DE1643273B2 - Antidiuretisch wirksames polypeptid und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues, antidiuretisch wirksames Polypeptid und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Für die Behandlung des Diabetes insipidus erweisen sich solche Präparate am geeignetsten, die eine hohe und spezifische antidiuretische Aktivität aufweisen. Stoffe solcher Eigenschaften sind bekannt und wurden mit verschiedenen strukturellen Modifikationen des

Vasopressinmoleküls dargestellt. Die vorteilhaftesten

Eigenschaften unter den bisher bekannten Stoffen dieses Typs zeigt das l-Desamino-Phe²-Arg⁸-vasopressin (s. Tabelle).

Gemäß der Erfindung wird ein Analogon des Vasopressins geschaffen, welches eine besonders hohe und hierbei auch spezifisch antidiuretische Wirkung hat.

Das erfindungsgemäße Polypeptid besitzt die Formel

Mep — Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys — Pro — D-Arg — GIy-NH₂ *) 12345678 9

und enthält in der Stellung 1 ß-Merkaptopropionsäure (Mep) und in der Stellung 8 D-Arginin.

Aus Coil, czechosiov. ehem. comm., 28, 1963, S. 747 bis 749, ist ein antidiuretisch wirksames Polypeptid der allgemeinen Formel:

GIy — Cys — Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys — Pro — Lys — GIy — NH₂

bekannt. Dieses Peptid besitzt zwar eine protrahierte, antidiuretische Wirkung, die jedoch sehr niedrig ist. Bei einer Dosis von 5 · 10~⁴ μg beträgt sie nämlich nur 40 I. E./mg. Bei einer Dosis von 5 ■ 10~² μg beträgt sie 101. E./mg. Weiterhin ist die Wirkung nicht spezifisch, wobei die presorische Aktivität etwa

15 I. E./mg beträgt.

Demgegenüber besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid eine ant'^inretische Aktivität von etwa

16 000 I. E./mg, wobei die presorische Aktivität nur 11 I. E./mg beträgt.

Ein weiterer therapeutischer Nachteil der bekannten Verbindung ist, daß ihre Wirksamkeit umgekehrt proportional zu der Dosis ist. Das heißt, die Wirksamkeit nimmt bei dem bekannten Polypeptid mit steigender Dosis ab. Dieses Verhalten ist aber vom praktischen therapeutischen Standpunkt aus gesehen unvorteilhaft.

*) Die Abkürzung »Gin« steht für das j'-Monoamid der Glutaminsäure, und »Asn« für das /Ϊ-Monoamid der Asparaginsäure. Gebräuchlich sind demgemäß auch die Abkürzungen »Glu-NH₂« bzw. »Asp-NH₂«.

Daher ist das Glycyl-8-lysin-vasopressin für therapeutische Zwecke weniger geeigoet als das erfindungsgemäße Polypeptid.
h i i

Azid des /S-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins mit dem Amid des L-Prolyl-N^G-tosyl-D-arginyl-

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird glycins zu einem geschützten Derivat des Oktapeptids das genannte Polypeptid dadurch hergestellt, daß das 5 der Formel

Mep (R¹) — Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys(Ri) — Pro — D-Arg(R²) — GIy-NH₂

(Π)

kondensiert wird indem R¹ eine Benzylgruppe und R² eine p-Toluol-sulfonylgruppe bedeutet; die Schutzgruppen werden durch Einwirkung von Alkalimetallen in flüssigem Ammoniak abgespalten, und die gewonnene reduzierte Form des Polypeptide der Formel

Mep(SH) — Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys(SH) — Pro — D-Arg — GIy-NH₂

(III)

wird durch Oxydation, mit Vorteil mit Kaliumferricyanid, in einer wäßrigen Lösung bei pH 6,5 bis 7,0 in das antidiuretisch aktive Polypeptid der Formel I übergeführt.

Das geschützte Derivat des Oktapepiid«, der Formel II kann auch durch andere, allgemein bei der Herstellung von Polypeptiden verwendete Methoden gewonnen werden. Zum Beispiel kann man dieses durch stufenweisen Aufbau sowohl vom Amino- wie auch vom Carboxylende und gleichfalls durch Kupplung vorher dargestellter Polypeptide, welche die Teilaminosäurefolge des Polypeptids gemäß Formel I enthalten, herstellen.

