DE2853840A1

DE2853840A1 - Cyclisches bradykinin-analogon-cyclo- eckige klammer auf (n epsilon -1l-lysin, 6-glyzin) bradykinin eckige klammer zu

Info

Publication number: DE2853840A1
Application number: DE19782853840
Authority: DE
Inventors: Geb Kondrascheva Inta Misinja; Felix Kazimirovitsch Mutulis; Gunar Ignatjevitsch Tschipens
Original assignee: INST ORGANICHESKOGO SINTEZA AK
Current assignee: INST ORGANICHESKOGO SINTEZA AK
Priority date: 1977-12-14
Filing date: 1978-12-13
Publication date: 1979-06-28
Also published as: US4187217A; FR2411828B1; DE2853840C2; FR2411828A1; SU798098A1; JPS5811941B2; JPS5498799A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues synthetisches Analogon eines bekannten Naturstoffes - des Gewebehormons Bradykinin und seine Anwendung, in Arzneimitteln.

Bradykinin und andere Peptide, die die Aminosäurenreihe des Bradykinins enthalten, z.B. Kallidin, Methionyllysylbradykinin, die Kinine von Insekt- und anderen tierischen Giften sind in der Natur überaus verbreitet und erfüllen wichtige Funktionen bei der Regelung biochemischer und physiologischer Vorgänge im tierischen und menschlichen Organismus. Mit Störungen der Bildung und des Abbaus des Bradykinins und. der ihm verwandten Peptide sind verschiedene Erkrankungen und pathologische Zustände des menschlichen Organismus verbunden. Darum besteht ein dringendes Bedürfnis nach Analoga und Antimetaboliten des Bradykinins, die geeignet sind, die genannten Vorgänge in gewünschter Weise zu beeinflussen (A.A. Dzizinsky, O.A. Gomazkov, Kinine in der Physiologie und Pathologie des Herz- und Gefäßsystems, Novosibirsk, 1976, in Russisch).

Das in der Natur vorkommende Bradykinin selbst ist für diese Zwecke nicht geeignet. Seine Hauptmängel sind eine kurze Wirkungsdauer (die Halbwertszeit des Bradykinins im menschlichen Blut beträgt nur 30 Sekunden) (K.A. Saameli, T.K.Eskes, Am. J. Physiol. 20JL, 261 (1962)) und die Vielfalt der von ihm hervorgerufenen biologischen Effekte, d.h. der Mangel an Selektivität. Das Hormon wirkt auf die glatte Muskulatur und das Blutkreislaufsystem, beeinflußt die Permeabilität der Kapillargefäße und ruft zahlreiche andere Wirkungen hervor. Deshalb kann eine therapeutische Anwendung des Bradykinins unvertretbare Nebenwirkungen haben. Dasselbe

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gilt auch von den bisher bekannten synthetischen Analoga des Bradykinins, deren es mehr als 170 gibt (Handbook of Experimental Pharmacology, vol. XXV, Bradykinin, Kallidin and Kallikrein, Ed. E.G. Erdos, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-N.York, 1970, 1-768). Der Zweck der vorliegenden Erfindung bestand in der Entwicklung eines neuen Bradykinin-Analogons mit ausgeprägter Selektivität und protahierter Wirkungsdauer.

Gegenstand der Erfindung ist ein cyclisches Bradykinin-Analogon - Cyclo-/tN^£ -1-L-lysin,6-glyzin)-bradykinin/ (verkürzt ZBA) der Formel

Γ" I

ι ψ₂ I

-j-COCH (CN₉) ^H-J-COCHNH-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-Pro-Phe

Diese Verbindung besitzt eine bemerkenswerte Selektivität und eine stark prolongierte Halbwertszeit - Eigenschaften, die im Hinblick auf die therapeutische Anwendung sehr wertvoll sind.

