JPH0812590A - 感染症予防治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次のアミノ酸配列をもつオリザテンシンを有
効成分とする感染症予防治療剤。 Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg 特にカンジダによる感染症の予防及び治療に用いられ
る。 【効果】 真菌、特にカンジダ菌による感染症をファゴ
サイトーシス活性化によって、予防乃至治療することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、米蛋白質由来の生理活
性ペプチド、オリザテンシンを有効成分とする感染症予
防治療剤、特にカンジダ菌の感染症予防治療剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より、食品蛋白質由来の生理活性物
質について多くの研究、報告がされている。本発明者ら
は、食品に広く生理活性物質を探索した結果、米蛋白質
に含まれるペプチドにファゴサイトーシス活性があるこ
とを見出し、このペプチドをオリザテンシンと命名した
（平成５年度日本農芸化学会関西・西日本合同支部大会
講演要旨集 p82；特願平６−７４２６４号）。 本発明
者らは、このペプチドについて更に鋭意研究を進めた結
果、細菌による感染症、特にカンジダ菌、例えばカンジ
ダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）による感染
症に対し顕著な治療効果があることを見出し、本発明を
完成するに至った。

【０００３】従来よりカンジダ・アルビカンス菌は真菌
症等の感染症の原因菌として知られている。この菌の感
染症に対するペプチドとして代表的なものに、抗真菌性
を有するペプチドＬ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｌ−Ｐｈｅが特開昭
５８−１０９４５９号に開示されている（ここで、Ｘは
できる限り置換されたフェニルラジカルを持つ不定のア
ミノ酸を示す）。このペプチドの作用機序は細胞内にお
ける代謝拮抗であり、この代謝拮抗作用により菌の死滅
を図る。一方、免疫増強活性を有する感染症の治療剤と
して、Ｔ−リンパ球の分化及びファゴサイトーシス活性
を促進するアジメゾン（一般名；２−シアナジリジニル
−２−カルバモイル−アジリジニル−１−プロパン）が
知られている。しかし、上述のように感染症を治療する
ためのペプチドは数少なく、又、これらは効果及び副作
用の面で満足できるものではなかった。さらに、本発明
におけるようなファゴサイトーシス活性化を特徴とする
カンジダ菌感染症の予防及び治療剤は殆ど知られていな
かった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は生理活性ペプ
チド オリザテンシンを有効成分とする感染症予防治療
剤、特にカンジダ菌による感染症予防治療剤を提供する
ことを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明はオリザテンシ
ン、すなわち Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Argで
表されるペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有
効成分とする感染症予防治療剤に関する。さらに詳しく
は、カンジダ菌による感染症に対する感染症予防治療剤
に関する。

【０００６】本発明における有効成分であるオリザテン
シンは、米粉に食塩水を加え透析して得られた可溶性蛋
白質をトリプシン処理し、高速液体クロマトグラフで分
画を行い、得ることができる。又、市販のペプチドシン
セサイザーを用いることにより容易に合成が可能であ
る。例えば、合成装置としてＳａｍ Ｔｗｏペプチド合
成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）を用いてペプチドの
合成を行う。即ち、樹脂に活性基を保護したアミノ酸を
吸着させ、これにデブロッキング液を注入して保護基を
除去し、活性基を保護したアミノ酸を注入し、両者を反
応させジペプチドを合成する。この操作を繰り返すこと
により、目的とする配列を有するペプチドを合成す。ペ
プチドの担体としての樹脂からの脱離と保護基の除去
は、１０％アニソールを含む無水フッ化水素中で０℃の
温度条件下に１時間攪拌することにより行う。フッ化水
素を留去した後樹脂をエーテルで洗浄し、３０％酢酸に
より抽出し、凍結乾燥により粗ペプチドが得られる。こ
の粗ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した
後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムを接続した高
速液体クロマトグラフにより、０．１％のトリフルオロ
酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、
精製する。このようにして得られたペプチドのアミノ酸
配列は、プロテインシーケンサーによる配列分析及びア
ミノ酸分析計によるアミノ酸分析により特定できる。

