DE1493560A1 - Cyclische Peptide und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

Cyclisohe Peptide und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft cyclische Peptide, namentlich Derivate und Analoga natürlicher Hormone vom Oxitocin-, Yasopressin- und Insulintyp, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

R₁-CH-CO-A-B-C-D-CH-CO-R₀
1 I ,2

ClL

-CH,

wobei A, B, C und D L-oC -Amino saurere a te, R.. ein Wasserstoffatom oder eine Aminogruppe, und zwar eine freie oder durch eine schützende Gruppe - wie z. B. eine Benzyloxicarbonyl-, terc. Butyloxicarbonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Tosyl-, iOrmylgruppe, einen L-«6-Aminosäure- oder Peptidkettenrest mit 2 bis 6 L- öl-Aminosäuren oder durch Einführung von schützenden Gruppen modifizierten L-oC-Aminosäurereste - substituierte Aminogruppe, Rp eine Hydroxil- oder Aminogruppe, und zwar eine freie oder den Bestandteil eines L-oC-Aminosäurerestes oder einer Peptidkette bildende Aminogruppe oder irgendeine dieser Gruppen, die durch eine schützende Gruppe modifiziert ist, und X die Gruppe CH₂S, CR₂OH₂, CH₂NH, CH₂O, NHNH oder CONH bedeutet.

Bisher bekannte-Substanzen void. Typ

R⁵-CH.CO-A-B-C-D-NH.CH.CO.R⁴

CH₂S-

JSCHr

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|Alt 7 SI Abs. 2 Nr. 1 Satz 3-des Ändcrunssgc·. v. 4. 9.

wobei A, B, C, D dieselbe Bedeutung wie oben haben, R^ ein Wasserstoffatom oder ein Aminosäure- oder Peptidrest ist, der mit dem Carboxilende gebunden ist, und R eine mit dem Aminende gebundene Kette ist, kommen im menschlichen Organismus oder im Tierorganismus als Hormone vor (Oxitocin, Vasopressin, Yasotocin, Isotocin, Insulin). Diese Hormone, ob sie nun schon aus Naturstoffen isoliert oder neuerdings in einigen Fällen synthetisch hergestellt wurden (Oxitocin, Vasopressin) finden als Arzneien Verwendung. Dieselbe Verwendung finden in letzterer Zeit auch einige synthetische Analoga dieser Hormone, die von der Struktur der Naturhormone durch Substitution oder Funktionsgruppen abgeleitet werden, wobei einige Aminosäurereste durch andere ersetzt werden und ähnlich. Alle diese Substanzen, ob sie nun schon natürlichen oder synthetischen Ursprungs sind, zeichnen sich durch Gegenwart einer CystIm-Disulfidbrücke aus, die einen Teil des zwanziggliedrigen Ringes bildet. Dieser Strukturtyp hat eine Grenzstabilität (Heston G.S., Rydon N.H., Schofield J.A.: J. Chem. Soc. 1956, 3157). Die Formung einer Disulfidbrücke, die in allen bisherigen Synthesen die letzte Reaktionsstufe vorstellt, verläuft darum mit niedriger Ausbeute (du Vigneaud V.U. Mitarb.: J.Am.Chem.Soc. 76, 3115 (1954) Boissonas R.A. "Polypeptideswhich Affect Smooth Muscles and Blood Vessels", ed. Schachter, Pergamon Press, 1960, S. 7-19» Rudinger J., Honzl J., Zaoral M: Coll. Chechoslov. Chem. Coromun. 21, 202 (1956), Chem. Listy 50 288 (1956); namentlich ist die Ausbeute bei den Insulinsynthesen in dieser Endphase sehr gering (Meienhofer J. und Mitarbeiter: Z. Naturforsch. 18, 1120, (1963); Katsoyannis, P. G.Tometsko, A. Fukudak.: J.Am. Chem.Soc. 85, 2863 (1963) und stellt einer praktischen Auswertung die größten Hindernisse entgegen. Darüber hinaus ist die Disulfidbrücke in den Endprodukten chemisch (Ressler Ch.: Science 12ß, 1281 (1958)) und

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metabolisch unbeständig (Rychlik I.: Oxitooin, Vasopressin and their Sutructural Analogues, Proc. Second Int. Pharm. Meeting, Pergamon Press, 1964, S. 153 - 162; Tomizawa H.H.: H. Biol. Chem. 237, 3393 (1962) und dessen Reaktionen bilden den Hauptgrund für die Aktivitätsverluste dieser Hormone, Basselbe gilt auch für die bisher synthetisch hergestellten biologisch aktiven Analoga. Andererseits wurde bisher allgemein vorausgesetzt, daß die Gegenwart einer Disulfidgruppe in einem Ring von dieser Größe eine unerläßliche Voraussetzung für die biologische Wirkung dieser Größenordnung bildet, wie sie die Naturhormone aufweisen (Jarvis D., du Vigneaud V.: Science 143, 545 (1964), und auf dieser Voraussetzung beruhen auch die üblichen Theorien über den Hechanismus dieser Hormone. Man mußte demnach voraussetzen, daß die aus der Gegenwart der Disulfidbrücke im zwanziggliedrigen Ring erwachsenden Nachteile nicht beseitigt werden können, ohne daß dies auch den Verlust der biologischen Aktivität zur Folge hätte.

Es gelang nun die Beweisführung, daß auch in Substanzen, in denen die Disulfidbrücke durch andere Atome oder Gruppen ersetzt wurde, die hochstehende biologische Aktivität, die für das Molekül des Prototyps charakteristisch ist, erhalten bleibt.