Die blutdrucksenkende Aktivität des ZBA (in einer Dosis von 50 ^ug/kg) gleicht im Versuch an Ratten ungefähr derjenigen des Bradykinins. Während jedoch die biologische Wirkung des Bradykinins nicht mehr als 1,5 Minuten nach der Applikation dauert, führt eine einmalige Verabreichung des ZBA zu einer stabilen Blutdrucksenkung, die drei Stunden lang anhält. Zudem ist diese Verbindung nicht mit der für die Kinine charakteristischen myotropen Aktivität (Kontraktion des Krumm-

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darms beim Versuch an Ratten) behaftet und vergrößert die Gefäßdurchlässigkeit in geringerem Maße als Bradykinin, d.h. die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung ist ausgesprochen selektiv.

Beschreibung der Synthese des Cyclo-/~(N -i-L-lysinjö-glyzin)-bradykinins/

Die erfindungsgemäße Verbindung kann durch ein Mehrstufenverfahren hergestellt werden, das man folgenderweise verwirklicht:

a) Man versetzt Benzyloxykarbonylprolin mit Glyzin-tert. -butylester und erhält Benzyloxykarbonylprolylglyzin-tert.-butylester;

b) man hydriert das Produkt der Stufe "a" und erhält Prqlylglyzin-tert.-butylester;

c) man versetzt tert.-Butoxykarbonylnitroarginin mit oO -Benzyloxykarbonyllysin-p-nitrophenylester und erhält OC -Benzyloxykarbonyl, £L-tert.-butoxykarbonylnitroarginyllysin-p-nitrophenylester;

d) man versetzt das Produkt der Stufe "c" mit Prolin und erhält ⁰^- -Benzyloxykarbonyl, <£ - (tert. -butoxykarbonylnitroarginyl)-Iysylprο1in;

e) man bearbeitet das Produkt der Stufe "d" mit Trifluoressigsäure und erhält ^-Benzyloxykarbonyl,£-(nitroarginyl)lysylprolintrifluoracetat;

f) man versetzt tert.-Butoxykarbonylphenylalanin-p-nitrophenylester mit GIyzin und erhält tert.-Butoxykarbonylphenylalanylglyzin;

g) man versetzt das Produkt der Stufe "f" mit Polylphenylalanin-p-nitrobenzylester und erhält tert.-Butoxykarbonylphenylalanylglyzylprolylphenylalanin-p-nitrobenzylester;

h) man bearbeitet das Produkt der Stufe "g" mit Hydra-

zinhydrat und erhält tert.-Butoxykarbonylphenylalanylglyzyl-

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prolylphenylalaninhydrazid;

i) man versetzt die Produkte der Stufen "e" und "h" miteinander und erhält 06-Benzyloxykarbonyl, £-(tert.-butoxykarbonylphenylalanylgly zylprolylphenylalanylnitroarginyl) lysylprolin;

j) man versetzt die Produkte der Stufen "b" und "i" miteinander und erhält cx—Benzyloxykarbonyl, £ -(tert.-butoxykarbonylphenylalanylglyzylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylprolylprolylglyzin-tert.-butylester;

k) man setzt das Produkt der Stufe "j" in <X-Benzyloxykarbonyl, £■ -(phenylalanylglyzylprolylphenylalanylnitroarginyl)lysylprolylprolylglyzinhydrochlorid um;

1) man cyclisiert das Produkt der Stufe "k" und erhält Cyclo-^( oc-benzyloxykarbonyl, £ -(phenylalanylglyzylprolylphenylalanylnitroarginyl)lysylprolylprolylglyzyl7 J

m) man hydriert das Produkt der Stufe "1" und erhält Cyclo-/(N^ -1-L-lysin, 6-glyzin)bradykinin7·

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird im folgenden Beispiel die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung im einzelnen beschrieben sowie eine schematische Darstellung der Synthese und eine Übersicht über die Ergebnisse der biologischen Tests beigefügt.

Für die Synthese wurden Aminosäurenderivate der Firma "Reanal¹¹ (Ungarn) benutzt. Die Eindampfungen wurden in einem Vakuumverdampfer bei 30⁰C durchgeführt.