【０００７】本発明におけるペプチドはヒト及び動物に
対し、そのままの形或いは薬理学的に許容される塩のペ
プチドを含む医薬組成物として経口的及び非経口的に安
全に投与される。薬理学的に許容される塩として、例え
ばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシ
ウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アルミニウ
ムその他の金属塩、及びアルキルアミン塩、ピリジン塩
等の有機アミン塩等があげられる。投与量は症状、性
別、年令等によって異なるが、成人一日当り、オリザテ
ンシンを１０〜１００ｍｇを一日一回乃至数回に分けて
投与するとよい。製剤として、例えば注射剤、錠剤、散
剤、顆粒剤及びカプセル剤等が挙げられる。これらの製
剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に
許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤及び着色剤
等と共に医薬組成物として投与される。これらの製剤に
用いる担体や賦形剤として例えば乳糖、ブドウ糖等の糖
類、デンプン類、炭酸カルシウム等の無機物、カンゾウ
末等の植物末及び結晶セルロース等、結合剤として例え
ばデンプン糊液、アラビアゴム、トラガントゴム、ゼラ
チン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエ
ーテル、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロ
ース、カルメロース、エチルセルロース及び結晶セルロ
ース等、崩壊剤として例えばデンプン、寒天、ゼラチン
末、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウ
ム、結晶セルロース、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナト
リウム等、滑沢剤として例えばステアリン酸マグネシウ
ム及びタルク等、着色剤として例えば医薬品に添加する
ことが許容されているものを、各々適宜用いることがで
きる。錠剤、顆粒剤及びカプセル剤は矯味或いは徐放化
製剤として、糖類、ヒドロキシメチルセルロースフタレ
ート及び酢酸フタル酸セルロース等適当なコーティング
物質を用いてコーティングしても良い。又、注射剤を調
製する場合には、主薬を必要に応じ適当なｐＨ調整剤、
緩衝剤、安定剤、可溶化剤等を用いて、常法により注射
剤とする。又、本発明に用いたペプチドは食品由来であ
るので安全性は高く、実際にラットに対する経口投与で
１ｇ／ｋｇ体重投与しても全く副作用が生せず安全であ
る。

【０００８】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、
本発明はこれらにより限定されるものではない。

【０００９】

【実施例】

（１）酵素分解による本発明で使用するペプチドの製造
方法 米粉を７倍量の１Ｍ食塩水にて抽出し、その遠心上清を
０．１Ｍ食塩水に対して透析し可溶性蛋白質を得た。透
析は、Ｖｉｓｋａｓｅ Ｓａｌｅｓ社製の透析膜を用い
て透析した。この蛋白質をｐＨ７．６に調整した後、蛋
白質の１／１００に相当するトリプシンを加え３７°Ｃ
にて５時間の消化を行い、沸騰水上で１０分間加熱して
酵素を失活させ、トリプシン消化物とした。２１ｍｇの
トリプシン消化物をオクタデシルシランカラム（Ｃｏｓ
ｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈−ＡＲ、２０φ×２５０ｍｍ、ナカ
ライテスク社製）を装着した高速液体クロマトグラフ
（Ｍ６００、ミリポア社製）にて、０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜５
０％／分、１０ｍｌ／分）により分画した。この分画に
おけるアセトニトリル濃度約３１％で溶出された活性画
分をフェネチルシリカカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｐ
Ｈ−Ｔ−５、４．６φ×２５０ｍｍ、野村化学社製）に
て０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直
線的濃度勾配（０〜４０％／分、１ｍｌ／分）により分
画した。この分画におけるアセトニトリル濃度約３６％
で溶出された活性画分をさらにオクタデシルシランカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈−ＡＲ、４．６φ×１５
０ｍｍ、ナカライテスク社製）にて１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）を含むアセトニトリルの直線的濃度勾
配（０〜４０％／分、１ｍｌ／分）により分画した。こ
の分画のアセトニトリル濃度約２８％で溶出された活性
画分をプロテインシーケンサー（４７７Ａ、アプライド
バイオシステムズ社製）にて解析し、 Gly-Tyr-Pro-Met
-Tyr-Pro-Leu-Pro-Argのアミノ酸配列を有する９残基か
らなるペプチドを確認した。又、このペプチドのＲｆ値
は、次の条件で測定して０．５６であった。 薄層プレート；メルク社製シリカゲル（ｓｉｌｉｃａ
ｇｅｌ）６０Ｆ₂₅₄ 展開溶媒；ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝１
５：３：１０：１２