Sin Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptides besteht darin, daß auf nicht cyclische Peptide oder deren Derivate, die die Gruppe X enthalten, mit Reagenzien eingewirkt wird, die eine Peptidbindung bilden, wie z. B. mit Dioyclohexylcarbodiimid, Chlorameisensäure, see. Butylester, N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3¹-sulfonet uow..

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Die erfindungsgemäßen Substanzen sind Analoga der biologisch, aktiven Peptide mit einer Disulfidbrücke. Bei Erhaltung der biologischen Hauptwirkung der natürlichen Hormone haben die Substanzen eine viel größere chemische Stabilität. Sie können in festem. Zustand aufbewahrt werden, ihre Lösungen lassen sich in einem größeren pH-Wert-Bereich bereiten, die Lösungen können durch Erhitzen sterilisiert werden ubw. Die erfindungsgemäßen Substanzen können mit Arzneimitteln kombiniert werden, die Zusätze mit z. B. Reduktionseigenschaften enthalten, die mit Disulfiden reagieren. Bei der Synthese von Verbindungen mit einer größeren Anzahl von Disulfidbrücken wird durch Ersatz der Disulfidbrücke durch die Gruppe X, wobei X dieselbe Bedeutung wie oben hat, die Wahrscheinlichkeit des Zustandekommens der restlichen Disulfidgruppen auf die gewünschte Art erhöht und damit vergrößert Bich auch die Ausbeute des aktiven Produkts.

Beispiel 1 Benzyloxioarbonyl-tyrosyl-iBoleucyl-glutaminyl-asparaflinyl- S-benzyl-cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid

Zu einer Lösung von Benzyloxicarbonyl-tyrosinhydrazid (1,0 g) in einem Gemisch von Tetrahydrofuran (10 ml) und azeotroper Chlorwasserstoff säure (1,50 ml), das auf -15⁰C abgekühlt wurde, wurde unter Rühren eine Lösung von 3,75 M Natriumnitritlösung in Wasser (0,90 ml) zugegossen. Nach 10 Minuten wurde das Reaktionsgemisch bei -15⁰C mit vorgekühltem. Essigsäureäthylester (40 ml) verdünnt und bei -15⁰C mit einer 3# Natriumbicarbonatlösung in der Sole ausgeschüttelt. Nach kurzem Trocknen mit Natriumsulfat ⁽ wurde die Azidlösung zu einer Lösung von Isoleucylglutaminyl-aeparaginyl-S-Benzylcysteinyl-prolyl-leuqa.-glycinamid (2,5 g) in Dimethylformamid (80 ml) gegeben.

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Nach zwölfstündigem Stehen bei O⁰C wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne gedampft, der Rückstand wurde mit verdünnter Salzsäure verrieben, abfiltriert und mit verdünnter Salzsäure und Wasser durchgewaachen. Fach der Kristallisation aus wäßrigem Dimethylformamid wurden 2,49 g (80?ί) des Produkts mit Schmelzpunkt 214-217⁰C erhalten. Daa Analysenmuster wurde auf dieselbe Weise zweimal umkristallisiert, wobei jedoch keine Änderungen im Schmelzpunkt ersichtlich waren. Der Analyse nach ist das Produkt ein Hemihydrat.

I¹Ur C₅₅H₇₅H₁₁O₁₅S^S H₂O (1140,3)

berechnet: 57,95 # C, 6,72 56 H, 13,52 # N, gefunden: 57,99 # C, 6,81 £ H, 13,47 $ N.

y-Jodbutteraäure-terc. butylester

Zu einer Lösung von V-Jodbuttersäure (48 g) in Essigsäure terc. butylester (900 ml) wurde 70 °ß> Überchlorsäure (3,6 ml) beigefügt. Nach dreitägigem Stehen bei Laboratoriumstemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit einer 5 ^-Lösung von Natriumcarbonat und Wasser geschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und das terc. Butylacetat im Vakuum im Stickstoffstrom abgedampft. Das Produkt wurde in Stickstoffatomosphäre destilliert; Ausbeute 32 g (42 56) der Substanz mit Siedepunkt 95 - 100°C/5 ram Hg, n^° 1,4840.

Mr G₈H₁₅JO₂ (270,1)

berechnet: 35,57 1» C, 5,60 $ H, 46,98 °/o J, gefunden: 35,47 # C, 5,50 $> H, 46,86 # J,

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Tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (3-carboxipropyl) cysteinyl-prolyl-leucylglyoinaroid

