JPH038360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は鎮痛作用を有するテトラペプチドに関
するものであり、詳しくは式（） （式中、R₁およびR₂はそれぞれ水素または低
級アルキルを、R₃は−COOH，−CONH₂または
−CH₂OHを示す。）で表わされるテトラペプチ
ド誘導体に関するものである。 尚、本明細書中において使用されるアミノ酸残
基およびその誘導体の略号は、当該分野の慣用に
ならつたものであり、次の略号が使用される。 Tyr：チロシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Phe：フエニルアラニン MePhe：Ｎ−メチルフエニルアラニン Phe−ol：フエニルアラニノール 従来より、生体内のオピエートレセプターに結
合する能力を有する内因性モルヒネ様物質の探索
研究が行なわれてきた。その結果二つのペンタペ
プチドＨ−Tyr−Gly−Gly−Phe−Met−OH（メ
チオニンエンケフアリン）、Ｈ−Tyr−Gly−Gly
−Phe−Leu−OH（ロイシンエンケフアリン）と
が単離、構造決定され（J.Hughes et al，
Nature，258，577（1975））、両者ともラツト脳室
内投与で鎮痛作用を持つことが確認された。 以来、同様な内因性モルヒネ様物質として各種
エンドルフイン類（α，β，γ，δ−エンドルフ
イン、α，β−ネオエンドルフインetc）が単離
されている。 また、本発明者の一人である高木らは、直接の
鎮痛効果を指標にウシの脳から前述の物質とは異
なつた新しい内因性鎮痛物質を単離し（H.
Takagi et al，Nature，282，410（1979））、こ
のものがジペプチドTyr−Argであることを突き
とめキヨートルフインと命名し、またその周辺化
合物にも脳内投与で鎮痛作用のあることを見出し
た（H.Takagi et al，Eur.J.Pharmacol.55，109
（1979））。 ところで、これらの化合物は、β−エンドルフ
インを除いて末梢投与では鎮痛効果を示さない。
またβ−エンドルフインについても、このものは
31個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、そ
の製造は非常に困難で、医薬品として大量に供給
するには難点がある。 そこで、本発明者らは経済的に有利で、しかも
末梢投与でも充分な鎮痛効果のある化合物を得る
べく、前記二種のエンケフアリンの共通構造部分
であるテトラペプチドTyr−Gly−Gly−Pheにキ
ヨートルフイン構造を組み入れた化合物につき鋭
意検討の結果、本発明を完成した。 式（）に示した本発明のテトラペプチド誘導
体は公知の手段を用いた化学的合成法により得る
ことができる。 すなわち、テトラペプチド誘導体の合成は、液
相法でも固相法でも可能である。 また、ペプチド合成におけるペプチド鎖の延長
方法には、アミノ酸を逐次延長してゆくステツプ
ワイズエロンゲーシヨン法とアミノ酸数個からな
るフラグメントをあらかじめ合成しておき、次い
でフラグメントの間でカツプリングするフラグメ
ントコンデンセーシヨン法とがあるが、本テトラ
ペプチド誘導体はいずれの方法によつても製造す
ることができる。 縮合方法としては、アジド法、混合酸無水物
法、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）
法、活性エステル法、酸化還元法、ジフエニル燐
酸アジド（DPPA）法、DCC＋添加物（１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）
法、ウツドワード法等をあげることができる。 溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうる
ことが知られているものから適宜選択されうる。
たとえば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、ヘキサメチルホスホロアミド、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルまたはこ
れらの混合物があげられる。 尚、本発明の化合物の製造にあたり、反応に関
与しないアミノ酸およびペプチドのカルボキシル
基は、一般にはエステル化することによりすなわ
ち、低級のアルキルエステル（メチルエステル、
エチルエステル、第三ブチルエステル等）、アラ
ルキルエステル（ベンジルエステル、ｐ−メトキ
シベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステ
ル等）として保護される。反応に関与しないアミ
ノ基の保護基としてベンジルオキシカルボニル
基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、
ホルミル基、第三ブチルオキシカルボニル基、ト
リフルオロアセチル基等、ペプチド合成化学の分
野で通常使用されている保護基を例示することが
できる。さらに、側鎖に官能基を有するアミノ酸
のうち、Tyrの水酸基はアセチル基、ベンジル
基、ベンジルオキシカルボニル基、第三ブチル基
等で保護されることがあるが、必ずしも常に保護
する必要はない。Argのグアニジノ基の保護基と
しては、例えば、ニトロ基、トシル基、ｐ−メト
キシベンゼンスルホニル基、メシチレン−２−ス
ルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソ
ボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキ
シカルボニル基等を示すことができる。 また、本発明化合物のＣ末端部分のアルコール
化については、対応するアミノ酸もしくはペプチ
ドのエステルを公知の手段で還元することにより
行なわれる。 保護基を有するアミノ酸、ペプチドフラグメン
ト、さらに最終的に製造された保護基のついたテ
トラペプチド誘導体の脱保護は、通常この分野で
使用されている方法、すなわち、接触還元、液体
アンモニア／ナトリウム、フツ化水素、臭化水
素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、
メタンスルホン酸、トリフルオルメタンスルホン
酸等を用いて行なわれる。 本発明によつて製造されるテトラペプチド誘導
体の精製は、イオン交換樹脂、分配クロマトグラ
フイー、ゲルクロマトグラフイー、向流分配等、
ペプチド化学の分野で繁用されている方法を適宜
用いて行なわれる。 次に本発明化合物の試験例を示す。 試験例 dd−Ｋマウス（14〜17ｇ、雄）またはSTD−
ddyマウス（16〜30ｇ、雄）を１群10匹ずつ用
い、試験化合物を生理食塩水に溶解し無麻酔下大
槽内、あるいは静脈内に注射した。鎮痛作用はテ
イル−ピンチ法（H.Takagi et al.Japanese J.
