JPH0322851B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0322851B2 JPH0322851B2 JP58117949A JP11794983A JPH0322851B2 JP H0322851 B2 JPH0322851 B2 JP H0322851B2 JP 58117949 A JP58117949 A JP 58117949A JP 11794983 A JP11794983 A JP 11794983A JP H0322851 B2 JPH0322851 B2 JP H0322851B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- purification
- recovery rate
- degree
- molecular weight
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 97
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 82
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 61
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 56
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 106
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 84
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 81
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 29
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 25
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 25
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 23
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 18
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 11
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 9
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 8
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 8
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 6
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 6
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 5
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 5
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010001062 polysaccharide-K Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 108010048090 soybean lectin Proteins 0.000 description 2
- WHBHBVVOGNECLV-OBQKJFGGSA-N 11-deoxycortisol Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WHBHBVVOGNECLV-OBQKJFGGSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102000002281 Adenylate kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020000543 Adenylate kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 235000010520 Canavalia ensiformis Nutrition 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 241001464975 Cutibacterium granulosum Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000187678 Nocardia asteroides Species 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 208000003252 Signet Ring Cell Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 240000001417 Vigna umbellata Species 0.000 description 1
- 235000011453 Vigna umbellata Nutrition 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010018850 cytochrome C(551) Proteins 0.000 description 1
- 230000000445 cytocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000003370 dye binding method Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000008123 signet ring cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は新規な低分子蛋白質を有効成分とする
制ガン剤に関する。 カースウエル(Carswell)らは、バチルスカ
ルメツテイ グエリン(Bacillus Calmette
Guerin、BCG)で感作したマウスに、14日目に
エンドトキシンを投与すると、2時間後にその血
清中に、L−細胞に対して細胞毒性を有する因子
が産生されることを見い出し、これをツーモア
ネクロシス フアクター(Tumor necrosis
factor,TNF)と名付けた〔Proc.Nat.Acad.
Sci.,USA.72巻,3666頁,1975年〕。グリーン
(Green)らは、上記物質を硫酸アンモニウムに
よる分画沈澱、ゲル過などにより部分精製し、
上記TNFの分子量が約150000であると報告した
〔Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,73巻,381頁,
1976年〕。その後マテイウース(Matthews)ら
は、ウサギにBCGを投与し、2週間後にエンド
トキシンを投与して、TNFを産生し、精製して、
ゲル過法による分子量が39000で、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法(Polyacrylamide gel
electrophoresis,PAGE)によつて67000である
と報告した〔Br.J.Cancer,42巻,416頁,1980
年〕。更に原中らは、プロピオンバクテリウム
アクネス(Propioni−bacterium acnes)とエン
ドトキシンを用いて、マウス及びウサギでTNF
を産生し、その分子量はゲル過法及びPAGEに
より39000であると報告した〔日本臨床 40巻、
1872頁、1982年〕。 以上の他にも、L−細胞に対して細胞毒性を有
する生理活性物質(TNF)の存在は、多数報告
されているが、その分子量をとつてみても、カル
(Kull)から225000〔J.Immunol.,126巻,1279
頁、1980年〕からマテイウースら及び原中らの
39000の範囲に分布しており、末だ充分に単離精
製されているとは云えず、その性状を調べるに足
る充分な量は得られていないのが現状である。 本発明者らも上記L−細胞に対して細胞毒性を
有する物質の本体を究めるべく鋭意研究を重ねて
きた。その結果、従来報告された例のない低分子
蛋白質を単離精製することに成功し、これが制ガ
ン作用を有することを見い出し、本発明に到達し
た。 本発明の制ガン剤の有効成分である上記新規な
低分子蛋白質(以下単に「本発明物質」という)
は、以下の特性を有することにより特徴付けられ
る。 (1) 分子量 A バイオゲルA1.5mを用いたゲル過法による
分子量 バイオゲル(Biogel)A1.5m(バイオ・ラド社
製、アメリカ)をカラム(16×1000mm、フアルマ
シア社製、スエーデン)に充填し、0.04Mトリス
−塩酸/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム
(SDS)/4M尿素/0.1MNaCl(PH7.8)の緩衝液
を用い、本発明物質試料200μg(蛋白量)を添
加し、ゲル過を行ない、試料の溶出位置より標
準分子量キツト(フアルマシア社製、スエーデ
ン)から求めた標準曲線を用いて分子量を算出し
た。尚上記蛋白量は、ブラツドフオード
(Bradford)の方法〔Anal.Biochem.,72巻、
248頁、1976年〕に準じてクーマジーブリリアン
トブルー G−250による色素結合法により求め
たものであり、以下同様である。 得られた結果は、第1図に示す通りである。図
中1は牛血清アルブミン(分子量67000)を、2
は卵白アルブミン(分子量43000)を、3はキモ
トリプシノーゲンA(分子量25000)を、4はリボ
ヌレアーゼ(分子量13700)を示し、aが本発明
物質である。第1図より本発明物質aは、キモト
リブシノーゲンA3の後に溶出し、その分子量は
約17200であると認められる。 B TSKゲルG3000SWを用いたゲル過法によ
る分子量 フアルマシアFPLCシステム(フアルマシア社
製、スエーデン)にTSKゲルG3000SW(東洋曹
達社製)カラムを接続し、0.1%SDS/0.1Mリン
酸ナトリウム(PH7.0)の緩衝液を用いて、本発
明物質試料100μg(蛋白量)を付加してゲル過
を行ない、高速液体クロマト用標準分子量キツト
(オリエンタル酵母社製)を用い、これらの溶出
パターンより、本発明物質試料の分子量を算出し
た。高速液体クロマトグラフイーによる溶出パタ
ーンを第2図に、また該クロマトグラフイーの溶
出時間から求めた分子量分布を第3図にそれぞれ
示す。各図において5はグルタミン酸脱水素酵素
(分子量290000、尚第2図には示されていない)
を、6はエノラゼ(分子量67000)を、7はアデ
ニル酸キナーゼ(分子量32000)を、8はチトク
ロームC(分子量12300)を、aは本発明物質をそ
れぞれ示す。各図より本発明物質aは、チトクロ
ームC8の前に溶出し、その分子量は約15300と
算出される。 C SDS/ポリアクリルアミドゲルを用いた電気
泳動法による分子量 近藤らの方法〔生化学、44巻、304頁、1972年〕
に従い、リン酸ナトリウム/SDS(PH7.2)で、
SDS−ポリアクリルアミドゲルに、本発明物質試
料5μg(蛋白量)を付与し、40mAで7時間電気泳
動を行ない、標準分子量キツト(オリエンタル酵
母社製)を用いて、電気泳動パターン(第4図)
を記録し、これより分子量曲線(第5図)を作製
し、該図より試料の分子量を算出した。第4図及
び第5図においてaはチトクロームC7量体(分
子量86100)を、bはチトクロームC6量体(分子
量73800)を、cはチトクロームC5量体(分子量
61500)を、dはチトクロムC4量体(分子量
49200)を、eはチトクロームC3量体(分子量
36900)を、fはチトクロームC2量体(分子量
24600)を、gはチトクロームC単量体(分子量
12300)を、それぞれ示す。またsは本発明物質
である。第5図より本発明物質sの、分子量は約
16700と算出される。 (2) 等電点 等電点測定装置(バイオ・ラド社製、アメリ
カ)とアンホライン(Ampholine)ポリアクリ
ルアミドプレート(PH3.5〜9.5)(LKB社製、ア
メリカ)を使用し、標準等電点測定マーカーキツ
ト(フアルマシア社製、スエーデン)を使用し、
本発明物質の等電点を測定した。すなわち、紙
片に本発明物質試料約5μg(蛋白量)を吸収させ、
ゲル上にのせ、10W定電力にて、約2時間泳動さ
せ、電流が一定となつた時点で泳動を終了した。
ゲルは1mm間隔で切り取り、緩衝液にて溶出し、
L−細胞に対する活性の測定に供した。等電点は
等電点マーカーを基準に算出した。その結果、本
発明物質の等電点はPH3.8±0.3と算出された。 (3) 紫外部吸収の測定 ダブルビーム分光光計度UV−300(島津製製所
製)を使用し、0.02M トリス−塩酸/0.1M
NaCl(PH7.8)に溶解した本発明物質試料の紫外
部吸収を測定した。その結果を第6図に示す。該
図より極大値は277nm、極小値は250nmであつ
た。 (4) 溶解性、色及び性状 文発明物質試料を3mg蛋白量/ml濃度に0.02M
トリス−塩酸緩衝液(PH7.8)に溶解した溶液
は、無色透明である。 該溶液にアセトン又はエタノールを70V/V%
以上加えると沈澱を生ずる。 また本発明物質の3mg蛋白量/ml水溶液は、弱
酸性を示す。 (5) 呈色反応 ビユウレツト反応、フオリンローリー反応法、
ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応につ
いてペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反応
は、いずれも陽性である。 (6) アミノ酸組成比 本発明物質試料を6N塩酸で110℃、24時間加水
分解(減圧下)後、アミノ酸アナライザー(ダイ
オネツク(dionex)500、ダイオネツクス社)に
より分析した。その結果本発明物質はグリシン
(Gly)を基準として、以下の比率で各アミノ酸
を含有することが確認された。構成アミノ酸 比率(モル比) Gly 1.00(基準) Asp及び/又はAsn 1.10±0.06 Thr 0.45±0.02 Ser 0.90±0.05 Glu及び/又はGln 1.82±0.09 Pro 0.84±0.04 Ala 1.11±0.06 Cys 0.20±0.02 Val 0.86±0.04 Met 0.18±0.01 Ile 0.38±0.02 Leu 1.73±0.09 Tyr 0.6±0.03 Phe 0.34±0.02 His 0.28±0.01 Lys 0.44±0.02 Arg 0.46±0.02 (7) ミノ酸配列 本発明物質試料のアミノ酸配列を、アミノ酸シ
ークエンサー(Beckman Sequencer
model890c、ベツクマン社製;各アミノ酸は逆相
高速液体クロマトグラフイーにより同定した)を
用いて分析した。その結果アミノ末端側より17個
のアミノ酸が以下の通り配列していることが確か
められた。 H−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro−Leu−
Ala−His−Val−Val−Ala−Asn−Pro−Gln
−Val−Glu− また、本発明の低分子蛋白質は、以下の生理活
性を有する点において特徴付けられる。 (a) L−細胞に対する細胞毒性作用 前記カースウエル(Casewell)らの方法及び
クロスターガード(Kloster gaard)の方法
〔Mol.,Imm.,17巻、613頁、1980年〕に準じ
て、本発明物質のL−細胞殺細胞効果を評価し
た。すなわち、L−細胞を250単位/mlのペニシ
リンと125μg/mlのストレプトマイシンとを含む
イーグルス ミニマル エツセンシヤルメデイウ
ム(MEM)培地に2×105細胞/mlとなる濃度
で懸濁させ、このL−細胞懸濁液名0.1ml及び適
当濃度に希釈した本発明物質試料各0.1mlを、96
穴マイクロプレート(コースター社製、アメリ
カ)の各ウエルに入れ、これを5%炭酸ガス含有
空気中、37℃で48時間培養する。培養細胞をニユ
ートラル レツド(neutral red)で染色し、生
細胞数をタイターテツクマルチスキヤン(フロー
ラボラトリーズ社製、アメリカ)により比色定量
する。活性はL−細胞を50%殺す力を1単位と
し、これに試料の希釈倍数を乗ずる。 その結果、本発明物質のL−細胞に対する細胞
毒性は、8.99×107単位/mg蛋白質以上であつた。 (b) メスA−ザルコーマ(MethA−sarcoma)
担ガンマウスによる抗腫瘍作用 2×105個メスA−ザルコーマ細胞を、
BALB/cマウス腹部皮内に移植し、7日後腫
瘍の大きさが直径7〜8mmとなつたマウスの尾静
脈より、上記L−細胞に対する細胞毒性作用測定
法(a)で2.5×104〜2.5×105単位/mlに希釈した本
発明物質試料の0.2mlを注射し、48時間後、前記
カールウエルらの方法に準じて、以下の判定基準
により抗腫瘍作用を判定した。 (−):変化なし (+):かすかな出血性壊死 ():中程度の出血性壊死(移植癌表面の真
ん中から50%以上にわたつて壊死) ():顕著な出血性壊死(移植癌の中央部が
重度に壊死し、周囲の癌組織がわずかに残
つた状態) 得られた結果を下記第1表に示す。
制ガン剤に関する。 カースウエル(Carswell)らは、バチルスカ
ルメツテイ グエリン(Bacillus Calmette
Guerin、BCG)で感作したマウスに、14日目に
エンドトキシンを投与すると、2時間後にその血
清中に、L−細胞に対して細胞毒性を有する因子
が産生されることを見い出し、これをツーモア
ネクロシス フアクター(Tumor necrosis
factor,TNF)と名付けた〔Proc.Nat.Acad.
