HU192962B - Process for producing analogues with strong gonadotripic activity of factor the general formula /i/ of hormone releasing luteinizing and estron-stimulating hormones - Google Patents

Description

Találmányunk tárgya eljárás új (I) általános képletű nagy gonadotrop aktivitású, luteinizáló és ösztron-stimuláló hormonokat felszabadító faktor analóg előállítására.

12345 678 9 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (I) I

X mely képletben X jelentése hidrogénatom vagy egy védőcsoport, előnyösen p-toluol-szulfonil-csoport (tozil-csoport).

A többi rövidítés jelentése a következő:

Et	etil-csoport,
pGlu	piroglutamil-sav,
His	hisztidin,
Trp	triptofán,
Ser	szerin,
Tyr	tirozin,
D-Tle	l-amino-3,3-dimetil-D-butánsav (terc-leucin),
Leu	leucin,
Arg	arginin és
Pro	prolin.

Az új biológiailag aktív nonapeptidek nagy gonadotrop aktivitással rendelkeznek, és a humán- ée állatgyógyászatban egyaránt használhatók az ivarzási ciklus ellenőrzésére, ivarzással kapcsolatos zavarok kezelésére, ós nem szteroid fogamzásgátlóként is.

Ismeretes, hogy a luteinizáló és öeztronstimuláló felszabadító faktor (LRF) a hipotalamusz révén jön létre és az LH + FSHnek a hipofízis elülső lebenyében való felszabadulását eegíti elő. A felszabadult LH + FSH szabályozza mindkét nemű emberek illetve állatok szteroid hormon szintjét. LRF receptorokat közvetlenül az ivarmirigyek környékén is találtak. Ennek (mármint a felszabadulás) ellenére olyan aktív LRF analógokat találhatunk a humán- ós állatgyógyászat területén, amelyeket pld. funkcionális sterilitás vagy petefészek cisztakezelésére használnak. Emellett néhány LRF analóg megnövekedett ós tartós működése az ellenkező hatáshoz vezethet, vagyis vieszaszorithatja az ovulációt és a spermatogenézist.

A természetes LRF dekapeptid 1234567 8 9 10 pClu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHi pGlu-His, Tyr-Gly éa Pro-Gly kötéseinek felnyitása következtében gyors enzimatikus lebomláson megy át. Ezért megkísérelték, hogy az ezekben a kritikus pozíciókban lévő aminosav-csoportok különböző szubsztituálása révén rezisztensebb analógokat állítsanak elő, amelyek módosult vagy megnövakedett és hosszabb ideig tartó hatással rendelkeznek, így például a 6-os helyzetben lévő Gly-nek különböző nem proteinszerű D-aminosavakkal vagy ezek származékaival, különösen bizonyos lipofil tulajdonságú származékaival való helyettesítése ellentétesen nagy aktivitású vegyületekhez vezetett. A 10-es helyzetben lévő Gly-NHi egyidejű megfelelő alkil-csoporttal való helyettesítése látszólag az LRF hatás növekedéséhez, az úgynevezett „szuper-aktív” analógokhoz vezetett. Ezek kis dózisban petefészek-zavarok kezelésére, és tejelő tehenek irányított reproduktív szerveiben az ovuláció megindítására alkalmasak. Ezeket az anyagokat nagy dózisban például farmon tartott állatok ivarzási ciklusában szabályozott megszakításéra, nem szteroid fogamzásgátlóként és néhány endokrin-függő tumor kezelésére használják.

A szerkezet (többek között az új szerkezeti változatok) és a hatás közötti összefüggés tartós, szisztemetikus megfigyelése olyan LRF analógokhoz vezetett, amelyek nagy biológiai potenciállal rendelkeznek és a gyógyászatban is valószínűleg felhasználhatók. igy találmányunk szerint a természetes LRF 6-os helyzetű glicin-csoportját egy D-konfigurációjú új kétértékű aminosav-csoporttal helyettesítünk. Az aminosav ilyen összefüggésében az irodalomban még eehol nem szerepelt. A fent említett aminosav az 1-emino-3,3-dimetil-D-butánsav (terc-leucin) volt. Alifás oldallánc szerkezete jelentős lipofil tulajdonsággal rendelkezik és szférikus szempontból jelentősen gátolt. Mindkét tulajdonsága kedvező hatást gyakorol az LRF analóg tulajdonságaira, különösen hatásuk nagyságára és időtartamára. Az így nyert 6-D-Tle LRF analóg sokkal stabilabb a metabolikus hatásokkal szemben és hosszabb ideig hat, mint azok az analógok, amelyek 0-terc-butil-D-szerin csoportot vagy aromás oldalláncot tartalmaznak, például 3-(2-naftil)-D-alanint. A 10-Gly-NHi rész legkedvezőbben NHEt csoporttal helyettesíthető.