Für den vorübergehenden Schutz der Sulfhydrylgruppen, der Aminogruppen und der Guanidingruppe können Substituenten verwendet werden, wie sie in der synthetischen Chemie der Polypeptide bekannt sind. Die Schutzgruppen können wiederum durch die allgemein bei der Synthese der Polypeptide benützten Methoden beseitigt werden, und zwar entweder in einer Reaktionsstufe oder auch in mehreren. Auch die Oxydation der reduzierten Form des Polypeptids der Formel III zum zyklischen Polypeptid der Formel I kann mit den an sich bekannten Methoden durchgeführt werden, sowohl in wäßriger Lösung wie auch in Gemischen von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln.

Man kann z.B. in folgender Weise vorgehen: Durch Kondensation des Chlorids der /?-Benzylmerkaptopropionsäure mit dem Methylester des Tyrosins wird der bisher nicht beschriebene Methylester des /ff-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosins bc reitet, der durch Einwirkung von Hydrazinhydrat in das bisher nicht beschriebene Hydrazid und Azid übergeführt wird und mit dem Methylester des L-Phenylalanins gekuppelt wird. Das entstandene Derivat des Dipeptidesters wird wiederum in der Form des Azids mit dem Methylester des L-Glutaminyl-i.-asparaginyl-S-benzyl-cysteins zu dem bisher unbekannten Methylester des /i-Benzylmerkaptopropionyl-i.-tyrosyli.-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins kondensiert, der dann wiederum durch die Azidsynthese mit dem Amid des L-Prolyl-N^G-Tosyl-D-arginylglycins zu der neuen Verbindung, dem geschützten Derivat des Oktapeptids gemäß der Formel II, verbunden wird.

Die Schutzgruppen werden durch Reduktion mit

Natrium in flüssigem Ammoniak beseitigt, worauf das reduzierte Produkt durch Oxydation mit Kaliumferricyanid in das neue, cyclische, biologisch aktive Disulfid gemäß der Formel I übergeführt wird.

Das cyclische Disulfid gemäß der Formel 1 zeichnet

sich durch höhere und spezifischere antidiuretische Aktivität (s. die folgende Tabelle) gegenüber dem natürlichen Arginin-vasopressin aus, von dem es sich dadurch unterscheidet, daß es in der Stellung 1 an Stelle des Cysteins die /?-Merkaptopropionsäure und in der Stellung 8 an Stelle des Arginins das D-Arginin enthält.

Das Polypeptid nach der Formel I, das man als l-Desamino-8-D-arginin-vasopressin bezeichnen kann, erweist sich bezüglich seiner biologischen Wirkung als sehr vorteilhaft wirkendes Präparat für die Regulierung der Polyurie und Milderung der Polydipsie bei Diabetes Insipidus.

Für die Herstellung von Applikationsformen für die parenterale, perorale, intranesale, subkutane, intramuskuläre und intravenöse Anwendung kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl in Form der freien Base wie auch als Salz anorganischer und organischer Säuren verwendet werden, eventuell mit einem Zusatz von Hilfsstoffen, Stabilisierungs- und Konservierungszusätzen, Süßstoffen, aromatischen Stoffen, Netzmitteln und ähnlichem. Als anorganische Säure kann z. B. Chlorwasserstoff-, Phosphor- und Borsäure verwendet werden, als organische Säure z. B. Essig-, Zitronen- und Weinsäure, als Verbindungen, die eine saure Funktion besitzen, Tannin und ähnliches. Als Hilfsstoffe können Stärke, Laktose, natürliche und gehärtete Öle, Talkum, Glyzerin und ähnliches benützt werden, wobei mit »gehärteten Ölen« durch Fetthärtung im großtechnischen Maßstab durch Hydrierung von pflanzlichen und tierischen fetten Ölen gewonnene harte Fette verstanden werden.

