설페이트, 포타슘코코일글리시네이트, 소듐스테아로일글루타메이트, 포타슘세틸포스페이트 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피부 외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물은, 피토킬레틴 이외에, 피부에 적용하기 위하여 통상적으로 함유되는 성분들, 오일, 폴리머, 점증제, 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적으로 함유되는 성분들 및 이들의 함량은 목적하는 조성물의 기능, 성상 등에 따라서 적절히 조절될 수 있다.

예컨대, 상기 오일은 실리콘 오일, 예컨대, 사이클로펜타실록산, 디메치콘, 디메치콘올, 사이클로메치콘, 트리실록산, 아모디메치콘, 페닐트리메치콘, 디실록산, 사이클로헥사실록산, PEG-디메치콘류 (예컨대, PEG-12 디메치콘, PEG-10 디메치콘, PEG-7 디메치콘 등), 폴리실리콘류 (예컨대, 폴리실리콘-11 등), 시메치콘, 디페닐디메치콘, PEG-9폴리디메칠실록시에칠디메치콘 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 비실리콘 오일, 예컨대, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 부틸렌글라이콜디카프릴레이트/디카프레이트, 하이드로제네이티드폴리이소부텐, 이소프로필미리스테이트, 세틸에틸헥사노에이트, 하이드로제네이티드폴리데센, 디에톡시에틸석시네이트, 헥실라우레이트, 트리에틸헥사노인, 이소노닐이소노나노에이트, 폴리이소부텐 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 트리글리세라이드; 왁스 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 폴리올은 부틸렌글라이콜, 글리세린, 글리세레스 (예컨대, 글리세레스-26 등), 메틸프로판디올, PEG(poly(ethylene glycol))/PPG(poly(propylene glycol)) 코폴리머류 (예컨대, PEG/PPG-17/6코폴리머 등), 메틸글루세스류 (예컨대, 메틸글루세스-20 등), 디프로필렌글라이콜, 프로필렌글라이콜, 프로판디올, 카프릴릴글라이콜, 펜틸렌글라이콜 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 점증제는 카보머, 암모늄아크릴로일디메틸타우레이트/브이피코폴리머, 잔탄검, 소듐폴리아크릴레이트, 하이드록시에틸셀룰로오스, 아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머, 소듐폴리아크릴레이트, 소듐아크릴레이트/소듐아크릴로일디메틸타우레이트코폴리머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 소듐카보머 등으로 이루어진 고분자 화합물들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 첨가제는 피부 외용제 및/또는 화장료의 제조에 통상적으로 사용되는, 이온 봉쇄제, 유화 안정제, pH 조절제, 피부컨디셔닝제, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트 (emollient), 비타민, 곤충 기피제, 보존제, 소염제, 염기성화 또는 산성화제, 착색제 (안료), 용해제, 담체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 피부 외용제 및/또는 화장료 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 용제를 포함할 수 있으며, 사용 가능한 용제는 정제수, 암반수, 온천수, 빙하수, 해수, 심층 해양수, 식물 추출수 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 앞서 설명한 성분 이외에 스킨(피부) 케어 및/또는 모발/두피 케어에 유리한 효과를 발휘하는 활성성분을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 유리한 효과는 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 수분 공급, 피부 보습, 피부 영양 공급, 모공 축소, 피부결 개선, 각질 제거, 피부 볼륨 개선, 두피 보호, 두피 또는 피부의 피지 방지, 탈모 방지, 모발 수분 공급, 모발 영양 공급, 모발 볼륨 개선 등을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 적용 대상의 피부/모발/두피에서 소망하는 모든 효과일 수 있다. 예컨대, 상기 활성 성분은 각종 식물 추출물 (예컨대, 지모 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 연꽃 추출물, 토마토 추출물, 금은화 추출물, 동백꽃 추출물, 해조류 추출물 등), 식물 캘러스 배양물 또는 배양 추출물, 효모 추출물, 세포 함유 또는 무세포 효모 배양물 또는 배양 추출물, 비타민, 각종 펩타이드, 지질, 또는 지방산 (예컨대, 각종 어패류 유래의 지질, 지방산, 펩타이드 등) 히알루론산, 글리코시드 (예컨대, 알부틴 등), 이외의 각종 피부용 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 소망하는 효과에 따라서 적절한 활성성분을 선택하여 사용할 수 있다. 일 예에서, 상기 활성성분은 수소첨가 폴리이소부텐 (hydrogenated polyisobutene)과 지모추출물의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 예는 상기 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 제품은 피부, 모발, 및/또는 두피 케어용 제품일 수 있고, 예를 들어 얼굴, 손, 발, 온몸 등의 피부, 두피, 모발 등에 적용하기 위한 모든 형태의 화장품 및/또는 세정용 (클렌징) 제품일 수 있다. 일 예에서, 상기 제품은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림(자외선차단제), 비비크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품; 및 샴푸, 비누, 클렌징폼, 바디클렌저 등의 세정용 제품 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 예에서, 상기 화학식 1의 피토킬레틴은 고체상 펩타이드 합성법으로 각 아미노산을 결합시켜 합성하거나, 작은 펩타이드 단편들을 결합한 수렴반응 등을 통해서 합성하거나, 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학 합성 방법으로 합성할 수 있다.

