ES2117703T5 - Preparacion de factor viii. - Google Patents
Preparacion de factor viii.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER UNA PREPARACION FACTOR VIII, SEGURA CONTRA LA ACCION DEL VIRUS Y MUY PURA Y SE CARACTERIZA A TRAVES DE LA COMBINACION DE LAS MEDIDAS A) DEPURAR CROMATOGRAFICAMENTE UNA FRACCION CONTENIENDO FACTOR VIII; B) TRATAR TENSIOACTIVAMENTE UNA SOLUCION ACUOSA DE FACTOR VIII QUE TENGA UNA RELACION ENTRE TENSIOACTIVO/PROTEINA ENTRE 1:1 Y 66:1 Y C) CALENTAR LA PREPARACION DEL FACTOR VIII QUE SE ENCUENTRE EN ESTADO SOLIDO.
Description
Preparación de factor VIII.
La invención se refiere a un procedimiento para
la fabricación de un factor VIII a prueba de virus, altamente
purificado.
La coagulación de la sangre se activa por una
serie de reacciones sucesivas de diferentes proteínas o enzimas.
Debido a una falta de factores de coagulación de la sangre se impide
la formación de fibrina a partir de fibrinógenos y con ello el
cierre de la herida; la consecuencia son hemorragias. Un caso de
este tipo se da en la hemofilia A. Esta es la enfermedad más
ampliamente difundida y es provocada por la falta de factor VIII. El
factor VIII existe en el plasma junto con el factor de von
Willebrand (vWF) como complejo no ligado covalentemente (FVIII/vWF).
Las proteínas FVIII y vWF, así como el complejo FVIII/vWF se
utilizan para el tratamiento de substitución de hemofílicos. En los
preparados farmacéuticos correspondientes se plantean altos
requerimientos con relación a la actividad y la seguri-
dad.
dad.
El material de partida para la fabricación de los
preparados es en la mayoría de los casos plasma humano, que contiene
el factor VIII, pero sólo en cantidades reducidas (aproximadamente
0,1 - 0,2 \mug/ml). Por lo tanto, para la obtención del factor
VIII no sólo deben procesarse grandes cantidades de plasma, sino que
deben separarse también las proteínas concomitantes perturbadoras en
la mayor medida posible, ya que muchas de estas proteínas
concomitantes presentan propiedades físico-químicas
similares.
Una dificultad adicional consiste en que el
preparado debe inactivarse todavía con relación a agentes
infecciosos, puesto que el material de partida puede contener por
ejemplo virus de hepatitis o HIV. A ello hay que añadir todavía que
cada etapa individual del procedimiento y cada inactivación deben
realizarse para que se mantenga a ser posible la actividad biológica
de los factores de coagulación deseados.
En los métodos clásicos de producción se emplean
precipitaciones escalonadas (por ejemplo, crioprecipitación o
precipitaciones a través del empleo de sulfato de amonio), cuyo
objeto es la eliminación de impurezas, como factores de complejo de
protrombina, fibrinógenos y fibronectina. La pureza de los
concentrados del factor VIII obtenidos está aproximadamente en 1
E/mg y normalmente no excede los límites de 10-20
E/mg de proteína.
Por el documento
EP-A-0 378 208 se conoce un
procedimiento para la fabricación del factor VIII, según el cual una
solución de crioprecipitado se somete a un tratamiento con un
disolvente orgánico (tri-(n-butil)fosfato
(TNBP)) en presencia del disolvente Tween®80 para la inactivación de
los virus. El factor VIII se somete a continuación a una
precipitación de purificación de dos etapas, se liofiliza y se
calienta en el estado seco.
El tratamiento de productos biológicos y
farmacéuticos con 0,25 - 10% en peso de un anfífilo (detergente) no
desnaturalizador se describe en el documento
EP-B-0 050 061.
