JPS63216898A - 希薄水溶液からソマトトロビンを回収する方法 - Google Patents
希薄水溶液からソマトトロビンを回収する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は希薄水溶液から生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
）蛋白質を回収する方法に関する。より具体的に本発明
は、水溶液に対し遷移金属塩を添加することにより該溶
液から生物活性ソマトトロピンを回収する方法に関する
。
）蛋白質を回収する方法に関する。より具体的に本発明
は、水溶液に対し遷移金属塩を添加することにより該溶
液から生物活性ソマトトロピンを回収する方法に関する
。
成長ホルモンとしても知られるソマトトロピンは、多く
の動物種の脳下垂体により分泌されるポリペプチドホル
モンである。これらのホルモンは多数の治療用途にとっ
て貴重なものであり、そしてソマトトロピンを含んで成
る組成物はヒトの脳下垂体欠乏症および胃腸出血の処置
に際して、あるいは骨折の癒合促進ならびに挫傷および
その他の創傷治癒を促進するために投与することができ
る。ソマトトロピンはまた、各種の薬剤解放装置を介し
て、あるいは注射によって投与した場合、動物の肉およ
び乳の生産を促進させるのにも有用である［イー・ジエ
ー・ターマン（Ｅ、Ｊ４ｕｒｍａｎ）「脳下垂体前葉成
長因子の成る効果」論文（”ＳｏｍｅＥｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ″Ｔｈｅｓｉｓ） ：バーデュ
ー大学（１’ｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）１９
５３年４月；エル・ジエー・マツタリン（Ｌ、Ｊ、Ｍａ
ｃｈｌｉｎ） ｒＪ、Ａｎｔｍ、ｓｃｉ、 Ｊ ３５
ニア９４ ８００頁（１９７２年）：ティー・アール・
カッサー他（Ｔ、Ｒ，Ｋａｓｓｅｒ ｅｔａｌ、） ｒ
Ｊ、＾ｎｉｍ、ｓｃｉ、 Ｊ ５３：４２０ ４２６頁
（１９８１年）：エル・ジェー・マツクリンｒ Ｊ、Ｄ
ａｉｒｙ Ｓｃｉ、 ４５６ ：５７５−５８０頁（１
９７３年）参照１゜ソマトトロピンは幾分種特異的であ
るが、動物ソマトトロピンのアミノ酸配列の間では可成
りの相同性があり、そしてこれらのホルモンは種間活性
（ｉｎｔｅｒ−ｓｐｅｃｉｅｓａｃｔｉｖｉｔｙ）を示
している。更に、ソマトト口ピンの様々な活性フラグメ
ントが見出されている。
の動物種の脳下垂体により分泌されるポリペプチドホル
モンである。これらのホルモンは多数の治療用途にとっ
て貴重なものであり、そしてソマトトロピンを含んで成
る組成物はヒトの脳下垂体欠乏症および胃腸出血の処置
に際して、あるいは骨折の癒合促進ならびに挫傷および
その他の創傷治癒を促進するために投与することができ
る。ソマトトロピンはまた、各種の薬剤解放装置を介し
て、あるいは注射によって投与した場合、動物の肉およ
び乳の生産を促進させるのにも有用である［イー・ジエ
ー・ターマン（Ｅ、Ｊ４ｕｒｍａｎ）「脳下垂体前葉成
長因子の成る効果」論文（”ＳｏｍｅＥｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ″Ｔｈｅｓｉｓ） ：バーデュ
ー大学（１’ｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）１９
５３年４月；エル・ジエー・マツタリン（Ｌ、Ｊ、Ｍａ
ｃｈｌｉｎ） ｒＪ、Ａｎｔｍ、ｓｃｉ、 Ｊ ３５
ニア９４ ８００頁（１９７２年）：ティー・アール・
カッサー他（Ｔ、Ｒ，Ｋａｓｓｅｒ ｅｔａｌ、） ｒ
Ｊ、＾ｎｉｍ、ｓｃｉ、 Ｊ ５３：４２０ ４２６頁
（１９８１年）：エル・ジェー・マツクリンｒ Ｊ、Ｄ
ａｉｒｙ Ｓｃｉ、 ４５６ ：５７５−５８０頁（１
９７３年）参照１゜ソマトトロピンは幾分種特異的であ
るが、動物ソマトトロピンのアミノ酸配列の間では可成
りの相同性があり、そしてこれらのホルモンは種間活性
（ｉｎｔｅｒ−ｓｐｅｃｉｅｓａｃｔｉｖｉｔｙ）を示
している。更に、ソマトト口ピンの様々な活性フラグメ
ントが見出されている。
因習的にはソマトトロピンは摘出した脳下垂体組織から
単離により得られて来た、組換えＤＮＡテクノロジーの
出現によって、ソマトトロピンの生産を特徴づける組換
えＤＮＡを含有する遺伝子工学的微生物からソマトトロ
ピンを得ることが可能となって来た。たとえば、バイオ
ジエン・エヌ・ヴ４− （Ｂｉｏｇｅｎ Ｎ、Ｖ、）の
欧州特許出願筒８３３０４５７４．３号（公告番号第０
１０３３９５号）参照。ソマトトロピン供給源が動物で
あるが、微生物であるかによって、その精製は汚染物質
、たとえばその他の蛋白質、ポリペプチドおよび細胞破
片を除去すること、ならびにその適切に包み込んだ（ｆ
ｏｌｄｅｄ）生物活性形態における蛋白質を提供するこ
とを要するものである。このソマトトロピンは蛋白質精
製の１種以上の知られた方法を用いて精製することがで
きるが、それらの方法にはゲルクロマトグラフィー、親
和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
、限外濾過、透析、硫酸アンモニウムのような塩類によ
る沈澱、グアニジン−〇〇Ｉまたはドデシル硫酸ナトリ
ウムを用いる封入体からの抽出ならびに多くの他の知ら
れた技法が包含される。ソマトトロピンに関する各種精
製技法の若干の実例はカーク−オドマー「エンサイクロ
ペディア・オブ・ケミカル・テクノロジー（Ｋｉｒｋ−
Ｏｔｈｔｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ｊ第３版、
第１１＠；ヘキストの米国特許第４，３７１．４６２号
；およびハート他（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ）のｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋ｗ Ｊ、 Ｊ２１８：５７３−ｓｓｔ頁（１
９８４年）中に見出すことができる。
単離により得られて来た、組換えＤＮＡテクノロジーの
出現によって、ソマトトロピンの生産を特徴づける組換
えＤＮＡを含有する遺伝子工学的微生物からソマトトロ
ピンを得ることが可能となって来た。たとえば、バイオ
ジエン・エヌ・ヴ４− （Ｂｉｏｇｅｎ Ｎ、Ｖ、）の
欧州特許出願筒８３３０４５７４．３号（公告番号第０
１０３３９５号）参照。ソマトトロピン供給源が動物で
あるが、微生物であるかによって、その精製は汚染物質
、たとえばその他の蛋白質、ポリペプチドおよび細胞破
片を除去すること、ならびにその適切に包み込んだ（ｆ
ｏｌｄｅｄ）生物活性形態における蛋白質を提供するこ
とを要するものである。このソマトトロピンは蛋白質精
製の１種以上の知られた方法を用いて精製することがで
きるが、それらの方法にはゲルクロマトグラフィー、親
和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
、限外濾過、透析、硫酸アンモニウムのような塩類によ
る沈澱、グアニジン−〇〇Ｉまたはドデシル硫酸ナトリ
ウムを用いる封入体からの抽出ならびに多くの他の知ら
れた技法が包含される。ソマトトロピンに関する各種精
製技法の若干の実例はカーク−オドマー「エンサイクロ
ペディア・オブ・ケミカル・テクノロジー（Ｋｉｒｋ−
Ｏｔｈｔｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ｊ第３版、