Sci.,USA.72巻,3666頁,1975年〕。グリーン
(Green)らは、上記物質を硫酸アンモニウムに
よる分画沈澱、ゲル過などにより部分精製し、
上記TNFの分子量が約150000であると報告した
〔Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,73巻,381頁,
1976年〕。その後マテイウース(Matthews)ら
は、ウサギにBCGを投与し、2週間後にエンド
トキシンを投与して、TNFを産生し、精製して、
ゲル過法による分子量が39000で、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法(Polyacrylamide gel
electrophoresis,PAGE)によつて67000である
と報告した〔Br.J.Cancer,42巻,416頁,1980
年〕。更に原中らは、プロピオンバクテリウム
アクネス(Propioni−bacterium acnes)とエン
ドトキシンを用いて、マウス及びウサギでTNF
を産生し、その分子量はゲル過法及びPAGEに
より39000であると報告した〔日本臨床 40巻、
1872頁、1982年〕。 以上の他にも、L−細胞に対して細胞毒性を有
する生理活性物質(TNF)の存在は、多数報告
されているが、その分子量をとつてみても、カル
(Kull)から225000〔J.Immunol.,126巻,1279
頁、1980年〕からマテイウースら及び原中らの
39000の範囲に分布しており、末だ充分に単離精
製されているとは云えず、その性状を調べるに足
る充分な量は得られていないのが現状である。 本発明者らも上記L−細胞に対して細胞毒性を
有する物質の本体を究めるべく鋭意研究を重ねて
きた。その結果、従来報告された例のない低分子
蛋白質を単離精製することに成功し、これが制ガ
ン作用を有することを見い出し、本発明に到達し
た。 本発明の制ガン剤の有効成分である上記新規な
低分子蛋白質(以下単に「本発明物質」という)
は、以下の特性を有することにより特徴付けられ
る。 (1) 分子量 A バイオゲルA1.5mを用いたゲル過法による
分子量 バイオゲル(Biogel)A1.5m(バイオ・ラド社
製、アメリカ)をカラム(16×1000mm、フアルマ
シア社製、スエーデン)に充填し、0.04Mトリス
−塩酸/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム
(SDS)/4M尿素/0.1MNaCl(PH7.8)の緩衝液
を用い、本発明物質試料200μg(蛋白量)を添
加し、ゲル過を行ない、試料の溶出位置より標
準分子量キツト(フアルマシア社製、スエーデ
ン)から求めた標準曲線を用いて分子量を算出し
た。尚上記蛋白量は、ブラツドフオード
(Bradford)の方法〔Anal.Biochem.,72巻、
248頁、1976年〕に準じてクーマジーブリリアン
トブルー G−250による色素結合法により求め
たものであり、以下同様である。 得られた結果は、第1図に示す通りである。図
中1は牛血清アルブミン(分子量67000)を、2
は卵白アルブミン(分子量43000)を、3はキモ
トリプシノーゲンA(分子量25000)を、4はリボ
ヌレアーゼ(分子量13700)を示し、aが本発明
物質である。第1図より本発明物質aは、キモト
リブシノーゲンA3の後に溶出し、その分子量は
約17200であると認められる。 B TSKゲルG3000SWを用いたゲル過法によ
る分子量 フアルマシアFPLCシステム(フアルマシア社
製、スエーデン)にTSKゲルG3000SW(東洋曹
達社製)カラムを接続し、0.1%SDS/0.1Mリン
酸ナトリウム(PH7.0)の緩衝液を用いて、本発
明物質試料100μg(蛋白量)を付加してゲル過
を行ない、高速液体クロマト用標準分子量キツト
(オリエンタル酵母社製)を用い、これらの溶出
パターンより、本発明物質試料の分子量を算出し
た。高速液体クロマトグラフイーによる溶出パタ
ーンを第2図に、また該クロマトグラフイーの溶
出時間から求めた分子量分布を第3図にそれぞれ
示す。各図において5はグルタミン酸脱水素酵素
(分子量290000、尚第2図には示されていない)
を、6はエノラゼ(分子量67000)を、7はアデ
ニル酸キナーゼ(分子量32000)を、8はチトク
ロームC(分子量12300)を、aは本発明物質をそ
れぞれ示す。各図より本発明物質aは、チトクロ
ームC8の前に溶出し、その分子量は約15300と
算出される。 C SDS/ポリアクリルアミドゲルを用いた電気
泳動法による分子量 近藤らの方法〔生化学、44巻、304頁、1972年〕
に従い、リン酸ナトリウム/SDS(PH7.2)で、
SDS−ポリアクリルアミドゲルに、本発明物質試
料5μg(蛋白量)を付与し、40mAで7時間電気泳
動を行ない、標準分子量キツト(オリエンタル酵
母社製)を用いて、電気泳動パターン(第4図)
を記録し、これより分子量曲線(第5図)を作製
し、該図より試料の分子量を算出した。第4図及
び第5図においてaはチトクロームC7量体(分
子量86100)を、bはチトクロームC6量体(分子
量73800)を、cはチトクロームC5量体(分子量
61500)を、dはチトクロムC4量体(分子量
49200)を、eはチトクロームC3量体(分子量
36900)を、fはチトクロームC2量体(分子量
24600)を、gはチトクロームC単量体(分子量
12300)を、それぞれ示す。またsは本発明物質
である。第5図より本発明物質sの、分子量は約
16700と算出される。 (2) 等電点 等電点測定装置(バイオ・ラド社製、アメリ
カ)とアンホライン(Ampholine)ポリアクリ
ルアミドプレート(PH3.5〜9.5)(LKB社製、ア
メリカ)を使用し、標準等電点測定マーカーキツ
ト(フアルマシア社製、スエーデン)を使用し、
本発明物質の等電点を測定した。すなわち、紙
片に本発明物質試料約5μg(蛋白量)を吸収させ、
ゲル上にのせ、10W定電力にて、約2時間泳動さ
せ、電流が一定となつた時点で泳動を終了した。
ゲルは1mm間隔で切り取り、緩衝液にて溶出し、
L−細胞に対する活性の測定に供した。等電点は
等電点マーカーを基準に算出した。その結果、本
発明物質の等電点はPH3.8±0.3と算出された。 (3) 紫外部吸収の測定 ダブルビーム分光光計度UV−300(島津製製所
製)を使用し、0.02M トリス−塩酸/0.1M
NaCl(PH7.8)に溶解した本発明物質試料の紫外
部吸収を測定した。その結果を第6図に示す。該
図より極大値は277nm、極小値は250nmであつ
た。 (4) 溶解性、色及び性状 文発明物質試料を3mg蛋白量/ml濃度に0.02M
トリス−塩酸緩衝液(PH7.8)に溶解した溶液
は、無色透明である。 該溶液にアセトン又はエタノールを70V/V%
以上加えると沈澱を生ずる。 また本発明物質の3mg蛋白量/ml水溶液は、弱
酸性を示す。 (5) 呈色反応 ビユウレツト反応、フオリンローリー反応法、
ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応につ
いてペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反応
は、いずれも陽性である。 (6) アミノ酸組成比 本発明物質試料を6N塩酸で110℃、24時間加水
分解(減圧下)後、アミノ酸アナライザー(ダイ
オネツク(dionex)500、ダイオネツクス社)に
より分析した。その結果本発明物質はグリシン
(Gly)を基準として、以下の比率で各アミノ酸
を含有することが確認された。構成アミノ酸 比率(モル比) Gly 1.00(基準) Asp及び/又はAsn 1.10±0.06 Thr 0.45±0.02 Ser 0.90±0.05 Glu及び/又はGln 1.82±0.09 Pro 0.84±0.04 Ala 1.11±0.06 Cys 0.20±0.02 Val 0.86±0.04 Met 0.18±0.01 Ile 0.38±0.02 Leu 1.73±0.09 Tyr 0.6±0.03 Phe 0.34±0.02 His 0.28±0.01 Lys 0.44±0.02 Arg 0.46±0.02 (7) ミノ酸配列 本発明物質試料のアミノ酸配列を、アミノ酸シ
ークエンサー(Beckman Sequencer
model890c、ベツクマン社製;各アミノ酸は逆相
高速液体クロマトグラフイーにより同定した)を
用いて分析した。その結果アミノ末端側より17個
のアミノ酸が以下の通り配列していることが確か
められた。 H−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro−Leu−
Ala−His−Val−Val−Ala−Asn−Pro−Gln
−Val−Glu− また、本発明の低分子蛋白質は、以下の生理活
性を有する点において特徴付けられる。 (a) L−細胞に対する細胞毒性作用 前記カースウエル(Casewell)らの方法及び
クロスターガード(Kloster gaard)の方法
〔Mol.,Imm.,17巻、613頁、1980年〕に準じ
て、本発明物質のL−細胞殺細胞効果を評価し
た。すなわち、L−細胞を250単位/mlのペニシ
リンと125μg/mlのストレプトマイシンとを含む
イーグルス ミニマル エツセンシヤルメデイウ
ム(MEM)培地に2×105細胞/mlとなる濃度
で懸濁させ、このL−細胞懸濁液名0.1ml及び適
当濃度に希釈した本発明物質試料各0.1mlを、96
穴マイクロプレート(コースター社製、アメリ
カ)の各ウエルに入れ、これを5%炭酸ガス含有
空気中、37℃で48時間培養する。培養細胞をニユ
ートラル レツド(neutral red)で染色し、生
細胞数をタイターテツクマルチスキヤン(フロー
ラボラトリーズ社製、アメリカ)により比色定量
する。活性はL−細胞を50%殺す力を1単位と
し、これに試料の希釈倍数を乗ずる。 その結果、本発明物質のL−細胞に対する細胞
毒性は、8.99×107単位/mg蛋白質以上であつた。 (b) メスA−ザルコーマ(MethA−sarcoma)
担ガンマウスによる抗腫瘍作用 2×105個メスA−ザルコーマ細胞を、
BALB/cマウス腹部皮内に移植し、7日後腫
瘍の大きさが直径7〜8mmとなつたマウスの尾静
脈より、上記L−細胞に対する細胞毒性作用測定
法(a)で2.5×104〜2.5×105単位/mlに希釈した本
発明物質試料の0.2mlを注射し、48時間後、前記
カールウエルらの方法に準じて、以下の判定基準
により抗腫瘍作用を判定した。 (−):変化なし (+):かすかな出血性壊死 ():中程度の出血性壊死(移植癌表面の真
ん中から50%以上にわたつて壊死) ():顕著な出血性壊死(移植癌の中央部が
重度に壊死し、周囲の癌組織がわずかに残
つた状態) 得られた結果を下記第1表に示す。
【表】
次に本発明の新規低分子蛋白質を得る方法につ
いて記述する。 本発明物質は、基本的には公知の方法に従い、
免疫賦活作用を有する物質を哺乳動物に投与し、
次いでグラム陰性菌由来のエンドトキシン又は植
物由来のレクチンを投与することにより、該哺乳
動物体内に産生される。より詳細には、例えばカ
ースウエルらの方法〔Proc.Nat.Acad.Sci.,
USA.,72巻,3666頁,1975年〕に準じて、まず
哺乳動物に免疫賦活作用を有する物質を投与す
る。ここで哺乳動物としては、例えばマウス、ラ
ツト、モルモツト、ウサギ等を例示でき、特にこ
れらに限定されない。免疫賦活作用を有する物質
としては、公知の各種物質を用いることができ
る。その具体例としては例えばバチルス カルメ
ツテイ グエリン(BCG)、コリネバクテリウム
パルバム(Corynebacterium parvam)、プロ
ピオンバクテリウム アクネス(Propioni−
bacterium acnes)、ミコバクテリウム ブチリ
カム(Mycobacterium butyricum)、コリネバ
クテリウム グラニユロサム(Corynebacterium
granulosum)、ストレプトコツカス ピロジネス
(Streptococcus pyrogenes)、プラスモデイウム
(Plasmodium)等のほか、ザイモザン
(Zymosan)、ノカルデイア アストロイデス
(Nocardia asteroides)、リステリア モノサイ
トジエネス(Lysteria monocytogenes)、グルカ
ン(glucan)、細胞膜骨格(cellwall skelton)、
デキストラン硫酸(dextran sulfate)、ムラミル
ジペプタイド(muramyldipeptide)、クレスチン
(呉羽工業社製)等を例示できる。これら免疫賦
活作用を有する物質の投与は、一般に静脈内又は
腹腔内注射により行なわれる。投与量は適宜に決
定されるが、通常1〜1000mg/Kg程度の範囲とす
るのが好ましい。 本法では次いで上記免疫賦活作用を有する物質
の投与後7〜14日目にグラム陰性菌由来のエンド
トキシン又は植物由来のレクチンを供試動物に投
与する。上記エンドトキシン及びレクチンとして
は、公知の各種のものをいずれも使用できる。そ
の代表例としては、例えば大腸菌、緑膿菌、チフ
ス菌等に由来するリポポリサツカライドやタチナ
タマメレクチン(コンカナバリンA、ConA)、
ダイズマメレクチン(SBA)、アカインゲンマメ
レクチン(PHA)等を例示することができる。
これらの投与は通常静脈内注射によるのが望まし
い、投与量は特に限定はないが、通常約10μg〜
10mg/Kgの範囲から選択されるのが一般的であ
る。上記エンドトキシン又はレクチンの投力後約
1.5〜3時間で目的とする制ガン作用を有する本
発明の低分子蛋白質が供試動物の血清もしくは血
漿中に産生される。 本発明物質の採取及び分離精製は、通常の方法
に従い実施される。すなわち供試動物から常法に
従い採血し、得られる血清もしくは血漿中に含有
される当該物質の性質を利用して、物理化学的又
は生化学的手段に従い、例えば塩析、クロマトグ
ラフイー、電気泳動法、抽出法、遠心分離法、透
析法等を単独で又は適宜組合せることにより行な
われる。より具体的には、上記血清又は血漿(以
下これらを粗製溶液と記す)を次の工程に付すこ
とにより実施される。 (1) 硫酸アンモニウム塩析 (2) ゲル過 (3) ハイドロキシアパタイトクロマトグラフイー (4) フアルマシアFPLCモノQカラムクロマトグ
ラフイー (5) 硫酸アンモニウム塩析溶解クロマトグラフイ
ー (6) ゲル過 以下に、これら工程の詳細を説明する。 精製工程 1 粗製溶液に硫酸アンモニウム(以下「硫安」と
記す)を添加し、50〜80%飽和溶液を調製する。
この溶液を2時間〜一夜低温室(4℃)に放置
し、生理活性低分子蛋白質を充分沈澱させる。次
いで冷却遠心分離機(日立製作所製)を使用し、
10000回転/分で10〜30分間遠心分離を行ない生
理活性を有する沈澱を集める。この段階での活性
回収率(前記L−細胞に対する細胞毒性活性測定
法による)は80〜100%であり、精製度は10〜20
倍である。 精製工程 2 工程1で得られた沈澱を0.02M トリス−塩酸
(PH7.8)/0.1M NaClの緩衝液に懸濁させる。こ
の懸濁液に2〜8Mの尿素を加え、不溶性物質を
10000回転/分で10〜30分間冷却遠心分離を行な
い、清澄な生理活性を有する上清液を得、これを
ゲル過に付す。ゲル過用担体としてはウルト
ロゲルAcA44,54(LKB社製、アメリカ)、ある
いはバイオゲルA1.5m(バイオ・ラド社製、アメ
リカ)等が用いられる。 ゲル過分画物につき、前記L−細胞に対する
細胞毒性活性測定を行ない、活性画分を集めて、
限外過膜YM10(アミコン社製・アメリカ)を
装着した限外過装置TCF−10(アミコン社製・
アメリカ)により限外過濃縮を行なう。但し、
濃縮は50〜80%飽和硫安沈澱法によつてもよい。
この方法による活性回収率は80〜100%であり、
精製度は20〜50倍である。 精製工程 3 工程2で得られた生理活性画分の濃縮液を透析
用チユーブ(半井化学薬品社製)を用い、50〜
100倍量の0.02Mリン酸緩衝液(PH6.8)に対して
4℃で、数回外液を交換しながら、一夜透析す
る。透析液を冷却遠心分離機(4℃)で10000回
転/分、20〜30分間遠心分離を行ない、清澄な上
清を得る。次いでこの上清液をハイドロキシアパ
タイト(日本ケミカル社製)に吸着させ、0.02M
〜0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)で連続的濃度勾
配法に従い、もしくは段階的に濃度を上昇させて
生理活性区分を溶離する。得られた生理活性区分
を限外過濃縮、又は硫安塩析により濃縮する。
この方法による生理活性区分の回収率は40〜80%
であり、精製度は約4〜10倍である。 精製工程 4 精製工程3で得られた生理活性区分の濃縮液を
透析用チユーブに入れ、50〜100倍量の希薄なリ
ン酸、あるいはトリス緩衝液(PH7.0〜8.0)に対
して、4℃で一夜透析する。この透析液をフアル
マシアFPLCモノQカラム(フアルマシア社製、
スエーデン)に吸着させ、緩衝液濃度、あるいは