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Synthese des zyklI sehen ißradykiη I η-Ana logons

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Pile GIy Pro Phe Arg Lys Pro Pro GIy

B BOC-I-ONP H4-OH C BOC D BOC E BOC F BOC-G BOO H . H ¹ L

Z-I-OH H-l-ONB'TosOH-Z

OH H

NO₂ ONB BOC-^OH Z-I-ONP-HCl

ONB-BOC •I IBr ONB BOC

N„H„ HV

»-ONP H--OH

,NO,

/NO₂

/NO₉

/NO₂

Ζ>λ

/NO₂

OH ZfOII I-I-J-OtBu'H

-CF COOH

k>H H

OtBu

'-OtBu
OtBu

OH-HCl

• 2CH COOH

Alle Aminosäuren mit Ausnahme des Glyzins haben L-Konfiguration. Die in offenen Kapillaren festgestellten Schmelzpunkte sind unkorrigiert angegeben. Die Identität der dargestellten Verbindungen wurde mittels Dünnschichtchromatographie mit Silufol-Platten in folgenden Systemen: A - Chloroform - Äthanol - Äthylacetat - Essigsäure ~ Wasser (85:5:8:2:0,25),

B - Chloroform - Äthanol - n-Butanol - Äthylacetat - Wasser (10:6:4:3:1),

C - Chloroform - Methanol - Wasser (40:30:5), D - Butanol - Essigsäure - Wasser (4:1:1), E - Äthylacetat - Pyridin - Essigsäure - Wasser (5:5:1:3) sowie durch Elektrophorese mit Papier FN 16 in 1 N oder 5 N Essigsäure geprüft. Die eIektrophoretische Beweglichkeit Ejt. wurde im Verhältnis zu Histidin bestimmt. Stoffliche Flecken wurden durch Betrachten der Chromatogramme in ultraviolettem Licht durch Besprühung mit Ninhydrin oder mit Hilfe von Chlor und einem Benzidinreagens festgestellt. Bei allen Verbindungen stimmten die Ergebnisse der Elementaranalyse in befriedigender Weise mit dem berechneten Gehalt an C, N und H überein. Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte weitgehend durch protonenmagnetische Resonanz bei 60 mHz. Die chemischen Schübe sowie die Form und Intensität der Signale entsprachen der Struktur von Peptiden. Die Aminosäurenanalyse wurde mit dem Gerät BIOCAL-200 durchgeführt, nachdem das jeweilige Peptid in einer zugeschmolzenen Ampulle einer 24-stündigen Hydrolyse bei 110⁰C unterzogen worden war.

a) Benzyloxykarbonylprolylglyzin-tert.-butylester ( E 8-9):

Man löste 10,0 g (40 mMol) Benzyloxykarbonylprolin in 50 ml Dimethylformamid, gab 4,45 ml (40 mMol) N-Methylmorpholin und bei -15° (tropfenweise) eine abgekühlte Lösung von 5,3 ml (40 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester in 10 ml Dimethyl-

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formamid hinzu. Dann wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei -15° gerührt und eine abgekühlte Suspension von 10,6 g (50 mMol) Glyzin-tert.-butylesterphosphit in 100 ml Dimethylformamid und 0,56 ml (50 mMol) N-Methylmorpholin zugegeben. Es wurde weitere 30 Minuten bei -15° gemischt und dann das Reaktionsgefaß 15 Minuten lang bei -10° stehengelassen. Die Lösungsflüssigkeit wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in einer Mischung von 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser aufgelöst, die Äthylacetatschicht mit Λ0% Kaliumhydrogenkarbonat- und Kaliumhydrogensulfatlösungen und mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft. Der ölige Rückstand wurde durch Behandlung mit einer Äther-Hexanmischung (1:1) kristallisiert.

Ausbeute: 9,2 g "(63 %)

F:. 71-72⁰C; /ocj*⁰ = -49,0° (C = 2, in Dimethylformamid) R_f = 0,55 (A); 0,64 (B); 0,68 (C).

b) Prolylglyzin-tert.-butylester (P 8-9):

5,0 g (13,8 mMol) E 8-9 wurden in einer Lösung von 50 ml Äthanol in Gegenwart von Palladiumschwarz 5 Stunden hydriert, Nach Abfilterung des Katalysators wurde die Lösungsflüssigkeit eingedampft, der Rückstand in einer Mischung von trokkenem Äther und Hexan (1:2) aufgelöst und nochmals eingedampft. Hierbei fand ein Kristallisierungsprozeß statt, und nach völliger Eindampfung blieb eine farblose kristalline Substanz übrig. Ausbeute: 2,8 g (89 %), P: 56-57°C. /jxJq⁰ = -38,6° (c = 1, in Dimethylformamid), E_H±s =0,83 (1 N Essigsäure). R_f = 0,28 (B); 0,15 (D); 0,70 (E).