Pharmacol，16，287（1966））により測定した。
試験化合物は、容量依存的に鎮痛作用が認めら
れ、これらの鎮痛作用の50％有効量（ED50）は
次表の通りである。 （ArgはＤ体、TyrおよびPheはＬ体）

【表】

【表】 本発明化合物はいずれも大槽内投与において、
メチオニンエンケフアリン、ロイシンエンケフア
リンよりはるかに強い鎮痛効果を有するのみなら
ず、静脈内投与においても強い効力を示す。 また、マウス皮下注におけるLD₅₀は200mg／Kg
以上であり、この範囲の投与では異常行動や呼吸
抑制もみられず、本発明の化合物がモルヒネの有
する好ましくない副作用、すなわち、便秘、呼吸
抑制、血圧降下、縮瞳、依存性等を伴なわない安
全かつ有用な鎮痛薬になりうることが大いに期待
される。 なお、生体内に存在するエンケフアリナーゼに
よつてＮ端部ジペプチドが切断される場合、本化
合物では鎮痛作用を有するTyr−Argとなる。 したがつて、本発明化合物は作用発現、作用持
続性、および作用機作の点で新しいタイプの鎮痛
薬となる可能性がある。 本化合物は主として非経口的（静脈内、皮下
等）に投与されるが、場合によつては経口投与さ
れることもある。投与量は広い範囲から適宜選択
され、例えば大人で１〜100mg／Kg／日の範囲が
適当である。 本剤は、公知の製剤方法により任意の剤型、例
えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒
剤、スプレー剤、シロツプ剤等に加工して使用す
ることが可能であり、投与経路として注射、内
服、坐剤、経鼻等が可能である。 以下に実施例をあげ本発明を説明するが、これ
は本発明の技術的範囲を制限するものではない。 尚、実施例中の略号は、当該分野での慣用に従
う他、次による。 Boc：第三ブチルオキシカルボニル Ｚ：ベンジルオキシカルボニル Mts：メシチレン−２−スルホニル ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドエステル TFA：トリフルオル酢酸 DMF：ジメチルホルムアミド MSA：メタンスルホン酸 THF：テトラヒドロフラン OTCP：２，４，５−トリクロロフエニルエス
テル また、薄層クロマトグラフイー（TLC）はシ
リカゲルを用い溶媒系は次の通りである。 Rf₁（クロロホルム：メタノール：水＝８：
３：１） Rf₂（ｎ−ブタノール：酢酸：酢酸エチル：水
＝１：１：１：１） Rf₃（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：
５） アミノ酸はArgはＤ体を、TyrおよびPheはＬ
体を使用した。 実施例 １ (1) Boc−Gly−Phe−OHの製造 Ｈ−Phe−OH1.65ｇを水10mlに溶かしトリエ
チルアミン2.7mlを加えた。次にDMF10mlに溶か
したBoc−Gly−ONB3.36ｇを加え、室温で18時
間反応した。溶媒留去、残渣を水20mlに溶かし、
酢酸エチル30mlで抽出した。水層をクエン酸酸性
にし、油状物を酢酸エチル30mlで抽出し、飽和食
塩水で洗浄。硫酸ナトリウムで乾燥後酢酸エチル
留去。残渣にｎ−ヘキサンを加えて結晶化した。
収量2.10ｇ、融点140〜143℃。Rf₁＝0.35 〔α〕²⁴ _D＋28.5゜（Ｃ＝1.0、メタノール） 元素分析 C₁₆H₂₂N₂O₅として 計算値 C59.61，H6.88，N8.69 実験値 C59.52，H6.66，N8.68 (2) Ｚ−Tyr−Arg（Mts）−Gly−Phe−OHの製
造 Boc−Gly−Phe−OH0.64ｇをアニソール１ml
存在下、TFA2mlで処理し、無水エーテルを加え
て粉末とした。これをDMF3mlにとかし、トリエ
チルアミン0.28mlを加えて中和した。この溶液に
Ｚ−Tyr−Arg（Mts）−NHNH₂1.33ｇから得ら
れたアジドのDMF（５ml）溶液を加え、４℃で48
時間反応した。溶媒留去。残渣に５％炭酸水素ナ
トリウム水溶液20mlを加え、酢酸エチル20mlで洗