NaCl濃度を連続的に上昇させて生理活性物質の
溶離を行なう。この工程での活性回収率は70〜90
%であり、精製度は約3〜6倍上昇する。 精製工程 5 精製工程4における活性区分につき限外過濃
縮を行ない、硫安塩析溶解カラムクロマトグラフ
イーに付する。トーヨーパールSW50、55、また
は60(いずれも東洋曹達社製)をカラムに充填し、
フアルマシアFPLCシステム(フアルマシア社
製・スエーデン)を用い、カラム中で生理活性区
分を硫安塩析、次いで連続的に硫安濃度を下げて
活性区分を溶解分別する。この段階での活性回収
率は30〜70%であり、精製度は約3〜4倍であ
る。 精製工程 6 精製工程5で得られた活性区分を濃縮し、バイ
オ・ゲルA1.5mあるいはウルトロゲルAcA44又
は54を充填したカラム(16×1000mm)に付し、ゲ
ル過を行なう。あるいはトーヨーソーダ高速液
体クロマト用カラムG2000SW又はG3000SW(東
洋曹達社製)を用いてゲル過を行なう。この工
程における活性回収率は25〜75%でり、精製度は
約3〜6倍である。 精製工程1〜6を通しての活性回収率は、5〜
30%であり、精製度は2.7×104〜7.8×105倍であ
る。 この様にして得られた生理活性を有する低分子
蛋白質の特性を測定した結果は、前記した通りで
ある。 かくして本発明の低分子蛋白質を得る。得られ
る本発明物質は前述した通り、L−細胞に対して
インビトロで直接細胞毒作用を有し、またインビ
ボで抗腫瘍作用を有するに加え、以下の薬理試験
例に示す通りヒトガン細胞乃至メラノーマ細胞に
対しても細胞毒作用乃至殺細胞作用を示し、しか
も低毒性である。 薬理試験例 細胞毒乃至殺細胞作用 (a) ヒトガン細胞殺細胞作用 ヒトバーキツトリンパ腫由来株Raji(J.Nat.
Cancer Inst.,37巻、547頁、1966年〕、ヒト胃癌
(印環細胞癌)由来株Kato−〔Jpn.J.Exp.
Med.,48巻、61頁、1978年〕及びヒト鼻咽腔癌
由来株KB〔Cancer Res.,18巻、1017頁、1958
年〕の各細胞に対する本発明物質の殺細胞効果を
評価した。すなわち、ヒトバーキツトリンパ腫由
来細胞株及びヒト胃癌由来細胞株を、250単位/
mlのペニシリン、125μg/mlのストレプトマイシ
ン及び10%非働化牛胎児血清を含むRPMI1640培
地で2×105細胞/mlに調整した。また、ヒト鼻
咽腔癌由来細胞株を、250単位/mlのペニシリン、
125μg/mlのストレプトマイシン及び10%非働化
牛血清を含むイーグルス ミニマル エツセンシ
ヤル メデイウム培地を用いて2×105細胞/ml
に調整した。 上記各細胞調整液0.1mlと各種濃度に希釈した
本発明物質0.1mlとを96穴マイクロプレートの各
ウエルに入れ、これを5%炭酸ガス含有空気中、
37℃で48時間培養した。 培養48時間後に細胞をトリパンブルーで染色
し、顆微鏡下でビルケルチユルク計算盤(エルマ
オプテイカルワークス社製、日本)を使用して生
細胞数を算出した。この結果、本発明物質の各種
細胞の増殖を50%抑制する濃度は、ヒトバーキツ
トリンパ腫由来細胞に対しては8.0ng蛋白量/ml
以上、ヒト胃癌由来細胞に対しては27.0ng蛋白
量/ml以上、ヒト鼻咽腔癌由来細胞に対しては
11.0ng蛋白量/ml以上であつた。 (b) メラノーマ細胞に対する細胞毒性作用 ヘルソン(Helson)らの方法〔Nature,258
巻,731頁,1975年〕に準じて、本発明物質のメ
ラノーマA−375〔J,Natl.Cancer Inst.,51巻,
1417頁,1973年〕細胞に対する細胞毒性作用を評
価した。即ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン及び10%非働化牛
胎児血清を含むイーグルス培地を用いてメラノー
マA−375細胞5×104細胞/mlの懸濁液を調整し
た。この細胞懸濁液各1ml及び本発明物質を適当
に希釈調整した試料溶液1mlを3.5cm径のシヤー
レに入れ、5%炭酸ガス含有空気中下37℃で培養
した。 培養3日目に上記(a)と同様にして細胞をトリパ
ンブルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチユルク
計算盤を使用して生細胞数を算出した。この結
果、本発明物質のメノラーマA−375細胞の増殖
を50%抑制するのに必要な量は14ng蛋白量/ml
以上であつた。 薬理試験例 急性毒性 8週令のddY系雌雄マウスを各々10匹用い、本
発明物質を3.7mg蛋白量/Kgの割合で静脈内投与
し、急性毒性を調べた。 その結果死亡例は認められず、LD0は3.7mg/
Kg以上であることが確認された。また、観察期間
中、本発明物質に起因すると考えられる明らかな
中毒症状は認められなかつた。 以上の通り本発明物質は各種細胞に対し細胞毒
作用乃至殺細胞作用を奏し、また低毒性であると
ころから抗腫瘍剤乃至制ガン剤として有用であ
る。 本発明物質はこれを抗腫瘍剤乃至制ガン剤とし
て利用するに当つては、その有効量を含有する各
種形態に調整され、該形態に応じた各種投与経路
により投与される。その製剤形態としては通常液
状溶液、懸濁液、乳濁液等を例示でき、これらは
一般に静脈、皮下又は筋肉内に投与される。これ
らはまた使用前に適当な担体の添加によつて液状
になし得る乾燥品として提供することもできる。
該抗腫瘍剤の投与量は、疾患の程度、患者の年
齢、性別等によつて異なるが、通常、蛋白量とし
て約1.85〜18.5μg/Kg/日を1〜数回に分けて投
与するのが好ましい。 以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述
べるが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。 実施例 1 ニユージランドホワイト又は日本白色系雌ウギ
(体重2.0〜3.0Kg)にホルマリン死菌コリネバク
テリウム パルバム(Corynebacterium
paruvam、ウエルカム社製、イギリス)70mgを
耳静脈より注射した。注射9日後に100μgのリポ
ポリサツカライド(大腸菌055;B5、デイフコ社
製、アメリカ)を耳静脈より注射し、2時間後心
臓より全採血した。採血した血液を5000回転/分
で20分間遠心分離し、血清を分離した。該操作に
より100羽のウサギから15900単位/mlの力価を有
する血清7530mlが得られた。 なお、ニユージランドホワイトと日本白色系の
本生理活性物質の産生量は第2表に示すように、
日本白色系ウサギの方が高かつた。
いて記述する。 本発明物質は、基本的には公知の方法に従い、
免疫賦活作用を有する物質を哺乳動物に投与し、
次いでグラム陰性菌由来のエンドトキシン又は植
物由来のレクチンを投与することにより、該哺乳
動物体内に産生される。より詳細には、例えばカ
ースウエルらの方法〔Proc.Nat.Acad.Sci.,
USA.,72巻,3666頁,1975年〕に準じて、まず
哺乳動物に免疫賦活作用を有する物質を投与す
る。ここで哺乳動物としては、例えばマウス、ラ
ツト、モルモツト、ウサギ等を例示でき、特にこ
れらに限定されない。免疫賦活作用を有する物質
としては、公知の各種物質を用いることができ
る。その具体例としては例えばバチルス カルメ
ツテイ グエリン(BCG)、コリネバクテリウム
パルバム(Corynebacterium parvam)、プロ
ピオンバクテリウム アクネス(Propioni−
bacterium acnes)、ミコバクテリウム ブチリ
カム(Mycobacterium butyricum)、コリネバ
クテリウム グラニユロサム(Corynebacterium
granulosum)、ストレプトコツカス ピロジネス
(Streptococcus pyrogenes)、プラスモデイウム
(Plasmodium)等のほか、ザイモザン
(Zymosan)、ノカルデイア アストロイデス
(Nocardia asteroides)、リステリア モノサイ
トジエネス(Lysteria monocytogenes)、グルカ
ン(glucan)、細胞膜骨格(cellwall skelton)、
デキストラン硫酸(dextran sulfate)、ムラミル
ジペプタイド(muramyldipeptide)、クレスチン
(呉羽工業社製)等を例示できる。これら免疫賦
活作用を有する物質の投与は、一般に静脈内又は
腹腔内注射により行なわれる。投与量は適宜に決
定されるが、通常1〜1000mg/Kg程度の範囲とす
るのが好ましい。 本法では次いで上記免疫賦活作用を有する物質
の投与後7〜14日目にグラム陰性菌由来のエンド
トキシン又は植物由来のレクチンを供試動物に投
与する。上記エンドトキシン及びレクチンとして
は、公知の各種のものをいずれも使用できる。そ
の代表例としては、例えば大腸菌、緑膿菌、チフ
ス菌等に由来するリポポリサツカライドやタチナ
タマメレクチン(コンカナバリンA、ConA)、
ダイズマメレクチン(SBA)、アカインゲンマメ
レクチン(PHA)等を例示することができる。
これらの投与は通常静脈内注射によるのが望まし
い、投与量は特に限定はないが、通常約10μg〜
10mg/Kgの範囲から選択されるのが一般的であ
る。上記エンドトキシン又はレクチンの投力後約
1.5〜3時間で目的とする制ガン作用を有する本
発明の低分子蛋白質が供試動物の血清もしくは血
漿中に産生される。 本発明物質の採取及び分離精製は、通常の方法
に従い実施される。すなわち供試動物から常法に
従い採血し、得られる血清もしくは血漿中に含有
される当該物質の性質を利用して、物理化学的又
は生化学的手段に従い、例えば塩析、クロマトグ
ラフイー、電気泳動法、抽出法、遠心分離法、透
析法等を単独で又は適宜組合せることにより行な
われる。より具体的には、上記血清又は血漿(以
下これらを粗製溶液と記す)を次の工程に付すこ
とにより実施される。 (1) 硫酸アンモニウム塩析 (2) ゲル過 (3) ハイドロキシアパタイトクロマトグラフイー (4) フアルマシアFPLCモノQカラムクロマトグ
ラフイー (5) 硫酸アンモニウム塩析溶解クロマトグラフイ
ー (6) ゲル過 以下に、これら工程の詳細を説明する。 精製工程 1 粗製溶液に硫酸アンモニウム(以下「硫安」と
記す)を添加し、50〜80%飽和溶液を調製する。
この溶液を2時間〜一夜低温室(4℃)に放置
し、生理活性低分子蛋白質を充分沈澱させる。次
いで冷却遠心分離機(日立製作所製)を使用し、
10000回転/分で10〜30分間遠心分離を行ない生
理活性を有する沈澱を集める。この段階での活性
回収率(前記L−細胞に対する細胞毒性活性測定
法による)は80〜100%であり、精製度は10〜20
倍である。 精製工程 2 工程1で得られた沈澱を0.02M トリス−塩酸
(PH7.8)/0.1M NaClの緩衝液に懸濁させる。こ
の懸濁液に2〜8Mの尿素を加え、不溶性物質を
10000回転/分で10〜30分間冷却遠心分離を行な
い、清澄な生理活性を有する上清液を得、これを
ゲル過に付す。ゲル過用担体としてはウルト
ロゲルAcA44,54(LKB社製、アメリカ)、ある
いはバイオゲルA1.5m(バイオ・ラド社製、アメ
リカ)等が用いられる。 ゲル過分画物につき、前記L−細胞に対する
細胞毒性活性測定を行ない、活性画分を集めて、
限外過膜YM10(アミコン社製・アメリカ)を
装着した限外過装置TCF−10(アミコン社製・
アメリカ)により限外過濃縮を行なう。但し、
濃縮は50〜80%飽和硫安沈澱法によつてもよい。
この方法による活性回収率は80〜100%であり、
精製度は20〜50倍である。 精製工程 3 工程2で得られた生理活性画分の濃縮液を透析
用チユーブ(半井化学薬品社製)を用い、50〜
100倍量の0.02Mリン酸緩衝液(PH6.8)に対して
4℃で、数回外液を交換しながら、一夜透析す
る。透析液を冷却遠心分離機(4℃)で10000回
転/分、20〜30分間遠心分離を行ない、清澄な上
清を得る。次いでこの上清液をハイドロキシアパ
タイト(日本ケミカル社製)に吸着させ、0.02M
〜0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)で連続的濃度勾
配法に従い、もしくは段階的に濃度を上昇させて
生理活性区分を溶離する。得られた生理活性区分
を限外過濃縮、又は硫安塩析により濃縮する。
この方法による生理活性区分の回収率は40〜80%
であり、精製度は約4〜10倍である。 精製工程 4 精製工程3で得られた生理活性区分の濃縮液を
透析用チユーブに入れ、50〜100倍量の希薄なリ
ン酸、あるいはトリス緩衝液(PH7.0〜8.0)に対
して、4℃で一夜透析する。この透析液をフアル
マシアFPLCモノQカラム(フアルマシア社製、
スエーデン)に吸着させ、緩衝液濃度、あるいは
NaCl濃度を連続的に上昇させて生理活性物質の
溶離を行なう。この工程での活性回収率は70〜90
%であり、精製度は約3〜6倍上昇する。 精製工程 5 精製工程4における活性区分につき限外過濃
縮を行ない、硫安塩析溶解カラムクロマトグラフ
イーに付する。トーヨーパールSW50、55、また
は60(いずれも東洋曹達社製)をカラムに充填し、
フアルマシアFPLCシステム(フアルマシア社
製・スエーデン)を用い、カラム中で生理活性区
分を硫安塩析、次いで連続的に硫安濃度を下げて
活性区分を溶解分別する。この段階での活性回収
率は30〜70%であり、精製度は約3〜4倍であ
る。 精製工程 6 精製工程5で得られた活性区分を濃縮し、バイ
オ・ゲルA1.5mあるいはウルトロゲルAcA44又
は54を充填したカラム(16×1000mm)に付し、ゲ
ル過を行なう。あるいはトーヨーソーダ高速液
体クロマト用カラムG2000SW又はG3000SW(東
洋曹達社製)を用いてゲル過を行なう。この工
程における活性回収率は25〜75%でり、精製度は
約3〜6倍である。 精製工程1〜6を通しての活性回収率は、5〜
30%であり、精製度は2.7×104〜7.8×105倍であ
る。 この様にして得られた生理活性を有する低分子
蛋白質の特性を測定した結果は、前記した通りで
ある。 かくして本発明の低分子蛋白質を得る。得られ
る本発明物質は前述した通り、L−細胞に対して
インビトロで直接細胞毒作用を有し、またインビ
ボで抗腫瘍作用を有するに加え、以下の薬理試験
例に示す通りヒトガン細胞乃至メラノーマ細胞に
対しても細胞毒作用乃至殺細胞作用を示し、しか
も低毒性である。 薬理試験例 細胞毒乃至殺細胞作用 (a) ヒトガン細胞殺細胞作用 ヒトバーキツトリンパ腫由来株Raji(J.Nat.
Cancer Inst.,37巻、547頁、1966年〕、ヒト胃癌
(印環細胞癌)由来株Kato−〔Jpn.J.Exp.
Med.,48巻、61頁、1978年〕及びヒト鼻咽腔癌
由来株KB〔Cancer Res.,18巻、1017頁、1958
年〕の各細胞に対する本発明物質の殺細胞効果を
評価した。すなわち、ヒトバーキツトリンパ腫由
来細胞株及びヒト胃癌由来細胞株を、250単位/
mlのペニシリン、125μg/mlのストレプトマイシ
ン及び10%非働化牛胎児血清を含むRPMI1640培
地で2×105細胞/mlに調整した。また、ヒト鼻
咽腔癌由来細胞株を、250単位/mlのペニシリン、
125μg/mlのストレプトマイシン及び10%非働化
牛血清を含むイーグルス ミニマル エツセンシ
ヤル メデイウム培地を用いて2×105細胞/ml
に調整した。 上記各細胞調整液0.1mlと各種濃度に希釈した
本発明物質0.1mlとを96穴マイクロプレートの各
ウエルに入れ、これを5%炭酸ガス含有空気中、
37℃で48時間培養した。 培養48時間後に細胞をトリパンブルーで染色
し、顆微鏡下でビルケルチユルク計算盤(エルマ
オプテイカルワークス社製、日本)を使用して生
細胞数を算出した。この結果、本発明物質の各種
細胞の増殖を50%抑制する濃度は、ヒトバーキツ
トリンパ腫由来細胞に対しては8.0ng蛋白量/ml
以上、ヒト胃癌由来細胞に対しては27.0ng蛋白
量/ml以上、ヒト鼻咽腔癌由来細胞に対しては
11.0ng蛋白量/ml以上であつた。 (b) メラノーマ細胞に対する細胞毒性作用 ヘルソン(Helson)らの方法〔Nature,258
巻,731頁,1975年〕に準じて、本発明物質のメ
ラノーマA−375〔J,Natl.Cancer Inst.,51巻,
1417頁,1973年〕細胞に対する細胞毒性作用を評
価した。即ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン及び10%非働化牛
胎児血清を含むイーグルス培地を用いてメラノー
マA−375細胞5×104細胞/mlの懸濁液を調整し
た。この細胞懸濁液各1ml及び本発明物質を適当
に希釈調整した試料溶液1mlを3.5cm径のシヤー
レに入れ、5%炭酸ガス含有空気中下37℃で培養
した。 培養3日目に上記(a)と同様にして細胞をトリパ
ンブルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチユルク
計算盤を使用して生細胞数を算出した。この結
果、本発明物質のメノラーマA−375細胞の増殖