다른 예에서, 화학식 1의 피토킬레틴은 다음의 단계를 수행하여 제조될 수 있다:

(1) 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)으로 보호화된 펩타이드-레진을 수득하는 단계;

(2) 상기 수득된 보호화된 펩타이드-레진에서 레진을 제거하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

목적하는 피토킬레틴 화합물을 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 작용기가 존재하는 경우에는 상기 단계 (1)에서 상기 작용기가 보호된 아미노산을 사용하여 펩타이드를 합성할 수 있으며, 상기 작용기에 결합된 보호기는 단계 (2)에서 제거된다.

본 발명에 따른 피토킬레틴의 제조과정의 한 구체예를 반응식 1에 나타내었다:

[반응식 1]

펩타이드 합성 및 정제

화학식 1의 피토킬레틴은 Fmoc을 이용한 고체상 펩타이드 합성법(Solid Phase Peptide Synthesis)을 사용하여 제조할 수 있다.

고체상 펩타이드 합성법은 레진에 서열상 첫 번째 아미노산(즉, C 말단쪽 첫 번째 아미노산인 글리신)을 붙인 후, 다음 서열의 순서에 따라 coupling-deprotection을 되풀이하는 것이다. 고체 지지체에 결합해 있는 펩타이드의 보호(Fmoc)되어 있지 않은 N-말단의 아미드 그룹에 N-말단이 보호되어 있는 다음 아미노산의 C-말단의 카르복실 기가 반응한다. 그 후, 탈보호시켜 그 다음 아미노산이 반응할 수 있도록 N-말단을 노출시킨다.

고체상 펩타이드 합성법은 아미노기에 Fmoc와 tert-butoxycarbonyl(Boc)의 보호기가 주로 사용되며, C-말단쪽으로부터 N-말단쪽으로 합성이 진행된다. 아미노산의 N-말단은 상기 보호기로 보호된다. 아미노산의 N-말단 끝에는 염기에 쉽게 제거되는 Fmoc 보호기와 산에서 쉽게 제거되는 tert-butyl(tBu) 및/또는 Trityl 보호기가 곁사슬을 보호하고 있다. 첫 번째 Fmoc-아미노산을 레진의 링커에 결합시킨 후에 피페리딘을 사용하여 Fmoc을 제거한다. Kaiser test로 Fmoc 보호기가 제거되었는지 확인하고 다음, Fmoc-아미노산의 카르복실기를 활성화시켜 두 번째 반응을 시킨다. Kaiser test를 통해 레진에서 free 아민을 확인하여 반응완료 여부를 확인한다. 합성은 Fmoc 보호기의 제거 및 다음 Fmoc-아미노산의 반응을 한 cycle로 하여, 펩타이드 서열에 따라 합성된다. 합성 완료된 펩타이드는 TFA (Trifluoroacetic acid)를 처리하여 레진으로부터 펩타이드를 분리하고 곁사슬의 보호기도 이때 제거된다.