Das Benzyloxicarbonyl-oetapeptid-Amid (1,71 g) wurde in flüssigem Ammoniak (150 ml, über Natrium destilliert) gelöst und zu der Lösung in "kleinen Mengen Wasserstoff zugeführt, bis eine 8 Minuten dauernde Dunkelblaufärbung eintrat. Nach Entfärbung durch Ammoniumchlorid wurde zum. Reaktionsgeroisch terc. Butylester der /-Jodbuttersäure (1,14 g) gegeben, die Lösung wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und lyofilisiert. Das Lyofilisat wurde in Wasser gelöst, das pH wurde mit 1 N Salzsäure auf den Wert 6 bis 6,5 gebracht und das ausgeschiedene halbstarre Öl mit Wasser verrieben, bis die Substanz kristallin wurde. Nach Abfiltrieren wurden die Kristalle mit Wasser und Äther ausgewaschen; Ausbeute 0,65 g. Der so erhaltene Rohester wurde in wasserfreier Trifluoressigsäure gelöst (20 ml) und das Reaktionsgemisch nach zweistündigem Stehen bei Laboratoriumstemperatur im. Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 $6 Äthylalkohol gelöst und über eine Sulfonationsaustauschersäule (Zerolit 225 im H⁺-Zyklus) filtriert. Die Ionexsäule wurde mit Wasser bis zu neutralem. pH ausgewaschen und das Produkt mit 10 °/o Pyridinlösung freigesetzt. Nach Einengen im Vakuum, und nach Lyofilisierung wurde das Produkt an einer Dowex-Anionenaustauschersäule 1X2 (200 - 400 mesh, Pyridinacetatcyclus) chromatographiert, wobei die Gradientenelution (1 i> Pyridinlösung - 2 °ß> Essigsäurelösung) zur Anwendung gelangte. Das Produkt wiirde aus der Kolonne bei einem pH-Wert von 5,5 eluiert und mittels Lyofilisierung isoliert; Ausbeute 0,14g Das zur Analyse bestimmte Muster wurde aus einem. Methyl-

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alkohol-Äthergemisch ausgefällt, Schmelzpunkt 145, 147⁰C Für O₄₄H₆₉N₁₁O₁₅S . 2H₂O (1028,1)

berechnet: 51,41 # C, 7,16 $> H, 14,99 # Ή, gefunden: 51,48 $> C, 7,33 1» H, 14,64 % N.

Analyse der Aminosäuren:

Asp 0,97 Cys (CHg)₃CO₃H 0,83, GIu 094, GIy 0,80, lie 1,04, Leu 1,00, Pro 0,86, Tyr 0,91.

Das Produkt ist elektrophoretisch und chromatographisch homogen.

Lactam des tyrosyl-iBoleuoyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(3-carboxlpropyl) oysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamids ("Deamino-oarba -oxitooln")

a) Cyclisierung duroh das Woodward-Reagens K

Zu einer Lösung von Aoyolopeptid (54,4 mg) in Dimethylformamid (8 ml), die auf O⁰C abgekühlt wurde, wurde unter Rühren N-Äthyl-5-phenyl-isoxazolin-3'-sulfonat (Woodward-Reagens E) (13,2 mg) zugefügt. Nach zweistündigem Stehen bei O⁰C wurde das Reaktionsgemisch mit Dimethylformamid verdünnt (8 ml) und N-Äthylpiperidin (5,85 mg) zugesetzt. Nach neuntttgigem Rühren bei Laboratoriumstemperatur wurde das Reaktionsgemisoh zur Trockne abgedampft, der Rückstand wurde in Wasser (50 ml) gelöst und sukzessiv über die Ionenaustauscher Dowex 50, Amberlit IR-4B und Zerolit 225 filtriert. Aus den Eluaten wurden nach Eindiokung und Lyofilisierung 16,6 mg des Produktes erhalten, das elektrophoretisch und ohromatographiBoh einheitlich war (negative Ninhydrinreaktion, positive Paulisehe Reaktion und Platin!jod-Reaktion) und das naoh dem Analysenwert für Stickstoff 80 $> peptidiscb.es Material enthält.

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U93560

Sie Analyse der Aminosäuren: Asp 1,10, CyS(CCHp)₅ COOH) 0,70, GIu 0,90, GIy 1,00, lie 0,95, Leu 1,04, Pro 1,00, Tyr 0,70.

Biologische Aktivitäten: oxitocinische Aktivität am Uterus der Ratte in vitro gemessen: 60 Int. Einheiten/mg; vasodepressorische Aktivität: 25 Int. Einheiten/mg; antidiuretische Aktivität an einer intakten Ratte in Alkoholnarkose gemessen: 1 Int. Einheit/mg.

b) Cyclisierung mittels der Anhydrid-Methode

Zu einer Lösung von Acyclo-peptid (13,1 mg) in Dimethylformamid (1,5 ml), die auf -15⁰C abgekühlt wurde, wurde der see. Butylester der Chlorameisensäure (1,82 mg) gegeben. Nach zehnminutigem Stehen bei -15⁰C wurde das Reaktionsgemisch auf 2⁰C erhitzt, mit Dimethylformamid verdünnt (2 ml) und mit N-Äthylpiperidin (1,50 mg) neutralisiert. Nach 24 stündigem Stehen bei Laboratoriumstemperatur wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und der Rückstand, nachdem er im Wasser gelöst wurde, auf dieselbe Weise wie in Absatz a) verarbeitet. Die Ausbeute betrug 4,5 mg des Produkts, das elektrophoretisch und chromatographisch einheitlich und nach den Konstanten mit der unter a) hergestellten Substanz identisch war.

Beispiel 2

U -Tosylamino- β-Chlorbuttersäure-tero.Butylester

Zu einer Lösung von et -Tosyl-L- oL, Jf-diaminobuttersäure (5,5 g) in azeotropischer Chlorwasserstoffsäure (100 ml), die auf 80⁰C erhitzt wurde, wurde innerhalb 5 Minuten Natriumnitrit (40 g) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde naoh Abkühlen auf Laboratoriumstemperatur ausgeäthert, die Ätherschicht wurde wit einer 5 ί> Überchlorsäurelösung ausgewaschen, dann mit Wasser und schließlich mit Natriumsulfat getrocknet und der Äther wurde im

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Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in tero. Butyl-Essigsäureester (100 ml) gelöst, dann wurde 70 fi Über-, ohloreäure zugefügt und das Reaktionsgemisch 3 Tage bei Laboratoriumstemperatur stehen gelassen. Nach dem Durohwasohen mit 5 # Natriumbioarbonatlösung und Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in Äther gelöst und bei O⁰C über Nacht stehen gelassen. Die abge schiedenen Kristalle des «*~Tosylamino-butyrolacetons wurden abfiltriert, Schmelzpunkt 136 - 138⁰C.

