KR20060022208A

KR20060022208A - 펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체

Info

Publication number: KR20060022208A
Application number: KR1020040071020A
Authority: KR
Inventors: 이윤식; 김한영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단; 주식회사 태평양
Priority date: 2004-09-06
Filing date: 2004-09-06
Publication date: 2006-03-09

Abstract

본 발명은 신규 미백제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 멜라닌(melanin) 형성 기작에 직접적으로 작용하는 효소로 알려진 타이로시나제(tyrosinase)에 작용하여, 타이로시나제 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 아스코르빈산 유도체에 대한 것이다.

미백제

Description

펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체 {PEPTIDE COUPLED ASCORBIC ACID DERIVATIVES}

도 1은 아스코르빈산에 펩타이드의 아민 말단을 결합시키기 위해 활성화시키는 과정을 나타내는 반응 개략도이다.

도 2는 고체상 합성법을 이용하여 펩타이드를 트리틸 레진 위에서 합성하고, 활성화된 아스코르빈산과 결합시키는 과정을 나타내는 반응 개략도이다.

도 3는 종래 기술에 따른 아스코르빈산 미백제의 안정성과 본 발명의 아스코르빈산 유도체 미백제의 안정성을 비교한 그래프이다.

최근 인구의 노령화, 레저 인구의 증가로 인하여 자외선에 노출 기회의 증가, 사회적 스트레스의 증가, 환경오염에 의한 오존층의 파괴에 따른 자외선 조사 량이 증가함에 따라 피부의 색소침착 이상 현상을 일으킬 수 있는 기회가 늘어나면서 이에 상응하여 피부 미백에 관한 관심도 증대되고 있다. 이러한 피부 미백에 대한 사회 경제적 요구의 점증에 따라 생체 친화적이면서도 미백 활성이 높은 물질을 개발하는 것이 중요한 기술적 과제로 대두되고 있다.

국내에서도 이에 관한 연구가 활발히 진행되어 이러한 색소 침착을 치료하기 위한 약품이 이미 40여종 이상 출시되고 있으며, 화장품에서도 미백 제품이라 하여 피부 미백에 효과를 나타내는 화장품들이 여러 회사에서 판매하고 있다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데, 특히 멜라닌이 결정적 요소로 작용한다. 멜라닌은 피부 표피 내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트에서 합성되어 주변 각질세포(케라티노사이트)로 전이되어 사람의 피부색을 나타내게 된다. 피부의 외각인 표피층에 존재하는 멜라닌은 자외선 차단의 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해 주는 동시에 피부 생체 내에서 생성된 자유 라디칼(free radical)등을 잡아주는 역할을 하여 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 한다.

그러나 내,외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되지 아니하는 안정한 물질로서, 과잉 생산된 멜라닌은 여성들의 주요 고민인 기미, 주근깨 등을 유발하는 등 문제가 되고 있다.

생체 내에서 일어나는 멜라닌의 합성 과정을 살펴보면, 멜라닌은 타이로신(tyrosine)혹은 도파(DOPA)를 기질로 하여 타이로시나아제(tyrosinase) 등의 효소 를 촉매로 한 중합화 산화 과정을 통해 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부에 자유 라디칼 생성이 많아지거나, 염증 반응이 있거나, 자외선 등의 자극이 가해지면 멜라닌 생성은 증가된다.

현재 유통되고 있는 미백제는 멜라닌 색소가 생성되는 것을 억제하는 성분과 각질 등에 이미 침착돼 있는 멜라닌 색소를 제거하는 성분 등이 함유돼 있다.

멜라닌 색소의 형성을 억제하는 미백 성분으로는 알부틴, 코직산, 아스코르빈산 등이 있으며, 색소가 침착된 각질을 제거하는 물질로는 AHA(alpha hydroxy acid), BHA(butylated hydroxyanisole), 레티노이드 등이 있다.