Tabelle

Verbindung Aktivität

antidiuretische
InI. Einh./tng

presorische
Int. Einh./mg

Spezifltät der Wirkung

l-Desamino-D-Arg*-vasopressin ... l-Desamino-Phe^z-Arg⁸-vasopressin 16 000 ± 200
800 ± 170

11
29 ±7

1454 27,5

Die Aktivität ist in internationalen Einheiten/mg förmigen .Reaktionsgemisch wird Wasser im Überausgedrückt. Die Spezifität der Wirkung ist durch schuß zugesetzt, das ausgeschiedene Produkt abgedas Verhältnis der antidiuretischen Aktivität zur saugt, am Filter gewaschen und aus wäßrigem Äthanol presorischen Aktivität ausgedrückt. umkristallisiert. Ausbeute 11,95 g (78%),

Der Charakter der antidiuretischen Aktivität, 5 Schmelzpunkt 193 bis 194°C.

welche bekanntlich die Erhöhung der Wasserresorp- (a)g⁵—6,0 + 0,5° (c 0,5 Dimethylformamid),
tion in der Niere, die bei dem Menschen durch

Arginin-vasopressin reguliert wird, bezeichnet, ausge- Für C₁₉H₂₃N₃O₃S (373,5):

drückt durch das Verhältnis 10 g Dosis — Wirkung, Berechnet .... C 61,10%, H 6,21%, N 11,25%;

is? bei l-Desamino-8-D-Arginin-vasopressin verschie- io gefunden C 61,10%, H 6,11%, N 11,15%.

den im Vergleich mit dem natürlichen Hormon. Bei

Arginin-vasopressin hat diese Abhängigkeit einen Methylester des

annähernd linearen Verlauf, bei l-Desamino-8-D-Argi- yJ-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyJ-L-phenylalanins nin-vasopressin entspricht sie einer exponentiellen

Funktion mit einem viel steileren Anstieg. Bei graphi- 15 5,6 g Hydrazid des /7-Benzylmerkaptopropionyl-

scher Darstellung sind die entsprechenden Kurven für L-Tyrosins werden in einem Gemisch von 50 ml

Arginin-vasopressin und l-Desamino-8-D-Arginin-va- Dimethylformamid und 4 ml konzentrierter Salzsäure

sopressin nicht parallel, die GröCe der antidiuretischen gelöst; der Lösung wird unter Rühren und Kühien

Aktivität des Analogons hängt dementsprechend von bei —10°C 1,03 g Natriumnitrit in 2 ml Wasser

der Dosis ab (steigt mit steigender Dosis) und läßt sich 20 zugesetzt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird

natürlich nicht in der üblichen Weise ausdrücken: mittels N-Äthylpiperidin auf 6 bis 7 eingestellt und

Bei niedrigen Dosen (5 bis 20 pg) entspricht die Akti- 2,7 g L-Phenyl-alaninmethylester in 3 ml Dimethyl-

vität etwa 900 I. E./mg, für 100 pg und höhere Dosen formamid zugesetzt. Nach 12 Stunden Stehen bei 0⁰C

ergibt sich eine Aktivität von etwa 40 000 I. E./mg. und 2 Stunden bei Zimmertemperatur wird das

Der in der Tabelle angeführte Wert (16000 ± 200) gilt 25 Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abge-

für den in der klinischen Praxis anwendbaren Bereich dampft und dem schmierigen Abdampfrückstand

von therapeutischen Dosen. Wasser im Überschuß zugesetzt, das abgeschiedene

Es ist bekannt, daß das Vasopressin und seine Produkt wird abgesaugt und aus wäßrigem Äthanol

Analoga zwar eine hohe antidiuretiscäe Wirkung umkristallisiert. Ausbeute 7,6 g (97%); Schmelzpunkt

haben, jedoch zugleich auch eine bei der Applikation 30 151 bis 152⁰C (λ)£⁵—17,5 —0,5° (c0,5 Dimethylform-

sehr unvorteilhafte Erhöhung des Blutdruckes ver- amid). Jn der Literatur (H u g u e η i η R. L., B ο i s-

ursachen. Je kleiner diese den Blutdruck erhöhende sonas R. A.: HeIv. Chim. Acta, 49 [1966], S. 695,

Wirkung, die presorische Aktivität, im Vergleich zur ist als Schmelzpunkt 147 bis 148⁰CuHd(A)S³- 17,5^r 1"

antidiuretischen Aktiviät ist, um so vorteilhafter ist (c 1,45 Dimethylformamid) angeführt, für ein Produkt,

das Präparat für die Applikation. 35 das mit einer 68%igen Ausbeute durch Kupplung des