第１１＠；ヘキストの米国特許第４，３７１．４６２号
；およびハート他（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ）のｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋ｗ Ｊ、 Ｊ２１８：５７３−ｓｓｔ頁（１
９８４年）中に見出すことができる。
多くのこれら精製法の成果はソマトトロピンを含む希薄
水溶液である。従って、回収法は精製したソマトトロピ
ンをこれらの希薄水溶液から再生することを要する。
水溶液である。従って、回収法は精製したソマトトロピ
ンをこれらの希薄水溶液から再生することを要する。
現在のソマトトロピン回収法は、ホルモンの希薄溶液の
凍結乾燥を伴っている。しかしながら、凍結乾燥は乾燥
した生物学的に活性な物質を回収することについて費用
の掛かる方法であり、それは生産速度の低いこと、装置
の高価なこと、更に凍結状態からの水物質（ｗａｔｅｒ
５ｕｂｓｔａｎｃｅ）の昇華の間非常な低圧を維持す
る必要性のあることに起因している。凍結乾燥は大規模
では特に費用を高くするものであるが、それは大容量の
溶液を伴うからである。
凍結乾燥を伴っている。しかしながら、凍結乾燥は乾燥
した生物学的に活性な物質を回収することについて費用
の掛かる方法であり、それは生産速度の低いこと、装置
の高価なこと、更に凍結状態からの水物質（ｗａｔｅｒ
５ｕｂｓｔａｎｃｅ）の昇華の間非常な低圧を維持す
る必要性のあることに起因している。凍結乾燥は大規模
では特に費用を高くするものであるが、それは大容量の
溶液を伴うからである。
費用が掛からず、そしてソマトトロピンの生物活性に悪
影響を及ぼさない技術における方法が必要とされる。
影響を及ぼさない技術における方法が必要とされる。
本発明の目的は生物活性を減少させることなく、水溶液
からソマトトロピンを回収する安価な方法を提供するこ
とにある。
からソマトトロピンを回収する安価な方法を提供するこ
とにある。
本発明の他の目的は、従来の回収法の機器費と比較して
より安い機器費となるような方法を提供することにある
。
より安い機器費となるような方法を提供することにある
。
更に本発明の目的は、従来法による労務費と比較してよ
り安い労務費となる水溶液からソマトトロピンを回収す
る方法を提供することにある。
り安い労務費となる水溶液からソマトトロピンを回収す
る方法を提供することにある。
本発明によって、遷移金属の水溶液塩を添加して、ソマ
トトロピンとの不溶性錯体を精製させることを特徴とす
る希薄水溶液からソマトトロピンを回収する方法が開示
されている。
トトロピンとの不溶性錯体を精製させることを特徴とす
る希薄水溶液からソマトトロピンを回収する方法が開示
されている。
不溶性錯体は遠心分離または濾過に引き続いて、凍結乾
燥し、真空上低温において水を除去し、あるいはその他
の方法により乾燥させれば、その溶液から分離させるこ
とができる。この方法は乾燥した生物活性ソマトトロピ
ンの回収に帰着する。
燥し、真空上低温において水を除去し、あるいはその他
の方法により乾燥させれば、その溶液から分離させるこ
とができる。この方法は乾燥した生物活性ソマトトロピ
ンの回収に帰着する。
本発明は脳下垂体ホモジネートまたは発酵培養液からソ
マトトロピンを精製した結果得られた希薄水溶液よりソ
マトトロピン（以下、ＳＴとも称する）を回収する方法
を指向している。本発明の方法は各種タイプのソマトト
ロピンを希薄水溶液から回収するために使用することが
できるが、それらには天然または組換え体ブタ・ウシ・
ヒツジ・ヒト、家禽または魚類タイプのものが含まれる
。
マトトロピンを精製した結果得られた希薄水溶液よりソ
マトトロピン（以下、ＳＴとも称する）を回収する方法
を指向している。本発明の方法は各種タイプのソマトト
ロピンを希薄水溶液から回収するために使用することが
できるが、それらには天然または組換え体ブタ・ウシ・
ヒツジ・ヒト、家禽または魚類タイプのものが含まれる
。
本明細書中で使用されるように、用語「ソマトトロピン
」は完全な長さくｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）の天然また
は組換え型ソマトトロピンならびに成長促進能力を有す
るその誘導体の包含を意図している。誘導体はポリペプ
チドホルモンの生物学的に活性なフラグメントを含んで
おり、これらにはたとえば、ウシ、ソマトトロピンのΔ
４構造（上述のバイオジエン欧州特許出願中に記載され
るようなＮ−末端から４アミノ酸を欠いているポリペプ
チド）およびΔ７ブタ・ソマトトロピンで示されるポリ
ペプチドがあるが、このものは完全な長さのホルモン、
すなわちその成熟体（１１ａｔｕｒｅ）の最初のアミノ
酸が少ないブタ・ソマトトロピンのそれに相当するアミ
ノ酸配列を有しており（かつバイオジエン・エヌ・ケイ
ーの欧州特許公告第０１０４９２０号中に記載されてい
る）。用語「ソマトトロピン」はまた、無関係なＮ−末
端メチオニンを含んで成るポリペプチドの活性フラグメ
ントを包含するものである。本明細書中で使用されるよ
うに、用語「生物学的に活性」は、生体に対するその投
与に引き続いて、該生体の生物学的プロセスに関し実証
し得る効果を有するポリペプチドを意味している。
」は完全な長さくｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）の天然また
は組換え型ソマトトロピンならびに成長促進能力を有す
るその誘導体の包含を意図している。誘導体はポリペプ
チドホルモンの生物学的に活性なフラグメントを含んで
おり、これらにはたとえば、ウシ、ソマトトロピンのΔ
４構造（上述のバイオジエン欧州特許出願中に記載され
るようなＮ−末端から４アミノ酸を欠いているポリペプ
チド）およびΔ７ブタ・ソマトトロピンで示されるポリ
ペプチドがあるが、このものは完全な長さのホルモン、
すなわちその成熟体（１１ａｔｕｒｅ）の最初のアミノ
酸が少ないブタ・ソマトトロピンのそれに相当するアミ
ノ酸配列を有しており（かつバイオジエン・エヌ・ケイ
ーの欧州特許公告第０１０４９２０号中に記載されてい
る）。用語「ソマトトロピン」はまた、無関係なＮ−末
端メチオニンを含んで成るポリペプチドの活性フラグメ
ントを包含するものである。本明細書中で使用されるよ
うに、用語「生物学的に活性」は、生体に対するその投
与に引き続いて、該生体の生物学的プロセスに関し実証
し得る効果を有するポリペプチドを意味している。
生物学的に活性なソマトトロピンは成長強化量をもって
生体に投与したとき、その生体の成長速度を高めること
ができる。生物学的に活性なソマトトロピンはまた、生
体に適量を投与すると、生体の供給効率、栄養分布また
は形骸品質（ｃａｒｃａｓｓｑｕａｌｉｔｙ）を高める
ことができる。
生体に投与したとき、その生体の成長速度を高めること
ができる。生物学的に活性なソマトトロピンはまた、生
体に適量を投与すると、生体の供給効率、栄養分布また
は形骸品質（ｃａｒｃａｓｓｑｕａｌｉｔｙ）を高める
ことができる。
本発明の方法はソマトトロピンを含有する希薄水溶液に
、遷移金属塩を添加する工程を含んで構成される。望ま
しいのは溶液中のソマトトロピンがその適切に包み込ん
だ生物活性形態において存在することである。遷移金属
の塩はソマトトロピンと共に不溶性錯体を形成し、その
結果該ソマトトロピンは希薄水溶液から沈澱する。これ
らの錯体はソマトトロピン分子および金属イオン、たと
えばＺｎ”、Ｃｕ”、Ｃｏｚ′″、Ｍｎ”、Ｐｅ”また