El procedimiento para el tratamiento de proteínas
con disolventes orgánicos, dado el caso en presencia de detergentes,
se conoce a partir del documento
EP-B-0 131 740. Aquí se muestra que
el tratamiento con un detergente es por sí solo relativamente
ineficaz con relación a la inactivación de los virus. No obstante,
los disolventes solamente actúan contra virus recubiertos con
membrana. Ya se han producido infecciones de hepatitis, que se
atribuyen a concentrados de Factor VIII contaminados con hepatitis
A, que han sido inactivadas de los virus de esta manera. El virus de
hepatitis A no posee membrana que contenga lípido; por lo tanto, no
se inactiva (Mannucci P M y col. (1992) The Lancet 339, 819
"Outbreak of hepatitis A among Italian patients with
haemophilia").
El tratamiento de fracciones que contienen el
Factor VIII con disolventes orgánicos se realiza la mayoría de las
veces de tal manera que el disolvente que actúa con efecto tóxico
debe separarse de manera costosa una vez realizado el tratamiento.
En el documento EP-A-0 343 275 se
propone a tal fin la extracción de la fracción que contiene Factor
VIII con aceites, como aceite de soja o aceite de ricino. A
continuación se somete el factor VIII a una cromatografía de
permeación en gel en materiales de intercambio de iones.
De acuerdo con el procedimiento del documento
EP-A-0 094 611 se calienta el Factor
VIII para la reducción de la infección en el estado seco.
Según el documento
EP-B-0 159 311, se calientan
productos sanguíneos en el estado sólido, húmedo para la
inactivación de virus potencialmente existentes. Para un concentrado
de Factor VIII de este tipo "calentado con vapor" no se conoce
ningún caso de infección (Mannucci P M (1992) Transfusion 32,
134-138 "Low risk of viral infection after
administration of vapor-heated factor VIII
concentrates").
Un tratamiento con calor de concentrados de
Factor VIII altamente purificados se considera crítico. A un Factor
VIII purificado mediante cromatografía debe añadirse, según el
documento EP-A-0 173 242, por
ejemplo una mezcla de estabilizantes (hidratos de carbono y
aminoácidos), antes de que ésta sea calentada en solución. En otros
casos es usual someter la fracción que contiene Factor VIII todavía
antes de la purificación mediante cromatografía, a un tratamiento
para la inactivación de virus.
La invención se plantea el cometido de poner a
disposición un procedimiento, según el cual se puede fabricar un
factor VIII purificado, que se considera a prueba de virus en virtud
de un tratamiento efectivo para la inactivación de los virus.
Preferentemente, la actividad específica del
preparado fabricado debe ser al menos 25 E/mg de proteína.
El cometido se soluciona según la invención por
medio de la combinación de las siguientes medidas:
- a)
- una purificación cromatográfica de una facción que contiene factor VIII,
- b)
- un tratamiento con tensido del factor VIII en solución acuosa, que está libre de disolventes orgánicos, en la relación de tensido/proteína de 1:1 a 1000:1 y
- c)
- un tratamiento con calor de la preparación de factor VIII en el estado sólido.
El factor VIII puede fabricarse según la
invención como complejo-FVIII/vWF, FVIII o bien vWF.
Durante el procedimiento de fabricación se puede realizar tal vez un
tratamiento para la disociación del
complejo-FVIII/vWF, por ejemplo con cloruro de
calcio.
Se ha encontrado que el tratamiento con tensido
según la invención se puede utilizar sorprendentemente para la
inactivación con éxito de virus. Como tensidos se emplean por
ejemplo tensidos no-iónicos, como Tween®80,
Triton®X-100, Triton®X-114,
dodecilmaltosido u octilglucosido, tensidos zwitteriónicos, como
dimetiloctilamin-N-óxido o
N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato,
y tensidos iónicos, como desoxicolato de sodio o colato de sodio. El
tratamiento con tensido se realiza sobre todo en solución acuosa,
que está libre de disolventes orgánicos. Como solución acuosa se
ofrece por ejemplo una solución de crioprecipitado, que está
purificada dado el caso todavía por adsorción de los factores del
complejo de protrombina. En tal solución se prefiere la relación de
tensido/proteína de 1:1 a 10:1.