A részlegesen védett LRF analóg prekurzorok a megfelelő nem-védett vegyület aktivitásénak jelentős részét megőrzik, így a szabad Arg jelenléte a 10-es helyzetben nem kritikus, nem fejt ki nagy ellentétes hatást. Ennek a felfedezésnek a további jelentősége abban áll, hogy különösen az állatgyógyászatban lehetőséget ad arra, hogy a megfelelő biológiai hatást ezeknek a könnyebben hozzáférhető és kevésbé drága szintetikus prekurzoroknak a használata révén érjük el. Hasonló találmányokról már korábban beszámoltak néhány LRF analóg ellenkező előjelű, inhibitor hatásával kapcsolatban.

Az LRF analóg (VI) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Len-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (VI) és (VII) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (VII) képletű vegyületekkel 10 és 200 jug-os dózisokban kezeltek olyan nőket, akiknek nem volt petefészkük. A RIA próbát dupla, antitestek homológ rendszerében végezték el (Strupnicki R., Mladej A.: Andocrinology 68, 6 (1976)]. A szarvasmarha NIHLER-1716-2 készítményt használták jódozási standardként, a RIA érzékenység 100 jug fölött volt. Az STH-prolaktin keresztreakció

1%~os volt. A teszt eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
	Az	LF + FHS szint	1. táblázat 200 pg-os LRF illetve	analógjaival való kezelés után
	vegyület	FS hatás	a hatás .“ideje	átlagos ,(Y FSH koncentráció
	hatóanyag nincs		perc	pg/ml 31.2 ± 1.9
	LRF	40 ± 11.5	100 ± 26,7	108.4 ± 16.1
	VI	26.7 ± 3.8	43 + 20.4	72.4 ± 10.9
	VII	40.0 ± 6.0	230 t 32.1	110.9 ± 11.7
	vegyület	lut. hatás	a hatás ideje	átlagos Qf LH koncentráció
		perc	perc	pg/ml

hatóanyag

nincs	—
LRF	53.3 ± 13.9	12.3
VI	46.6 ± 15.4	86.7
VII	53.3 ± 19.0	236.7
A (VII) képletű	vegyületet két	dózis-
szinten vizsgáltunk,	és azt találtuk,	hogy
jelentős agonisztikus	hatása van; ez	a ve-

gyület aktívabb volt, mint a (VI) képletű vegyület, vagyie a megfelelő tozil-származék, sq és sokkal aktívabb, mint a természetes LRF, amely az összehasonlítás alapjául szolgált. A találmány szerinti D-Tle-vel való helyettesítése az LRF hatásának és hatási idejének jelentős megnövekedését eredményezte, ez vi- 35 lágosan megfigyelhető volt még 10 pg per állat dózis esetében is. A részlegesen védett (VI) képletű prekurzorról bebizonyosodott, hogy jelentőse aktivitással rendelkezik. Ez megerősíti az említett 6-os helyzetben való 49 szerkezeti eltérésnek a peptid molekula konformációjára (térbeli elrendeződésére) gyakorolt hatását. A helyettesítés kedvező hatásának mértéke jelentősen túlhaladja a 8-as helyzetben lévő Arg tozilezésónek ellenkező 15 előjelű hatását. A természetes LRF megfelelő

8-tozil-származéka ténylegesen majdnem inaktív volt.

Az (I) általános képletű nonapeptidek a megfelelő aminosav vagy alacsonyabb szén- 50 atomszámú peptid-csoport reakciójával a peptidkémiából ismert preparatív módszerekkel állíthatók eló.