を50%抑制するのに必要な量は14ng蛋白量/ml
以上であつた。 薬理試験例 急性毒性 8週令のddY系雌雄マウスを各々10匹用い、本
発明物質を3.7mg蛋白量/Kgの割合で静脈内投与
し、急性毒性を調べた。 その結果死亡例は認められず、LD0は3.7mg/
Kg以上であることが確認された。また、観察期間
中、本発明物質に起因すると考えられる明らかな
中毒症状は認められなかつた。 以上の通り本発明物質は各種細胞に対し細胞毒
作用乃至殺細胞作用を奏し、また低毒性であると
ころから抗腫瘍剤乃至制ガン剤として有用であ
る。 本発明物質はこれを抗腫瘍剤乃至制ガン剤とし
て利用するに当つては、その有効量を含有する各
種形態に調整され、該形態に応じた各種投与経路
により投与される。その製剤形態としては通常液
状溶液、懸濁液、乳濁液等を例示でき、これらは
一般に静脈、皮下又は筋肉内に投与される。これ
らはまた使用前に適当な担体の添加によつて液状
になし得る乾燥品として提供することもできる。
該抗腫瘍剤の投与量は、疾患の程度、患者の年
齢、性別等によつて異なるが、通常、蛋白量とし
て約1.85〜18.5μg/Kg/日を1〜数回に分けて投
与するのが好ましい。 以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述
べるが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。 実施例 1 ニユージランドホワイト又は日本白色系雌ウギ
(体重2.0〜3.0Kg)にホルマリン死菌コリネバク
テリウム パルバム(Corynebacterium
paruvam、ウエルカム社製、イギリス)70mgを
耳静脈より注射した。注射9日後に100μgのリポ
ポリサツカライド(大腸菌055;B5、デイフコ社
製、アメリカ)を耳静脈より注射し、2時間後心
臓より全採血した。採血した血液を5000回転/分
で20分間遠心分離し、血清を分離した。該操作に
より100羽のウサギから15900単位/mlの力価を有
する血清7530mlが得られた。 なお、ニユージランドホワイトと日本白色系の
本生理活性物質の産生量は第2表に示すように、
日本白色系ウサギの方が高かつた。
【表】
該血清1000mlに472gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約100mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は98%で精製度は18倍であつた。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの尿
素を加え溶解させた。これを10000回転/分で30
分間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液50mlをとり、0.02M トリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いゲル過(カラムサイズ50×
1000mm)し、溶出区分につきL−細胞に対する活
性測定法により、活性を調べ活性区分を集めた。
該方法による活性回収率は92%で、精製度は33倍
であつた。全段階を通しての活性回収率は90.2%
で精製度は約600倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着した限
外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して4
℃透析を行なつた。外液を3時間毎に3回交換し
た後、同緩衝液中で、4℃、一夜放置した。この
透析活性区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝液
(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイトゲ
ルのカラム(サイズ26×400mm)に付した。流速
5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液で充
分洗浄した後、0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)
500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlを
使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。この方法では非吸着区分に活性は認
められず、すべての活性は吸着され、吸着された
活性区分はリン酸緩衝液濃度0.15M〜0.3Mの間
に溶出された。活性区分を集め、アミコン限外
過濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過濃
縮を行なつた。この方法による活性回収率は48%
であり、精製度は4.5倍であつた。全工程を通し
ての活性回収率は43.3%、精製度は2.7×103倍で
あつた。 次いで、上記方法で得られた活性区分の濃縮液
を透析用チユーブにいれ、50倍量の0.02Mトリス
−塩酸(PH7.8)/0.1MNaCl緩衝液に対して、4
℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で緩衝化した
フアルマシアモノQカラムに透析内液を付し、1
ml/分、1ml/分画の条件で活性物質を吸着させ
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02Mトリス
−塩酸(PH7.8)/1.0M NaClを用い連続的に
NaCl濃度を上昇させ、吸着した活性区分を溶離
させた。活性区分をアミコン限外過膜YM10を
装着した限外過装置を用い濃縮した。この方法
による活性回収率は80%であり、精製度は4倍上
昇した。全工程を通しての活性回収率は34.6%で
あり、精製度は1.1×104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の緩衝液
を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離
を行なつた。活性区分を集め、アミコン限外過
膜YM10を装着した限外過濃縮装置により濃縮
した。この方法による活性回収率は62%であり、
精製度は4倍であつた。全工程を通しての活性回
収率は21.5%、精製度は4.40×104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SWカラム(7.5×
600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画でゲ
ル過を行なつた。この方法で活性回収率は26%
であり、精製度は5.3倍上昇した。全工程を通じ
ての活性回収率は5.6%であり、精製度は2.33×
105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.24×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 2 ニユージランドホワイト系雌ウサギ(体重2.0
〜3.0Kg)にホルマリン死菌ミコバクテリウム
ブチリカム(デイフコ社製、アメリカ)150mgを
耳静脈より注射した。注射9日後に100μgのリポ
ポリサツカライド(大腸菌 055;B5、デイフコ
社製、アメリカ)を耳静脈より注射し、2時間後
心臓より全採血した。採血した血液を5000回転/
分で20分間遠心分離し、血清を分離した。該操作
により、100羽のウサギから5160単位/mlの力価
を有する血清7410mlが得られた。 該血清1000mlに472gの硫安を添加後、よく溶
解し、4℃で一夜放置した。硫安塩析液を10000
回転/分、30分間冷却遠心分離(4℃)し、沈澱
を集め、この沈澱を約100mlの0.02M トリス−
塩酸/0.1M NaCl緩衝液(PH7.8)に懸濁させた。
この段階での活性回収率は97%で、精製度は20倍
であつた。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの割
合で尿素を加え溶解後、10000回転/分で30分間
冷却遠心分離(4℃)を行ない、不溶物を除去し
た。この上清50mlをとり、0.02M トリス−塩酸
(PH7.8)/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルト
ロゲルAcA54(カラムサイズ50×1000mm)を用い
流速40ml/時、7ml/分画でゲル過し、活性区
分を集めた。該方法による活性回収率は92%で、
精製度は28倍であつた。全段階を通しての活性回
収率は89.2%で、精製度は約560倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着した限
外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して4
℃で透析を行なつた。外液を3時間毎に3回交換
した後、同緩衝液中で、一夜透析した。この透析
活性区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝液(PH
6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイトゲル
のカラム(サイズ26×400mm)に流速5.0ml/時、
3ml/2分画で吸着させた。吸着させた活性区分
を0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)と0.5M リン
酸緩衝液(PH6.8)とを使用し、連続的に濃度勾
配を上昇させることにより溶離した。この方法で
の活性回収率は68%であり、精製度は10倍であつ
た。全工程を通しての活性回収率は60.7%、精製
度は5.6×103倍であつた。 次いで、上記活性区分を限外過器で濃縮し、
透析用チユーブにいれ、50培量の0.02Mトリス−
塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対して、4
℃で一夜透析を行なつた。この透析した活性区分
を、同緩衝液で緩衝化したフアルマシアモノQカ
ラムに1ml/分、1ml/分画の条件で吸着させ
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02M トリ
ス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩衝液を用い連
続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着された活性区
分を溶出させた。活性区分をアミコン限外過濃
縮器により濃縮した。この方法による活性回収率
は62%であり、精製度は4倍上昇した。全工程を
通しての活性回収率は37.6%、で精製度は2.24×
104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安緩衝液で平衡化したトー
ヨーパールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、
流速1ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の
緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶
解分画を行なつた。活性区分を集め、限外過濃
縮器により濃縮した。この段階での活性回収率は
34%であり、精製度は4.7倍であつた。全工程を
通じての活性回収率は12.8%であり、精製度は
1.05×105倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SWカラム(7.5×
600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画でゲ
ル過を行なつた。この段階での活性回収率は62
%であり、精製度は6.3倍であつた。全工程を通
じての活性回収率は7.9%であり、精製度は6.62
×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.19×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 3 ニユージランドホワイト系雌ウサギ(体重2.0
〜3.0Kg)にクレスチン(呉羽化学工業株式会社
製)100mgを耳静脈より注射した。注射9日後に
100μgのリポポリサツカライド(大腸菌055:B5、
デイフコ社製、アメリカ)を耳静脈より注射し、
2時間後心臓より全採血した。採血した血液を
5000回転/分で20分間遠心分離し、血清を分離し
た。該操作により、100羽のウサギから6200単
位/mlの力価を有する血清7000mlが得られた。 該血清1000mlに472gの硫安を添加溶解後4℃
で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分、30分間、4℃で遠心分離し、再
度沈澱を集め、約100mlの0.02M トリス−塩酸
緩衝液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この
段階での活性回収率は98%で精製度は18倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの割
合で尿素を加え溶解させた。これを10000回転/
分で30分間、4℃で遠心分離し、不溶物を除去し
た。この上清液50mlをとり、0.02M トリス−塩
酸/0.5MNaCl(PH7.8)緩衝液で平衡化したウル
トロゲルAcA54を用いゲル過(カラムサイズ
50×1000mm)し、L−細胞に対する活性測定法に
より、活性を調べ、活性区分を集めた。該方法に
よる活性回収率は95%で、精製度は30倍であつ
た。全段階を通しての活性回収率は93.1%で精製
度は約540倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着したゲ
ル過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して透
析を行なつた。外液を3時間毎に3回換した後、
同緩衝液中で4℃、一夜放置した。この透析活性
区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)
で平衡化したハイドロキシアパタイトゲルのカラ
ム(サイズ26×400mm)に付した。流速5.0ml/
時、3ml/分画の条件下に同緩衝液で充分洗浄し
た後、0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlと
0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlとを使用し、
連続的に濃度勾配を上昇させることにより吸着物
質を溶離した。この方法では非吸着区分に活性は
認められず、すべての活性は吸着され、吸着され
た活性区分はリン酸緩衝液濃度0.15M〜0.3Mの
間に溶出された。活性区分を集め、アミコン限外
過濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過
濃縮を行なつた。この方法での活性回収率は56%
であり、精製度は10倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は52.1%、精製度は5.4×103倍であ
つた。 次いで、上記活性区分の濃縮液を透析用チユー
ブにいれ、50倍量の0.02M トリス−塩酸(PH
7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対して、4をで一夜
透析を行なつた。同緩衝液で緩衝化したフアルマ
シアモノQカラムに透析内液を付し、1ml/分、
1ml/分画の条件で活性区分を吸着させた。次い
で同緩衝液で充分洗浄後、0.02M トリス−塩
酸/1.0M NaCl緩衝液(PH7.8)を用い連続的に
NaCl濃度を上昇させ、吸着した活性区分を溶離
させた。活性区分をアミコン限外過膜YM10を
装着した限外過装置を用い濃縮した。この方法
による活性回収率は80%であり、精製度は5.5倍
上昇した。全工程を通しての活性回収率は41.7
%、精製度は2.97×104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス.塩酸/
70%飽和硫安(PH7.8)緩衝液で平衡化したトー
ヨーパールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、
流速1ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1M トリス−塩酸(PH7.8)
の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて
溶出溶離を行なつた。活性区分を集め、アミコン
限外過膜YM10を装着した限外過濃縮装置に
より濃縮した。この段階での活性回収率は64%で
あり、精製度は3.9倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は26.7%であり、精製度は1.16×105
倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M リン酸ナトリウ
ム/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液(PH7.0)で平
衡化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイ
ズ7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分
画でゲル過を行なつた。この段階での活性回収
率は28%であり、精製度は5.0倍上昇した。全工
程を通じての活性回収率は7.5%であり、精製度
は5.8×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は8.99×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 4 ニユージランドホワイト系雌性ウサギ(体重
2.0〜3.0Kg)にホルマリン死菌コリネバクテリウ
ム・パルバム(ウエルカム社製、イギリス)100
mgを耳静脈より注射した。注射9日後に10mgのコ
ンカナバリンA(和光純薬工業社製)を耳静脈よ
り注射し、2時間後心臓より全採血した。採血し
た血液を5000回転/分で20分間、4℃で遠心分離
し、血清を分離した。該操作により、100羽のウ
サギから3780単位/mlの力価を有する血清7640ml
が得られた。 該血清1000mlに472gの硫安を添加後、よく溶
解し、4℃で一夜放置した。硫安塩析液を10000
回転/分で30分間冷却遠心分離(4℃)し、沈澱
を集め、約100mlの0.02Mトリス−塩酸/0.1M
NaCl緩衝液(PH7.8)に懸濁させた。この段階で
の活性回収率は99%で、精製度は20倍であつた。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの尿
素を加え溶解後、10000回転/分で30分間冷却遠
心分離(4℃)し、不溶物を除去した。この上清
50mlをとり、0.02Mトリス−塩酸(PH7.8)/
0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲル
AcA54を用いゲル過(カラムサイズ50×1000
mm、流速40ml/時、7ml/分画)し、溶出区分を
集めた。該方法による活性回収率は95%で、精製
度は41倍であつた。全段階を通しての活性回収率
は94.1%で精製度は約820倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着した限
外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して4
℃で透析を行なつた。外液を3時間毎に3回交換
した後、同緩衝液中で、4℃、一夜放置した。こ
の透析活性区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝
液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイ
トゲルのカラム(サイズ26×400mm)に流速5.0
ml/時、3ml/分画で吸着させた。吸着させた活
性区分は0.02Mリン酸緩衝液(PH6.8)と0.5M
リン酸緩衝液(PH6.8)とを使用し、連続的に濃
度を上昇させる事により吸着物質を溶離した。こ
の方法による活性回収率は65%であり、精製度は
9.8倍であつた。全工程を通しての活性回収率は
61.1%、精製度は8.0×103倍であつた。 次いで、上記活性区分を限外過器で濃縮し、
透析用チユーブにいれ、50倍量の0.02Mトリス−
塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液を用い、4℃
で一夜透析を行なつた。この透析した活性区分を
同緩衝液で平衡化したフアルマシアモノQカラム
に1ml/分、1ml/分画の条件で吸着させた。次
いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02M トリス−塩
酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩衝液を用い連続的に
NaCl濃度を上昇させ、吸着した活性区分を溶出
した。活性区分をアミコン限外過濃縮器により
濃縮した。この方法による活性回収率は74%であ
り、精製度は5.3倍であつた。全工程を通しての
活性回収率は45.2%であり、精製度は4.2×104倍
であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安緩衝液で平衡化したトー
ヨーパールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、
流速1ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1M トリス−塩酸(PH7.8)
緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を下げて、溶解
分画を行なつた。活性区分を集め、限外過濃縮
器により濃縮した。この方法による活性回収率は
58%であり、精製度は3.2倍であつた。全工程を
通しての活性回収率は26.2%で、精製度は1.4×
105倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M リン酸ナトリウ
ム(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平
衡化したトーヨーソーダーG3000SWカラム(7.5
×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画で
ゲル過を行なつた。この方法で活性回収率は44
%であり、精製度は5.7倍であつた。全工程を通
しての活性回収率は11.5%で、精製度は7.8×105
倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.3×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 5 ddY雌性マウス(体重25〜30g)にホルマリン
死菌コリネバクテリウム パルバム(ウエルカム
社製、イギリス)1mgを腹腔内投与し、注射9日
後にリポポリサツカライド(緑膿菌;デイフコ社
製、アメリカ)10μgを尾静脈内注射し、2時間
後眼球を摘出して眼窩静脈叢より血液を採取し
た。採取した血液を5000回転/分で20分間遠心分
離し、血清を分離した。該操作により、100匹の
マウスから56100単位/mlの力価を有する血清
90.6mlが得られた。 該血清100mlに47.2gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約20mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は98%で、精製度は21倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液20mlに対し7.2gの尿素
を加え溶解させた。これを10000回転/分で30分
間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液10mlをとり、0.02Mトリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いてゲル過(カラムサイズ26×
1000mm)し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は90%で、精製度は32倍であつた。全段階を
通しての活性回収率は88.2%で、精製度は約672
倍であつた。 次いでアミコン限外過濃縮器TCF−10を用
いて活性区分を濃縮した。この濃縮液を0.02M
リン酸緩衝液(PH6.8)に対して、4℃で一夜透
析をした。この透析活性区分を0.02Mリン酸緩衝
液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイ
トゲルのカラム(サイズ26×400mm)に付した。
流速5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液
で充分洗浄した後、0.02M リン酸緩衝液(PH
6.8)500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500
mlを使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着
物質を溶離した。活性区分を集め、アミコン限外
過濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過
濃縮を行なつた。この方法による活性回収率は40
%であり、精製度は6倍であつた。全工程を通し
ての活性回収率は35.3%であり、精製度は4.03×
103倍であつた。 次いで、上記方法で得られた活性区分を0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対
して、4℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で緩
衝化したフアルマシアモノQカラムに透析内液を
付し、1ml/分、1ml/分画の条件で当該物質を
吸着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、
0.02M トリス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩
衝液を用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着
した活性区分を溶離させた。活性区分は限外過
濃縮した。この方法による活性回収率は75%であ
り、精製度は5倍上昇した。全工程を通しての活
性回収率は26.5%であり、精製度は2.02×104倍で
あつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の緩衝液
を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離
を行なつた。活性区分を限外過濃縮装置を用い
濃縮した。この方法による活性回収率は47%であ
り、精製度は4倍であつた。全工程を通しての活
性回収率は12.4%であり、精製度は8.08×104倍で
あつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイズ
7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画
でゲル過を行なつた。この方法での活性回収率
は31%であり、精製度は4倍上昇した。全工程を
通じての活性回収率は3.8%であり、精製度は
3.23×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.04×107単位/mg蛋白質であつた 実施例 6 ddY雌性マウス(体重25〜30g)にザイモザン
A(シグマ社製 アメリカ)2.0mgを腹腔内投与
し、注射9日後にエンドトキシン(大腸菌リポポ
リサツカライド)10μgを尾静脈内注射し、2時
間後眼球を摘出して眼窩静脈叢より血液を採取し
た。採取した血液を5000回転/分で20分間遠心分
離し、血清を分離した。該操作により、100匹の
マウスから4800単位/mlの力価を有する血清96ml
が得られた。 該血清100mlに47.2gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約20mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は97%で、精製度は17倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液20mlに対し7.2gの尿素
を加え溶解させた。これを10000回転/分で30分
間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液10mlをとり、0.02M トリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いてゲル過(カラムサイズ26×
1000mm)し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は92%で、精製度は38倍であつた。全段階を
通しての活性回収率は89.2%で精製度は約646倍
であつた。 次いでアミコン限外過濃縮器TCF−10を用
いて活性区分を濃縮した。この濃縮液を0.02M
リン酸緩衝液(PH6.8)に対して、4℃で一夜透
析をした。この透析活性区分を0.02M リン酸緩
衝液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタ
イトゲルのカラム(サイズ26×400mm)に付した。
流速5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液
で充分洗浄した後、0.02Mリン酸緩衝液(PH6.8)
500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlを
使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。活性区分を集め、アミコン限外過
濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過濃縮
を行なつた。この方法による活性回収率は43%で
あり、精製度は6.8倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は38.3%、精製度は4.39×103倍であ
つた。 次いで、上記方法で得られた活性区分を0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対
して4℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で緩衝
化したフアルマシアモノQカラムに透析内液を付
し、1ml/分、1ml/分画の条件で当該物質を吸
着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩衝液を
用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着した活
性区分を溶離させた。活性区分は限外過濃縮し
た。この方法による活性回収率は77%であり、精
製度は4.4倍上昇した。全工程を通しての活性回
収率は29.5%であり、精製度は1.93×104倍であつ
た。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の緩衝液
を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離
を行なつた。活性区分を限外過濃縮装置を用い
濃縮した。この方法による活性回収率は43%であ
り、精製度は3.2倍であつた。全工程を通しての
活性回収率は12.7%、精製度は6.2×104倍であつ
た。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイズ
7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画
でゲル過を行なつた。この方法での活性回収率
は28%であり、精製度は5.4倍上昇した。全工程
を通じての活性回収率は3.6%であり、精製度は
3.35×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.44×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 7 ウイスター系雌性ラツト(体重200〜250g)に
ホルマリン死菌コリネバクテリウム パルバム
(ウエルカム社製、イギリス)10mgを腹腔内投与
し、注射9日後にエンドトキシン(大腸菌リポポ
リサツカライド)250μgを尾静脈内注射した。エ
ンドトキシン投与2時間後にエーテル麻酔下で腹
部下大静脈より血液を採取した。採取した血液を
5000回転/分で20分間遠心分離し、血清を分離し
た。該操作により、100匹のラツトから1500単