Für G₁₁H₁₃NO₄S (255,3)

berechnet: 51,75 # C, 5,13 # H, 5,49 #■ N, gefunden: 51,71 # C, 5,22 # H, 5,48 <?o N.

Die ätherischen Mutterlaugen wurden zur Trockne abgedampft, und der Rüokstand wurde aus wäßrigem Äthanol kristallisiert, 0,76 g des Produkts mit Schmelzpunkt 85 bis 90⁰C wurden gewonnen. Das für die Analyse bestimmte Muster wurde 2 mal umkristallisiert, Schmelzpunkt 81 - 83⁰C.

Für C₁5H₂₂NO₄SCl (347,9)

berechnet: 51,78 $ C, 6,37 $> H, 4,03 # N, 9,22 <fi S,

10,19 # Cl, gefunden: 51,76 $ C, 6,56 # H, 4,25 $> N, 8,94 5* S,

10,39 i» Cl.

⁰¹—Tosylamino- t -Jodbuttersäure-tero. Eutylester

Der Chlorester (1,Og) wurde durch Erhitzen in Aceton (40 ml) mit Natriumiodid (3,0 g) in den Jodester umgewandelt. Nach Abfiltrieren des abgeschiedenen Natriumchlorids wurde das Aceton durch Äther ersetzt, die Ätherlösung wurde auf O⁰C abgekühlt und das abgeschiedene

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- ίο -

οί. -Tosylaminobutyrolaceton abfiltriert. Der Äther wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus wäßrigem Äthanol kristallisiert; Ausbeute 1,60 g der Substanz mit Schmelzpunkt 89 - 92⁰G.

Für C₁₅H₂₂NO₄SJ (439,2)

berechnet: 28,89 Ί» J,
gefunden: 28,64 # J.

N-Tosyl-carba -oxitocin

N-Benzyloxicarbonyl-S-benzyl-octapeptid-Amld wurde mit Natrium in flüssigem Ammoniak reduziert und in situ mit demoL-Tosylamino-r-Jodbuttersäure-terc. Butylester, wie bei dem Deamino-carba-oxitocin, alkyliert. Das Rohprodukt wurde mit Triofluoressigsäure hydrolisiert, die Trifluoressigsäure wurde mit Hilfe von Zerolit 225 beseitigt und das Produkt an einer Dowex 1 X 2-Säule unter Anwendung der Gradientenelution chromographiert. Das erhaltene Produkt (ehromatographisch und elektrophoretisch homogen) wurde mit Hilfe des Woodwardschen Reagens K in Dimethylformamidlösung analog dem. Deamino-Analogen cyclisiert.

PUr 051H₇₄N₁₂O₁₄S₂ . 4H₂O (1216,4)

berechnet: 50,37 i> C, 6,79 °ß> H, 13,82 $> N, gefunden: 50,60 $> C, 6,47 i> H, 13,91 % N.

Durch Reduktion mit Natrium, in flüssigem Ammoniak wurde ein Produkt erhalten, das oxitocinische, vasopressinische und antidiuretische Aktivität aufwies.

Beispiel 3

£-Methyl- eL -aminosuberathydrochlorid Einer Suspension von oC-Amlnosuberinsäure (2,85 g)

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-H- U93560

(FarkalioTa H., Rudinger J.: Coll~GzechoeloT.Chem.ComiD.un. 30, 3117 (1965) ) in Methanol (45 ml) wurde eine Lösung Ton 5 H Chlorwasserstoffsäure in Methanol (9 ml) zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde 30 min bei Zimmertemperatur gehalten, dann unter Termindertem Druck zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Methanol aufgenommen, die Lösung erneut zur Irookne unter Termindertem Druck eingedampft und der Vorgang noch einmal wiederholt. Der Rückstand wurde in Methanol (15 ml) aufgenommen, das Hydroohlorid mit Äther (50 ml) ausgefällt und 2,3 g (64 ?6) elektrophoretisch homogenes Material mit einem Schmelzpunkt τοη 222 - 230⁰C gewonnen. Für die Analyse wurde eine Probe in Methanol-Äther umkristallisiert; Schmelzpunkt 225 - 235⁰C.

Für C₉H₁₈ClHO₄ (239,7)

berechnet: 45,09 Ί» C, 7,57 ί> H, 5,84 # N, gefunden: 45,27 Ί» C, 7,67 # H, 5,91 + N.

Dioyclohexylaminsalz des £-Methyl-benzyloxyoarbony1- ■oL -aminosuberats. ά

£-Methyl-ot-aminosuberathydroohlorid (1,03 g) in Wasser wurde mit Benzylchloroformiat (0,8 ml) und 5#iger NaHCO,-LÖBung (30 ml) 1 1/2 Stunden geschüttelt und während dieser Zeit 1N NaOH (20 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde mit Äther gewaschen, angesäuert und das Produkt mit Äthylaoetat extrahiert; der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in Äther gelöst, Dioyolohexylamin (0,45 ml) zugesetzt und die Misohung mit Petroläther extrahiert. Das duroh Abkühlen auf O⁰O abgeschiedene kristalline Salz wurde am Filter gesamm/elt und mit Äther gewaschen; Ausbeute 1,14 (54 #), Schmelzpunkt 120 - 123⁰C

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°28^H46^N2°6 (506,7)

berechnet: 66,37 # 0, 9,15 1> H, 5,53 i» F, gefunden: 66,50 # C, 8,84 # H, 5,46 # H.