Az (I) általánoe képletű vegyületek előnyösen a (II) általános képletű hexapeptid- 55 -származék

Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (II)

X mely képletben

X jelentése az (I) képletben megadottal 60 megegyezik,

Y pedig hidrogénatomot vagy egy hidrogónezóaael eltávolítható védőcsoportot, előnyösen benziloxi-karbonil-csoportot jelent, 65 és a (III) általános képletű tripeptid reakciójával

5.0 10.7 10	0.26 + 0.04 7.43 + 1.6 3.88 ± 1.3 11.24 ± 1.59
	pGlu-Gie-Trp	(III)
és	kívánt esetben	a védőcsoportok lehasítá-

sóval állíthatók elő.

Az addíciós reakciók oldatban, mely a peptidkémia klasszikus preparatív technikája (Schroeder, E., Lübke, K.: The Peptides. Vol. I és II, Acad. Press, New York, 1965) vagy szilárd fázisban (Stewart, J.M., Young, J.D.: Solid phase peptides ayntheBys. W.H. Freeman Comp., San Francisco, 1969.) is végrehajthatók.

Eljárásunk szerint a terminális amino-csoportokat előnyösen egy benziloxi-karbonil-csoport bevitelével védtük meg, az oldalláncok funkciós csoportjait - az egyetlen Arg kivitelével - nem volt szükséges megvédeni. Az arginin guanidino-csoportjának megvédését tozil-csoporttal végeztük. Ez szokványos módszerekkel eltávolítható, mi egy új eljárást dolgoztunk ki rá; trifluor-metán-szulfonsav és trifluor-ecetsav oldatának és egy megfelelő védő ágens pl. tioglikolsav keveréke bizonyult megfelelőnek a tozil-csoport eltávolítására. Ez az eljárás biztosítja a tózil-csoport gyors eltávolítását anélkül, hogy a maradék érzékeny peptid-rész deteriorálódna és ennek következtében sokkal magasabb kitermelést eredményez, mint az ismert eljárások.

A védőcsoport lehasítása után a kapott terméket rögtön tisztíthatjuk folyadékkromatográfiás módszerrel, ez a találmányunk szerinti nonapeptid nagy tisztaságban való kinyerését eredményezi. Stocionárius fázisként előnyösen a felületén kémiailag kötött 8-10 szénatomszámú ezénhidrogénréteget tartalmazó 10-30 pm szemcsenagyságú szilikagélt használtunk. Az eluciót az alkalmazott peptid vegyületre számított 20-60 tf% mennyiségű metanol és 0,1-0,5%, előnyösen 0,2% vizes trifluor-ecetsav keverékével mint mozgó fázissal végeztük. A trifluor-eceteav mint ionizá-36 ció-visszaszorító jelenlétére azért volt szükség, hogy megfelelő elválasztást kapjunk. Ez az eljárás lehetővé tette a vegyületek egy lépcsőben való tisztítását, anélkül, hogy sómentesitésre ie szükség lett volna.

A folyadékkromatográfiát eddig hasonló peptid-vegyületek tisztítására nem használták. Az előbb említett mozgó fázist úgy hoztunk létre, hogy az eddig leírt mozgó fázisokban jelenlévő különböző pH-jú puffer-oldatokat, melyek az ionizáció szabályozására szolgáltak, megfelelő oldószerrel helyettesítettük. Amikor puffer-oldatot is tartalmazó elegy a mozgó fázis, az elválasztott termékeket még egy további lépésben sómentesíteni kell, amely az elválasztást igen munka- és időigényessé teszi.

A találmányunk szerinti eljárást a kővetkező példákkal illusztráljuk, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

A példákban a jelölések jelentése a következő:

Z benziloxi-karbonil-csoport,

Tos tozil-ceoport,

DCHA diciklohexil-amin.

1. példa

Ζ-Pro-NH-Et előállÍtása(I) g (0,2 mól) Z-Pro-t oldunk 170 ml dimetil-formamid és 21 ml piridin elegyében, és az oldatot -40 °C-ra hűtjük. 29 ml (0,22 mól) pivalil-kloridot adunk a keverékhez és 10 percig keverjük 30 °C-on. A reakcióelegy -40 “C-ra való lehűtése után 10 g (0,21 mól) etil-amin és 50 ml dimetil-formamid keverékét adjuk hozzá. Egy éjszakai állás után 0 °C-on a dimetil-formamidot desztilláljuk és a maradékot etil-acetátban oldjuk és hagyjuk kikristályosodni. 50 g terméket kapunk. O.p.: 125-130 C. Kitermelés: 91%.