浄、水層をクエン酸酸性にし酢酸エチル20mlで抽
出。飽和食塩水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥後
酢酸エチル留去。残渣にエチルエーテルを加えて
粉末とした。収量1.25ｇ。融点125〜130℃。 Rf₁＝0.30 〔α〕²⁴ _D−1.6゜（Ｃ＝1.0，DMF） 元素分析 C₄₃H₅₁N₇O₁₀Sとして 計算値 C60.19，H5.99，N11.43 実験値 C60.43，H5.77，N11.64 (3) Ｈ−Tyr−Arg−Gly−Phe−OHの製造 Ｚ−Tyr−Arg（Mts）−Gly−Phe−OH422mgに
チオアニソール0.5ml ｍ−クレゾール0.5mlを加
え、氷冷下MSA3mlを加えた。０℃で30分、室温
で60分撹拌。反応液にエチルエーテルを加えると
沈殿を生ずる。上清をデカントして除き、残渣に
水20mlを加えた。ダウエツクス１×４（AcO^-約
３ｇ）を加えて30分撹拌し、樹脂を濾去。濾液を
濃縮乾固し、エチルエーテルを加えて固化粉末
化。このものを0.2N酢酸２mlに溶かし、同溶媒
を溶出液とするセフアデツクスＧ−10カラムクロ
マトグラフイー（カラム1.8×145cm）に付した。
７mlずつ分取し、275nmの吸光度を測定。24〜29
のチユーブを集め濃縮し、残渣にエチルエーテル
を加えて粉末とした。収量206mg。Rf₂＝0.53 Rf₃
＝0.23 〔α〕²⁴ _D＋72.0゜（Ｃ＝0.7、メタノール） 元素分析C₂₆H₃₅N₇O₆・CH₃ COOH・1.5H₂O
として 計算値 C53.49，H6.73，N15.60 実験値 C53.69，H6.99，N15.50 アミノ酸分析 Tyr 1.00，Arg 0.92，Gly 1.02， Phe 0.98 実施例 ２ (1) Ｚ（OMe）−Arg（NO₂）−Gly−Phe−OBzlの
製造 Boc−Gly−Phe−OBzl4.71ｇにアニソール3.6
ml存在下、TFA9mlを加え、０℃、15分、室温１
時間反応。反応液にｎ−ヘキサンを加えると結晶
析出、濾取し、乾燥後、DMF10mlに溶かしトリ
エチルアミン1.59mlで中和した。この溶液をＺ
（OMe）−Arg（NO₂）−OH4.81ｇ、トリエチルア
ミン1.75ml、エチル クロロホルメート1.19mlよ
り調整した混合酸無水物のDMF（10ml）溶液に加
え、室温で18時間反応。溶媒留去。残渣を酢酸エ
チルに溶かし５％クエン酸、５％炭酸水素ナトリ
ウム、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾
燥。溶媒を留去しエチルエーテルを加えて粉末と
した。THF−エチルエーテルより再沈殿。収量
4.79ｇ、融点133〜136℃、Rf₁0.62 〔α〕²⁴ _D−4.9゜（Ｃ＝0.7，DMF） 元素分析値C₃₃H₃₉N₇O₉・１／２H₂Oとして 計算値 C57.71，H5.87，N14.28 実験値 C57.89，H5.42，N14.43 (2) Ｚ（OMe）−Tyr（Bzl）−Arg（NO₂）−Gly−
Phe−OBzlの製造 Ｚ（OMe）−Arg（NO₂）−Gly−Phe−OBzl4.79
ｇをアニソール３ml存在下、TFA8mlにより０℃
15分、室温１時間処理。無水エーテルを加え粉末
とし、濾取。このものをDMF20mlにとかし、ト
リエチルアミン0.99ml。Ｚ（OMe）−Tyr（Bzl）−
OTCP4.78ｇ，HOBt0.96ｇを加え、室温で18時
間反応。溶媒留去。残渣にエチルエーテルを加え
粉末とし、バツチ式に５％炭酸水素ナトリウム水
溶液で洗浄後、DMF−エチルエーテルより再沈
殿。収量6.35ｇ、融点99〜102゜。Rf₁＝0.72 〔α〕²⁴ _D−10.2℃（Ｃ＝0.9，DMF） 元素分析値 C₄₉H₅₄N₈O₁₁として 計算値 C62.01，H5.95，N11.81 実験値 C62.33，H6.26，N11.76 (3) Ｈ−Tyr−Arg−Gly−Phe−OHの製造 Ｚ（OMe）−Tyr（Bzl）−Arg（NO₂）−Gly−Phe