位/mlの力価を有する血清306mlが得られた。 該血清100mlに47.2gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約20mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は94%で、精製度は21倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液20mlに対し7.2gの尿素
を加え溶解させた。これを10000回転/分で30分
間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液10mlをとり、0.02Mトリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いてゲル過(カラムサイズ26×
1000mm)し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は90%で、精製度は47倍であつた。全段階を
通しての活性回収率は84.6%で、精製度は約987
倍であつた。 次いでアミコン限外過濃縮器TCF−10を用
いて活性区分を濃縮した。この濃縮液を0.02M
リン酸緩衝液(PH6.8)に対して、4℃で一夜透
析した。この透析活性区分を0.02M リン酸緩衝
液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイ
トゲルカラム(サイズ26×400mm)に付した。流
速5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液で
充分洗浄した後、0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)
500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlを
使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。活性区分を集め、アミコン限外過
濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過濃縮
を行なつた。この方法による活性回収率は64%で
あり、精製度は7.3倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は54.1%であり、精製度は7.2×103
倍であつた。 次いで、上記方法で得られた活性区分を0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に
対して、4℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で
緩衝化したフアルマシアモノQカラムに透析内液
を付し、1ml/分、1ml/分画の条件で当該物質
を吸着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、
0.02M トリス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩
衝液を用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着
した活性区分を溶離させた。活性区分は限外過
濃縮した。この方法による活性回収率は81%であ
り、精製度は8.1倍上昇した。全工程を通しての
活性回収率は43.9%であり、精製度は5.83×104倍
であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1M トリス−塩酸(PH7.8)の緩衝
液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶
離を行なつた。活性区分を限外過濃縮装置を用
い濃縮した。この方法による活性回収率は38%で
あり、精製度は5.1倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は16.7%で、精製度は2.97×105倍で
あつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイズ
7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画
でゲル過を行なつた。この方法での活性回収率
は39%であり、精製度は6.1倍上昇した。全工程
を通しての活性回収率は6.5%であり、精製度は
1.81×106倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.05×107単位/mg蛋白質であつた。
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約100mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は98%で精製度は18倍であつた。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの尿
素を加え溶解させた。これを10000回転/分で30
分間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液50mlをとり、0.02M トリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いゲル過(カラムサイズ50×
1000mm)し、溶出区分につきL−細胞に対する活
性測定法により、活性を調べ活性区分を集めた。
該方法による活性回収率は92%で、精製度は33倍
であつた。全段階を通しての活性回収率は90.2%
で精製度は約600倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着した限
外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して4
℃透析を行なつた。外液を3時間毎に3回交換し
た後、同緩衝液中で、4℃、一夜放置した。この
透析活性区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝液
(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイトゲ
ルのカラム(サイズ26×400mm)に付した。流速
5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液で充
分洗浄した後、0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)
500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlを
使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。この方法では非吸着区分に活性は認
められず、すべての活性は吸着され、吸着された
活性区分はリン酸緩衝液濃度0.15M〜0.3Mの間
に溶出された。活性区分を集め、アミコン限外
過濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過濃
縮を行なつた。この方法による活性回収率は48%
であり、精製度は4.5倍であつた。全工程を通し
ての活性回収率は43.3%、精製度は2.7×103倍で
あつた。 次いで、上記方法で得られた活性区分の濃縮液
を透析用チユーブにいれ、50倍量の0.02Mトリス
−塩酸(PH7.8)/0.1MNaCl緩衝液に対して、4
℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で緩衝化した
フアルマシアモノQカラムに透析内液を付し、1
ml/分、1ml/分画の条件で活性物質を吸着させ
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02Mトリス
−塩酸(PH7.8)/1.0M NaClを用い連続的に
NaCl濃度を上昇させ、吸着した活性区分を溶離
させた。活性区分をアミコン限外過膜YM10を
装着した限外過装置を用い濃縮した。この方法
による活性回収率は80%であり、精製度は4倍上
昇した。全工程を通しての活性回収率は34.6%で
あり、精製度は1.1×104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の緩衝液
を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離
を行なつた。活性区分を集め、アミコン限外過
膜YM10を装着した限外過濃縮装置により濃縮
した。この方法による活性回収率は62%であり、
精製度は4倍であつた。全工程を通しての活性回
収率は21.5%、精製度は4.40×104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SWカラム(7.5×
600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画でゲ
ル過を行なつた。この方法で活性回収率は26%
であり、精製度は5.3倍上昇した。全工程を通じ
ての活性回収率は5.6%であり、精製度は2.33×
105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.24×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 2 ニユージランドホワイト系雌ウサギ(体重2.0
〜3.0Kg)にホルマリン死菌ミコバクテリウム
ブチリカム(デイフコ社製、アメリカ)150mgを
耳静脈より注射した。注射9日後に100μgのリポ
ポリサツカライド(大腸菌 055;B5、デイフコ
社製、アメリカ)を耳静脈より注射し、2時間後
心臓より全採血した。採血した血液を5000回転/
分で20分間遠心分離し、血清を分離した。該操作
により、100羽のウサギから5160単位/mlの力価
を有する血清7410mlが得られた。 該血清1000mlに472gの硫安を添加後、よく溶
解し、4℃で一夜放置した。硫安塩析液を10000
回転/分、30分間冷却遠心分離(4℃)し、沈澱
を集め、この沈澱を約100mlの0.02M トリス−
塩酸/0.1M NaCl緩衝液(PH7.8)に懸濁させた。
この段階での活性回収率は97%で、精製度は20倍
であつた。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの割
合で尿素を加え溶解後、10000回転/分で30分間
冷却遠心分離(4℃)を行ない、不溶物を除去し
た。この上清50mlをとり、0.02M トリス−塩酸
(PH7.8)/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルト
ロゲルAcA54(カラムサイズ50×1000mm)を用い
流速40ml/時、7ml/分画でゲル過し、活性区
分を集めた。該方法による活性回収率は92%で、
精製度は28倍であつた。全段階を通しての活性回
収率は89.2%で、精製度は約560倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着した限
外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して4
℃で透析を行なつた。外液を3時間毎に3回交換
した後、同緩衝液中で、一夜透析した。この透析
活性区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝液(PH
6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイトゲル
のカラム(サイズ26×400mm)に流速5.0ml/時、
3ml/2分画で吸着させた。吸着させた活性区分
を0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)と0.5M リン
酸緩衝液(PH6.8)とを使用し、連続的に濃度勾
配を上昇させることにより溶離した。この方法で
の活性回収率は68%であり、精製度は10倍であつ
た。全工程を通しての活性回収率は60.7%、精製
度は5.6×103倍であつた。 次いで、上記活性区分を限外過器で濃縮し、
透析用チユーブにいれ、50培量の0.02Mトリス−
塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対して、4
℃で一夜透析を行なつた。この透析した活性区分
を、同緩衝液で緩衝化したフアルマシアモノQカ
ラムに1ml/分、1ml/分画の条件で吸着させ
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02M トリ
ス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩衝液を用い連
続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着された活性区
分を溶出させた。活性区分をアミコン限外過濃
縮器により濃縮した。この方法による活性回収率
は62%であり、精製度は4倍上昇した。全工程を
通しての活性回収率は37.6%、で精製度は2.24×
104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安緩衝液で平衡化したトー
ヨーパールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、
流速1ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の
緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶
解分画を行なつた。活性区分を集め、限外過濃
縮器により濃縮した。この段階での活性回収率は
34%であり、精製度は4.7倍であつた。全工程を
通じての活性回収率は12.8%であり、精製度は
1.05×105倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SWカラム(7.5×
600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画でゲ
ル過を行なつた。この段階での活性回収率は62
%であり、精製度は6.3倍であつた。全工程を通
じての活性回収率は7.9%であり、精製度は6.62
×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.19×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 3 ニユージランドホワイト系雌ウサギ(体重2.0
〜3.0Kg)にクレスチン(呉羽化学工業株式会社
製)100mgを耳静脈より注射した。注射9日後に
100μgのリポポリサツカライド(大腸菌055:B5、
デイフコ社製、アメリカ)を耳静脈より注射し、
2時間後心臓より全採血した。採血した血液を
5000回転/分で20分間遠心分離し、血清を分離し
た。該操作により、100羽のウサギから6200単
位/mlの力価を有する血清7000mlが得られた。 該血清1000mlに472gの硫安を添加溶解後4℃
で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分、30分間、4℃で遠心分離し、再
度沈澱を集め、約100mlの0.02M トリス−塩酸
緩衝液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この
段階での活性回収率は98%で精製度は18倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの割
合で尿素を加え溶解させた。これを10000回転/
分で30分間、4℃で遠心分離し、不溶物を除去し
た。この上清液50mlをとり、0.02M トリス−塩
酸/0.5MNaCl(PH7.8)緩衝液で平衡化したウル
トロゲルAcA54を用いゲル過(カラムサイズ
50×1000mm)し、L−細胞に対する活性測定法に
より、活性を調べ、活性区分を集めた。該方法に
よる活性回収率は95%で、精製度は30倍であつ
た。全段階を通しての活性回収率は93.1%で精製
度は約540倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着したゲ
ル過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して透
析を行なつた。外液を3時間毎に3回換した後、
同緩衝液中で4℃、一夜放置した。この透析活性
区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)
で平衡化したハイドロキシアパタイトゲルのカラ
ム(サイズ26×400mm)に付した。流速5.0ml/
時、3ml/分画の条件下に同緩衝液で充分洗浄し