c ) CC -Benzyloxykarbonyl- €- - (tert. -butoxykarbonyl-^ nitroarginyl)lysin-p-nitrophenylester (C 5-6):

Einer Lösung von 12,8 g (34,3 mMol) tert.-Butoxykarbonyl-o)-nitro-arginin und 3,8 ml (34,3 mMol) N-Methylmorpholin in

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100 ml Dimethylformamid wurden bei -15°C 4,63 ml (34,3 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester, danach 10,0 g (22,8 mMol) CL-Benzyloxykarbonyllysin-p-nitrophenylesterhydrochlorid in Pulverform beigegeben. Es wurde 30 Minuten bei -10°C gemischt und dann im Laufe von zwei Stunden tropfenweise eine Lösung von 2,55 ml (22,8 mMol) N-Methylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid zugesetzt. Man mischte nochmals 30 Minuten bei -20⁰C und gab dann 1,33 ml (12,1 mMol) ß-Dimethylaminoäthylamin zu. Nach weiterem halbstündigem Umrühren wurde die Lösungsflüssigkeit eingedampft und der Rückstand in einer Mischung von 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser gelöst. Die Äthylacetatschicht wurde mit 10 % Lösungen von Kaliumhydrogenkarbonat und Kaliumhydrogensulfat (zweimal) sowie mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft. Das Ergebnis war eine gelbliche amorphe Substanz. Ausbeute: 13,5 g (86,5 %). R_f = 0,80 (A); 0,90 (D). £<<Jq⁰ = -20,9° (c = 1, in Dimethylformamid).

d) oc -Benzyloxykarbonyl- £- - (tert. -butyloxykarbonyl- CO nitroarginyl)lysylprolin (D 5-7):

10,0 g (14,2 mMol) C 5-6 wurden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, 2,46 g (21,4 mMol) feingeriebenes Prolin und 1,66 ml (1,49 mMol) N-Methylmorpholin zugegeben und in einem Magnetrührer 20 Stunden umgerührt. Danach wurde die Lösungsflüssigkeit eingedampft, der Rückstand in einer Mischung von 100 ml Äthylacetat und 100 ml 10 % Kaliumhydrogensulfatlösung gelöst, die Wasserschicht abgeschieden, die Äthylacetatschicht mit 10 % Kaliumhydrogensulfatlösung und anschließend mit 10 % Kaliumhydrogenkarbonatlösung extrahiert. Die Wasser- und Hydrogenkarbonatschicht wurde abgeschieden, mit überschüssiger 10 % Kaliumhydrogensulfatlösung auf pH 2 eingestellt und mit Äthylacetat (2 χ 100 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft. Das Ergebnis war eine farblose amorphe Substanz. Ausbeute: 7,9 g (82 %). /ocj^° = -23,1° (c = 1, in

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Dimethylformamid). R_£ = 0,54 (A); 0,81 (D).

e) OC-Benzyloxykarbonyl-&-(aJ -nitroarginyl)lysylprolintrifluoracetat (E 5-7):

5,0 g (7,37 mMol) D 5-7 wurden bei 0°C in einer Mischung von Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1:1) gelöst, 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und anschließend bei Zimmertemperatur zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit trockenem Äther verrieben, die hierbei entstandene feste Substanz gefiltert und auf dem Filter mit trockenem Äther gewaschen. Das Ergebnis waren 5,0 g (98 %) einer farblosen amorphen Substanz. Etj. = 0,49 ( 5 N Essigsäure), /cc7q° = -11,1° (c = 1, in Dimethylformamid). R_£ = 0,57 (C); 0,70 (E).