Benzyl oxy carbonyl- °<—aminosuberyl-prolyl-leucyl-glycinamid £-methylester

Das Dioyclohexylaminsalz des ß-Methylbenzyloxycarbonyl-eL-suberats (0,51 g) in 5O?6igem wäßrigen Methanol wurde mit einem Überschuß von stark saurem. Kationaustauscher, z. B. Zerolit 225 (^säureform), geschüttelt, das Harz abfiltriert, die Lösung unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand mit Benzol azeotropisch getrocknet. Er wurde dann in Dimethylformamid (3 ml) zusammen mit Prolyl-leucylglycinamid (0,32 g) gelöst und Dicyclohexylcarbodiimid (0,23 g) in Acetonitril (5 ml) zugesetzt. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während 24 Stunden wurde die Lösung mit Äthylacetat verdünnt, filtriert und das Filtrat zur Trockne abgedampft. Der Rückstand wurde noch einmal in Äthylacetat aufgenommen, die Lösung filtriert und mit 1 N HCl, Wasser, 0,5N NaHCO, und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in ein amorphes Pulver (0,55 g) durch Zerreiben unter Äther verwandelt; die Elektrophorese nach der Behandlung mit Bromwasserstoff in Essigsäure zeigte, daß das Produkt vollkommen homogen war.

Benzyloxyoarbonyltyrosyl-iBoleucyl-ftlutaminyl-asparafcinylel-aroino-Buberyl-prolyl-leucyl-glvcinamid- £-methylester.

Benzyloxycarbonyl-ci -aminosuberyl-prolyl-leucyl-glycinamidk-methylester (0,55 g), das gemäß dem vorhergehenden Beispiel erhalten wurde, wurde in Essigsäure (1 ml) aufgelöst und mit 35%igem Bromwasserstoff in Essigsäure (3 ml) be-

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handelt. Die Lösung wurde 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt, der Niederschlag abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuumexsikkator über NaOH getrocknet.

Benzyloxyoarbonyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginhydrazid (0,38g) (K.Jo¥t, Coll.Czechöslov.Chem.Commun., im Druck) in Dimethylformamid (H ml), enthaltend 4,5N Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (0,55 ml), wurde bei -30⁰C mit Butylnitrit (0,062 ml) behandelt und bei derselben Temperatur 4 min länger gehalten. Eine Lösung des Tetrapeptidhydrobormids, wie oben bereitet, in Dimethylformamid (4 ml) wurde zugesetzt und dann folgte N-Äthyl-piperidin (0,45 ml); das Reaktionsgemisch wurde bei O⁰C für 12 Stunden beiseite gestellt und dann unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit 1N HCl zerrieben, abfiltriert und am Filter mit mehr 1N HCl und mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt (0,52 g) (Schmelzpunkt 215 - 218⁰C) wurde mit heißer 0,5N NaHCO₅-Lösung extrahiert und der Rückstand mit Wasser gewaschen. Ausbeute: 0,47 g (82 #); Schmelzpunkt 218 - 220⁰C.

^{Für C}54^H80^N11°16 <¹¹39,2)

berechnet: 56,94 5* C, 7,08 $> H, 13,55 1> N, gefunden: 57,13 t C, 7,08 ?6 H, 13,93 # N.

Tyrosyl-isoleuoyl-glutaminvl-asparaginyl- d -aminosuberylprolvl-leucyl-glToinamid.

Das Benzyloxyoarbonyloctapeptidesteramid (0,25 g), das gemäß dem Vorhergehenden hergestellt war, wurde in Dimethylformamid (12,5 ml) und Wasser (7,5 ml) mit 10 # palladizierter Aktivkohle (0,25 g) in einem Strom von Wasserstoff so lange geschüttelt, bis kein Kohlendioxyd mehr entwickelt wurde. Die filtrierte Lösung wurde bis zur Trockne unter vermindertem Druck einge-

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Γ - 14 -

dampft, der Rückstand mit heißem Methanol zerrieben, die Suspension mit Äther verdünnt, auf O⁰O abgekühlt und das Produkt mit Äther gewaschen; Ausbeute 0,17 g (77 #). Die Anwesenheit der erwarteten Aminosäure wurde nach Säurehydrolyse durch Chromatographie und Elektrophorese nachgewiesen. Das Material wurde in 50#igem Methanol (9 ml) gelöst, mit 1N NaOH (1,2 ml) behandelt, auf 2 Stunden bei Zimmertemperatur beiseitegestellt und dann über eine Säule von schwach saurem Kationj austauscher, ζ. B. Amberlite DRC-50 (Ammoniumsalz), ^: filtriert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, die vereinigten Eluate zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äther gewaschen. Das Produkt (0,16 g) wurde auf einer Säule von stark basischem Anionaus-" tauscher, ζ. B. Dowex 1 χ 2 (200 - 400 Maschen) (Acetat), zuerst mit 1#igem Pyridin ins Gleichgewicht gebracht und dann mittels Gradientenelution mit 1#igem Pyridin-2#iger Essigsäure chromatographiert; das gesuchte Peptid wurde bei pH 5,4 eluiert. Ausbeute: 0,107 g (50$ Benzyloxycarbonylester), Aminosäureanalyse: Asp 0,93, GIu 0,98, Pro 1,11, GIy 1,0, He +■ Asub 2,01, Leu 1,00, Tyr 0,69.