본 명세서에서 제공되는 피부 외용제 조성물 및/또는 화장료 조성물은 피토킬레틴을 포함함으로써 우수한 항산화능을 나타낼 뿐만 아니라, 피부 세포독성을 보이지 않고 수용성이며 장시간 보관시에도 안정성이 우수한 효과를 기지며, 유해 물질로부터 피부를 보호하는 기능이 우수한 것을 특징으로 한다.

도 1은 실시예에서 제조된 피토킬레틴과 글루타치온의 세포독성 시험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예에서 제조된 피토킬레틴과 글루타치온의 항산화 효과를 시험한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 실시예에서 제조된 피토킬레틴과 글루타치온의 항염 효과를 시험한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

실시예 1: 피토킬레틴 화합물의 제조

하기의 화학식을 갖는 피토킬레틴 화합물을 제조하였다:

[화학식 1]

(상기 식에서, n은 1 또는 2이고, R은 -OH 또는 -NH₂임)

1.1. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신( γECγECG ) (n=1, R= -OH)

1.1.1 감마- 글루타밀 (O- t부틸 )- 시스테이닐 ( 트리틸 )-감마- 글루타밀 (O- t부틸 )-시스테이닐(트리틸)-글리신(보호화된 펩타이드 )레진의 제조

상기 펩타이드는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 합성하였으며, N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N,N-디아이소프로필카보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다 [참고문헌 : Wang C. Chan,Perter D. White, 'Fmoc-solid phase peptide synthesis', Oxford].

구체적으로, 유리 고상 반응기에서 아미노기가 2-클로로트리틸클로라이드 레진(Bead Tech, Inc) 0.04g을 용매인 디크로로메탄 3ml에서 10분 동안 부풀린(swelling) 다음, 용매를 제거하고, Fmoc-Gly-OH/DIEA(N,N-Diisopropylethylamine), 디클로로메탄을 반응하여 Fmoc-Gly-O-Resin을 합성한다음, 20% 피페리딘(piperidine) 3ml로 2회 처리하여 Fmoc를 제거하였다. Fmoc이 제거된 레진을 DMF (N,N'-Dimethylformamide)로 6회 처리하고, HOBt-DIC로 활성화된 Fmoc-Cys(Trt)-OH 용액과 실온에서 약 4시간 동안 반응시켰다. 이후 동일한 공정으로 Fmoc-γ-Glu-O(tBu), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-O(tBu) 등과 연속적으로 반응시켜 수득한 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-글리신)레진을 DMF (N,N'-Dimethylformamide)로 3회, DCM로 3회 세척하였다.

1.1.2. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신( γECγECG )의 제조

상기에서 합성된 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신)-레진을 트리플루오로아세트산 : 트리아이소프로필실란 : 물(95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 tert-Bu, Trt기를 제거하고 레진으로 부터 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신을 분리시킨 다음, 냉각된 디에틸 에테르로 상기 펩타이드를 결정화시켰다. 수득한 건조된 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신 Crude peptide를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography; Column: C18, 20x250mm)에서 정제한 다음 동결 건조한 결과 순도 95% 이상의 펩타이드를 확보하였다.

수율: 48%

1.2. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 -시스테이닐-글리신 ( γECγECγECG ) (n=2, R= -OH)

1.2.1. 감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-글리신(보호화된 펩타이드 )레진의 제조

구체적으로, 유리 고상 반응기에서 아미노기가 2-클로로트리틸클로라이드 레진(Bead Tech, Inc) 0.04g을 용매인 디크로로메탄 3ml에서 10분 동안 부풀린(swelling) 다음, 용매를 제거하고, Fmoc-Gly-OH/DIEA(N,N-Diisopropylethylamine), 디클로로메탄을 반응하여 Fmoc-Gly-O-Resin을 합성한다음, 20% 피페리딘(piperidine) 3ml로 2회 처리하여 Fmoc를 제거하였다. Fmoc이 제거된 레진을 DMF로 6회 처리하고, HOBt-DIC로 활성화된 Fmoc-Cys(Trt)-OH 용액과 실온에서 약 4시간 동안 반응시켰다. 이후 동일한 공정으로 Fmoc-γ-Glu-O(tBu), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-O(tBu) 등과 연속적으로 반응시켜 수득한 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-글리신)레진을 DMF로 3회, DCM로 3회 세척하였다.