_ f) tert.-Butoxykarbpnyl-phenylalanil-glyzin (C 1-2):

6,4 g (16,6 mMol) tert.-Butoxykarbonyl-phenylalanin-p-nitrophenylester, 1,13 g (15 mMol) Glyzin und 1,67 ml (15 mMol) N-Methylmorpholin wurden in einer Mischung von 200 ml Dimethylformamid und 20 ml Wasser gelöst, die Lösung 20 Stunden bei Zimmertemperatur gelagert, eingedampft und das im Rückstand gebliebene Öl in einer Mischung von 80 ml 10 % wässeriger Kaliumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wurde abgeschieden, die Wasserschicht mit Äther (50 ml) extrahiert und mit überschüssiger 1056 wässeriger Kaliumhydrogensulfatlösung auf pH 2 eingestellt. Die gewonnene Lösung wurde mit Äthylacetat (2x50 ml) extrahiert, der Auszug mit 50 ml Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und zur Trockne eingedampft. Das Ergebnis war eine farblose kristalline Substanz. Ausbeute: 4,0 g (82,7 %). Für analytische Zwecke wurde aus Äthylacetat kristallisiert. F: 165⁰C, Z²*^⁰ = -9,0° (c =1, in Dimethylformamid). R_f =0,85 (A); 0,90 (B); 0,88 (C).

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g) tert. -Butoxykarbonyl-phenylalanylglyzylprolylphenylalanin-p-nitrobenzylester (D 1-4):

2,80 g (8,7 mMol) C1-2 wurden in 50 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 1,84 g (10 mMol) Pentrafluorphenol zugegeben, auf -20° abgekühlt, 1,90 g (9,2 mMol) Dicyclohexylkarbodiimid zugesetzt, bis zur Auflösung des letzteren geschüttelt und 30 Minuten bei 0° stehengelassen. Anschließend gab man 4,15 g (8,7 mMol) Prolylphenylalanin-p-nitrobenzylesterhydrobromid (C 3-4) (A.P. Pavar, G.I. Chipens, Zh. obshch. khim., 41, 459 (1971)) und 0,97 ml (8,7 mMol) N-Methylmorpholin zu. Mit dem Fortschreiten der Reaktion wurde bei Zimmertemperatur unter pH-Kontrolle (durch Auftropfen der Lösungsflüssigkeit auf feuchtes Indikatorpapier) zur Aufrechterhaltung von pH 8 tropfenweise N-Methylmorpholin zugesetzt. Drei Stunden nach Zugabe der Aminokomponente wurde die Mischung eingedampft, dem Rückstand 100 ml Methylenchlorid zugegeben und gefiltert. Das Filtrat wurde der Reihe nach mit 10 % Kaliumhydrogenkarbonat- und Kaliumhydrogensulfatlösungen und mit Wasser gewaschen, über entwässertem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Ergebnis war eine ölige Substanz, die durch Verreiben mit trockenem Äther kristallisiert wurde. Ausbeute: 5,4 g (88,4 %), F: 125-155. ß>Cj^ = -45,6° (c = 1, in Dimethylformamid). R_f = 0,88 (A); 0,91 (B); 0,91 (D).

h) tert.-Butoxykarbonylphenylalanylglyzylprolylphenylalaninhydrazid (E 1-4):

3,0 g (4,26 mMol) D 1-4 und 1,0 ml Hydrazinhydrat wurden eine Stunde bei 70° in 30 ml Äthanol gewärmt, anschließend filtriert, das Filtrat mit 50 ml Wasser versetzt und 20 Stunden bei -10° gelagert, abgefiltert und die Kristalle auf dem Filter mit 30 ml 50% wässerigen Äthanols, danach mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral reagierte. Getrocknet wurde im Exsikkator mit P₂ ⁰5* Ausbeute: 2,3 g (92,8 %). F: 140 160°. JP<J^ = -59,8° (c = 1, in Dimethylformamid). R_f =

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0,93 (A); 0,92 (B); 0,91 (D).

i) (V-Benzyloxykarbonyl-ξ, -(tert.-butoxykarbonylphe- nylalanylglyzinprolylphenylalanyl-Oi -nitroarginyl)lysylprolin (F 1-7):