はＦｅ”を含んで成る。これらの錯体はソマトトロピン
分子内で金属イオンと若干のアミノ酸残基との間にリガ
ンド結合を存している。ソマトトロピン−金属錯体の沈
澱に続いて、その沈澱物を大部分の水性媒質から濃縮水
性スラリーの形態で分離することができる。次いで、不
溶性錯体を乾燥して残留水を除去すればよい。得られた
生成物は乾燥ソマトトロピン遷移金属錯体である。生成
物中の遷移金属の存在は、該生成物を生体に投与したと
きソマトトロピンの生物活性に対し何らの顕著な悪影響
をも示さなかった。
、遷移金属塩を添加する工程を含んで構成される。望ま
しいのは溶液中のソマトトロピンがその適切に包み込ん
だ生物活性形態において存在することである。遷移金属
の塩はソマトトロピンと共に不溶性錯体を形成し、その
結果該ソマトトロピンは希薄水溶液から沈澱する。これ
らの錯体はソマトトロピン分子および金属イオン、たと
えばＺｎ”、Ｃｕ”、Ｃｏｚ′″、Ｍｎ”、Ｐｅ”また
はＦｅ”を含んで成る。これらの錯体はソマトトロピン
分子内で金属イオンと若干のアミノ酸残基との間にリガ
ンド結合を存している。ソマトトロピン−金属錯体の沈
澱に続いて、その沈澱物を大部分の水性媒質から濃縮水
性スラリーの形態で分離することができる。次いで、不
溶性錯体を乾燥して残留水を除去すればよい。得られた
生成物は乾燥ソマトトロピン遷移金属錯体である。生成
物中の遷移金属の存在は、該生成物を生体に投与したと
きソマトトロピンの生物活性に対し何らの顕著な悪影響
をも示さなかった。
上に言及したように、ソマトトロピンを得るための従来
手順によれば、脳下垂体ホモジネート中のソマトトロピ
ンまたは発酵培養液中の組換えソマトトロピンの溶液は
ソマトトロピンの量に比較して大量の水を含んでいる。
手順によれば、脳下垂体ホモジネート中のソマトトロピ
ンまたは発酵培養液中の組換えソマトトロピンの溶液は
ソマトトロピンの量に比較して大量の水を含んでいる。
この種の溶液はたとえば、ソマトトロピンのｇ当たり本
釣１００ｇ以上を含んでいる可能性がある。従来の回収
方法によれば、水の全量が凍結乾燥される。しかし、本
発明の方法を利用し、そして遷移金属塩を溶液に添加し
てソマトトロピンを溶液からソマトトロピン−遷移金属
錯体として沈澱させれば、該沈澱物から大部分の当初大
容量水を容易に分離して、乾燥すべき濃縮水性スラリー
を残留させることができる。−例として上に述べた当初
溶液中で、水対ソマトトロピンの比率１００：１を用い
れば、濃縮スラリー中の水対ソマトトロピンの割合は典
型的に僅かに５ｇ：１ｇとすることができる。従って、
除去すべき水の負荷（ｌｏａｄ）は２０倍の係数により
減少された。
釣１００ｇ以上を含んでいる可能性がある。従来の回収
方法によれば、水の全量が凍結乾燥される。しかし、本
発明の方法を利用し、そして遷移金属塩を溶液に添加し
てソマトトロピンを溶液からソマトトロピン−遷移金属
錯体として沈澱させれば、該沈澱物から大部分の当初大
容量水を容易に分離して、乾燥すべき濃縮水性スラリー
を残留させることができる。−例として上に述べた当初
溶液中で、水対ソマトトロピンの比率１００：１を用い
れば、濃縮スラリー中の水対ソマトトロピンの割合は典
型的に僅かに５ｇ：１ｇとすることができる。従って、
除去すべき水の負荷（ｌｏａｄ）は２０倍の係数により
減少された。
更に、ソマトトロピンと遷移金属イオンとの生物活性錯
体と関連する水は、凍結乾燥に使用する装置よりも安価
な装置によって遥かに速やかに除去することが可能であ
る。本発明の方法は資本設備および建造物ならびに乾燥
工程を操作する労働力における非常に効果のある節減を
もたらすものである。
体と関連する水は、凍結乾燥に使用する装置よりも安価
な装置によって遥かに速やかに除去することが可能であ
る。本発明の方法は資本設備および建造物ならびに乾燥
工程を操作する労働力における非常に効果のある節減を
もたらすものである。
本発明方法で使用し得る遷移金属には亜鉛、銅、マンガ
ン、鉄およびコバルトがある。好ましい金属には亜鉛、
銅、およびマンガンがあり、最も好ましいのは亜鉛であ
る。本発明方法において特に有効なこれら金属の塩類に
は、亜鉛、銅、マンガン、鉄およびコバルトの塩化物が
あるが、その他の塩類、たとえば硫酸塩、酢酸塩、また
は酒石酸塩もまた、本方法中で使用することができる。
ン、鉄およびコバルトがある。好ましい金属には亜鉛、
銅、およびマンガンがあり、最も好ましいのは亜鉛であ
る。本発明方法において特に有効なこれら金属の塩類に
は、亜鉛、銅、マンガン、鉄およびコバルトの塩化物が
あるが、その他の塩類、たとえば硫酸塩、酢酸塩、また
は酒石酸塩もまた、本方法中で使用することができる。
本発明方法は、各種の精製方法によって得られる希薄水
溶液からソマトトロピンを回収するために有用である。
溶液からソマトトロピンを回収するために有用である。
本発明により回収できるソマトトロピンは摘出した脳下
垂体組織またはソマトトロピンの生産を特徴づける組換
えＤＮＡを含有する遣伝子工学処理した微生物から単離
により得ることができる。
垂体組織またはソマトトロピンの生産を特徴づける組換
えＤＮＡを含有する遣伝子工学処理した微生物から単離
により得ることができる。
それからソマトトロピンが回収される水溶液は変動量の
ソマトトロピンを含んでいてもよい。遷移金属塩はソマ
トトロピンを沈澱させるための有効量をもって添加され
る。一般に実験室スケール反応において、金属塩はその
濃度が溶液１．０リンドル中でソマトトロピンの０．０
２５ ミリモル当たり約０．１２ミリモル乃至約１２ミ
リモルの範囲となるように添加することができる。この
種反応において使用される金属の典型的な油は水溶液１
．０リツトル中で、ソマトトロピン０．０２５ ミリモ
ル当たり金属塩約１．２ ミリモルであればよい。しか
し、ソマトトロピンを効果的に沈澱させるのに足る遷移
金属塩の量は変動可能である。本願実施例Ｘの大規模反
応においては、たとえば亜鉛塩約ｌθモル対組換えブタ
３７１モルの比率がそのＳＴを沈澱させるのに効果的で
あることが見出された。有効量は当業者の日常実験法に
より決定することができる０通常は溶液中のソマトトロ
ピンの完全な沈澱のために過剰の金属塩を使用すること
になる。ソマトトロピン−遷移金属塩錯体の最終生成物
は一最に少なくとも金属約１−８モル／ＳＴＩモルを含
んでいる。重量基準で、一般に生成物は遷移金属０．３
乃至８重量％を含有している。好ましいのは、生成物が
金属約０．４乃至７重量％を含んでいることである。
ソマトトロピンを含んでいてもよい。遷移金属塩はソマ
トトロピンを沈澱させるための有効量をもって添加され
る。一般に実験室スケール反応において、金属塩はその
濃度が溶液１．０リンドル中でソマトトロピンの０．０
２５ ミリモル当たり約０．１２ミリモル乃至約１２ミ
リモルの範囲となるように添加することができる。この
種反応において使用される金属の典型的な油は水溶液１
．０リツトル中で、ソマトトロピン０．０２５ ミリモ
ル当たり金属塩約１．２ ミリモルであればよい。しか
し、ソマトトロピンを効果的に沈澱させるのに足る遷移
金属塩の量は変動可能である。本願実施例Ｘの大規模反
応においては、たとえば亜鉛塩約ｌθモル対組換えブタ
３７１モルの比率がそのＳＴを沈澱させるのに効果的で
あることが見出された。有効量は当業者の日常実験法に
より決定することができる０通常は溶液中のソマトトロ
ピンの完全な沈澱のために過剰の金属塩を使用すること
になる。ソマトトロピン−遷移金属塩錯体の最終生成物