2. példa

Ζ-Arg (Tos)-Pro-NH-Et (II) előállítása

4,5 g (16,2 millimól) Z-Pro-NH-Et-ról eltávolítjuk a védöcsoportot ecetsavas hidrogén-bromid oldattal való kezeléssel. 20 perces szobahőmérsékleten való állás után a hidrobromidot éterrel kicsapjuk és rögtön 30 ml dimetil-formamidban oldjuk.

g (17,8 millilmól) Z-Arg(Tos)DCHA-t 2 n sósavval elbontunk, és a felszabadult Z-Arg(Tos)DCHA-t etil-acetáttal extraháljuk. Az oldószer desztillálása után ezt a terméket hab formájában kapjuk. Az anyagot 60 ml dimetil-formamidban oldjuk, -40 °C-ra hűtjük le, és ezen a hőmérsékleten 1,4 ml (20 millimól) piridint, 2,2 ml N-etil-piperidint és 2,1 ml (18 millimól) pivalil-kloridot adunk hozzá. 20 perces -30 °C-on való keverés után a Pro-NH-Et HBr fenti oldatát adjuk hozzá, ós az elegy pH-ját 7,5-re állítjuk be

N-etil-piperidinnel, majd egy éjszakán keresztül a hűtőszekrényben (-5 °C) állni hagyjuk. Az illékony komponenseket lehajtjuk, a maradékot etil-acetáttal extraháljuk és az; extraktumot egymás után 1 n sósavval, 5% nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal és vízzel mossuk. Ezután az oldószert ledesztilláljuk egyidejű vízmentesítés mellett. 6,02 g (63%) anyagot kapunk hab formájában.

Aminosav-összetétel analízis:

Pro = 0,91; Arg = 1,09.

3. példa

Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (III) előállítása g (8,7 millimól) Z-Arg(Tos)-Pro-NH-Et-ről lehasítjuk a védőcsoportot ecetsavas hidrogén-bromid-oldat segítségével. A hidrogénbromidot éterrel kicsapjuk az oldatból ós azonnal 25 ml dimetil-formamidban átoldjuk. Az. ezt követő kondenzációt ismét a fenti vegyes anhidrides módszerrel hajtjuk végre 3,72 (8,7 millimól) Z-LeuDCHA-t, 1,2 ml (10 millimól) pivalil-kloridot, 0,83 ml (8,7 millimól) piridint és 1,19 ml (8,7 millimól) N-etil-piperidint használva. Dimetil-formamidot alkalmazunk oldószerként. A terméket a 2. példában leírt módon izoláljuk. A kapott termék 4,5 g (73%) súlyú, hab formájában nyerjük. Aminoböv összetétel analízis: Leu = 0,98;

Arg = 1,09; Pro = 0,93.

4. példa

Z--D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (IV) előállítása

2,6 g (5,82 millimól) Z-D-Tle DCHA-t 0,1 n kénsavval kezelünk, hogy elbontsuk a sót, és a felszabadult Z-D-Tle-t etil-acetátba extraháljuk át. Az oldószer ledesztillálása után 2 g olajos terméket kapunk, amelyet 20 ml metilén-kloridban oldunk.

g (5,7 millimól) (III) képletű vegyületet dekarbo-benzoxilezünk ecetsavas hidrogén-bromid-oldat segítségével. A termék metanolos oldatát OH fázisban lévő ioncserélő gyanta oszlopon vezetjük keresztül a hidrobromid-só felszabadítása céljából. 2,9 g Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et-t kapunk hab formájában. Ez a termék pH = 2,5-nél ée 5,7-ηέΙ elektroforetikusan homogén (a kimutatás ninhidrinnel történt). A kapott szabad tripeptid amidot 15 ml metilén-kloridban oldjuk és -20 °C-ra hűtve az előzőleg elkészített Z-D-Tle oldatot és 2 g-(9,7 millimól) diciklohexil-karbodiimid és 10 ml metilén-klorid elegyét adjuk hozzá. A reakciókeveréket 4 napon keresztül -5 °C-on állni hagyjuk. Ezután a diciklohexil-karbamid csapadékot szűrjük, a szürletet desztilláljuk, és a maradékot etil-acetátban oldjuk. A fenti terméket egymást követően 1 n sósavval, 5%-os nátrium-hidre-48 génkarbonát oldattal és vízzel való mosás után semleges formában nyerjük.