た後、0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlと
0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlとを使用し、
連続的に濃度勾配を上昇させることにより吸着物
質を溶離した。この方法では非吸着区分に活性は
認められず、すべての活性は吸着され、吸着され
た活性区分はリン酸緩衝液濃度0.15M〜0.3Mの
間に溶出された。活性区分を集め、アミコン限外
過濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過
濃縮を行なつた。この方法での活性回収率は56%
であり、精製度は10倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は52.1%、精製度は5.4×103倍であ
つた。 次いで、上記活性区分の濃縮液を透析用チユー
ブにいれ、50倍量の0.02M トリス−塩酸(PH
7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対して、4をで一夜
透析を行なつた。同緩衝液で緩衝化したフアルマ
シアモノQカラムに透析内液を付し、1ml/分、
1ml/分画の条件で活性区分を吸着させた。次い
で同緩衝液で充分洗浄後、0.02M トリス−塩
酸/1.0M NaCl緩衝液(PH7.8)を用い連続的に
NaCl濃度を上昇させ、吸着した活性区分を溶離
させた。活性区分をアミコン限外過膜YM10を
装着した限外過装置を用い濃縮した。この方法
による活性回収率は80%であり、精製度は5.5倍
上昇した。全工程を通しての活性回収率は41.7
%、精製度は2.97×104倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス.塩酸/
70%飽和硫安(PH7.8)緩衝液で平衡化したトー
ヨーパールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、
流速1ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1M トリス−塩酸(PH7.8)
の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて
溶出溶離を行なつた。活性区分を集め、アミコン
限外過膜YM10を装着した限外過濃縮装置に
より濃縮した。この段階での活性回収率は64%で
あり、精製度は3.9倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は26.7%であり、精製度は1.16×105
倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M リン酸ナトリウ
ム/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液(PH7.0)で平
衡化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイ
ズ7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分
画でゲル過を行なつた。この段階での活性回収
率は28%であり、精製度は5.0倍上昇した。全工
程を通じての活性回収率は7.5%であり、精製度
は5.8×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は8.99×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 4 ニユージランドホワイト系雌性ウサギ(体重
2.0〜3.0Kg)にホルマリン死菌コリネバクテリウ
ム・パルバム(ウエルカム社製、イギリス)100
mgを耳静脈より注射した。注射9日後に10mgのコ
ンカナバリンA(和光純薬工業社製)を耳静脈よ
り注射し、2時間後心臓より全採血した。採血し
た血液を5000回転/分で20分間、4℃で遠心分離
し、血清を分離した。該操作により、100羽のウ
サギから3780単位/mlの力価を有する血清7640ml
が得られた。 該血清1000mlに472gの硫安を添加後、よく溶
解し、4℃で一夜放置した。硫安塩析液を10000
回転/分で30分間冷却遠心分離(4℃)し、沈澱
を集め、約100mlの0.02Mトリス−塩酸/0.1M
NaCl緩衝液(PH7.8)に懸濁させた。この段階で
の活性回収率は99%で、精製度は20倍であつた。 次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04gの尿
素を加え溶解後、10000回転/分で30分間冷却遠
心分離(4℃)し、不溶物を除去した。この上清
50mlをとり、0.02Mトリス−塩酸(PH7.8)/
0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲル
AcA54を用いゲル過(カラムサイズ50×1000
mm、流速40ml/時、7ml/分画)し、溶出区分を
集めた。該方法による活性回収率は95%で、精製
度は41倍であつた。全段階を通しての活性回収率
は94.1%で精製度は約820倍であつた。 次いでアミコン限外過膜YM10を装着した限
外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を濃縮
した。この濃縮液を透析用チユーブにいれ、50倍
量の0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)に対して4
℃で透析を行なつた。外液を3時間毎に3回交換
した後、同緩衝液中で、4℃、一夜放置した。こ
の透析活性区分をあらかじめ0.02M リン酸緩衝
液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイ
トゲルのカラム(サイズ26×400mm)に流速5.0
ml/時、3ml/分画で吸着させた。吸着させた活
性区分は0.02Mリン酸緩衝液(PH6.8)と0.5M
リン酸緩衝液(PH6.8)とを使用し、連続的に濃
度を上昇させる事により吸着物質を溶離した。こ
の方法による活性回収率は65%であり、精製度は
9.8倍であつた。全工程を通しての活性回収率は
61.1%、精製度は8.0×103倍であつた。 次いで、上記活性区分を限外過器で濃縮し、
透析用チユーブにいれ、50倍量の0.02Mトリス−
塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液を用い、4℃
で一夜透析を行なつた。この透析した活性区分を
同緩衝液で平衡化したフアルマシアモノQカラム
に1ml/分、1ml/分画の条件で吸着させた。次
いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02M トリス−塩
酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩衝液を用い連続的に
NaCl濃度を上昇させ、吸着した活性区分を溶出
した。活性区分をアミコン限外過濃縮器により
濃縮した。この方法による活性回収率は74%であ
り、精製度は5.3倍であつた。全工程を通しての
活性回収率は45.2%であり、精製度は4.2×104倍
であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安緩衝液で平衡化したトー
ヨーパールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、
流速1ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1M トリス−塩酸(PH7.8)
緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を下げて、溶解
分画を行なつた。活性区分を集め、限外過濃縮
器により濃縮した。この方法による活性回収率は
58%であり、精製度は3.2倍であつた。全工程を
通しての活性回収率は26.2%で、精製度は1.4×
105倍であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M リン酸ナトリウ
ム(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平
衡化したトーヨーソーダーG3000SWカラム(7.5
×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画で
ゲル過を行なつた。この方法で活性回収率は44
%であり、精製度は5.7倍であつた。全工程を通
しての活性回収率は11.5%で、精製度は7.8×105
倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.3×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 5 ddY雌性マウス(体重25〜30g)にホルマリン
死菌コリネバクテリウム パルバム(ウエルカム
社製、イギリス)1mgを腹腔内投与し、注射9日
後にリポポリサツカライド(緑膿菌;デイフコ社
製、アメリカ)10μgを尾静脈内注射し、2時間
後眼球を摘出して眼窩静脈叢より血液を採取し
た。採取した血液を5000回転/分で20分間遠心分
離し、血清を分離した。該操作により、100匹の
マウスから56100単位/mlの力価を有する血清
90.6mlが得られた。 該血清100mlに47.2gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約20mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は98%で、精製度は21倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液20mlに対し7.2gの尿素
を加え溶解させた。これを10000回転/分で30分
間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液10mlをとり、0.02Mトリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いてゲル過(カラムサイズ26×
1000mm)し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は90%で、精製度は32倍であつた。全段階を
通しての活性回収率は88.2%で、精製度は約672
倍であつた。 次いでアミコン限外過濃縮器TCF−10を用
いて活性区分を濃縮した。この濃縮液を0.02M
リン酸緩衝液(PH6.8)に対して、4℃で一夜透
析をした。この透析活性区分を0.02Mリン酸緩衝
液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイ
トゲルのカラム(サイズ26×400mm)に付した。
流速5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液
で充分洗浄した後、0.02M リン酸緩衝液(PH
6.8)500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500
mlを使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着
物質を溶離した。活性区分を集め、アミコン限外
過濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過
濃縮を行なつた。この方法による活性回収率は40
%であり、精製度は6倍であつた。全工程を通し
ての活性回収率は35.3%であり、精製度は4.03×
103倍であつた。 次いで、上記方法で得られた活性区分を0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対
して、4℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で緩
衝化したフアルマシアモノQカラムに透析内液を
付し、1ml/分、1ml/分画の条件で当該物質を
吸着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、
0.02M トリス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩
衝液を用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着
した活性区分を溶離させた。活性区分は限外過
濃縮した。この方法による活性回収率は75%であ
り、精製度は5倍上昇した。全工程を通しての活
性回収率は26.5%であり、精製度は2.02×104倍で
あつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の緩衝液
を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離
を行なつた。活性区分を限外過濃縮装置を用い
濃縮した。この方法による活性回収率は47%であ
り、精製度は4倍であつた。全工程を通しての活
性回収率は12.4%であり、精製度は8.08×104倍で
あつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイズ
7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画
でゲル過を行なつた。この方法での活性回収率
は31%であり、精製度は4倍上昇した。全工程を
通じての活性回収率は3.8%であり、精製度は
3.23×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.04×107単位/mg蛋白質であつた 実施例 6 ddY雌性マウス(体重25〜30g)にザイモザン
A(シグマ社製 アメリカ)2.0mgを腹腔内投与
し、注射9日後にエンドトキシン(大腸菌リポポ
リサツカライド)10μgを尾静脈内注射し、2時
間後眼球を摘出して眼窩静脈叢より血液を採取し
た。採取した血液を5000回転/分で20分間遠心分
離し、血清を分離した。該操作により、100匹の
マウスから4800単位/mlの力価を有する血清96ml
が得られた。 該血清100mlに47.2gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約20mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は97%で、精製度は17倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液20mlに対し7.2gの尿素
を加え溶解させた。これを10000回転/分で30分
間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液10mlをとり、0.02M トリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いてゲル過(カラムサイズ26×
1000mm)し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は92%で、精製度は38倍であつた。全段階を
通しての活性回収率は89.2%で精製度は約646倍
であつた。 次いでアミコン限外過濃縮器TCF−10を用
いて活性区分を濃縮した。この濃縮液を0.02M
リン酸緩衝液(PH6.8)に対して、4℃で一夜透
析をした。この透析活性区分を0.02M リン酸緩
衝液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタ
イトゲルのカラム(サイズ26×400mm)に付した。
流速5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液
で充分洗浄した後、0.02Mリン酸緩衝液(PH6.8)
500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlを
使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。活性区分を集め、アミコン限外過
濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過濃縮
を行なつた。この方法による活性回収率は43%で
あり、精製度は6.8倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は38.3%、精製度は4.39×103倍であ
つた。 次いで、上記方法で得られた活性区分を0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に対
して4℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で緩衝