は一最に少なくとも金属約１−８モル／ＳＴＩモルを含
んでいる。重量基準で、一般に生成物は遷移金属０．３
乃至８重量％を含有している。好ましいのは、生成物が
金属約０．４乃至７重量％を含んでいることである。
ソマトトロピンの沈澱は中性近傍または塩基性溶液中で
行われるのが好ましい。水溶液のｐＨは６．８乃至９．
８であるのが望ましい。ソマトトロピンの希薄水溶液は
、ソマトトロピンの能率のよい回収に関してｐｉ約７．
４および９．０の範囲において最も好ましいものとなる
。
行われるのが好ましい。水溶液のｐＨは６．８乃至９．
８であるのが望ましい。ソマトトロピンの希薄水溶液は
、ソマトトロピンの能率のよい回収に関してｐｉ約７．
４および９．０の範囲において最も好ましいものとなる
。
各種の緩衝液を、ソマトトロピンを含有する水溶液中で
使用することができる。この緩衝液は遷移金属塩の添加
に先立って、ツマ１−１−ロピンが溶液中で所定ｐＨを
維持するのを助けるために添加される。金属イオン、Ｚ
ｎ”、Ｃｕｔ ４、Ｃｏ”、Ｍｎ”、Ｆｅ”またはＦｅ
”と不溶性塩類を生成するアニオンを含有する緩衝液は
注意をもって使用すべきである。
使用することができる。この緩衝液は遷移金属塩の添加
に先立って、ツマ１−１−ロピンが溶液中で所定ｐＨを
維持するのを助けるために添加される。金属イオン、Ｚ
ｎ”、Ｃｕｔ ４、Ｃｏ”、Ｍｎ”、Ｆｅ”またはＦｅ
”と不溶性塩類を生成するアニオンを含有する緩衝液は
注意をもって使用すべきである。
本方法にとって有用な緩衝液には、炭酸塩緩衝液（ｐＨ
７，４乃至９．８に調整されたＮａｔＣＯｓ ０．４２
＋Ｍ 、ＮａＨＣＯｓ Ｏ，５ｍＭ） 、ｐＨ約７．４
におけるトリスＨＣＩ ５０＋ａＭ、およびｐＨ約９．
８におけるエタノールアミン６０−Ｍがある。
７，４乃至９．８に調整されたＮａｔＣＯｓ ０．４２
＋Ｍ 、ＮａＨＣＯｓ Ｏ，５ｍＭ） 、ｐＨ約７．４
におけるトリスＨＣＩ ５０＋ａＭ、およびｐＨ約９．
８におけるエタノールアミン６０−Ｍがある。
希薄ソマトトロピン含有水溶液に対する遷移金属塩の添
加は金属−ソマドトロピン錯体の沈、Ｂを惹き起こす。
加は金属−ソマドトロピン錯体の沈、Ｂを惹き起こす。
この溶液は金属−ソマドトロピン錯体が水溶液から沈澱
している間攪拌することが望ましい。遷移金属の塩が希
薄ソマトトロピン含有水溶液に添加され、かつこのソマ
トトロピンが不溶性ソマトトロピン−金属塩錯体として
沈澱した後、次いでこの不溶性錯体は水溶液から分離し
、かつ乾燥すればよい。分離工程は従来法、たとえば遠
心分離または濾過あるいは両法の組合わせに従えばよい
。沈澱した物質は室温において遠心分離によりペレット
化しても、あるいは濾過により分離してもよく、次に従
来法、たとえば真空下の低温または凍結乾燥における水
の除去により乾燥すればよい。遠心分離または濾過した
ソマトトロピンを真空下、低温で乾燥すべき場合、その
温度は０℃乃至２５℃の範囲にあればよい。
している間攪拌することが望ましい。遷移金属の塩が希
薄ソマトトロピン含有水溶液に添加され、かつこのソマ
トトロピンが不溶性ソマトトロピン−金属塩錯体として
沈澱した後、次いでこの不溶性錯体は水溶液から分離し
、かつ乾燥すればよい。分離工程は従来法、たとえば遠
心分離または濾過あるいは両法の組合わせに従えばよい
。沈澱した物質は室温において遠心分離によりペレット
化しても、あるいは濾過により分離してもよく、次に従
来法、たとえば真空下の低温または凍結乾燥における水
の除去により乾燥すればよい。遠心分離または濾過した
ソマトトロピンを真空下、低温で乾燥すべき場合、その
温度は０℃乃至２５℃の範囲にあればよい。
本発明方法により得られた乾燥ソマトトロピンは、凍結
乾燥により調整されたソマトトロピンまたは天然のソマ
トトロピンと略同−量の生物活性を有している。更に、
組換えブタ・ソマトトロピンのインビボ投与にシミュレ
ートさせて行ったインビトロ実験は、そのソマトトロピ
ンが本発明方法を利用して回収した場合、従来の凍結乾
燥を用いる回収方法と比較して、（ＥＤＴＡの存在下で
）溶解度保持性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａ＋ａｉｎｔ
ｅｎａｎｃｅ）が改良さ ゛れることを示した。
乾燥により調整されたソマトトロピンまたは天然のソマ
トトロピンと略同−量の生物活性を有している。更に、
組換えブタ・ソマトトロピンのインビボ投与にシミュレ
ートさせて行ったインビトロ実験は、そのソマトトロピ
ンが本発明方法を利用して回収した場合、従来の凍結乾
燥を用いる回収方法と比較して、（ＥＤＴＡの存在下で
）溶解度保持性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａ＋ａｉｎｔ
ｅｎａｎｃｅ）が改良さ ゛れることを示した。
以下の実験例は単に本発明の例示であり、従ってその範
囲の限定として考えられるべきではない。
囲の限定として考えられるべきではない。
精製した凍結乾燥６７組換えブタ・ソマトトロピン（Δ
７ｒｐＳＴ） ［インターナショナ″ル・ミネラルズ・
アンド・ケミカル・コーポレーション、ロフト番号ＣＦ
ＯＯ８−ＯＢＡ、９４． Ｉ ］を脱イオンＨｚＯ（ｄ
Ｈｚｏ）中で濃度１０ｍｇΔ７ｒｐＳＴ ／ｍｌに再構
成した。この物質を炭酸塩緩衝液（ＩＩｃ＋によりｐＨ
７，４に調整されたＮａｚＣＯｉ ０．４２ｍＭ 、Ｎ
ａｔｌＣＯ＋ ０．５０ｍＭ） ＞ｔｏｏに対して透析
し、そしてこの透析物質に一部をｐｌ＋７．４の炭酸塩
緩衝液９部中に希釈した。Δ７ｒｐＳＴの二つの得られ
た溶液（１０，０およびＩ 、 ＯｍｇΔ７ｒｐＳＴ
／ｗ＋１）に１２ｓ Ｉ−Δ７ｒｐＳＴ（同一のＩｌ
’ＩＣロフト番号）を加えて最終濃度０．０２μキユリ
一／ｍｌとし、上澄み液画分中の放射能の測定および引
き続く遠心分離によって沈澱物百分率を決定した。
７ｒｐＳＴ） ［インターナショナ″ル・ミネラルズ・
アンド・ケミカル・コーポレーション、ロフト番号ＣＦ
ＯＯ８−ＯＢＡ、９４． Ｉ ］を脱イオンＨｚＯ（ｄ
Ｈｚｏ）中で濃度１０ｍｇΔ７ｒｐＳＴ ／ｍｌに再構
成した。この物質を炭酸塩緩衝液（ＩＩｃ＋によりｐＨ
７，４に調整されたＮａｚＣＯｉ ０．４２ｍＭ 、Ｎ
ａｔｌＣＯ＋ ０．５０ｍＭ） ＞ｔｏｏに対して透析
し、そしてこの透析物質に一部をｐｌ＋７．４の炭酸塩
緩衝液９部中に希釈した。Δ７ｒｐＳＴの二つの得られ
た溶液（１０，０およびＩ 、 ＯｍｇΔ７ｒｐＳＴ
／ｗ＋１）に１２ｓ Ｉ−Δ７ｒｐＳＴ（同一のＩｌ
’ＩＣロフト番号）を加えて最終濃度０．０２μキユリ
一／ｍｌとし、上澄み液画分中の放射能の測定および引
き続く遠心分離によって沈澱物百分率を決定した。
この沈殿実験のために選択された′ａ移金属塩は塩化亜
鉛、塩化マグネシウムおよび塩化第二銅であった。各基
の２４ｍＭ、２．４ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を
調製した。トリクロロ酢酸（２０χ）を正の沈澱対照と
して使用した。金属塩またはトリクロロ酢酸溶液（０，
５＋ｗｌ）を、Δ７ｒｐＳＴ（０，５ａ＋１）ソマトｌ
−ロピンを含有する水溶液に添加し、そして沈澱工程は
室温で１時間に亘り行った。沈澱した物質を、室温、１
５、０００ｘｇｌＯ分間の遠心分離によりペレット化し
た。
鉛、塩化マグネシウムおよび塩化第二銅であった。各基
の２４ｍＭ、２．４ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を
調製した。トリクロロ酢酸（２０χ）を正の沈澱対照と