미백제 용도로 주로 사용되는 의약품은, 멜라닌 생성 억제 원료로 알려진 물질로서 페놀, 카테콜, 레소시놀, 히드로퀴논(hydroquinone)등의 폴리하이드록시페놀 화합물다. 폴리하이드록시 화합물은 항산화 효과에 의하여 타이로시나아제의 활성을 억제하는 화합물이며, 효소 활성의 억제라는 긍정적인 효과가 있으나 폴리하이드록시 화합물은 멜라닌 생성세포를 파괴하여 백반증을 유발하는 등 심한 피부 자극을 유발하므로 그대로 피부에 적용하기에는 안전성 측면에서 문제가 있다.

또한 화장품에서 현재 주로 쓰이고 있는 피부 미백제인 아스코르빈산 유도체 또는 상백피, 알로에, 감초 등의 식물 추출물들은 그 미백 효과가 충분하지 못할 뿐 아니라, 이러한 물질 대부분이 환원성을 지니기 때문에 화장품으로서 상온에서 장기간 보관 시에는 그 효과가 감소하거나 색이 변질되는 단점이 있어서, 이러한 단점이 제거된 좀더 효과적인 미백제의 개발이 요구되어 왔다.

이러한 미백제의 개발에 있어서 중요한 것은 높은 미백 활성을 가지면서 생 체 친화적이고, 장기 보관에도 안정한 물질을 개발하는 것이다. 즉, 효과적으로 타이로시나제의 활성을 저해하면서 생체 친화적이어서 피부에 부작용이 없어야 하고, 동시에 장기보관이 가능한 미백제를 합성하는 것이 중요한 기술적 관건이다.

이러한 기준을 만족시키는 미백제를 합성하기 위해서 당업계에서는 기존의 미백 활성이 있는 것으로 알려진 물질에 생체 친화적인 물질을 도입시켜 미백 활성과 생체 친화성을 적절히 조절하는 것과 동시에 미백제에 안정성을 확보하기 위한 연구가 이루어지고 있다.

이러한 연구에도 불구하고, 이제까지 미백활성과 생체 친화성을 갖춘 물질들에 대한 연구 개발은 다양하게 이루어졌으나, 장기 보관 안전성을 갖춘 미백제 물질은 아직까지 개발되지 못하고 있다.

현재까지 알려진 타이로시나제의 활성 억제제로 사용할 수 있는 미백 물질은, 타이로신의 가지에 있는 페놀과 유사한 구조를 가지는 환원성을 가지는 물질들이며, 코직산,알부틴, 아스코르빈산 등이 가장 널리 사용되고 있다.

코직산의 경우 멜라닌 생성 억제효과가 있어, 미백화장품의 원료로 사용이 가능하지만, 빛과 열, 그리고 pH에 대한 안정성 등이 좋지 아니하여 화장품 원료로 배합이 어렵다는 단점을 가지고 있다.

이러한 단점을 개선하기 위하여 코직산-비타민C 복합체(Chem.Pharm.Bull.,44(9), 1647-1655(1996)), 코직산-아미노산 복합체(Biosci.Biothech.Biochem.,59(9), 1745-1746,(1995)), 코직산-코직산 복합체(WO 02/053562), 코직산-신남산 복합체(US5,486,624), 코직산-옥소티아졸리딘 복합체 (US5,968,487), 코직산 모노지방산 에스테르(일본특개공 소60-9722), 코직산 디지방산 에스테르(일본특개공 61-60801), 코직산 배당체(일본특개공 평6-56872)등의 코직산 유도체가 개발된 바 있다.

알부틴도 피부 미백제 성분으로서 비교적 낮은 자극성을 지니기 때문에 피부 색소형성 억제(skin de-pigmentation)에 많이 이용되고 있다. 알부틴은 하이드로퀴논에 β-D-글루코오스가 결합되어 있는 구조를 가지고 있으며, 피부에 적용될 경우 인체 내에 존재하는 분해효소에 의해 β-D-글루코오스가 서서히 분해되고 이에 따라 생리활성물질인 하이드로퀴논이 서서히 분해됨으로써 뛰어난 미백작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

이와 같은 알부틴의 미백기능을 이용하는 선행기술은 대한민국 특허공개 제2001-0109730호에 기재되어 있는바, 알부틴을 함유하는 월귤나무를 사용하여 미백 화장료를 제조하고자 시도한 기술이 개시되어 있다.