2,1 g (3,62 mMol) E 1-4, wurden in 50 ml Dimethylformamid
gelöst, auf -30° abgekühlt und unter Umrühren eine abgekühlte (-70°) Mischung von 3,5 ml (15,7 mMol) 4,5 η-Lösung trokkenen Chlorwasserstoffs in Tetrahydrofuran und 20 ml Äthylacetat zugegeben. Dann wurde bei -30° tropfenweise eine abgekühlte Lösung von 0,45 ml (3,87 mMol) tert.-Butylnitrit
in 10 ml Äthylacetat zugesetzt, 30 Minuten bei -25 stehengelassen, 1,76 ml (15,8 mMol) N-Methylmorpholin und anschließend eine Lösung von 2,68 g (3,87 mMol) E 5-7 und
0,44 ml N-Methylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Tage bei -10° gelagert,
eingedampft, der Rückstand in einem Gemisch von 100 ml Methylenchlorid und 100 ml Wasser gelöst. Die Methylenchloridschicht wurde abgetrennt, der Reihe nach mit 10 % Kaliumhydrogenkarbonat- und Kaliumhydrogensulfatlösungen und mit
Wasser (je 100 ml) gewaschen, mit trockenem Magnesiumsulfat entwässert, gefiltert und eingedampft. Das Ergebnis war ein öl, das beim Verreiben mit einer Mischung von Äther und '
Äthylacetat (1:1) auskristallisierte. Ausbeute: 3,50 g
(85,8 %), F: 140-177°. /K7p° = -44,1° (c = 1, in Dimethylformamid). R_f =■■ 0,53 (A); 0,84 (B); 0,87 (D).

Ö) ΰί-Benzylaoxykarbonyl- £ -(tert.-butoxykarbonylphenylalanylglyzylprolylphenylalanylöj-nitroarginyl) lysylprolylprolylglyzin-tert.-butylester (G 1-9):

2,70 g (2,40 mMol) F 1-7 wurden in 40 ml Dimethylformamid
gelöst, auf 0° abgekühlt und 2,19 g (2,89 mMol) der Komplexverbindung Dicyclohexylkarbodiimid mit Pentafluorphenol
("Komplex F") (J. Kovacs, L. Kisfaludy, M.Q. Ceprinir, J.
Am. Chem. Soc. 89_, 183 (1967)) und 1,1 g (4,8 mMol) Prolyl-

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glyzin-tert.-butylester (F 8-9) zugegeben. Danach wurde 20 Stunden bei Zimmertemperatur gelagert, eingedampft, der Rückstand in 50 ml Methylenchlorid aufgelöst, gefiltert, das FiItrat mit 50 ml 10% Kaliumhydrogensulfatlösung und 50 ml Wasser gewaschen, mit trockenem Magnesiumsulfat entwässert, gefiltert und eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal in einer minimalen Menge Methylenchlorid gelöst und mit Äther ausgefällt. Ausbeute: 2,8 g (87,2 %), F: 150-193°, £*J*° = -60,3° (c= 1, in Dimethylformamid). R_f = 0,57 (A); 0,68 (B); 0,60 (D).

k) U-Benzyloxykarbonyl-£ - (phenylalanylglyzylprolylphenylalanyl-ω-nitroarginyl)lysylprolylprolylglyzinhydrogenchlorid (H 1-9):

1»⁸ g O »346 mMol) G 1-9 wurden bei 0° in 50 ml einer Mischung von Trifluoressigsäure mit Methylenchlorid (1:1) gelöst,20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und bei 0° eingedampft. Der Rückstand wurde durch Verreiben mit 20 ml trockenen Äthers kristallisiert, in 10 ml trockenen Dimethylformamids gelöst, 0,33 ml (1,5 mMol) einer 4,5 n-Lösung wasserfreien Hydrogenchlorids in Tetrahydrofuran zugegeben und mit 100 ml trockenen Äthers ausgefällt. Ausbeute: 1,55 g (95 %), F: 140-192°, ßxj^⁰ = -77,8°, R_f = 0,73 (C); 0,74 (E).