−OBzl6.1ｇをDMF30ml、酢酸10mlにとかし、
パラジウム黒２ｇにより接触還元した。24時間還
元後、触媒濾去。濾液を濃縮し、残渣にエチルエ
ーテルを加えて粉末化。以下実施例１−(3)と同様
に精製した。 収量3.23ｇ。Rf₂＝0.53 Rf₃＝0.23 実施例 ３ (1) Ｚ−Tyr−Arg（Mts）−Gly−Phe−NH₂の製
造 Boc−Gly−Phe−NH₂386mgにアニソール0.5
ml存在下、TFA1.4mlを加え、常法処理。エチル
エーテルを加え、生ずる沈殿を濾取乾燥。この粉
末をDMF4mlに溶かし、トリエチルアミン0.14ml
を加えた。氷冷下この溶液にＺ−Tyr−Arg
（Mts）−NHNH₂668mg，3.87N塩酸／DMF0.57
ml，亜硝酸イソアミル0.15ml、トリエチルアミン
0.46mlより調整したアジドのDMF溶液（４ml）
を加え、４℃で48時間反応。溶媒を留去し残渣を
酢酸エチルに溶かした。酢酸エチル層を1N−塩
酸、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水
で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチル
留去。残渣にエチルエーテルを加えて粉末とし
た。収量825mg、融点107〜111℃。 Rf₁＝0.46 〔α〕²⁴ _D−17.9゜（Ｃ＝0.7，DMF） 元素分析値 C₄₃H₅₂N₈O₉S・1.5H₂Oとして 計算値 C58.41，H6.27，N12.68 実験値 C58.56，H5.93，N12.26 (2) Ｈ−Tyr−Arg−Gly−Phe−NH₂の製造 Ｚ−Tyr−Arg（Mts）−Gly−Phe−NH₂ 308mg
にチオアニソール0.5ml、ｍ−クレゾール0.5mlを
加え氷冷下、さらにTFA（１ml）−MSA（３ml）
を加え、氷冷下15分、室温で２時間反応。以下実
施例１−(3)と同様にして精製した。収量186mg，
Rf₂＝0.60，Rf₃＝0.37 〔α〕²⁴ _D＋26.5゜（Ｃ＝0.4、メタノール） アミノ酸分析 Tyr 1.00，Arg 0.96，
Gly 1.04，Phe 0.98 実施例 ４：Ｈ−Tyr−Arg−Gly−Phe−olの製
造 Ｚ−Tyr−Arg（Mts）−Gly−Phe−OMe（融点
115〜117℃）の357mgをメタノール５mlに溶かし、
この溶液を氷冷下、水素化ホウ素ナトリウム155
mgを含んだ80％メタノール溶液10mlに滴加した。
室温に戻して５時間反応させ、溶媒を留去し、残
渣を酢酸エチルに溶解した。これを1N塩酸およ
び飽和食塩水で洗滌し、硫酸ナトリウムで乾燥後
酢酸エチルを留去し、残渣にエチルエーテルを加
えて粉末状のＺ−Tyr−Arg（Mts）−Gly−Phe−
olを得た。収量327mg。融点129〜132℃。 〔α〕²⁴ _D＋2.7゜（Ｃ＝0.2、メタノール）Rf₁＝0.62 このものを実施例１−(3)と同様にして保護基を
除去し精製し目的物を得た。 Rf₂ 0.62 Rf₃ 0.39 〔α〕²⁴ _D＋14.6゜（Ｃ＝0.5、メタノール） 以下、同様にしてｐ−メトキシベンジルオキシ
カルボニル−Ｎ−メチルフエニルアラニンまたは
第三ブチルオキシカルボニルＮ−メチルチロシン
を出発原料として次のペプチドを製造した。

【表】 製剤例 実施例１のペプチド １mg 滅菌生理食塩水 10ml 両者を混合して注射用液剤とする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、R₁およびR₂はそれぞれ水素または低
   級アルキルを、R₃は−COOH，−CONH₂または
   −CH₂OHを示す。）で表わされるテトラペプチ
   ド誘導体。 ２ 式 （式中、R₁およびR₂はそれぞれ水素または低
   級アルキルを、R₃は−COOH，−CONH₂または
   −CH₂OHを示す。）で表わされるテトラペプチ
   ド誘導体の少なくとも１つを有効成分とする鎮痛
   薬。