그러나 이와 같은 알부틴은 뛰어난 미백효과를 가지는 반면 화장료로 제형화할 시에 심한 변색을 야기시키는 단점을 가지고 있기 때문에 그 사용량에 제한을 받아왔으며, 이러한 단점을 해결하고자 하는 수많은 연구들이 수행되어 왔다.

이러한 예로서, 대한민국 특허공개 제1999-0065147호에 보면, 알부틴과 함께 루틴을 함유시켜 유효성분인 알부틴을 안정화시키고자 한 시도가 개시된 바 있으며, 대한민국 특허등록 제10-0198508호에 보면, 폴리락트산(PLA)을 벽재로 하여 알부틴을 캡슐화함으로써 알부틴 함유 미백 화장료의 안정성을 획득하고자 한 시도가 개시된 바도 있다.

그러나 알부틴만을 함유시킨 미백제의 경우 안정성이 떨어졌고, 안정성을 확보하기 위하여 루틴과 같은 다른 안정화 성분을 첨가하는 경우 첨가된 안정화제가 미백의 효과를 저하시키는 문제가 있었고, 캡슐화의 경우에도 비경제적이며, 미백효능을 보장하지 못하는 등의 단점이 있었다.

화장품 원료 물질 중 가장 대표적인 것으로서 비타민(Vitamins)이 사용되어 왔고, 비타민은 생체의 신진대사 촉진, 항상화 효과, 세포벽 보호, 면역력 증진, 감염 저항력 상승 등의 기능을 가진 생체내 필수 물질로서, 대부분 영장류의 경우 생합성이 불가능하여 음식물을 통한 섭취가 필수적이고 부족한 경우 다양한 결핍증을 일으키는 원인이 된다.

또한 피부 미용 및 치료에 있어서는 색소 침착 방지, 콜라겐 합성 촉진, 자외선 차단, 피부의 건조와 각화 방지, 주름 방지, 피부 보습 등 건강한 피부를 유지하는 데 매우 중요한 역할을 하는 물질이다.

비타민에는 예를 들면 레티놀(Retinol, 비타민 A), 아스코르빈산(Ascorbic acid, 비타민 C), 토코페롤(Tocophirol, 비타민 E) 및 이들의 유도체 등이 포함된다. 그 중 미백의 효과가 뛰어난 것으로 알려진 것은 아스코르빈산이다.

아스코르빈산, 즉 비타민 C는 멜라닌 생합성 과정 중 율속 단계 효소인 타이노시나아제에 대한 타이로신과의 경쟁적 결합을 시도하는 경쟁물질이고, 타이로시나아제 유전자의 발현 자체에 대한 억제제이며, 산화된 멜라닌을 환원하여 필요 이상의 멜라닌 생합성을 억제함으로써 미백 관련 생체 과정에 대한 전반적인 활성을 나타낸다(Postaire E et al., Biochem Mol Int, 42, 1023pp-1033pp,1997).

그러나, 이러한 아스코르빈산은 불안정성으로 인하여 사용에 어려움이 있었다. 특히 파괴 정도에 따라 노란색에서 갈색을 거쳐 거의 흑색에 가까운 짙은 갈색까지 색상이 변화하게 되어 상품성을 크게 감소시킨다.

이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로서, 아스코르빈산의 변질되기 쉬운 부위에 여러 가지 다른 염들과 화학 반응에 결합으로 다양한 유도체를 만드는 방법들이 사용되었다. 그러나 현재까지 만들어진 거의 모든 아스코르빈산 유도체는 그 효능에 있어서 순수 아스코르빈산보다 떨어지며 유도체화에 따른 합성 공정에서 유해한 용매들이 잔존함에 따른 피부자극 등의 우려가 있을 수 있어 문제되었다.