1.2.2. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 -시스테이닐-글리신 ( γECγECγECG )의 제조

상기에서 합성된 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신)-레진을 트리플루오로아세트산 : 트리아이소프로필실란 : 물(95 : 2.5 : 2.5 (v/v)) 의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 tert-Bu, Trt기를 제거하고 레진으로 부터 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신을 분리시킨 다음, 냉각된 디에틸 에테르로 상기 펩타이드를 결정화시켰다. 수득한 건조된 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신 Crude peptide를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography; Column: C18, 20x250mm)에서 정제한 다음 동결 건조한 결과 순도 95% 이상의 펩타이드를 확보하였다.

수율: 39%

1.3. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신- 아마이드 (γECγECG-NH ₂ ) (n=1, R= -NH ₂ )

1.3.1. 감마- 글루타밀 (O- t부틸 )- 시스테이닐 ( 트리틸 )-감마- 글루타밀 (O- t부틸 )-시스테이닐(트리틸)-글리신-아마이드(보호화된 펩타이드 )레진의 제조

구체적으로, 유리 고상 반응기에서 아마이드 레진(Bead Tech, Inc) 0.04g을 용매인 디크로로메탄 3ml에서 10분 동안 부풀린(swelling) 다음, 용매를 제거하고, HOBt-DIC로 활성화된 Fmoc-Gly-OH 용액과 실온에서 약 4시간 동안 반응시켰다. 이후 동일한 공정으로 Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-O(tBu), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-O(tBu) 등과 연속적으로 반응시켜 수득한 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-글리신-아마이드 레진을 DMF로 3회, DCM로 3회 세척하였다.

1.3.2. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신- 아마이드(γECγECG-NH ₂ )의 제조

상기에서 합성된 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신)아마이드-레진을 트리플루오로아세트산 : 트리아이소프로필실란 : 물(95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 tert-Bu, Trt기를 제거하고 레진으로 부터 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신 아마이드를 분리시킨 다음, 냉각된 디에틸 에테르로 상기 펩타이드를 결정화시켰다. 수득한 건조된 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신-아마이드 Crude peptide를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography; Column: C18, 20x250mm)에서 정제한 다음 동결 건조한 결과 순도 95% 이상의 펩타이드를 확보하였다.

수율: 38%

1.4. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 -시스테이닐-글리신-아마이드(γECγECγECG-NH ₂ ) (n=2, R= -NH ₂ )

1.4.1. 감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-글리신-아마이드(보호화된 펩타이드 )레진의 제조

구체적으로, 유리 고상 반응기에서 아마이드 레진(Bead Tech, Inc) 0.04g을 용매인 디크로로메탄 3ml에서 10분 동안 부풀린(swelling) 다음, 용매를 제거하고, HOBt-DIC로 활성화된 Fmoc-Gly-OH 용액과 실온에서 약 4시간 동안 반응시켰다. 이후 동일한 공정으로 Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-O(tBu), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-O(tBu) 등과 연속적으로 반응시켜 수득한 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(O-t부틸)-시스테이닐(트리틸)-감마-글루타밀(OtBu)-시스테이닐(트리틸)-글리신-아마이드 레진을 DMF로 3회, DCM로 3회 세척하였다.