1) Cyclo-Zbo--benzyloxykarbonyl-£ -(phenylalanylglyzylprolyl-phenylalanyl- ω -nitroarginyl) Iysylprolylprolylglyzyl7 (I 1-9):

1»1 g (0,91 mMol) H 1-9 wurde in 2 1 Dimethylformamid gelöst (dieses war unmittelbar vor der Benutzung mit Bariumoxid entwässert und mit Ninhydrin destilliert worden). In einer Atmosphäre wasserfreien Argons wurde unter Umrühren bei 0° 1,5 g die Komplexverbindung Dicyclohexylkarbodiimid mit Pentafluorphenol (1:3) ("Komplex F") (J. Kovacs, L.Kisfaludy, M.Q. Ceprini, J.Am. Chem. Soc, 89, 183 (1967)) zu-

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gegeben. Danach setzte man unter Umrühren in Argonatmosphäre bei Zimmertemperatur im Laufe von 6 Stunden eine Lösung von 0,19 ml (1,38 mMol) Triäthylamin in 300 ml Dimethylformamid zu. Die so erhaltene Mischung wurde 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stehengelassen und bei 28° eingedampft. Der ölige Rückstand wurde durch Verreiben mit trockenem Äther kristallisiert, gefiltert, der Filterrückstand mit Äther und anschließend mit Wasser gewaschen. Das gewonnene Produkt untersuchte man mittels Dünnschichtchromatographie im System B. Es wurde angenommen, daß die Substanz mit R« =0,6 das benötigte Cyclopeptid ist (eines der Hauptprodukte der Cyclisierung, chromatographisch beweglich, in UV-Licht und durch Bearbeitung mit einem Benzidinreagens erkennbar). Das Cyclisierungsgemisch wurde vorher in einer kleinen Säule (2x100 cm) mit Silikagel gereinigt (mittlere Teilchengröße 20jum, ■ erhalten durch Fraktionierung von Silikagel 5/40 um der Firma "Chemapol", CSSR). Als Elutionsmittel diente das System Chloroform-Äthanol-n-Butanol-Äthylacetat (10:6:4:3); hierbe i wurde Dicyclohexylharnstoff und eine Reihe von Peptidstoffen abgeschieden. Die Fraktionen, die das mutmaßliche Cyclopeptid enthielten, reinigte man nochmals in einer Säule mit Silikagel (3 x 250 cm, mittlere Teilchengröße 20 jam) mit dem System B als Elutionsmittel, indem man Fraktionen je 20 ml auffing und die Sorption bei 280 nm ("Uvicord IIⁿ) registrierte. Die Fraktionen ^5 bis 66 wurden eingedampft und der Rückstand mit Äther bearbeitet. Das Ergebnis waren 102 mg (9,7 %) einer kristallinen Substanz, F: 163-165°, chromatographisch rein (mittels Dünnschichtchromatographie auf "Merck"-Platten in 6 Systemen geprüft). R_f = 0,47 (B). Mol.-Gew. 1024 (kryoskopisch mittels Harnstoffschmelze bestimmt) (A.J. Berlin, Die Technik der Laborarbeiten in der organischen Chemie, Moskau, Goschimizdat, 1963, S. 348, in Russisch) laut Formel berechnet 1163, 313. D*J^ = -64,1 (c = 0,5 in Dimethylformamid), R_f = 0,37 (A); 0,43 (B),- 0,89 (C); 0,37 (D); 0,96 (E).

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m) Cyclo-/^ £. -phenylalanylglyzylprolylphenylalanylarginyl)-lysylprolylprolylglyzyl/diacetat (Cyclo-/(N^ -1-L-Iysin,6-glyzin)-bradykinin7 (J 1-9):

50 mg (0,043 mMol) 11-9 wurden in 5 ml Essigsäure gelöst und 20 Stunden in Gegenwart von Palladiumschwarz hydriert. Dann filterte man den Katalysator ab und lyophilierte das Filtrat. Der Rückstand wurde aus 10 ml Fasser lyophilisiert, nochmals in 10 ml Wasser gelöst, durch einen "Synpor"-Membranfilter filtriert und erneut lyophilisiert. Das Ergebnis war ein weißes lockeres Pulver, chromatographisch homogen, /o*Jn°= -76° (c = 0,65, in H₂O), Ausbeute: 45,7 mg (96 %), ^EHis ⁼ °'⁶⁵ (^{1 N Essi}g^säure)· ^Rf = 0>⁶9 (^E)·

Aminosäurenanalyse: Prolin 2,83, Glyzin 1,90, Phenylalanin 1,93, Lysin 1,00, Arginin 1,23. Bei Trypsinspaltung (T. Devenal, J. Gergey, Aminosäuren, Peptide und Eiweißstoffe, Moskau, Mir, 1976, S. 168 in Russisch) des Präparats wird nur eine Substanz (Ε_Η^ = 0,82 1 N Essigsäure) gebildet, was ein Beweis für den cyclischen Aufbau des Peptids ist.