따라서 당업계에는, 미백제의 환원성은 유지하면서 생체 친화성화성과 안정성을 높일 수 있는 기술의 개발의 오랫동안 요구되어 왔다.

따라서, 본 발명은 펩타이드를 기존의 미백 물질로 쓰이고 있는 아스코르빈산에 도입하여 생체 친화적, 즉 미백효과를 유지하며 피부에 부작용이 없고, 장기 보관에도 안정성을 유지하는 물질은 제공하는 것을 기본적 목적으로 한다. 본 발명의 목적은 미백활성과 생체 적합성을 가지면서 동시에 보관 안정성을 갖춘, 3내지 5개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) 아스코르빈산의 5번, 6번 히드록시기를 블록킹하고, 3번 히드록시기를 활성화 시키는 단계; ii) 트리틸레진 상에서 폴리펩타이드를 활성화 하는 단계; 그리고 iii) 상기 ii)에서 제조된 트리틸레진 상의 폴리펩티 드에 상기 i)에서 활성화 시킨 아스코르빈산을 반응시키는 단계를 포함하는 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 본 발명의 목적은, 3내지 5개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체를 제공함으로써 달성된다.

본 발명은, 미백 효과를 갖는 물질로 공지된 아스코르빈산의 불안정성을 개량하기 위하여, 아스코르빈산에 폴리펩타이드를 도입시킨 유도체를 제공한다. 본 발명에 따르면 기존의 미백제에 폴리펩타이드를 도입하여 타이로시나제 활성 저해 능력을 유지한 채, 생체 친화성과 안정성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 미백제는, 타이로시나제의 활성을 저해하는 아스코르빈산에, 폴리펩타이드를 도입시킨 하기 화학식의 물질이다.

본 발명의 미백 화합물의 제조에 사용되는 아스코르빈산은 종래 기술에 따라 제조되는 아스코르빈산이다. 아스코르빈산(L-threo-2,3,4,5,6-pentahydroxy-2- hexenoic acid-4-lactone)은, 인체에서는 필수 아미노산이지만 미생물에는 그렇지 아니한 비타민으로서, 주로 신선한 야채에 존재한다.

아스코르빈산은 환원력이 강한 화합물로서, L-아스코르빈산은 비타민 C라고도 불리며, 산화형과 환원형은 가역적으로 변한다. 수용액이 산성을 나타냄은 엔올형 히드록시기의 하나가 해리하기 때문이며, 생체 내에서 산화환원계에 관여하여, 비타민으로서의 작용을 나타낸다.

본 발명의 미백화합물의 제조에 사용되는 폴리펩타이드는 아미노산이 펩타이드 결합으로 결합된 2개 내지 5개의 펩타이드이다. 2분자 이상의 아미노산은 아미노기에서 -H와, 카르복실기에서 -OH가 결합하여, H₂O 한분자가 빠지면서, 펩티드결합(-CONH)을 이룬다. 아미노기와 카르복실기가 같은 탄소 원자로 결합되어 있는 것을 α-아미노산이라 하며, 순차적으로 인접한 탄소원자에 아미노기가 옮겨짐에 따라 β-, γ-, δ-아미노산이라고 지칭한다.

본 발명의 펩타이드는 고체상 합성법을 이용하여 펩타이드를 트리틸 레진 위에서 합성한다. 2-클로로 트리틸 레진에 Fmoc 아미노산을 N-메틸피롤리돈, NMP(N-methylpyrrolidone) 하에서 1.1당량 가하여 2시간 반응 시켜서 도입시킨다.