1.4.2. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -감마- 글루타밀 -시스테이닐-글리신-아마이드(γECγECγECG-NH ₂ )의 제조

상기에서 합성된 NH2-보호된 펩타이드(감마-글루타밀-시스테이닐- 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신)아마이드-레진을 트리플루오로아세트산 : 트리아이소프로필실란 : 물(95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 tert-Bu, Trt기를 제거하고 레진으로 부터 감마-글루타밀-시스테이닐- 감마-글루타밀-시스테이닐 -감마-글루타밀-시스테이닐-글리신 아마이드를 분리시킨 다음, 냉각된 디에틸 에테르로 상기 펩타이드를 결정화시켰다. 수득한 건조된 감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-감마-글루타밀-시스테이닐-글리신-아마이드 Crude peptide를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography; Column: C18, 20x250mm)에서 정제한 다음 동결 건조한 결과 순도 95% 이상의 펩타이드를 확보하였다.

수율:32%

비교예 1. 감마- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신 ( γECG )의 제조

상기 실시예 1에 기재된 제조방법에 따라 표제 화합물, 감마-글루타밀-시스테이닐-글리신 (γECG; 글루타치온)을 제조하였다.

수율: 41%

실시예 2. 세포배양을 이용한 세포독성 실험

상기 실시예 1에서 제조된 피토킬레틴 화합물의 피부세포에 대한 독성을 알아보기 위하여, 인간 섬유아세포(fibroblast)의 세포 증식에 미치는 효과를 시험하였다. 구체적으로, 인간 섬유아세포(fibroblast)를 1x10⁴cells/㎖의 농도로 24웰 배양판에 접종하였다. 배지는 소태아혈청(fetal bovine serum: FBS) 10%(v/v)를 함유한 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium, BRL, USA)을 사용하였다. 10%(v/v) FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 25~30%만큼 배양되면, 상기 실시예 1.1 내지 1.4 준비된 피토킬레틴 화합물 및 비교예 1에서 준비된 글루타치온이 각각 0.5, 1, 10, 또는 30ppm의 양으로 함유된 FBS 무함유 DMEM으로 교체하여 24시간 동안 더 배양하였다. 그 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물(MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5㎎/㎖)을 50㎕ 첨가하고, 3시간 동안 추가로 배양한 후, 상등액을 제거하고, 각 웰당 200㎕의 디메틸설폭시드(DMSO, Sigma D2650, USA) 용액을 가한 후, 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕씩 96웰로 취하여 병소 감염 진단 테스트법(ELISA)으로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포독성 정도는 세포증식 정도로서 측정하였으며, 세포 증식 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광도를 기준으로 하기 계산식 1에 의해 백분율로 산출하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

[계산식 1]

세포증식효과(%)= [(추출물처리시의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도]x100

도 1에 나타난 바와 같이, 시험에 사용된 모든 종류의 피토킬레틴 화합물이 시험된 모든 농도에서 세포독성을 보이지 않았으며, 이러한 결과는 상기 피토킬레틴 화합물이 화장품 등의 피부 외용제의 소재로서 안전하게 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 3. DPPH를 이용한 항산화 효과 확인

피토킬레틴 화합물들의 항산화 효능을 확인하기 위하여, 통상의 DPPH법 (DPPH assay)를 이용하였으며, 양성 대조군으로 대표적인 항산화제인 비타민 C (Ascorbic acid; Sigma 사)를 사용하였다. 구체적으로, 정제수에 아스코르브산, 상기 실시예 1.1 내지 1.4에서 준비된 피토킬레틴 화합물, 및 비교예 1 에서 준비된 글루타치온을 각각 녹이고, 상기 용액 0.3㎖를 0.2㎖ 에탄올에 첨가한 뒤, 여기에 0.1mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH, Sigma D9132-1G, USA) 용액 0.5㎖를 첨가하여, 각각의 최종농도가 0.5, 1, 10 또는 30ppm이 되도록 하였다. 그 후, 각각에서 생성된 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지를 확인하기 위하여, 10초간 강하게 와동(vortexing)시키고 냉암소에서 30분간 보관한 다음, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능(자유라디칼 소거효과)의 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광도를 기준으로 하기의 계산식 2를 통해 백분율로 산출하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

[계산식 2]

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1.1 내지 1.4의 피토킬레틴 화합물은 비교예 1의 화합물보다 우수한 항산화능을 보이며, 항산화 효능이 입증된 아스코르브산과 비교하여도, 비슷하거나 보다 우수한 항산화능을 가짐을 확인할 수 있다.