Lactam des Tyrosyl-isoleucyl-glutatpinyl-asparaginyl-cl·- amino-auberyl-prolyl-leucyl-glvcinamidB (Deaminodicarba-oxytocin).

Das Octapeptidderivat (16,8 mg), hergestellt gemäß dem.

j Vorhergehenden, in Dimethylformamid (2 ml) wurde bei j -15⁰C mit 2-Butylchloroforroiat (2,35 mg) behandelt. Die Lösung wurde bei dieser Temperatur 15 min gerührt, innerhalb 5 min auf +2⁰C anwärmen gelassen und nach weiteren 5 min mit Dimethyl-formamid (2,5 ml) verdünnt und mit ff-Äthylpiperidin (1,94 mg) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei +-2⁰C während 30 min und bei Zimmertemperatur 24 Stunden gerührt, und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

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Der Rückstand wurde im Wasser (20 ml) gelöst und die Lösung über eine Säule von stark saurem Kationaustauscher, z. B. Dowex 50 χ 4, und über eine Säule von schwach basischem Anionaustausoher, z. B. Amberlite IR-4B, filtriert, die Säule mit Wasser (100 ml) gewaschen, die vereinigten Eluate auf eine kleine Menge eingedampft und im gefrorenen Zustand getrocknet. Das Produkt (1,7 mg) war gemäß den Kriterien der Elektrophorese und Chromatographie in verschiedenen Systemen homogen; das Minhydrin-Hegativ wurde mit der Chlor-Stärke-Jod-Technik gefärbt. Aminosäure-Zusammensetzung: Asp 1,00, GIu 1,01, Pro 1,21, 0,99, He + Asub 1,97, Leu 1,00, Tyr 0,47.

Die biologische Aktivität wurde mit Hilfe der pharmakologischen Standardtechnik ausgeprobt und betrug 9 Int. Einheiten/mg am Rattenuterus in vitro und in situ, 3 Int. Einheiten/mg beim Milchsekretionsdruck des laktierenden Meerschweinchens, 10 Int. Einheiten/mg beim Blutdruck des Huhns und 0,3 Int. Einheiten/mg bei der antidiuretischen Probe von Ratten.

Beispiel 4 Alanyl-glyoinäthylesterhydrochlorid

Benzyloxycarbonylalanyl-glycinäthylester (t*4 g) in Äthanol (100 ml) enthaltend Chlorwasserstoff (5 ml) wurde mit 10 ^ palladisierter Aktivkohle (2,0 g) in einem Strom von Wasserstoff hydriert, bis die Entwicklung von Kohlendioxyd aufhörte. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Ausbeute: 9,5 g (90 $>) Hydrochlorid mit einem Schmelzpunkt von 155 - 156⁰C. Ein, Muster für die Analyse wurde aus Isoßropylalkohol-Äther umkristallisiert; Schmelzpunkt 155⁰C

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PUr C₇H₁₅ClN₂O₃ (210,5)

berechnet: 39,91 $ C, 7,18 j> H, 13,30 gefunden: 40,02 Ji C, 7,28 # H, 13,24

N, N.

Q-Ni trophenylsulphenyl-S-Benzyloys te inyl-alanylglycIn-äthyle s ter.

o-Nitrophenylsulphenyl-S-benzylcystein-dicyclohexylaminsalz (7,8 g) und Alanyl-glycinäthylesterhydrochlorid (2,85 g) in Chloroform (105 ml) wurden bei -30⁰C mit Dicyolohexyl-carbodiimid (3,2 g) behandelt. Das Reaktionsgemisoh wurde bei Zimmertemperatur 12 Stunden stehengelassen, dann zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äthylaoetat aufgenommen, die Lösung mit 0,5N H₂SOi, Wasser, 0,5N NaHCO, und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit einer Mischung von Äther und Petroläther zerrieben und filtriert. Das Produkt (6,5 g, Schmelzpunkt 165 - 167⁰C) wurde aus wäßrigem Aceton umkristallisiert und ergab 5,8 g (82 f>) reines Tripeptidderivat mit einem Schmelzpunkt von 167 - 169°C.

(520,6)

berechnet: 53,06 ?6 C, 5,42 $ H, 10,77 1> N, gefunden: 53,44 $> C, 5,80 96 H, 11,10 $ N.

o-Nitrophenylsulphenyl-S-benzyloysteinyl-alanylglycin. a) Herstellung durch Verseifung des Äthylesters:

o-Hltrophenylsulphenyl-S-benzylcysteinyl-alanyl-glycin äthyl-eeter (3,75 g) in Dimethylformamid (180 ml) und Wasser (150 ml) wurde bei Zimmertemperatur mit 2N NaOH

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-π. H9356Q

(6,75 ml) während 1 Stunde stehengelassen. Die Mischung wurde mit Wasser (600 ml) verdünnt, über Aktivkohle filtriert und das Filtrat mit 1N H₂SO. angesäuert. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewasohen: Ausbeute 3,2 g (90 #), Schmelzpunkt 164 - 167⁰C Eine Mischung mit dem unter b) hergestellten Produkt zeigte keine Schmelzpunktdepression.