A 3,9 g (93%) peptidet hab formájában kapjuk. A terméket vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat alapján homogénnek találtuk. A vékonyrétegkromatográfiás analízishez szilikagélt és futtatószerként kloroform-metanol 9:1 arányú elegyét használtuk.

Aminosav összetétel analízis:

D-Tle = 0,92; Leu = 0,98; Arg = 1,01; Pro - 0,93.

5. példa

Z-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH~Et (V) előállítása

A (IV) képletű vegyület 3,6 g-járól platina katalizátoron való hidrogénezéssel eltávolítjuk a védőcsoportot. 3,0 g (4,4 millimól) szabad tetrapeptidet kapunk. A Z-Ser-Tyr Na-mal való kondenzációját vízmentes dimetil-formamid-metilén-klorid elegyben

-30 °C-on hajtjuk végre 1,9 g Z-Ser-Tyr-N2H3-at, 1,5 ml 8 n dioxános sósav-oldatot és 0,9 ml n-butil-nitritet használva. A semlegesítést pH = 8-ig N-etil-piridinnel hajtjuk végre. Ezután a reakcióelegyet 0 “C-on 3 napon keresztül hűtőszekrényben állni hagyjuk. Az illékony komponenseket ledesztilléljuk és a maradékot etil-acetátban oldjuk. Az oldatot ismételten mossuk egymás után 1 n sósavval, 5% nátrium-hidrogénkarbonét-oldattal és vízzel, majd szárítjuk és desztilláljuk.

fgy 4,14 g (76%) nem kristályos formájú hexapeptidet kapunk. A termék homogenitását folyadékkromatográfiásán vizsgáltuk meg. (Oszlop méret: 0,4x25 cm; stacionárius fázis: módosított szilikagél, mozgó fázis:

tf% metanol és 30 tf% pH = 4,4-es foszfát-puffer elegye). A termék 82% címben jelzett hexapeptidet tartalmaz.

Aminosav összetétel analízis:

Ser = 1,14; Tyr = 1,05; D-Tle = 0,98; Leu = 1,03; Arg = 1,04; Pro = 1,00.

6. példa pFlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle~Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (VI) előállítása

Az 5. példában kapott (V) képletű vegy ületről (3,8 g) palládium katalizátoron való hidrogénezéssel metanolos oldatban lehasítjuk a védőcsoportot. 3,2 g 88% hexapeptidet tartalmazó terméket kapunk. Az összetételét folyadékkromatográfiásán határoztuk meg, az oszlop mérete és a stacionárius fázis az 5. példában megadottal megegyezik, a mozgó fázis összetétele: 50 tf% metanol és 50 tf% trifluor-eceteav - trietil-amin pH = 3,9-es puffer, a meghatározást ultraibolya fényben 220 mm-es hullámhossznál végeztük.

Az azid-kondenzációt vízmentes dime6 til-formamid és dimetil-szulfoxid 1:1 arányú keverékében végeztük 1,6 g pGlu-His-Trp-NiHa-t, 3,2 g (V) képletű vegyületet és 0,5 ml n-butil-nitritet használva. A reakciót -?0 “C-on hajtottuk végre, az azidképződés ideje ezen a hőmérsékleten 30 perc. Ezután a reakciókeverók pH-ját 8-9-re állítottuk be és 4 napon keresztül állni hagytuk a hűtőszekrényben -5 “C-on, miközben a pH-ját időnként ellenőriztük. Az oldószerek lehajtása után a maradékot kismennyiségű éterben oldottuk és a kapott olajos oldatot 30 ml metanollal hígítottuk. A termék etil-acetát - éter keverék hozzáadására kicsapódik.

3,65 g (87%) nyers nonapeptidet kapunk. Folyadékkromatográfiás vizsgálata azt mutatja, hogy a kapott termék 70%-ban tartalmaz nonapeptidet és ezen kívül bizonyos mennyiségű kiindulási anyagot, mint azt a megfelelő kromatográfiás csúcsok mutatták. (Az azonosítás standard mintákkal való keverés révén történt.) A folyadékkromatográfiás meghatározásához a 4. példában említett oszlopot, stacionárius fázist, mozgó fázisként 60 tf% és 7,0-es pH-jú foszfát fuffer elegyét használtuk, a kimutatás 210 nm hullámhosszú ultraibolya fényben történt.