Biologische Prüfungsergebnisse

Die blutdrucksenkende Wirkung des Cyclo-^N^--1-L-lysin,6-glyzin)-bradykinins] wurde an narkotisierten Ratten geprüft. Wie die Prüfung zeigte, besitzt das cyclische Bradykininanalogon (ZBA) zum Unterschied vom natürlichen Bradykinin (BK) eine ausgeprägt prolongierte Wirkung. Die Schwellendosis des ZBA beträgt 5jig/kg, diejenige des BK 0,5 jug/kg. Bei einer Konzentration von 50 ug/kg gleicht die blutdrucksenkende Wirkung des ZBA derjenigen des BK, ist jedoch weitgehend prolongiert. Eine durch ZBA bewirkte Senkung des Quecksilberdrucks \um 30 bis 40 mm hält 1 bis 2 Stunden an; 2 bis Stunden nach der Verabreichung steigt der Druck wieder auf 40 bis 50 % des ursprünglichen Standes.

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Bei in-vitro-Versuchen (J.M. van Rossum, Arch. int. Pharmacodyn., 143« 299 (1963)) der isolierten Gebärmutter und dem Krummdarm von Ratten wurde festgestellt, daß· das ZBA in einer Konzentration von 10" bis 10~"^ Mol/l keine myotrope Wirkung hat, wie sie für das natürliche Bradykinin kennzeichnend ist. Die myotrope Wirkung des BK wird vom ZBA bei den angegebenen Konzentrationen nicht beeinflußt.

Die Gefäßdurchlässigkeit (N. Isokane, The Ochanomizu Med. J., 15.« 362 (1963)) wird durch ZBA in geringerem Maße vergrößert als durch Bradykinin; die Reaktionen sind bei Konzentrationen von jeweils 1 mg/kg und 25 Ug/kg vergleichbar.

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Claims

SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK

MARIAHILFPLATZ 5 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-800O MÖNCHEN 95

PROFESSIONAL REPRESENTATIVES ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE

Institut organitscheskogo sinteza Akademii Nauk Latvijskoj SSR

KARL LUDWIG SCHIFF

DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER

DIPL. ING. PETER STREHL

DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF

DIPL. ING, DIETER EBBINSHAUS

DR. ING. DIETER FINCK

TELEFON (O89) 48 SO 6* TELEX 6-23 565 AURO D

TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN

DEA-18959

13. Dezember 1978

CYCLISCHBS BRADYKININ-ANALOGON - CYCLO-[(N -1-L-LYSIN,6-GLYZIN)BRADYKININE

Patentanspruch

Cyclisches Bradykinin-Analogon - Cyclo-j^N -1-L-lysin,6-glyzin)-bradykininj, in dem das N-endständige Arginin des Bradykinins durch L-Lysin ersetzt, Serin in Stellung 6 des Bradykinins durch Glyzin ersetzt, der Cyclus durch eine chemische Peptidbindung, von der Carbonylgruppe des Arginins und der £~Aminogruppe des Lysins gebildet, zusammengeschlossen ist, folgender Struktur:

(Lys)

NH-

-NH,

Γ ^_H ""j ι ^x"2

I 1 ~ I I 2 3 —COCH (CN₉) ₄NH-{-COCHNH

-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-Pro-Phe

(Arg)

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ORIGINAL INSPECTED

"worin "Lys" den L-Lysinrest, "Pro" den L-Prolin-, "GIy" den L-Glyzin-, "Ehe" den L-Phenylalanin- und "Arg" den L-Argininrest bedeutet.

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