그 다음에, Fmoc 아미노산과 BOP (benzotriazole-1-yloxy-tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate) 커플링 시약을 이용하여 두 개의 아미노산을 더 도입하여 폴리펩타이드를 합성한다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) 아스코르빈산의 5번, 6번 히드록시기를 블록킹 하고, 3번 히드록시기를 활성화 시키는 단계; ii) 트리틸레진 상에서 폴리펩타이드를 활성화 하는 단계; 그리고 iii) 상기 ii)에서 제조된 트리틸레진 상의 폴리펩티드에 상기 i)에서 활성화 시킨 아스코르빈산을 반응시키는 단계를 포함하는 아스코르빈산 유도체를 합성하기 위한 방법을 제공함으로써 달성된다.

아스코르빈산 유도체를 합성하기 위해 아스코르빈산의 아스코르빈산을 아세톤과 아세틸 클로라이드를 가하여 반응시키고, 이를 아세톤/헥산으로 세척하여 5번과 6번이 아세탈의 형태로 보호된 생성물(5,6-O- isopropylidene ascorbic acid)을 얻는다. 5번과 6번이 아세탈의 형태로 결합되었음은 L-아스코르빈산의 ¹H-NMR과 5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid ¹H-NMR의 결과를 비교함으로 확인한다.

또한, 3번의 히드록시기만 활성화 시키기 위하여 수득된 생성물에 카바메이트의 전구체인 카보닐디이미다졸을 무수의 THF에 녹이고, 여기에 결합하는 펩타이드는 고체상 합성법을 이용하여 트리틸 레진 위에서 합성하며, 제조된 펩타이드가

합성되어 있는 트리틸레진상에서 3번의 히드록시기만 활성화된 아스코르빈산 유도체를 커플링시켜 새로운 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체를 제조한다.

아스코르빈산의 3번 히드록시기에 펩타이드가 결합하였음은 ¹³C-NMR과 Mass spectrometer를 이용하여 확인하고, 이들 아스코르빈산 유도체는 흡광도의 측정 결과 뛰어난 미백효과가 있음을 알 수 있으며, 또한 물질 자체는 안정성을 가지고 있으며, 피부 감작성 시험 결과 피부에 적용할 수 있는 안전한 물질임을 알 수 있다.

이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예 들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이들 실시예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

활성화된 아스코르빈산 유도체 합성

미백 물질인 아스코르빈산의 3번 히드록시기에 펩타이드의 아민 말단을 결합시키기 위해, 먼저 아스코르빈산의 5번과 6번의 두개의 히드록시기를 아세탈의 형태로 보호하였다. 아스코르빈산(25 g, 142 mmol)을 200 ml의 아세톤에 현탁시킨 상태로 30분 교반해 준 후, 아세틸 클로라이드(acetyl chloride(2.81 ml))를 가한다음 12시간 반응을 진행시켜 흰색의 액체를 얻었다.

이 용액을 4℃에서 24시간 방치하여 흰색의 침전물을 얻은 뒤, 여액을 여과하고 20% 아세톤/헥산으로 세척하여 5번과 6번이 아세탈의 형태로 보호된 생성물(5,6-O- isopropylidene ascorbic acid)을 얻었다.

여기에 3번 히드록시기만 활성화시키기 위하여, 상기에서 수득된 생성물(4 g, 19 mmol)과 카바메이트의 전구체인 카보닐디이미다졸(2.9 g, 18 mmol)을 무수의 THF(150 ml)에 녹인 다음 72시간 동안 반응시켜 주어 흰색의 고체를 침전으로 얻었다.

[실시예 2]

아스코르빈산의 5번과 6번의 히드록시기가 보호되었는지 여부 확인 실험

아스코르빈산의 5번과 6번의 히드록시기를 아세톤을 이용하여 아세탈의 형태로 보호하기 위하여 Jung's method(M. E. Jung; T. J. Shaw; J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6304)를 이용하였다. 5번과 6번 히드록시기가 보호된 아스코르빈산이 시판되고 있으며, 이렇게 보호된 아스코르빈산의 ¹H-NMR 은 이미 Aldrich 시약회사 자료집에 공개되어 있고, 본 실험에서 합성한 것과 그 결과가 일치하였다. 아래의 ¹H-NMR 데이터는 보호되지 아니한 아스코르빈산의 데이터와 5번과 6번의 히드록시기를 아세톤을 이용하여 아세탈 형태로 보호된 아스코르빈산의¹H-NMR 데이터를 나타낸다. 아래에 나타낸 바와 같이 1.33 ppm 부분에 아세탈 부분의 두개의 CH₃의 피크가 나타남을 보아 합성이 되었음을 알 수 있었다.