化したフアルマシアモノQカラムに透析内液を付
し、1ml/分、1ml/分画の条件で当該物質を吸
着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩衝液を
用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着した活
性区分を溶離させた。活性区分は限外過濃縮し
た。この方法による活性回収率は77%であり、精
製度は4.4倍上昇した。全工程を通しての活性回
収率は29.5%であり、精製度は1.93×104倍であつ
た。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1Mトリス−塩酸(PH7.8)の緩衝液
を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離
を行なつた。活性区分を限外過濃縮装置を用い
濃縮した。この方法による活性回収率は43%であ
り、精製度は3.2倍であつた。全工程を通しての
活性回収率は12.7%、精製度は6.2×104倍であつ
た。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイズ
7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画
でゲル過を行なつた。この方法での活性回収率
は28%であり、精製度は5.4倍上昇した。全工程
を通じての活性回収率は3.6%であり、精製度は
3.35×105倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.44×107単位/mg蛋白質であつた。 実施例 7 ウイスター系雌性ラツト(体重200〜250g)に
ホルマリン死菌コリネバクテリウム パルバム
(ウエルカム社製、イギリス)10mgを腹腔内投与
し、注射9日後にエンドトキシン(大腸菌リポポ
リサツカライド)250μgを尾静脈内注射した。エ
ンドトキシン投与2時間後にエーテル麻酔下で腹
部下大静脈より血液を採取した。採取した血液を
5000回転/分で20分間遠心分離し、血清を分離し
た。該操作により、100匹のラツトから1500単
位/mlの力価を有する血清306mlが得られた。 該血清100mlに47.2gの硫安を添加溶解後、4
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。沈澱を
10000回転/分で30分間遠心分離(4℃)し、沈
澱を集め、約20mlの0.02M トリス−塩酸緩衝
液/0.1M NaCl(PH7.8)に懸濁させた。この段階
での活性回収率は94%で、精製度は21倍であつ
た。 次いで、該沈澱懸濁液20mlに対し7.2gの尿素
を加え溶解させた。これを10000回転/分で30分
間冷却遠心分離(4℃)し、不溶物質を除去し
た。この上清液10mlをとり、0.02Mトリス−塩
酸/0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウルトロゲ
ルAcA54を用いてゲル過(カラムサイズ26×
1000mm)し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は90%で、精製度は47倍であつた。全段階を
通しての活性回収率は84.6%で、精製度は約987
倍であつた。 次いでアミコン限外過濃縮器TCF−10を用
いて活性区分を濃縮した。この濃縮液を0.02M
リン酸緩衝液(PH6.8)に対して、4℃で一夜透
析した。この透析活性区分を0.02M リン酸緩衝
液(PH6.8)で平衡化したハイドロキシアパタイ
トゲルカラム(サイズ26×400mm)に付した。流
速5.0ml/時、3ml/分画の条件下に同緩衝液で
充分洗浄した後、0.02M リン酸緩衝液(PH6.8)
500ml及び0.5M リン酸緩衝液(PH6.8)500mlを
使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。活性区分を集め、アミコン限外過
濃縮装置TCF−10を用い、4℃で限外過濃縮
を行なつた。この方法による活性回収率は64%で
あり、精製度は7.3倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は54.1%であり、精製度は7.2×103
倍であつた。 次いで、上記方法で得られた活性区分を0.02M
トリス−塩酸(PH7.8)/0.1M NaCl緩衝液に
対して、4℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で
緩衝化したフアルマシアモノQカラムに透析内液
を付し、1ml/分、1ml/分画の条件で当該物質
を吸着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、
0.02M トリス−塩酸(PH7.8)/1.0M NaCl緩
衝液を用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸着
した活性区分を溶離させた。活性区分は限外過
濃縮した。この方法による活性回収率は81%であ
り、精製度は8.1倍上昇した。全工程を通しての
活性回収率は43.9%であり、精製度は5.83×104倍
であつた。 次いで、上記濃縮液を0.1M トリス−塩酸
(PH7.8)/70%飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ールSW60(カラムサイズ10×500mm)に、流速1
ml/分、2ml/分画で付与し、カラム中で塩析し
た。ついで0.1M トリス−塩酸(PH7.8)の緩衝
液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶
離を行なつた。活性区分を限外過濃縮装置を用
い濃縮した。この方法による活性回収率は38%で
あり、精製度は5.1倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は16.7%で、精製度は2.97×105倍で
あつた。 次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウム
(PH7.0)/0.2M NaCl/0.1%SDS緩衝液で平衡
化したトーヨーソーダーG3000SW(カラムサイズ
7.5×600mm)を用い、流速1ml/分、1ml/分画
でゲル過を行なつた。この方法での活性回収率
は39%であり、精製度は6.1倍上昇した。全工程
を通しての活性回収率は6.5%であり、精製度は
1.81×106倍であつた。 なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活
性は9.05×107単位/mg蛋白質であつた。
第1図はバイオゲルA1.5mを用いたゲル過法
による本発明物質の分子量を測定した分子量分布
図である。第2図はトーヨーソーダーTSKゲル
G3000SWを用いたゲル過法による本発明物質
の溶出パターンである。第3図は第2図の各標準
蛋白質の溶出時間から求めた本発明物質の分子量
分布図である。第4図はポリアクリルアミドゲル
電気泳動による本発明物質の泳動図である。第5
図は第4図から求めた本発明物質の分子量分布図
である。第6図は本発明物質の紫外線吸収スペク
トル分析図である。
による本発明物質の分子量を測定した分子量分布
図である。第2図はトーヨーソーダーTSKゲル
G3000SWを用いたゲル過法による本発明物質
の溶出パターンである。第3図は第2図の各標準
蛋白質の溶出時間から求めた本発明物質の分子量
分布図である。第4図はポリアクリルアミドゲル
電気泳動による本発明物質の泳動図である。第5
図は第4図から求めた本発明物質の分子量分布図
である。第6図は本発明物質の紫外線吸収スペク
トル分析図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 下記の理化学的性質及び構造的特徴を有する
低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤。 a 分子量:16000±1500 b 等電点:PH3.8±0.3 c 0.1M NaCl加0.02Mトリス−塩酸緩衝液(PH
7.8)中での紫外部吸収極大値が277nm、極小
値が250nmである d 3mg蛋白量/mlの0.02Mトリス−塩酸緩衝液
(PH7.8)溶液において無色透明であり、アセト
ン又はエタノールを該溶液に70V/V%以上加
えると沈澱を生ずる e 水溶液は弱酸性を示す f ビユウレツト反応、フオリンローリー反応法
ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応に
ついてペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反
応を示す g アミノ酸組成比: 6N塩酸で110℃、24時間減圧下に加水分解後、
アミノ酸アナライザーにより分析したアミノ酸組
成比(モル比)は、Glyを1.00として以下の通り
である Gly 1.00 Asp及び/又はAsn 1.10±0.06 Thr 0.45±0.02 Ser 0.90±0.05 Glu及び/又はGln 1.82±0.09 Pro 0.84±0.04 Ala 1.11±0.06 Gys 0.20±0.02 Val 0.86±0.04 Met 0.18±0.01 Ile 0.38±0.02 Leu 1.73±0.09 Tyr 0.64±0.03 Phe 0.34±0.02 His 0.28±0.01 Lys 0.44±0.02 Arg 0.46±0.02 h アミノ酸配列 アミノ酸シークエンサーによるアミノ末端側よ
り17個のアミノ酸が以下の配列を有している。 H−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro−Leu−
Ala−His−Val−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−
Val−Glu−
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58117949A JPS608226A (ja) | 1983-06-28 | 1983-06-28 | 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58117949A JPS608226A (ja) | 1983-06-28 | 1983-06-28 | 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS608226A JPS608226A (ja) | 1985-01-17 |
JPH0322851B2 true JPH0322851B2 (ja) | 1991-03-27 |
Family
ID=14724217
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58117949A Granted JPS608226A (ja) | 1983-06-28 | 1983-06-28 | 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS608226A (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2601678B1 (fr) * | 1986-07-18 | 1989-11-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Peptides comprenant la sequence seryl-aspartyl-lysyl-prolyle, procede pour l'extraction du tetrapeptide correspondant, et applications, notamment a la protection de la moelle osseuse au cours de traitements anticancereux par la chimiotherapie |
JPS63115732A (ja) * | 1986-11-04 | 1988-05-20 | 株式会社 磯輪鉄工所 | 段ボ−ル製造装置の自動フル−ト変更装置 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59118714A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-07-09 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 制ガン作用を有する低分子蛋白質 |
-
1983
- 1983-06-28 JP JP58117949A patent/JPS608226A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59118714A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-07-09 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 制ガン作用を有する低分子蛋白質 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS608226A (ja) | 1985-01-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4275056A (en) | HGI-Glycoprotein capable of stimulating proliferation and differentiation of human granulocyte, process for preparing same and leukopenia curative containing same | |
JPH0770195A (ja) | 糖修飾インターフェロン | |
EP0215662A2 (en) | Anti-tumor protease preparations | |
US4529594A (en) | Protein having antitumor activity | |
EP0090892B1 (en) | Process for the purification of physiologically active substance having antitumour activity | |
HU185314B (en) | Process for producing water-soluble immunostimulant glyco-proteins from klebsiella pneumoniae | |
US4845078A (en) | Method for treating hematopoietic diseases | |
JPH0322851B2 (ja) | ||
JP2548822B2 (ja) | マカラスムギ由来の糖タンパク質、その製造法及びそれを含有する免疫調節剤 | |
JPH0341478B2 (ja) | ||
JPH0251440B2 (ja) | ||
JPH0611705B2 (ja) | 血小板減少症治療剤 | |
JPH0251439B2 (ja) | ||
JPH0341480B2 (ja) | ||
US4524026A (en) | Novel proteinous cancer-cell proliferation inhibitory factors | |
JPH0826072B2 (ja) | 生理活性ポリペプチド、その製法および用途 | |
EP0195681B1 (en) | Tumor cytostatic-cytocidal factor and method of obtaining same | |
NO850152L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av human, endogen cancerregulerende faktor. | |
KR890004692B1 (ko) | 항종양 생리학적 활성물질의 정제방법 | |
EP0178050A1 (en) | Proteinaceous substance | |
US5023320A (en) | Process for the purification of physiologically active substance having antitumor activity | |
JP2623280B2 (ja) | 抗腫瘍剤 | |
JPS60226816A (ja) | 抗腫瘍活性をもつヒト由来蛋白質 | |
JPS6363559B2 (ja) | ||
JP2000290196A (ja) | 血圧低下抑制剤 |