して使用した。金属塩またはトリクロロ酢酸溶液（０，
５＋ｗｌ）を、Δ７ｒｐＳＴ（０，５ａ＋１）ソマトｌ
−ロピンを含有する水溶液に添加し、そして沈澱工程は
室温で１時間に亘り行った。沈澱した物質を、室温、１
５、０００ｘｇｌＯ分間の遠心分離によりペレット化し
た。
−回０．５ｍｌの上澄み液アリコートを対のチューブ（
ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｔｕｂｅｓ）から排除し、そして
ポリプロピレンチューブ内で計数した。計数の最小回数
はバンクグランド上で４回であった。ペレットの生成は
視覚的に判定し、そして良好な相関関係がベレット寸法
とペレット化した１２５ ［−Δ７ｒｐＳＴの百分率
との間で示された。このことは１２５Ｉ−Δ７ｒｐＳＴ
が非標識Δ７ｒｐＳＴと同様な挙動をとることを示した
。
ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｔｕｂｅｓ）から排除し、そして
ポリプロピレンチューブ内で計数した。計数の最小回数
はバンクグランド上で４回であった。ペレットの生成は
視覚的に判定し、そして良好な相関関係がベレット寸法
とペレット化した１２５ ［−Δ７ｒｐＳＴの百分率
との間で示された。このことは１２５Ｉ−Δ７ｒｐＳＴ
が非標識Δ７ｒｐＳＴと同様な挙動をとることを示した
。
第１表はそれら実験の結果を示している。
Δ７ｒｐＳＴ ０．５ｍｇ ／ｍｌおよびΔ７ｒｐＳＴ
５ｍｇ／ｍｌにおいて、塩化亜鉛および塩化第二銅の
両者は１種類以上の試薬濃度における良好な沈澱特性を
示した。
５ｍｇ／ｍｌにおいて、塩化亜鉛および塩化第二銅の
両者は１種類以上の試薬濃度における良好な沈澱特性を
示した。
塩化第二銅の場合以外は金属塩の量を増加させると、同
等もしくはΔ７ｒｐＳＴ沈澱の増加をもたらした。
等もしくはΔ７ｒｐＳＴ沈澱の増加をもたらした。
第１表
畠データはｎ＝２の場合の平均上標準偏差を示す。
” ＲＴ−室温
大旌五一工
異なった緩衝液およびΔ７ｒｐＳＴ
の′ 、に関するＨ条 のｔ
精製、凍結乾燥したΔ７ｒｐＳＴ （実施例Ｉと同一
のロフト番号）をａｕｔｏ中で濃度１０ｍｇ／ｒ＠ｌに
再構成し、そしてアリコートを下記の緩衝液の一種類に
対して透析した：（１）炭酸塩緩衝液、ｐＨ１，４、（
２）トリスＨＣ１４０ｍＭ、ｐＨ７，４、または（３）
エタノールアミン６０ｍＭ、ｐ）１９．８゜３種類の試
料に、実施例Ｉにおけるように１２’ｓ Ｈ−Δ７ｒ
ｐＳＴを加えた。各試料をＺｎＣＩｚ ２４ｍＭの溶液
で１：１に希釈し、そしてΔ７ｒｐＳＴの沈殿百分率を
実施例■におけるように決定した。第■表はそれらの実
験の結果を示している。データは異なったｐＨにおける
各種の緩衝液からのΔ７ｒｐＳＴの能率のよい沈殿が亜
鉛により可能であることを示している。
のロフト番号）をａｕｔｏ中で濃度１０ｍｇ／ｒ＠ｌに
再構成し、そしてアリコートを下記の緩衝液の一種類に
対して透析した：（１）炭酸塩緩衝液、ｐＨ１，４、（
２）トリスＨＣ１４０ｍＭ、ｐＨ７，４、または（３）
エタノールアミン６０ｍＭ、ｐ）１９．８゜３種類の試
料に、実施例Ｉにおけるように１２’ｓ Ｈ−Δ７ｒ
ｐＳＴを加えた。各試料をＺｎＣＩｚ ２４ｍＭの溶液
で１：１に希釈し、そしてΔ７ｒｐＳＴの沈殿百分率を
実施例■におけるように決定した。第■表はそれらの実
験の結果を示している。データは異なったｐＨにおける
各種の緩衝液からのΔ７ｒｐＳＴの能率のよい沈殿が亜
鉛により可能であることを示している。
第■表
炭酸塩 ７．４ ７６＋／−０，３８トリ
ス５０ｍＭ ７．４ ８１ ＋ ／
０．１１工タノールアミン６０ｍＭ ９．８ ９
０ ＋ ／ −０，５２（ａ）データは、＝２の場合の
平均＋／−０標準偏差を表す。
ス５０ｍＭ ７．４ ８１ ＋ ／
０．１１工タノールアミン６０ｍＭ ９．８ ９
０ ＋ ／ −０，５２（ａ）データは、＝２の場合の
平均＋／−０標準偏差を表す。
沈殿実験用の調製に際して、Δ７ｒｐＳＴ （実施例
１におけるのと同一ロット番号） ５００ｍｇを脱イオ
ン水（ｄ１１□０）５０ｍｌ中で再構成した結果、残留
炭酸塩イオンからｐＨ１０，３を得た。この物質をｐ）
１７．４において炭酸塩緩衝液に関し、透析液のｐ１１
７．６となるまで徹底的に透析した。容量ゲイン（ｖｏ
ｌｕｍｅ Ｂａ’＋ｒ＋）は透析の間５＋ｎｌであった
。この透析液のｐＨは３ ｍ１Ｅｑの１Ｉｃｔで７，４
に降下され、そしてその溶液は室温における１５ＱＯｘ
ｇの遠心分離により透明となった。
１におけるのと同一ロット番号） ５００ｍｇを脱イオ
ン水（ｄ１１□０）５０ｍｌ中で再構成した結果、残留
炭酸塩イオンからｐＨ１０，３を得た。この物質をｐ）
１７．４において炭酸塩緩衝液に関し、透析液のｐ１１
７．６となるまで徹底的に透析した。容量ゲイン（ｖｏ
ｌｕｍｅ Ｂａ’＋ｒ＋）は透析の間５＋ｎｌであった
。この透析液のｐＨは３ ｍ１Ｅｑの１Ｉｃｔで７，４
に降下され、そしてその溶液は室温における１５ＱＯｘ
ｇの遠心分離により透明となった。
中性Δ７ｒｐＳＴ溶液の１０ｍ１アリコートを等容量の
ＺｎＣｌ２２．４ｍｌまたはＣｕＣ１ｚ ２．４＋ｎＭ
と組合わせた。
ＺｎＣｌ２２．４ｍｌまたはＣｕＣ１ｚ ２．４＋ｎＭ
と組合わせた。
室温における攪拌１時間後、この懸濁液を３０分間１５
、 ＱＯＱｘｇの遠心分離によってペレット化した。各
ペレットを一８０℃で凍結し、そしてｄｌｌ□０２０ｍ
１中に希釈した中性ｐｉ（のΔ７ｒｐＳＴ溶液２０＋＋
＋１から成るシェル凍結対照試料（ｓｈｅｌｌ ｆｒｏ
ｚｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓａｍｐｌｅ）と共に凍結乾
燥した。
、 ＱＯＱｘｇの遠心分離によってペレット化した。各
ペレットを一８０℃で凍結し、そしてｄｌｌ□０２０ｍ
１中に希釈した中性ｐｉ（のΔ７ｒｐＳＴ溶液２０＋＋
＋１から成るシェル凍結対照試料（ｓｈｅｌｌ ｆｒｏ
ｚｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓａｍｐｌｅ）と共に凍結乾
燥した。
凍結乾燥試料の乾量および蛋白質純度百分率を［イリノ
イ州、ロックフォードのピアース・ケミカル・カンパニ
ー（ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、）のＢ
ＣＡ蛋白質アッセイにより測定されるように〕測定して
、非沈殿、凍結乾燥処理に関連する各沈殿法の効率を計
算せしめた。第■表はこれらの測定値を示す。
イ州、ロックフォードのピアース・ケミカル・カンパニ
ー（ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、）のＢ
ＣＡ蛋白質アッセイにより測定されるように〕測定して
、非沈殿、凍結乾燥処理に関連する各沈殿法の効率を計
算せしめた。第■表はこれらの測定値を示す。
第ｍ表
沈殿法 Δ７ｒｐＳＴ（ｗ／ｗ） 乾量 Δ７ｒｐＳ
Ｔ 相対沈殿効率百分率 （ｍｇ） 重量（ｍｇ
） ＺｎＣ１ｚ １１５ ５４．５ ６２．７
８１ＣｕＣ１ｚ １０５ ４Ｂ、０ ５０．４
６５凍結乾燥 １１８ ６５．７ ７７．
５ １００Δ７ｒｐＳＴの生物活性に関する金属塩の
効果を測定するために、下垂体切除を施したラットを使
用して成長アラサイ （体重ゲインの測定）を行った［
パーロウ・ニス・エフ他（ｐａｒｌｏｗ＋ｓ、Ｆ、、ｅ
ｔ ａｉｒ）の「内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ） Ｊ ７７：１１２６−１ｌ３４（１９６５年）参