¹H-NMR of L-ascorbic acid (300MHz, d6-DMSO) δ 3.44-3.85(4H, m), 4.54(1H, d, J = 3Hz))

¹H-NMR of 5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid (300MHz, d6-DMSO ) δ 1.33(6H, s), 3.90-4.45(4H, m), 4.61(1H, d, J = 3Hz)

[실시예 3]

트리틸 레진을 이용한 고체상 펩타이드 합성

고체상 합성법을 이용하여 펩타이드를 트리틸 레진 상에서 합성하였다. 2-클로로 트리틸 레진에 N-메틸피롤리돈(NMP, N-methylpyrrolidone) 하에서 1.1당량 가하여 2시간 반응 시켜서 Fmoc 아미노산을 도입하였다. 그 다음에 Fmoc 아미노산과 BOP (benzotriazole-1-yloxy-tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate) 커플링 시약을 이용하여 두 개의 아미노산을 더 도입하여 폴리펩타이드를 합성하였다. 이 때 커플링 시간은 1시간으로 하였고, Fmoc을 떼어내는 조건은 25% piperidine/NMP로 각각 3분, 7분씩 2회 처리하였다.

[실시예 4]

펩타이드가 도입된 새로운 아스코르빈산 유도체 미백제의 제조

실시예 3에서 제조된 펩타이드가 합성되어 있는 트리틸레진상에서 실시예 1에서 합성한 활성화된 아스코르빈산 유도체를 커플링시켜 새로운 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체를 제조하였다. 위에서 제조한 N-말단 보호기가 제거된 레진에 NMP하에서 아스코르빈산 유도체 2당량을 가한다음 72시간 반응시켰다. 그 다음 트리틸 레진을 산으로 처리하여 목표하는 펩타이드 물질을 레진에서 떼어낸 뒤, 에테르를 이용하여 침전시켜서 고체로 얻어내었다.

[실시예 5]

아스코르빈산의 3번 하이드록시 위치에 카보닐디이미다졸이 결합하였는 지 여부 확인

아스코르빈산의 3번 위치의 히드록시기에만 선택적으로 카바메이트의 전구체인 카보닐디이미다졸을 도입하는 반응은 ¹H-NMR로는 확인이 불가능하고, ¹H-NMR로는 2번 위치가 활성화 된 물질과 3번 위치가 활성화 된 물질의 피크가 거의 차이없이 나오는 것으로 알려져 있다.

독일의 Beifuss 그룹은 ¹³C-NMR을 사용하여 이 두개를 구분하였다(U. Beifuss; O. Kunz; G. P. Aguado; SynLett 1999, 147.). 이에 따르면 2번 위치의 히드록시기가 치환 될 경우 aci-reductone moiety가 없어지기 때문에, 3번 카본 피크의 위치가 다운필드 되어 158 내지 160 ppm 사이에 나타나게 되지만, 3번 위치의 히드록시기가 치환 될 경우에는 aci-reductone moiety가 유지되기 때문에 2번과 3번의 히드록시기가 모두 그대로인 것과 차이가 거의 없이 3번 카본의 위치가 151 내지 153 ppm의 위치에 나타나게 된다는 것이다.

아래에 나타낸 ¹³C-NMR의 결과를 분석하여 보면 5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid와 최종 생성물의 C-3의 위치가 각각 15.92와 153.09로 거의 비슷하며, 이를 볼 때 최종 생성물은 3번 위치에만 카보닐디이미다졸이 도입되었음을 확인할 수 있다. C 뒤 쪽에 숫자에 아무 표시도 없는 것은 아스코르빈산의 카본이고, ' 표시 가 하나 있는 것은 5번과 6번이 묶여 있는 아세탈 부분의 카본이며, ' 표시 가 두개 있는 것은 3번 위치에 도입된 카보닐디이미다졸의 카본이다.