A nyers nonapeptid aminosav összetétel analízise:

Glu - 1,43; His = 1,41; Trp = 1,10; Ser = 1,09; Tyr = 1,20; D-Tle = 0,89; Leu - 1,00;

Arg = 0,88; Pro = 0,90.

A biológiai aktivitás értékelése céljából a terméket preparatív kromatográfiásan tisztítottuk a következő körülmények között: oszlopméret: 2,5x30 cm;

stacionárius fázis; módosított szilikagél (szemcsemérete: 10 pm), mozgó fázis: 60 tf% metanol és 40 tf% 0,2%-os vizes trifluor-ecetsav, detektálás: 210 nm-en.

A nyers nonapeptid mintából 300 ml-t a mozgó fázis 3 ml-ébe befecskendezve 148 mg terméket kapunk 96%-os tisztaságban. Op.: 205-208 “C. («)ϊ>°= -28,5 “ (C = 0,2, dimetil-formamidban)

Aminosav összetétel analízise a következő:

Glu = 1,01; His = 1,01; Trp - 0,90; Ser = 0,95; Tyr = 1,01; D-Tle = 0,95; Leu = 1,00;

Arg = 0,99; Pro = 1,01.

7, példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NE-Et (VII) előállítása

A (VI) képletű vegyület 30 mg-os mintáját a fenti módon tisztítjuk és 0,6 ml trifluor-ecetsavban oldjuk. Tioglikolsavat adunk hozzá, és az elegyet 0 ®C-ra hűtjük, 0,4 ml trifluor-metán-szulfonsavval kezeljük, és 30 percen keresztül hűtőszekrényben (-5 ’C) állni hagyjuk. A terméket ezután éterrel kicsapjuk és szűrőn összegyűjtjük. A kapott

-510 mérsékleten higroszkópos port 1 M ecetsavban oldjuk és a vizet fagyasztással távolltjuk el belőle. 25 mg nyerstermékét kapunk.

Az anyagot folyadékkromatográfiásán tisztítjuk. A következő körülmények között: 5 oszlopméret: 2,5x30 cm, stacionárius fázis: módosított szilikagél, mozgó fázis: 55 tf% 55%-os vizes metanol és / tf% 0,2%-os vizes trifluor-ecetsav elegye.

mg terméket a mozgó fázis 0,5 ral-ében ol- 10 dunk és beoltunk. A detektálást 280 nm-en végezzük. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és a metanolt vákuumban 30 °C-on ledesztilláljuk. A tisztított terméket 10,5 mg súlyú, 98%-os tisztaságú. [«]» = 15

-45,5 ⁰ (C = 0,1, 1 M ecetsavban)

Aminosav összetétel analízis:

Glu = 1,03; His = 0,94; Trp = 0,80; Ser = 0,95;

Tyr = 0,96; D-Tle = 0,90; Leu = 0,99;

Arg = 1,06; Pro = 1,01. 20

Claims (3)

1. Eljárás (I) általános képletű nagy 25 gonadotropikus aktivitású, luteinizáló és ösztron-etimulálá hormonokat felszabadító faktor előállítására, mely képletben

1234 5 678 9 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH- 30 -Et (I)

X jelentése hidrogénatom vagy p-toluol-szulfonil-csoport, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű

Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (II)

X vegyületet, mely képletben

X jelentése a fentiekben megadottal megegyezik,

Y jelentése hidrogénatom vagy hidrogénezéssel eltávolítható védőcsoport, előnyösen benziloxi-karbonil-csoport és a (III) képletű tripeptid pGlu-His-Trp (III) reakcióképes származékát egymással reagáltatják, majd kívánt esetben a védőcsoportol eltávolítjuk, a terméket izoláljuk és kívánt esetben tisztítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a 8-as helyzetben lévő p-toluol-szulfonil-csoportot trifluor-metán-ezulfonsav és trifluor-ecetsav elegyével távolitjuk el egy védő-szer, előnyösen tioglikolsav jelenlétében, majd a terméket izoláljuk és tisztítjuk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a reakciókeveréket reverz-fázisú folyadékkromatográfiával tisztítjuk, mozgó fázisként vizes metanol ós trifluor-ecetsav elegyét használva.