【００１０】（２）ペプチド合成による本発明で使用す
るペプチドの製造方法 Ｓａｍ Ｔｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社製）により、同装置の標準プロトコールに従って合成
した。即ち、１ｇ当たり０．５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を結合したアシルオキシメチル樹脂２
ｇをペプチド合成装置の反応容器にセットし、４５ｖ／
ｖ％トリフルオロ酢酸、２．５ｖ／ｖ％アニソール、５
２．５ｖ／ｖ％ジクロロメタンを含むデブロック液と２
０分間接触させｔ−Ｂｏｃ基を除いた。ジクロロメタン
による洗浄の後、１０ｖ／ｖ％ジイソプロピルカルボジ
イミド（それぞれ理論当量の６．７倍）を含む３４ｍｌ
のジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド混合液中で
２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフォルムアミド
及びジクロロメタンにて順次洗浄した後、上記と同様に
デブロッキングを行い、以下同様にＣ末端側からｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙ
ｒ（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、ｔ−Ｂｏｃ
−Ｐｒｏ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）、ｔ−
Ｂｏｃ−Ｇｌｙを順次結合せしめ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）−樹脂を得た。この樹脂を１０％アニソール
を含む無水フッ化水素中で１時間０°Ｃで反応させた
後、フッ化水素の留去及びエーテルによる洗浄を行っ
た。得られたペプチド及び樹脂の混合物から３０％酢酸
でペプチドを抽出し凍結乾燥することによって約８００
ｍｇの粗ペプチドを得た。粗ペプチドを０・１％トリフ
ルオロ酢酸に溶解した後、オクタデシルシランカラム
（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈−ＡＲ、２０φ×２５０ｍ
ｍ、ナカライテスク社製）を接続した高速液体クロマト
グラフ（Ｍ６００型、日本ウォータース社製）により、
０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直
線的濃度勾配（０〜５０％／５０分、１０ｍｌ／分）に
て展開した。目的とするペプチドはアセトニトリル濃度
約３９％にて溶出された。このよにして得られた物質が
Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Argのアミノ酸配列
を有する９残基からなるペプチドであることはアミノ酸
分析（Ｐｒｏ：Ｇｌｙ：Ｍｅｔ：Ｌｅｕ：Ｔｙｒ＝２．
９０：１．００：０．９５：０．９７：１．９０）及び
プロテインシーケンサー（４７７Ａ、アプライドバイオ
システムズ社製）により確認された。又、このペプチド
のＲｆ値は、製造例１と同様の方法で測定したところ、
製造例１と同様に０．５６であった。

【００１１】（３）オリザテンシンのカンジダ・アルビ
カンス感染症に対する予防及び治療効果 １群１０匹のマウスに対し、被検物質であるオリザテン
シンを０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ各々腹腔内投与し
た。又、陽性対照としてアジメゾンを１００ｍｇ／ｋｇ
腹腔内投与した。各化合物投与１時間後、カンジダ・ア
ルビカンスＡＴＣＣ１０２３１株菌体懸濁液を１０日間
で９０〜１００％のマウス致死効果が得られる量、各化
合物投与群及び無処置群に対し尾静脈より静注した。投
与日より１０日後のマウス生存数によって、各化合物の
カンジダ・アルビカンス感染症に対する効果を見た。各
化合物の効果は１０日後の生存率が３０％以上で効果有
りと判定した。結果を表１に示す。

【００１２】

【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 処置群 投与量(mg/kg体重) １０日後生存数（匹） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無処置群 ──── ０ オリザテンシン投与群 １０ ３ １ ０ ０．１ １ 陽性対照群 １００ ３ （アジメゾン投与） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （ｎ＝１０）

【００１３】上記表１より、オリザテンシン１０ｍｇ／
ｋｇ投与群で生存率は３０％であり、アジメゾンの１／
１０量でアジメゾン投与と同等の効果を示した。従っ
て、カンジダ・アルビカンス菌による感染症を顕著に予
防ないし治療することができた。

【００１４】（４）製剤の製造 各成分を混合、打錠し、オリザテンシン５ｍｇを含む５
００ｍｇの錠剤４００個を製造した。

【００１５】 各成分を混合した後、圧縮成形、粉砕、整粒して２０〜
５０メッシュの５％顆粒剤を製造した。

【００１６】 各成分を良く混和し１号カプセルに充填し、２５０個製
造した。

【００１７】 オリザテンシンを生理食塩水に溶解した後滅菌し、アン
プルに１ｍｌずつ封入し、１ｗ／ｖ％の注射剤を製造し
た。

【００１８】

【発明の効果】本発明のペプチド オリザテンシンは感
染症予防治療剤、特にカンジダ菌による感染症の予防治
療剤として有用である。本発明により、オリザテンシン
を有効成分とするカンジダ菌による感染症の予防治療剤
が提供される。本治療剤はファゴサイトーシス活性化の
ような、従来とは異なる作用機序により感染症を予防乃
至治療する薬剤であり、抗生物質耐性を持つカンジダ菌
にも有効である。

【００１９】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列を有するペプチド及び
   その薬理学的に許容される塩を有効成分とする感染症予
   防治療剤。 Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg
2. 【請求項２】 感染症がカンジダ菌に由来するものであ
   る、請求項１記載の感染症予防治療剤。