照］。この試験を行って、本発明方法により回収された
Δ７ｒｐＳＴの投与量についてラットにおける成長促進
活性を測定することによりソマトトロピンの生物活性を
示した。
Ｔ 相対沈殿効率百分率 （ｍｇ） 重量（ｍｇ
） ＺｎＣ１ｚ １１５ ５４．５ ６２．７
８１ＣｕＣ１ｚ １０５ ４Ｂ、０ ５０．４
６５凍結乾燥 １１８ ６５．７ ７７．
５ １００Δ７ｒｐＳＴの生物活性に関する金属塩の
効果を測定するために、下垂体切除を施したラットを使
用して成長アラサイ （体重ゲインの測定）を行った［
パーロウ・ニス・エフ他（ｐａｒｌｏｗ＋ｓ、Ｆ、、ｅ
ｔ ａｉｒ）の「内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ） Ｊ ７７：１１２６−１ｌ３４（１９６５年）参
照］。この試験を行って、本発明方法により回収された
Δ７ｒｐＳＴの投与量についてラットにおける成長促進
活性を測定することによりソマトトロピンの生物活性を
示した。
試験を行うために、若い（試験開始時期において３６日
齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグループ
に分けた。これらのラットは体重によりグループ分けし
、それらグループの体重および分布は、各グループの平
均開始体重が略等しくなるようにバランスさせた。各グ
ループのラットに処置を割り当てた。これらのラットに
は９日間毎日、ソマトトロピンあるいは対照溶液のいず
れかを皮下注射した。その注射は頭骨下方の肩甲下領域
近傍に施した。ソマトトロピンを可溶化させるために、
下記のパーロウの緩衝液を使用した。
齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグループ
に分けた。これらのラットは体重によりグループ分けし
、それらグループの体重および分布は、各グループの平
均開始体重が略等しくなるようにバランスさせた。各グ
ループのラットに処置を割り当てた。これらのラットに
は９日間毎日、ソマトトロピンあるいは対照溶液のいず
れかを皮下注射した。その注射は頭骨下方の肩甲下領域
近傍に施した。ソマトトロピンを可溶化させるために、
下記のパーロウの緩衝液を使用した。
１ 、８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ０，８に上昇させたＮ
ａ１（ＣＯｓ（０，０３Ｍ） 、ＮａＣＩ（０，１５Ｍ
）Ｉｌ、 ８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ９，５に上昇させ
たＮａＨＣＯ。
ａ１（ＣＯｓ（０，０３Ｍ） 、ＮａＣＩ（０，１５Ｍ
）Ｉｌ、 ８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ９，５に上昇させ
たＮａＨＣＯ。
（０，０３Ｍ） 、ＮａＣ１（０，１５Ｍ）既知量の
Δ７ｒｐＳＴ （第ｍ表参照）をｐＨ１０，８の緩衝液
中に溶解し、２Ｎ ＨＣＩをもってｐＨ９，５に調整し
、そしてｐＨ９，５緩衝液による容量とした。
Δ７ｒｐＳＴ （第ｍ表参照）をｐＨ１０，８の緩衝液
中に溶解し、２Ｎ ＨＣＩをもってｐＨ９，５に調整し
、そしてｐＨ９，５緩衝液による容量とした。
一つのグループの１０匹のラットは負の対照として使用
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射した。第二のグループは凍結乾燥
したΔ７ｒｐＳＴの溶液をもって注射した。その他のグ
ループは本発明による遷移金属−沈殿Δ７ｒｐＳＴの選
択された投与量から成る溶液をもって注射した。これら
ラットは１，２゜９および１０日目に重量測定し、そし
てそれらの体重を記録した。試験期間の最終日（１０日
目）において、ラット体重ゲインデータを分析した。
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射した。第二のグループは凍結乾燥
したΔ７ｒｐＳＴの溶液をもって注射した。その他のグ
ループは本発明による遷移金属−沈殿Δ７ｒｐＳＴの選
択された投与量から成る溶液をもって注射した。これら
ラットは１，２゜９および１０日目に重量測定し、そし
てそれらの体重を記録した。試験期間の最終日（１０日
目）において、ラット体重ゲインデータを分析した。
下垂体切除したラフ）（１回１４μｇの毎日の投与）に
よる成長アッセイはＺｎＣ１ｚ−沈殿Δ７ｒｐＳＴが負
の対照グループよりも温かに高い（ｐ＜０．０１）成長
促進活性を有し、そしてその活性は遷移金属塩を全く含
まない凍結乾燥したΔ７ｒｐＳＴ対照の活性と識別不能
であることを示した。同様な結果は塩化第二銅による沈
殿に関しても観察された。
よる成長アッセイはＺｎＣ１ｚ−沈殿Δ７ｒｐＳＴが負
の対照グループよりも温かに高い（ｐ＜０．０１）成長
促進活性を有し、そしてその活性は遷移金属塩を全く含
まない凍結乾燥したΔ７ｒｐＳＴ対照の活性と識別不能
であることを示した。同様な結果は塩化第二銅による沈
殿に関しても観察された。
第■表
試 料 投与量（μｇ）平均百分率 重量ゲイン±
Ｓ、 Ｄ。
Ｓ、 Ｄ。
負の対照 ０ ４．０ ４．
２Δ７ｒｐＳＴ ＺｎＣ１ｔ 沈殿 ２４
ｔｓ、ｓ本 １
．７Δ７ｒｐＳＴ ＣｕＣ１ｇ沈殿 ２４
１５．６＄ ４．７Δ７ｒｐＳＴ凍結乾燥
２４ １７．１本２．４ｇ片側ダネフト試験
（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ
）に続く分散の分析を利用すると、負の対照より逼かに
高い（ｐ ＜ ０．０１）。
２Δ７ｒｐＳＴ ＺｎＣ１ｔ 沈殿 ２４
ｔｓ、ｓ本 １
．７Δ７ｒｐＳＴ ＣｕＣ１ｇ沈殿 ２４
１５．６＄ ４．７Δ７ｒｐＳＴ凍結乾燥
２４ １７．１本２．４ｇ片側ダネフト試験
（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ
）に続く分散の分析を利用すると、負の対照より逼かに
高い（ｐ ＜ ０．０１）。
精製した、凍結乾燥６４組換えウシ・ソマトトロピン（
Δ４ｒｂＳＴ）を脱イオンＨｔＯ（ｄＨｚＯ）中で濃度
１０ｍｇΔ４ｒｂＳＴ／ｍｌに再構成する。この物質を
（実施例１で規定したような）炭酸塩緩衝液〉１００容
量に対して透析し、そしてこの物質の一部をｐＨ７゜４
の炭酸塩緩衝液９部中に希釈する。次に得られた溶液に
１２５１Δ４ｒｂＳＴを加えて最終濃度０．０２μキュ
’Ｊ−／ｍｌとし、上澄み液画分中の放射能の測定およ
び引き続く遠心分離によって沈殿物百分率を決定する。
Δ４ｒｂＳＴ）を脱イオンＨｔＯ（ｄＨｚＯ）中で濃度
１０ｍｇΔ４ｒｂＳＴ／ｍｌに再構成する。この物質を
（実施例１で規定したような）炭酸塩緩衝液〉１００容
量に対して透析し、そしてこの物質の一部をｐＨ７゜４
の炭酸塩緩衝液９部中に希釈する。次に得られた溶液に
１２５１Δ４ｒｂＳＴを加えて最終濃度０．０２μキュ
’Ｊ−／ｍｌとし、上澄み液画分中の放射能の測定およ
び引き続く遠心分離によって沈殿物百分率を決定する。
使用される遷移金属塩には塩化亜鉛、塩化マグふシウム
および塩化第二銅が含まれる。各基の２４ｍＭ、 ２．
４ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を調製する。トリク
ロロ酢酸（２０χ）を正の沈殿対照として使用する。
および塩化第二銅が含まれる。各基の２４ｍＭ、 ２．
４ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を調製する。トリク