실시예 4. 항염증 효과 확인

피토킬레틴 화합물들의 항염증 효능을 확인하기 위하여, iNOS (Inducible nitric oxide synthase) 활성 저해 정도를 확인하였다. 구체적으로, HaCaT 세포주 (각질형성세포)를 1g의 LPS로 활성화시킨 후, NOS 억제제로 잘 알려진 L-NMMA (CAS 53308-83-1; 양성대조군), 실시예 1.1 내지 1.4에서 준비된 피토킬레틴 화합물 및 비교예 1에서 준비된 글루타치온을 0.5, 1, 10 또는 30ppm의 농도로 배지에 처리한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양 상층액 100㎕와 Griess시약 (1%(w/v) sulfanilamide in 5%(w/v) phosphoric acid 및 1%(w/v)-naphthylamide in H₂O) 100㎕를 혼합하여 96웰-플레이트에서 10분 동안 반응시키고, 540nm에서 흡광도를 측정하여, NO의 양 (NO₂ 형태)을 측정하였다. NO₂의 농도는 질산나트륨(sodium nitrate)을 희석하여 흡광도를 측정함으로써 얻었다.

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1.1 내지 1.4의 피토킬레틴 화합물은 농도 의존적으로 항염증 효과를 나타내고, 비교예 1의 글루타치온보다 우수한 항염증 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

실시예 5. 중금속 킬레이팅 효과 확인

실시예 1 내지 4의 피토킬레틴 화합물 및 비교예 1의 글루타치온의 대표적인 중금속인 납과 카드륨 제거효과를 확인하였다.

납(60ppm) 및 카드뮴(30ppm) 용액에 실시예 1 내지 4의 피토킬레틴 화합물 및 비교예 1의 글루타치온을 각각 0.5, 1, 10, 또는 30 ppm 농도로 넣어 혼합하고 3회 반응시켰다.

3회 반응 후 반응액 내의 잔존 중금속 함량을 유도 결합 플라즈마(ICP-MS)를 이용하여 측정하였다. 대조군으로 10%(w/v) MCT (카프릴릴/카프릭트라이글리세라이드)를 포함하는 용액을 사용하였다.

흡착율은 중금속과 흡착 후 시료의 농도를 대조군 시료의 농도로 나누어 산출하였으며, 흡착율이 높을수록 중금속을 효과적으로 흡착 및 제거할 수 있음을 의미한다.

상기 중금속 제거율은 (1 - 흡착율) x 100으로 계산하였으며, 평가 결과는 하기 표 1과 같다:

구분	농도 (ppm)	납 흡착률 (%)	카드륨 흡착률 (%)
실시예 1.1	0.5	4.5	5.2
	1	8.4	10.2
	10	18.9	22.7
	30	35.2	40.1
실시예 1.2	0.5	6.4	4.9
	1	9.6	9.2
	10	19.2	18.3
	30	36.5	39.8
실시예 1.3	0.5	4.1	4.5
	1	7.4	7.8
	10	16.5	18.2
	30	29.5	30.1
실시예 1.4	0.5	4.3	4.8
	1	7.5	7.7
	10	17.4	18.2
	30	30.6	33.9
비교예 1	0.5	3.9	4.1
	1	6.4	7.1
	10	15.5	17.3
	30	27.8	29.2

표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1.1 내지 1.4의 피토킬레틴 화합물은 농도 의존적으로 중금속 제거 효과를 나타내고, 동일 농도에서 비교예 1의 글루타치온보다 우수한 중금속 제거 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

실시예 6: 화장품의 제조

6.1. 피토킬레틴을 포함하는 화장수의 제조

상기 실시예 1.1에서 제조된 피토킬레틴 펩타이드를 포함하는 화장수(스킨로션)를 하기 표 2에 기재된 조성과 함량으로 제조하였다.