El tratamiento con tensido se realiza
preferentemente antes de la purificación cromatográfica,
preferentemente con una relación de tensido/proteína de 3,5:1 a
10:1, pudiendo separarse el tensido durante la cromatografía de
manera sencilla.
Pero en otra forma de realización también es
posible el tratamiento con tensido durante la cromatografía. Esta
variante tiene la ventaja de que el factor VIII es absorbido de
manera específica también en presencia de proteínas que tienden a la
agregación y por lo tanto a la coadsorción no deseada.
Cuando se parte de material de partida que
contiene factor VIII con reducido contenido de proteína, se pretende
con frecuencia mantener una concentración determinada de tensido en
la solución acuosa. De esta manera la relación de tensido/proteína
puede equivaler hasta 1000:1.
Un exceso de cultivo celular, que contiene factor
VIII recombinante, presenta por ejemplo un contenido de proteína de
al menos aproximadamente 100 mg/l. Una concentración de tensido al
diez por ciento en este exceso de cultivo corresponde, por lo tanto,
a una relación de tensido/proteína de no más de aproximadamente
1000:1.
Para elevar la seguridad contra una infección por
virus no recubiertos con membrana, se propone la combinación según
la invención con el tratamiento térmico del factor VIII en el estado
sólido. Esta se puede realizar en el preparado liofilizado, siendo
realizado el tratamiento térmico preferentemente en el estado húmedo
del prepara-
do.
do.
Una forma de realización preferida de la
invención realiza a continuación, por lo tanto, el tratamiento
térmico con vapor caliente, siendo ajustada la preparación de Factor
VIII en estado sólido a un contenido de agua, metanol o etanol de
más de 0,05 (5% en masa) y menos de 0,70 (70% en masa),
preferentemente menos de 0,40 (40% en masa) y realizándose en un
recipiente cerrado, dado el caso en presencia de un gas protector
inerte, a una temperatura en el intervalo de 50 a 121ºC.
En el liofilizado del factor VIII pueden estar
contenidas adicionalmente albúmina o sales, como citrato de sodio o
bien aminoácidos.
Se ha constatado sorprendentemente que este
tratamiento térmico no implica ninguna merma esencial de la
actividad, por lo que se puede tratar también un Factor VIII
altamente purificado, relativamente inestable.
Durante la purificación cromatográfica se libera
en gran medida el Factor VIII de las proteínas concomitantes. Una
forma de realización preferida del procedimiento de fabricación
comprende una purificación cromatográfica de varias etapas,
empleando en una etapa un material de adsorción para factor VIII y
empleando en una etapa adicional un material para la adsorción de
proteínas contaminantes.
Así por ejemplo se puede emplear en primer lugar
un intercambiador de aniones para la adsorción del factor VIII y a
continuación un material con alta afinidad para fibronectina, como
gelatina o heparina, inmovilizada en un vehículo insoluble. También
aquí puede ser ventajosa la cromatografía en presencia de tensidos,
para reducir al mínimo la adsorción no específica del Factor VIII en
el vehículo de afinidad.
Para la fabricación de una preparación de Factor
VIII libre de albúmina se puede realizar la adsorción de la solución
que contiene factor VIII en geles de triacina (Cibacron®-Blue 3GA;
inmobilizada en un vehículo insoluble (Fa. Bio-Rad);
Fractogel® TSK-AF-Blue (Fa. Merck),
Blue-Sepharose®-CL6B (Fa. Pharmacia)).
Los geles de este tipo ligan con alta
selectividad albúmina, que no es separable con otros métodos del
Factor VIII y existe como impureza en preparaciones del Factor VIII,
si no se desea un contenido de albúmina para estabilización.
Para la purificación cromatográfica se emplean
preferentemente intercambiadores de aniones a base de acrilato, de
silicato o de hidrato de carbono, por ejemplo
DEAE-Sephadex® (Fa. Pharmacia),
QAE-Sepharose® (Fa. Pharmacia),
DEAE-Toyo-Pearl® (Fa. Tosohaas),
TMAE-Fractogel® (Fa. Merck) y similares.