¹³C-NMR of 5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid (75MHz, d6-DMSO ) δ 61.97(C-2'), 64.82(C-3'), 68.39(C-6), 73.38(C-5), 74.20(C-1'), 74.60(C-4), 118.13(C-2), 152.92(C-3), 170.65(C-1)

¹³C-NMR of Activated-L-ascorbic acid (75MHz, d6-DMSO) δ 64.91(C-2'), 67.05(C-3'), 67.43(C-6), 73.73(C-5), 74.38(C-1'), 75.48(C-4), 77.45(C-2''), 108.93(C-3''), 120.22(C-2), 134.68(C-4''), 153.09(C-3), 170.52(C-1), 175.04(C-1'')

[실시예6]

아스코르빈산에 펩타이드가 결합하였는 지 여부(Mass 결과)

Mass의 종류는 LC-Mass이고 먼저 HPLC로 순도를 확인한 뒤에 LC-Mass를 찍었다. 먼저 실험에 이용된 화합물의 화학식은 하기한 바와 같다.

먼저 HPLC를 찍어서 이 물질이 하나의 물질임을 확인하였다. HPLC 데이터는 피크 하나가 물질 하나를 나타내는데, 아래의 결과로 볼 때 이 물질은 하나의 물질 임을 확인할 수 있었다.

그 다음 LC-Mass를 이용하여 이 하나의 물질이 우리가 원하는 생성물임을 확인하였다. 아래의 그림에 결과가 원래의 분자량 보다 2가 많은 것은 양이온화 된 상태이기 때문이다.

실시예 5의 NMR의 결과로 볼 때, 아스코르빈산의 3번 히드록시기만 활성화 되었음을 알 수 있었고, HPLC의 결과로 볼 때, 합성한 최종 결과 물질이 하나의 물질임을 알 수 있고, LC-Mass의 결과로 볼 때, 그 하나의 물질이 분자량으로 보아 펩타이드가 도입된 아스코르빈산임을 확인하였다.

[실시예 7]

본 발명의 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체의 미백 활성 테스트

포스페이트 완충용액(pH 6.8, 0.1M)에 타이로시나제와 타이로신을 넣은 것과 실시예 3에서 얻은 물질을 첨가한 것을 37℃에서 10분 간 반응시킨 뒤, 얼음 중탕으로 옮겨서 반응을 중단시킨다. 그 다음 475nm에서 흡광도를 각각 측정하고 하기의 식에 의해 타이로시나제의 활성 저해 정도를 측정한다.

%활성 저해도 = (A-B)/A ×100

상기의 식에서 A는 실시예 3의 물질을 넣지 않은 것의 흡광도이고, B는 넣은 것의 흡광도이다.

이 식에 의해 도입한 펩타이드의 종류에 따라 각각의 타이로시나제 활성 저해 정도를 비교하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 이때 아무런 개질도 하지 아니한 아스코르빈산의 경우에 675μmol의 농도에서 50%의 활성 저해도를 보이므로, 반응액에서의 미백물질의 농도는 600μmol로 하였다.

상기의 표에서 보면 타이로신을 포함하고 있는 펩타이드를 기존의 미백제인 아스코르빈산에 도입하였을 때 효소의 활성 저해도의 상승이 있었다. 또한 페닐알라닌을 비롯한 몇몇 다른 아미노산들도 본래의 아스코르빈산과 비슷한 정도의 효소 활성 저해도를 보였다.