b) aus dem Tripeptid:

S-Benzylcysteinyl-alanyl-glycin (1,0 g) in Dioxan (6,5 ml) und 2N NaOH (3,9 ml) wurde mit o-Nitrophenylsulphenylchlorid (0,64), das in mehreren Portionen zugesetzt wurde, geschüttelt. Die Mischung wurde mit Wasser (40 ml) verdünnt, filtriert, das Piltrat und die Waschwässer mit 1N H₂SO₄ bei O⁰C angesäuert, das Produkt filtriert und mit Wasser gewaschen; Ausbeute 0,51 g, Schmelzpunkt 154 - 157⁰C Die Umkristallisation aus wäßrigem Aceton ergab 0,43 g (29 $>) Produkt mit einem Schmelzpunkt von 168 - 169⁰C; für die Analyse wurde ein Probe noch einmal mit dem gleichen Lösungsmittel umkristallisiert; Schmelzpunkt 171 - 172⁰C.

Für C₂₁H₂₄N₄O₆S₂ . \ H₂O (492,6)

berechnet: 50,30 <fo C, 5,02 # H, 11,20 % N, gefunden: 49,88 # C, 5,04 # H, 11,10 <f> N.

S-Benzyloysteinyl-alanyl-glycin.

Benzyloxyoarbonyl-S-benzylcysteinyl-alanyl-glycinäthylester (0,50 g) in Essigsäure (3 ml) wurde mit 35#igem Bromwasserstoff in Essigsäure (3 ml) bei Zimmertemperatur für 45 min beiseitegestellt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äther zerrieben, mit Wasser aufgenommen und mit 1If NaOH (4 ml) behandelt. Die Lösung wurde 4 Stunden

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bei Zimmertemperatur stehengelassen, über eine Säule von stark saurem Kationaustauscher, z. B. Zerolit 225 (Säureform), filtriert, die Säule mit Wasser gewaschen und das Peptid mit 3#igem wäßrigen Ammoniak eluiert. Das ammoniakalische Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, der Rückstand aus wäßrigem Isopropylalkohol umkristallisiert; Ausbeute 0,31 g (91 $>) freies Peptid mit einem Schmelzpunkt vcn 186 187°C. Pur die Analyse wurde ein Muster aus wäßrigem Isopropylalkohol umkristallisiert; Schmelzpunkt 190 193⁰C.

Für C₁₅H₂₁N₅O₄S (339,5)

berechnet: 53,08 $> C, 6,24 1> H, 12,38 $> N, gefunden: 53,68 96 C, 6,50 % H, 11,99 £ N.

Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-alanyl-glyoinäthylester.

Benzyloxycarbonyl-S-benzylcystein (15,42 g) in Chloroform (60 ml) enthaltend N-Äthylpiperidin (6,18 ml) wurden bei -2⁰C mit see. Butylchloroformiat (5,88 ml) unter Rühren behandelt und nach 5 min mit Alanyl-glycinäthylester, der von Hydrochlorid (9,48 g) in Chloroform (90 ml) in situ durch Addition von N-Äthylpiperidin (6,18 ml) in Freiheit gesetzt war. Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur während einer Stunde gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, der Rückstand nacheinander mit 1N HCl, Wasser, 0,5N NaHCO₅ und Wasser zerrieben und aus wäßrigem Äthanol kristallisieren gelassen; Ausbeute 17,0 g (75 t) Tripeptidderivat, Schmelzpunkt 155 - 158⁰C.

Für C₂₅H₅₁N₅O₆S (501,6)

berechnet: 59,87 # C, 6,23 # H, 8,38 JiN, gefunden: 59,77 1> C, 6,48 $ H, 8,49 # N.

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p-Nitrophenylaulphenyl-S-benzyloyBteinyl-alanyl-glycylvalln-p-nitrophenyleatar.

o-Ni trophenylsulphenyl-S-benzyloysteinyl-alanyl-glycin (1,08 g) in Dimethylformamid (21 ml), enthaltend N-Äthylpiperidin (0,30 ml), wurde bei -2⁰C mit see. Butylohloroformiat (0,285 nil) gerührt und nach 5 min Valin-p-nitrophenyleater, der aus dem Hydrobromid (0,69 g) freigemacht war, in Dimethylformamid in situ unter Zusatz von F-Äthylpiperidin (0,30 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt, auf -25⁰O gekühlt und mit Wasser (500 ml) verdünnt. Das Produkt wurde filtriert, mit Wasser gewasohen, in ithylacetat aufgenommen, die Lösung mit 0,2N H₂SO,, Wasser, 0,5IT ITaHCO, und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trookne abgedampft. Der Rückstand wurde mit Äther zerrieben, filtriert, mit Äther und Petroläther gewaschen und ergab 1,15 g Material mit einem unscharfen Schmelzpunkt von HO - 160⁰C (heiße Phase). Ein Muster für die Analyse wurde aus wäßrigem Aoeton umkristallisiert und ergab keinen Unterschied im Verhalten des Schmelzpunktes. Nach der Säurehydrolyse wurden alle erwarteten Aminosäuren durch Chromatographie Identifiziert.

berechnet: 53,92 * 0, 5,09 * H, 11,79 Ϊ N, gefunden: 53,34 Jt 0, 4,76 * H, 11,61 % V.

o-HitrophenylBttlphenyl-S-benzyloysteinyl-alanyl-glyoyl-VaIyI-If*¹-benzyloxyoarbopyloya ta thlonin- <t» -methylester.