Los intercambiadores de aniones a base de
acrilato están configurados preferentemente como "Matriz de
Tentakel" (ver Müller W (1990) Journal of Chromatography 510,
133-140 "New ion exchangers for the chromatography
of biopolymers"). En una matriz de este tipo los grupos de
intercambio se encuentran a lo largo de una cadena lateral, que está
conectada con la superficie de la matriz. De ello resulta una alta
capacidad de carga y una selectividad mejorada.
El Factor VIII/Complejo-vWF de
coagulación de la sangre, que se fabrica de acuerdo con el
procedimiento de la invención, se considera a prueba de virus y
tiene preferentemente una alta actividad específica de al menos 25
E/mg de proteína.
La invención se explica todavía en detalle por
medio de los siguientes ejemplos.
1 kg de crioprecipitado, obtenido a partir de 101
litros de plasma, se disolvió en 3,5 litros de tampón 1, una
solución de NaCl tamponada con Tris-lisina (85
mmol/l).
Para la purificación previa de la solución que
contiene Factor VIII se introdujo con agitación
Al(OH)_{3}, se separó Al(OH)_{3}, se
introdujo con agitación BaSO_{4} y se separó el BaSO_{4}. A
continuación se ajustó el valor-pH del exceso a 6,5,
se redujo la temperatura a 4ºC y se separó el precipitado obtenido
mediante centrifugación y se desechó.
Se añadieron 110 g de
Triton®X-100 por litro de exceso (relación de
tensido/proteína de 55:1) y se agitaron durante 30 minutos a 25ºC.
El Factor VIII se adsorbió entonces a pH 6,8 en 750 ml de
DEAE-Toyopearl® 650 M de la Fa. Tosohaas,
equilibrado con tampón 1, en una columna con un diámetro de 9
cm.
La fracción que contiene Factor VIII se eluyó con
2,25 litros de tampón 2 (una solución de NaCl 500 nM tamponada con
citrato) de gel.
La actividad específica era 76 IE Factor VIII por
mg de proteína.
Después de la liofilización de la fracción
ultrafiltrada que contiene Factor VIII se calentó el Factor VIII con
75% de peso/peso de H_{2}O en un recipiente cerrado durante 10
horas a 60ºC. La actividad del Factor VIII era 72% de la muestra no
calentada. Un tratamiento térmico en presencia de albúmina condujo a
una actividad del factor VIII de 92% de la muestra no calentada.
1 kg de crioprecipitado se obtuvo de la misma
manera que en el Ejemplo 1 y se disolvió.
La purificación previa se realizó con
Al(OH)_{3} y BaSO_{4}. Al exceso se añadieron 120
g de Tween 80 por litro (relación de tensido/proteína de 4:1) y se
agitaron durante 45 min. a 25ºC. Después de la dilución con tampón 1
en la relación 1:3 se purificó la solución cromatográficamente
mediante adsorción del Factor VIII en 400 ml de
EMD-TMAE-Fractogel® (Fa. Merck). El
gel de equilibró previamente con tampón 1. Las proteínas no ligadas
se separaron con tampón 1, a continuación se eluyó la fracción que
contiene Factor VIII con tampón 2.
La actividad específica era 45 IE Factor VIII por
mg de proteína.
El eluado se concentró mediante ultrafiltración y
se liofilizó. En un recipiente cerrado se calentó el Factor VIII en
presencia de 9,5% en peso/peso de H_{2}O durante 10 horas a
60ºC.
La actividad del factor VIII era 87% de la
muestra no caliente.
El factor de reducción total de virus según la
Directiva EC III/8115/89-EN de la Comisión de la
Comunidad Europea se determinó en el ejemplo de
HIV-1 y virus-FSME, añadiendo varias
veces suspensión de virus durante este procedimiento. El factor de
reducción total de virus era al menos 12. Esto corresponde a una
reducción del contenido total de virus de al menos 10^{12} sobre
todo el procedimiento.
La preparación con 3000 IE de Factor VIII,
fabricada según el Ejemplo 2, contenía 120 E de fibronectina
(3960 \mug).