ロロ酢酸（２０χ）を正の沈殿対照として使用する。
金属塩またはトリクロロ酢酸溶液（０，５ｍ１）を、Δ
４ｒｂＳＴ（０，５ｍ１）を含有する水溶液に添加し、
そして沈殿工程は室温で１時間に亘り攪拌しながら行う
。沈殿した物質を、室温、１５．０００ｘｇｌＯ分間の
遠心分離によりペレット化する。−回０．５ｍｌの上澄
み液アリコートを対のチューブから排除し、そしてポリ
プロピレンチューブ内で計数する。計数の最小回数はバ
ンクグラウンド上で４回である。ベレットの生成は視覚
的に判定する。実験の結果は実施例■における結果に類
似している。
４ｒｂＳＴ（０，５ｍ１）を含有する水溶液に添加し、
そして沈殿工程は室温で１時間に亘り攪拌しながら行う
。沈殿した物質を、室温、１５．０００ｘｇｌＯ分間の
遠心分離によりペレット化する。−回０．５ｍｌの上澄
み液アリコートを対のチューブから排除し、そしてポリ
プロピレンチューブ内で計数する。計数の最小回数はバ
ンクグラウンド上で４回である。ベレットの生成は視覚
的に判定する。実験の結果は実施例■における結果に類
似している。
スＪＬＬ−竺
沈殿実験用の調製に際して、実施例■におけるように調
製したΔ４ｒｂＳＴ ５００ｍｇを脱イオン（ｄＨｚｏ
）５０ｎ＋ ｌ中で再構成する。この物質をｐＨ７，４
の炭酸塩緩衝液に対し、透析液のｐＨが７．６となるま
で徹底的に透析する。この透析液のｐＨは３ ａ＋ｔ！
ｑのＨＣｌで７．４に降下され、そしてその溶液は室温
における１５００ｘｇの遠心分離により透明になる。
製したΔ４ｒｂＳＴ ５００ｍｇを脱イオン（ｄＨｚｏ
）５０ｎ＋ ｌ中で再構成する。この物質をｐＨ７，４
の炭酸塩緩衝液に対し、透析液のｐＨが７．６となるま
で徹底的に透析する。この透析液のｐＨは３ ａ＋ｔ！
ｑのＨＣｌで７．４に降下され、そしてその溶液は室温
における１５００ｘｇの遠心分離により透明になる。
中性Δ４ｒｂＳＴ溶液の１０１アリコートを等容量のＺ
ｎＣＩｚ ２．４＋ｌｌまたはＣｕＣ１ｇ ２．４ｍＭ
と組合わせる。
ｎＣＩｚ ２．４＋ｌｌまたはＣｕＣ１ｇ ２．４ｍＭ
と組合わせる。
室温における攪拌１時間後、この懸濁液を３０分間１５
００ｘｇの遠心分離によってペレット化する。各ペレッ
トを一８０℃で凍結し、そしてｄｔｌｚｏ ２０ｍ１中
で５０χ希釈した中性ｐＨのΔ４ｒｂＳＴ溶液２０ｍ１
から成るシェル凍結対照試料と共に凍結乾燥する。
００ｘｇの遠心分離によってペレット化する。各ペレッ
トを一８０℃で凍結し、そしてｄｔｌｚｏ ２０ｍ１中
で５０χ希釈した中性ｐＨのΔ４ｒｂＳＴ溶液２０ｍ１
から成るシェル凍結対照試料と共に凍結乾燥する。
凍結乾燥試料の乾量および蛋白質純度百分率を測定して
、非沈殿、凍結乾燥処理に関する各沈殿法の効率を計算
せしめる。
、非沈殿、凍結乾燥処理に関する各沈殿法の効率を計算
せしめる。
Δ４ｒｂＳＴの生物活性に関する金属塩の効果を測定す
るために、実施例■におけるように下垂体切除を施した
ラットを使用して成長アラサイを行う。
るために、実施例■におけるように下垂体切除を施した
ラットを使用して成長アラサイを行う。
この試験を行うために、若い（試験開始時期において３
６日齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグル
ープに分ける。これらのラットは体重によりグループ分
けし、それらグループの体重および分布は、各グループ
の平均開始体重が略等しくなるようにバランスさせる。
６日齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグル
ープに分ける。これらのラットは体重によりグループ分
けし、それらグループの体重および分布は、各グループ
の平均開始体重が略等しくなるようにバランスさせる。
各グループのラットに処置を割り当てる。
これらのラットには９日間毎日、ソマトトロピンあるい
は対照溶液のいずれかを皮下注射する。
は対照溶液のいずれかを皮下注射する。
その注射は頭骨下方の肩甲下領域近傍に施す。ソマトト
ロピンを可溶化させるために、下記のパーロウの緩衝液
を使用する。
ロピンを可溶化させるために、下記のパーロウの緩衝液
を使用する。
１ 、８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ１Ｏ，８に上昇させた
Ｎａ１ｌＣＯ＋（０，０３１’ｌ）、（ＮａＣ１（０，
１５Ｍ）Ｕ 、 ８Ｍ Ｎａ０Ｉ＋によりｐＨ９，５に
上昇させたＮａＨＣＯ。
Ｎａ１ｌＣＯ＋（０，０３１’ｌ）、（ＮａＣ１（０，
１５Ｍ）Ｕ 、 ８Ｍ Ｎａ０Ｉ＋によりｐＨ９，５に
上昇させたＮａＨＣＯ。
（０，０３Ｍ）、ＮａＣｌ （０，１５Ｍ）既知量のΔ
４ｒｂＳＴをｐＨ１０，８の緩衝液中に溶解し、２Ｎｌ
ｉＣＩをもってｐＨ９，５に言周整し、そしてｐＨ９，
５緩衝液による容量とする。
４ｒｂＳＴをｐＨ１０，８の緩衝液中に溶解し、２Ｎｌ
ｉＣＩをもってｐＨ９，５に言周整し、そしてｐＨ９，
５緩衝液による容量とする。
一つのグループの１０匹のラットは負の対照として使用
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射する。第二のグループは凍結乾燥
したΔ４ｒｂＳＴの溶液をもって注射する。その他のグ
ループは本発明による遷移金属−沈殿Δ４ｒｂＳＴの選
択された投与量から成る溶液をもって注射する。これら
ラットは１．２．９およびＩＯ日１に重量測定し、そし
てそれらの体重を記録する。試験期間の最終日（１０日
日目において、ラット体重ゲインデータを分析する。
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射する。第二のグループは凍結乾燥
したΔ４ｒｂＳＴの溶液をもって注射する。その他のグ
ループは本発明による遷移金属−沈殿Δ４ｒｂＳＴの選
択された投与量から成る溶液をもって注射する。これら
ラットは１．２．９およびＩＯ日１に重量測定し、そし
てそれらの体重を記録する。試験期間の最終日（１０日
日目において、ラット体重ゲインデータを分析する。
精製、凍結乾燥した、最初に脳下垂体より得たウシ・ソ
マトトロピン（ｂＳＴ）を脱イオン水（ｄＨ□０）中で
濃度１０ｍｇ ｂＳ↑／ ｍ Ｉに再構成する。この物
質を（実施例Ｉで規定したような）炭酸塩緩衝液〉１０
０容量に対して透析し、そしてこの透析した物質の一部
をｐＨ７，４の炭酸塩緩衝液９部中に希釈する。
マトトロピン（ｂＳＴ）を脱イオン水（ｄＨ□０）中で
濃度１０ｍｇ ｂＳ↑／ ｍ Ｉに再構成する。この物
質を（実施例Ｉで規定したような）炭酸塩緩衝液〉１０
０容量に対して透析し、そしてこの透析した物質の一部
をｐＨ７，４の炭酸塩緩衝液９部中に希釈する。
次に得られたｂＳＴの溶液に”Ｓ Ｉ−ｂｓＴを加えて
最終濃度０．０２μ／ｍｌとし、上澄み液画分中の放射
能の測定および引き続く遠心分離によって沈殿百分率を
決定する。
最終濃度０．０２μ／ｍｌとし、上澄み液画分中の放射
能の測定および引き続く遠心分離によって沈殿百分率を
決定する。
使用される遷移金属塩には塩化亜鉛、塩化マグネシウム
および塩化第二銅が含まれる。各基の２４１ｍＭ、２．
４ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を調整する。トリク
ロロ酢酸（２０χ）を正の沈ｌ股対照として使用する。
および塩化第二銅が含まれる。各基の２４１ｍＭ、２．
４ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を調整する。トリク