Trichlorphenylesters der /?-Benzy:merkaptopropion-

Beispiel säure mit dem L-Tyrosyl-L-phenylalanin-methylester

w _iU , ^ j hergestellt wurde.
Methylester des

/3-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosins Hydrazid des

9,2 g /i-Benzylmerkaptopropionsäure werden durch ^Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanins Einwirkung eines Überschusses von Thionylchlorid 14,0 g Methylester des/5-Benzylmerkaptopropionylin das Chlorid übergeführt, das in 20 ml Äthylacetat L-tyrosyl-i -phenylalanine werden 2 Stunden unter dem gelöst wird, die Lösung wird unter intensivem Rühren Rückfliißkühler mit 100 ml Methanol und 6 ml und Kühlen (0⁰C) einem Gemisch von 10,9 g L-Tyro- 45 80%igem Hydrazinhydrat gekocht. Das abgeschiedene sjnmethylester-hydrochlorid, 50 ml Wasser, 50 ml Produkt wird abgesaugt, am Filter mit Methanol und Äthylacetat zugesetzt. Dabei wird der pH-Wert des Äther gewaschen und aus einem Gemisch von Di-Reaktionsgemisches durch Zusatz von Natrium- methylformamid-Wasser umkristallisiert,
bikarbonat schwach alkalisch gehalten. Die Acetat- Ausbeute 10,1 g (72%).
schicht wird abgetrennt, getrocknet, unter verminder- 50 Schmelzpunkt 248 bis 250°C.
tem Druck abgedampft und der Abdanipfrückstand (λ)* — 21,9 J- 0,50 (c0,55 Dimethylformamid),
aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert. Aus den In der im vorherigen Beispiel aufgeführten Literatur Mutterlaugen wird durch Abdampfen und Umkristalli- wird als Schmelzpunkt 251 bis 253°C angegeben, sieren der zweite Anteil gewonnen. Die Gesamtausbeute beträgt 16,3 g, das sind 93% der Theorie. 55 Methylester des
Schmelzpunkt 89 bis 90°C. ^-Benzylmerkaptoprcpionyl-L-tyrosyl-i.-phenylalanyl-(«)S^J —3,4 ± 0,5° (c 0,5 Dimethylformamid). i.-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins

Für C₂₀H₂₃NO₄S (373,5): S,0 _g ^-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-i.-phe-Berechnet C 64,31%, H 6,21%, N 3,75%; ^6o nylalaninhydrazid werden nach dem üblichen Vergefunden C 64,38%, H 6,25%, N 3,71%. fahren (Z a ο r a I M.; Collection Czechoslov. Chem.

Commun. 30 [1965], S. 1853) mit 7,2g Methylestei des

Hydrazid des /ϊ-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosins L-Glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins kondensiert. Nach dem Umkristallisieren des Reaktions-

15,3 g Methylester des /Ϊ-Benzylmerkaptopropionyl- 65 produktes aus Dimethylformamid und Wasser werden

L-tyrosins werden in 60 ml Äthanol gelöst, 6 ml 11,3 g (76%) Produkt mit einem Schmelzpunkt von

80%iges Hydrazinhydrat zugesetzt und das Gemisch 253 bis 255°C gewonnen.

2 Stunden am Rückflußkühler gekocht. Dem brei- («)S³ — 29,6 ± 0,5° (c 0,5 Dimethylformamid).

Für C₁₈H₆₇N₇O₁₀S₂-V₂H₂O (965,1):
Berechnet .... C 59,73%, H 6,20%, N 10,17 °/₀;

gefunden

C 59,61%, H 6,23%, N 10,23%.

Hydrazid des

/3-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-i.-asparaginyl-S-benzyl-i.-cysteins

Einer Lösung von 10,8 g Methylester des /?-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins in 160 ml Dimethylformamid werden 12 ml 8O°/_Oiges Hydrazinhydrat zugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das abgeschiedene Produkt wird abgesaugt, am Filter mit Methanol und Äther gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute 6,7 g (62%); Schmelzpunkt 266 bis 268°C ohne Veränderung nach dem Umkristallisieren aus Dimethylformamid-Wasser.

(<x)S⁵ — 33,4 ± 0,5° (c 0,5 Dimethylformamid).

Für C₄₇H₆₇N₉O₉S₂ (956,1):

Berechnet .... C 59,04%, H 6,01%, N 13,19%;

gefunden

C 59,04%, H 6,16%, N 13,25%.