(3960 \mug).
Para la eliminación de esta impureza se purificó
cromatográficamente la preparación que contiene Factor VIII con una
columna de 15 ml de Heparin-Sepharose (1,6 cm de
diámetro) con un tampón de 260 mM NaCl.
El Factor VIII no se ligó, la fibronectina no era
apreciable en la fracción que contiene Factor-VIII.
La actividad específica era 46 IE Factor VIII por mg de proteína. La
fibronectina se pudo obtener mediante elución con una solución de
NaCl 750 mM.
Se obtuvo un kg de crioprecipitado de la misma
manera que en el ejemplo 1 y se disolvió.
La purificación previa se realizó con
Al(OH)_{3} y PEG 4000.
Se añadieron 0,15% de Al(OH)_{3}
y se agitaron durante 30 minutos a 25ºC. Se separó entonces el
Al(OH)_{3} mediante centrifugado y se desechó.
Al exceso se añadió 3,15% de PEG 4000, se ajustó
el valor-pH a 6,6 y se redujo la temperatura a 9ºC.
Se agitaron durante 30 minutos y el precipitado obtenido se separó
mediante centrifugación y se desechó.
Al exceso se añadieron otros 100 g de Tween 80
por litro (relación de tensido/proteína de 50:1) y se mezclaron
bien. Después de la dilución con tampón 1 en la relación 1 a 3 se
cromatografió la solución en 1,75 litros de
Q-Sepharose® Fast Flow de la Fa. Pharmacia.
Q-Sepharose® Fast Flow de la Fa. Pharmacia.
Se adsorbió el Factor VIII y las proteínas no
ligadas se separaron con 7,9 litros de tampón 1. Mediante elución
con 5,25 litros de una solución de NaCl 500 mM tamponada con citrato
de sodio se obtuvo una fracción que contiene factor VIII.
La actividad específica era 89 IE Factor VIII por
mg de proteína.
El eluado concentrado se liofilizó y a
continuación se calentó en presencia de 8% en peso/peso de H_{2}O
en un recipiente cerrado durante 10 horas a 60ºC.
La actividad del Factor VIII era 81% de la
muestra no caliente.
Claims (8)
1. Procedimiento para la fabricación de una
preparación de factor VIII a prueba de virus, altamente purificada,
caracterizado por la combinación de las medidas
- a)
- una purificación cromatográfica de una fracción que contiene factor VIII,
- b)
- un tratamiento con tensido del factor VIII en solución acuosa, que está libre de disolventes orgánicos, en la relación de tensido/proteína de 1:1 a 1000:1 y
- c)
- un tratamiento con calor de la preparación de factor VIII en el estado sólido.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque el tratamiento con tensido se realiza
antes de la purificación cromatográfica, siendo la relación de
tensido/proteína de 3,5:1 a 10:1.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque el tratamiento con tensido se realiza
durante la purificación cromatográfica.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el tratamiento
con calor se realiza con vapor caliente, siendo ajustada la
preparación de factor VIII en estado sólido a un contenido de agua,
metanol o etanol de más de 0,05 (5% en masa) y menos de 0,70 (70% en
masa), preferentemente menos de 0,40 (40% en masa) y realizándose en
un recipiente cerrado, dado el caso en presencia de un gas protector
inerte, a una temperatura en el intervalo de 50 a 121ºC.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la purificación
cromatográfica se realiza en varias etapas, empleando en una etapa
un material, que adsorbe factor VIII, y empleando en una etapa
adicional un material para la adsorción de proteínas
contaminantes.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque para la
purificación cromatográfica se emplea un intercambiador de aniones a
base de acrilato, silicato o hidrato de carbono.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
6, caracterizado porque se emplea un intercambiador de
aniones, que consta de una matriz, en la que están ligadas cadenas
laterales polímeras, que presentan grupos de intercambio de
aniones.
8. Preparación de Factor VIII/Complejo - vWF de
coagulación de la sangre, fabricada de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, con una actividad específica de al menos 25
E/mg.
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