[실시예 8]

제조한 미백제의 안정성 테스트

제조한 미백제와 기존의 미백제인 아스코르빈산을 상온의 대기 중에서 15일 동안 보관하면서 실시예 6과 같은 미백활성 테스트를 실시하였다. 도 2번의 그래프를 보면 제조한 미백제와 기존 미백제의 안정성에 확연히 차이가 있음을 알 수 있다. 도 2의 그래프에 따르면, 펩타이드가 도입되지 아니한 종래의 미백제인 아스코르빈산은 대기 중에서 24시간 이후 급속히 효소저해의 효율이 감소하지만, 펩타이드를 아스코르빈산에 도입하였을 때 효소저해의 효율이 15일 이상 유지됨을 알 수 있었다.

이와 같이, 본 발명에 따르면 종래 기술의 미백제인 아스코르빈산에 생체 친화적인 펩타이드를 도입함으로써 효소 활성 저해도를 향상시킴과 동시에 안정성까지 부여할 수 있었다. 특히 실시예 7의 표 1에 나타낸 바와 같이 펩타이드에 타이로신이이 포함되어 있을 경우에는 더 큰 효과를 나타낸다.

[실시예 9]

펩타이드 유도체의 안전성

펩타이드 유도체를 화장료 등의 원료로 사용하기 위해서는 피부에 안전해야한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 유도체의 피부에 대한 자극성 유무를 측정하였다. 안전성 실험은 펩타이드 유도체를 PEG 400에 용해시킨 3% 농도의 용액을 가지고 수행하였다.

피부 1차 자극 시험(Primary skin irritation test): 시험물질 적용 24시간 전에 토끼 12마리의 등 부위의 털을 제거하고 2.5×2.5cm 넓이에 0.1㎖씩, 24 시간 동안 도포하여 관찰하였다. 관찰 결과 자극이 없는 것으로 판정되었다.

피부 감작성 시험(Skin sensitization test): 기니아피그 암수 각 3마리씩 6마리에 Magnusson과 Kligman의 시험방법에 따라 실시한 결과 홍반, 부종, 가피 형성 등의 피부이상 증상은 관찰할 수 없었다.

이상의 피부에 대한 안전성 실험에서 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 피부에 적용할 수 있는 안전한 물질임을 확인할 수 있었다.

이렇게 펩타이드가 도입된 아스코르빈산을 화장품 사업에 이용할 경우, 더욱 생체 친화적이고 미백 기능이 향상된 고기능성 화장품을 제조할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 기존의 미백제인 아스코르빈산에 생체 친화적인 펩타이드를 도입함으로써 멜라닌 생성억제작용을 통한 미백 효과를 상승시킴과 동시에 안정성이 높은 미백물질을 만들 수 있다. 본 발명에 따르면 기존의 미백제로 쓰이고 있는 환원성 물질인 아스코르빈산 (ascorbic acid)에 생체 친화적인 펩타이드를 도입하여 장기보관 시에도 미백효과를 유지할 수 있는 안정성을 부여할 수 있다.

Claims

2내지 5개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 결합된 하기 일반식(IV)의 아스코르빈산 폴리펩티드 유도체;

상기 식에서, 아스코르빈산(ascorbic acid)의 3번 하이드록시기 위치에 결합되어 있는 AA는 아미노산이고 n은 2내지 5의 정수이다.
제1항의 아스코르빈산 유도체에 있어서, 상기 아미노산이 소수성 아미노산인 아스코르빈산 폴리펩티드 유도체.
제2항의 아스코르빈산 유도체에 있어서, 상기 아미노산이 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 라이신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린 및 아스파라긴산으로 이루어진 아미노산 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체.
제 3항의 아스코르빈산 유도체에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 타이로신을 포함하는 폴리 펩타이드인 것인 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체.
i) 아스코르빈산의 5번, 6번 히드록시기를 블록킹하고, 3번 하이드록시기를 활성화 시키는 단계;

ii) 트리틸레진 상에서 폴리펩타이드를 합성하는 단계; 그리고

iii) 상기 ii)에서 제조된 트리틸레진 상의 폴리펩타이드에 상기 i)에서 활성화시킨 아스코르빈산을 반응시켜 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체를 제조하는 방법