Amid des

/9-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L - glutaminyl - l - asparaginyl - S - benzyl - l - cysteinyl-L-prolyl-N^G-tosyl-D-arginyl-glycins

Dieses wird aus dem Hydrazid des/J-Benzylmerkaptopropionyl - L - ty rosy 1 - l - phenylalanyl - L - glutaminyl L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins und dem Amid des L-Prolyl-N^G-tosyl-D-arginyl-glycins nach dem üblichen Verfahren (s, das vorhergehende Literaturzitat) mit 68%iger Ausbeute hergestellt. Schmelzpunkt 223 bis 225° C.

Für C₆₇H₈₄N₁₄O₁₄S₃ (1405,65):

Berechnet.... C 57,24%, H 6,02%, N 13,95%; gefunden .... C 57,33%, H 6,01 %, N 13,99%.

l-Desamino-8-D-arginin-vasopressin

0,5 g Amid des /3-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl- L-cysteinyl-L-prolyl-N^G-tosyl-D-arginyl-glycins wird mit Natrium in flüssigem Ammoniak mit dem üblichen Verfahren (gemäß dem vorher angeführten Zitat) reduziert. Der nach dem Abdampfen des Ammoniak gewonnene Rückstand wird in 800 ml 5%iger Essigsäure gelöst, der ungelöste Anteil abfiltriert, das pH der Filtrate mit Natriumhydroxyd auf 6,5 bis 7 eingestellt und die Lösung in an sich bekannter Weise oxydiert. (Kimbrough R. D. Jr., Cash. W. D., B ran da L. Α., Chan. W. Y., du Vigneaud,

ao V.: J. Biol. Chem., 238 [1963], S. 1411). Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von Essigsäure auf 4,0 bis 4,5 eingestellt, das Peptid auf der Säule eines Carboxylationenaustauschers aufgefangen, mit 50%iger Essigsäure eluiert und duich Lyophilisation isoliert. Das Rohprodukt wird in an sich bekannter Weise (Z a ο r a 1 M., S ο r m F.: Collection Czechoslov. Chem. Commun., 31 [1966], S. 310) mit trägerloser Hochvoltelektrophorese gereinigt. Ausbeute an Lyophilisat beträgt 100 bis 200 mg, (α)?-65 ± 2° (cO,2, 1 M — CH₃COOH).

Für C₄₆H₆₄N₁₄O₁₂S₂ · 2 CH₃ · COOH (1189,3): Berechnet .... C 50,49%, H 6,10%, N 16,48%;

gefunden

C 50,39%, H 6,32%, N 16,45%.

Die Analyse der Aminosäurenzusammensetzung ergab: 7₂Cys 0,40, Tyr 0,98, Phe 1,03, GIu 1,05, Asp. 1,00, Pro 1,03, Arg 0,98, GIy 0,95.

$09510/52

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Polypeptid der Formel

Mep — Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys — Pro — D-Axg — GIy-NH₂ 1234567 89

das in dei Stellung 1 eine /5-Merkaptopropionsäure und in der Stellung 8 D-Arginin enthält.

2. Verfahren zur Herstellung des Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Azid des /5-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl - L - asparaginyl - S - benzyl - ί,- cysteins mit dem Amid des L-Prolyl-N^G-Tosyl-D-arginyl-glycins zu dem geschützten Derivat des Oktapeptids der Formel

Mep (R¹) — Tyr — Phe — GIn — Asn — CyS(R¹) — Pro — D-Arg (R²) — GIy-NH₂

kondensiert wird, wobei R¹ die Benzylgruppe und R² die p-Toluol-sulfonylgruppe bedeutet, worauf die Schut2:gruppen durch Einwirkung von Alkalimetallen in flüssigem Ammoniak abgespalten werden, und die gewonnene reduzierte Form des Polypeptids der Formel

Mep(SH)-Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys(SH) — Pro — D-Arg — GIy-NH;, (III)

durch Oxydation in das Polypeptid der Formel I übergeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid der Formel

Mep(SH)-Tyr — Phe — GIn — Asn — Cys(SH) — Pro — D-Arg — GIy-NH₂ (III)

mit Kaliumferricyanid in wäßriger Lösung bei pH 6,5 bis 7,0 oxydiert wird.