N^^--Benzyloxyoarbonyloyatathionin-oC-methyleater (0,50 g) und ■ b-lfitrophenylsulphenyl-S-benzyloyeteinyl-alanylglycyl-valin-p-nitropihenyleeter (0,96 g) in Dimethylformamid (15 ml), enthaltend N-Ithylpiperidin (0,152 g), wurden bei Zimmertemperatur 70 Stunden beiseitegestellt.

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-ZU-

Die Lösung wurde mit 1N H₂SO. angesäuert, mit Wasser verdünnt, das Produkt filtriert, mit Wasser gewaschen und aus Isopropylalkohol-Äther-Petroläther umkristalli« eiert; Ausbeute 0,95 g (75 #) Pentapeptidderivat, Schmelzpunkt 101 - 103⁰C (kapillar). Die Chromatographie zeigte naoh Säurehydrolyse die Anwesenheit von allen erwarteten Aminosäuren.

C₄₂H₅₃N₇O₁₁S₄ (944,1)

berechnet: 53,43 1» C, 5,66 # H, 10,39 i» N, gefunden: 53,37 # C, 5,78 # H, 10,37 1> N.

o-NitΓOphenylsulphenyl-S-benzyloysteinyl--alanyl-glycyl »benzyloxyoarbonyloystathionln-o^, -hydrazid.

Der im Vorhergehenden erhaltene Ester (0,10 g) wurde in Methanol (2 ml) mit 61#igem Hydrazin (0,05 ml) bei Zimmertemperatur für 48 Stunden beiseitegestellt. Die Lösung wurde mit Methanol (5 ml) -verdünnt, mit 1N H₂SO₄ angesäuert und auf O⁰C abgekühlt. Das Produkt wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und aus Isopropylalkohol umkristallisiert; Ausbeute 0,054 g Hydrazid, Schmelzpunkt 163 - 165°C.

Für C₄₁H₅₃N₉O₁₀S₄ . H₂O (962,1)

berechnet: 51,18 # C, 5,76 # H, 13,10 $ N, gefunden: 51,15 t C, 5,82 # H, 12,93 $ N.

S-Bengyloyetelnyl-alanyl-glycyl-valyl-N -benzyloxyoarbonyl-oys tathionin- oL^f -Iac tarn.

Das geschützte Hydrazid (43 mg),wie es im vorhergehenden Beispiel erhalten wurde, wurde in Dimethylformamid (0,4 ml) mit 0,6N Chlorwasserstoff in Äther (0,2 ml) behandelt,

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Nach 2 min wurde das P_rodukt durch Verdünnung mit Äther niedergeschlagen, mit Äther verrieben und filtriert. Bas elektrophoretisch homogene Produkt (21 mg) In 0,5N HGl (0,57 ml) und Tetrahydrofuran (0,25 ml) wurde bei O⁰O mit Natriumnitrit (1,32 mg) Im Wasser (0,2 ml) behandelt. Die Mischung wurde bei O⁰C 15 min gerührt, in eiskaltes Wasser (100 ml) gesohüttet, die Lösung mit 1Obigem Natriumkarbonat bei 0°0 4 Stunden und bei Zimmertemperatur weitere 16 Stunden gerührt, dann über eine Säule von stark saurem Kationaustausoher, z. B. Zerolit 225 (Säureform), filtriert. Die Säule wurde mit Wasser und dann mit 80#igem Methanol gewaschen, das methanolische Eluat auf ein kleines Volumen eingedampft und im gefrorenen Zustand getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,6 mg elektrophoretisch homogenes Produkt, dae mit Ninhydrin negativ, aber positiv mit dem Platinchloridreagens auf Schwefel und mit dem Chlor-Stärke-Jodreagens war.

Das Säurehydrolysat enthielt alle erwarteten Aminosäuren in den richtigen Proportionen.

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Claims (2)

— cc — ■ - - Patentansprüche

1. Cycliechee Peptid, gekennzeichnet durch die allgemeine Formal

R₁-CH-CO-A-B-C-D-CH-CO-R₉ I L

wobei A, B, C und D L-ot-Aminosäurereste, R₁ ein Wasser- ! stoff atom oder eine Aminogruppe, und zwar eine freie ^! oder durch eine schützende Gruppe - wie z. B. eine Benzyloxicarbonyl-, tero. Butyloxicarbonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Tosyl-, Formylgruppe, einen L-oC-Amino- \ säure- oder Peptidkettenrest mit 2 bis 6 L-oC-Aminosäuren oder durch Einführung von schützenden Gruppen modifizierten L-o£-Aminosäurereste - substituierte Aminogruppe, R₂ eine Hydroxil- oder Aminogruppe, und zwar eine freie oder den Bestandteil eines L-oc-Aminosäurerestes oder einer Peptidkette bildende Aminogruppe oder irgendeine dieser Gruppen, die durch eine schützende Gruppe modifiziert ist, und X die Gruppe CHgS, CH₂OH₂, CH₂NH, CH₂O, NHNH oder CONH bedeutet.

2. Verfahren zur Herstellung des Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auf nicht cyclische Peptide oder deren Derivate, die die Gruppe X enthalten, mit r Reagenzien eingewirkt wird, die eine Peptidbindung bilden, wie z. B« mit Dioyclohexylcarbodiimid, Chlorameisensäure, see. Butylester, N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat usw.

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