구체적으로, 성분 12번에 2, 3, 4, 5, 및 6번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시켰다(용해물 1). 한편, 성분 7번을 50℃ 정도로 가열하여 용해시킨 후, 여기에 8, 9, 11번을 투입하여 용해시켰다(용해물 2). 그런 다음, 상기 용해물 2를 상기 용해물 1에 투입하고, 마지막으로 성분 1, 10번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켜 화장수를 제조하였다.

번호	성분	함량 (중량%)
1	실시예1의 피토킬레틴 (100ppm)의 수용액	1.0
2	디소듐이디티에이	0.02
3	부틸렌글라이콜	4.0
4	글리세린	2.0
5	구연산	0.04
6	구연산나트륨	0.1
7	폴리옥시에틸렌 경화 피마자유	1.0
8	에탄올	3.0
9	방부제	미량
10	색소	미량
11	향료	미량
12	정제수	잔량

6.2. 피토킬레틴을 포함하는 영양로션의 제조

상기 실시예 1.1에서 제조된 피토킬레틴 펩타이드를 포함하는 영양로션을 하기 표 3에 기재된 조성과 함량으로 제조하였다.

구체적으로, 성분 2, 3, 4, 5, 6, 18번을 수상 용해조에 투입하여 80℃로 가온 후, 교반하여 수상 교반조를 준비하였다. 유상 용해조에 성분 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13번을 투입하여 80℃로 가온 후, 완전 용해시켜 유상 교반조를 준비하였다. 80℃에서 수상 교반조에 유상 교반조 내 유상 원료 혼합물을 투입하고 5분간 균일 유화시켰다. 상기 얻어진 유화물을 65℃로 냉각 후, 성분 14를 투입하여 3분간 교반하여 중화시켰다. 상기 얻어진 결과물을 40℃로 냉각시킨 후, 성분 1, 15, 16, 17을 투입하여 3분간 균일 교반시켰다. 상기 얻어진 결과물을 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜 영양로션을 제조하였다.

번호	성분	함량 (중량%)
1	실시예1.1의 피토킬레틴 펩타이드(100ppm)의 수용액	1.0
2	디소듐이디티에이	0.02
3	부틸렌글라이콜	4.0
4	글리세린	2.0
5	카보머	0.1
6	잔탄검	0.05
7	글리세릴스테아레이트	1.5
8	피이지-100스테아레이트	0.5
9	밀납	0.5
10	폴리솔베이트 60	1.0
11	스테아린산	1.0
12	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	6.0
13	스쿠알란	2.0
14	트리에탄올아민	0.1
15	방부제	미량
16	색소	미량
17	향료	미량
18	정제수	잔량

Claims

피토킬레틴(phytochelatin)을 포함하고,
상기 피토킬레틴은 화학식 1로 표현되는 것인, 항염증용 화장료 조성물:
[화학식 1]

상기 식에서, n은 1 또는 2이고, R은 -NH₂임.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 n은 2인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 조성물 총 중량 기준으로, 피토킬레틴을 0.00000001 내지 3 중량% 포함하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 피부, 두피, 및 모발로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 적용하기 위한, 화장료 조성물.
삭제
삭제
피토킬레틴(phytochelatin)을 포함하고,
상기 피토킬레틴은 화학식 1로 표현되는 것인, 항염증용 피부 외용 약학 조성물:
[화학식 1]

상기 식에서, n은 1 또는 2이고, R은 -NH₂임.
제7항에 있어서, 상기 화학식 1에서 n은 2인, 피부 외용 약학 조성물.
제7항에 있어서, 조성물 총 중량 기준으로, 피토킬레틴을 0.00000001 내지 3 중량% 포함하는, 피부 외용 약학 조성물.
삭제
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 제품.
제12항에 있어서, 상기 제품은 피부, 두피, 또는 모발에 적용하기 위한 화장품 또는 세정용 제품인, 제품.
삭제
삭제