ロロ酢酸（２０χ）を正の沈ｌ股対照として使用する。
金属塩またはトリクロロ酢酸溶液を、ｂＳＴを含有する
水溶液に添加し、そして沈殿工程は室温で１時間に亘り
撹拌しながら行う。沈殿した物質を、室温、１５，００
０ｘｇｌＯ分間の遠心分離によりペレット化する。−回
０．５ｍｌの上澄み液アリコートを対のチューブから排
除し、そしてポリプロピレンチェーブ内で計数する。計
数の最小回数はバックグラウンド上で４回である。ペレ
ットの生成は視覚的に判定する。実験の結果は実施例Ｉ
における結果に類似している。
水溶液に添加し、そして沈殿工程は室温で１時間に亘り
撹拌しながら行う。沈殿した物質を、室温、１５，００
０ｘｇｌＯ分間の遠心分離によりペレット化する。−回
０．５ｍｌの上澄み液アリコートを対のチューブから排
除し、そしてポリプロピレンチェーブ内で計数する。計
数の最小回数はバックグラウンド上で４回である。ペレ
ットの生成は視覚的に判定する。実験の結果は実施例Ｉ
における結果に類似している。
沈殿実験用の調製に際して、実施例■におけるように調
製したｂＳＴ ５００ｍｇを脱イオン水（ａｏｚＯ）５
０ｍｌ中で再構成する。この物質をｐｌ＋７．４の炭酸
塩緩衝液に対して徹底的に透析し、そしてその溶液は室
温における１５００ｘｇの遠心分離により透明になる。
製したｂＳＴ ５００ｍｇを脱イオン水（ａｏｚＯ）５
０ｍｌ中で再構成する。この物質をｐｌ＋７．４の炭酸
塩緩衝液に対して徹底的に透析し、そしてその溶液は室
温における１５００ｘｇの遠心分離により透明になる。
中性ｂＳＴ溶液の１０ａ＋１アリコートを等容量のＺｎ
Ｃ１ｇ２．４ｍｌまたはＣｕＣ１ｇ ２．４ｍＭと組合
わせる。室温における攪拌１時間後、この懸濁液を３０
分間１５，０００×ｇの遠心分離によってペレット化す
る。各ペレットを一８０℃で凍結し、そしてｄＨｚｏ
２抛ｌ中で５０χ希釈した中性ｐＨのｂｓＴ？８液２０
ｍ１から成るシェル凍結対照試料と共に凍結乾燥する。
Ｃ１ｇ２．４ｍｌまたはＣｕＣ１ｇ ２．４ｍＭと組合
わせる。室温における攪拌１時間後、この懸濁液を３０
分間１５，０００×ｇの遠心分離によってペレット化す
る。各ペレットを一８０℃で凍結し、そしてｄＨｚｏ
２抛ｌ中で５０χ希釈した中性ｐＨのｂｓＴ？８液２０
ｍ１から成るシェル凍結対照試料と共に凍結乾燥する。
凍結乾燥試料の乾量および蛋白質純度百分率を測定して
、非沈殿、凍結乾燥処理に関連する各沈殿法の効率を計
算せしめる。
、非沈殿、凍結乾燥処理に関連する各沈殿法の効率を計
算せしめる。
ｂＳＴの生物活性に関する金属塩の効果を測定するため
に、実施例ＩＩＩにおけるように下垂体切除を施したラ
ットを使用して成長アラサイを行う。
に、実施例ＩＩＩにおけるように下垂体切除を施したラ
ットを使用して成長アラサイを行う。
この試験を行うために、若い（試験開始時期において３
６日齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグル
ープに分ける。これらのラットは体重によりグループ分
けし、それらグループの体重および分布は、各グループ
の平均開始体重が略等しくなるようにバランスさせる。
６日齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグル
ープに分ける。これらのラットは体重によりグループ分
けし、それらグループの体重および分布は、各グループ
の平均開始体重が略等しくなるようにバランスさせる。
各グループのラットに処置を割り当てる。
これらのラットには９日間毎日、ソマトトロピンあるい
は対照溶液のいずれかを皮下注射する。
は対照溶液のいずれかを皮下注射する。
その注射は頭骨下方の肩甲下領域近傍に施す。ソマトト
ロピンを可溶化するために、下記のパーロウの緩衝液を
使用する。
ロピンを可溶化するために、下記のパーロウの緩衝液を
使用する。
１ 、８Ｍ ＮａＯＨによりρ旧０．８に上賓させたＮ
ａＨＣＯａ（０，０３Ｍ）、ＮａＣ１（０，１５Ｍ）Ｉ
Ｉ 、 ８Ｍ Ｎａ０１１によりｐＨ９，５に上昇させ
たＮａＨＣＯ。
ａＨＣＯａ（０，０３Ｍ）、ＮａＣ１（０，１５Ｍ）Ｉ
Ｉ 、 ８Ｍ Ｎａ０１１によりｐＨ９，５に上昇させ
たＮａＨＣＯ。
（０，０３Ｍ）、ＮａＣｌ （０，１５Ｍ）既知量のｂ
ＳＴをＰＨ１０，８の緩衝液中に溶解し、２Ｎ ＨＣＩ
をもってｐＨ９，５に調整し、そしてｐＨ９，５緩衝液
による容量とする。
ＳＴをＰＨ１０，８の緩衝液中に溶解し、２Ｎ ＨＣＩ
をもってｐＨ９，５に調整し、そしてｐＨ９，５緩衝液
による容量とする。
一つのグループの１０匹のラットは負の対照として使用
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射する。第二のグループは凍結乾燥
したウシ・ソマトト［Ｊピンの溶液をもって注射する。
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射する。第二のグループは凍結乾燥
したウシ・ソマトト［Ｊピンの溶液をもって注射する。
その他のグループは本発明による遷移金属−沈殿ｂＳＴ
の選択された投与量から成る溶液をもって注射する。こ
れらラットは１２．９および１０日１に重量測定し、そ
してそれらの体重を記録する。試験期間の最終日（１０
日１ににおいて、ラット体重ゲインデータを分析する。
の選択された投与量から成る溶液をもって注射する。こ
れらラットは１２．９および１０日１に重量測定し、そ
してそれらの体重を記録する。試験期間の最終日（１０
日１ににおいて、ラット体重ゲインデータを分析する。
精製、凍結乾燥した、最初に脳下垂体より得たブタ・ソ
マトトロピン（ｐＳＴ）を脱イオン水（ｄ１１□０）中
で濃度１０ｍｇ ｐＳＴ／ｍｌに再構成する。この物質
を（実施例■で規定したような）炭酸塩緩衝液〉１００
容量に対して透析し、そしてこの透析した物質の一部を
ｐＨ７，４の炭酸塩緩衝液９部中に希釈する。
マトトロピン（ｐＳＴ）を脱イオン水（ｄ１１□０）中
で濃度１０ｍｇ ｐＳＴ／ｍｌに再構成する。この物質
を（実施例■で規定したような）炭酸塩緩衝液〉１００
容量に対して透析し、そしてこの透析した物質の一部を
ｐＨ７，４の炭酸塩緩衝液９部中に希釈する。
次に得られたｐＳＴの溶液にＩｔｓ Ｔ−ｐＳＴを加
えて最終濃度０．０２μキュ’Ｊ−／ｍｌとし、上澄み
液画分中の放射能の測定および引き続く遠心分離によっ
て沈殿物百分率を決定する。
えて最終濃度０．０２μキュ’Ｊ−／ｍｌとし、上澄み
液画分中の放射能の測定および引き続く遠心分離によっ
て沈殿物百分率を決定する。
使用される遷移金属塩には塩化亜鉛、塩化マグネシウム
および塩化第二銅が含まれる。各基の２４ｍＭ、２．４
ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を調製する。トリクロ
ロ酢酸（２０χ）を正の沈殿対照として使用する。
および塩化第二銅が含まれる。各基の２４ｍＭ、２．４
ｍＭ 、および０．２４ｍＭ溶液を調製する。トリクロ
ロ酢酸（２０χ）を正の沈殿対照として使用する。
金属塩またはトリクロロ酢酸溶液を、ｐＳＴを含有する
水溶液に添加し、そして沈殿工程は室温で１時間に亘り
撹拌しながら行う。沈殿した物質を、室温、１５． Ｏ
ＯＯｘｇｌＯ分間の遠心分離によりペレット化する。−
回０．５ｍｌの上澄み液アリコートを対のチューブから
排除し、そしてポリプロピレンチューブ内で計数する。
水溶液に添加し、そして沈殿工程は室温で１時間に亘り
撹拌しながら行う。沈殿した物質を、室温、１５． Ｏ
ＯＯｘｇｌＯ分間の遠心分離によりペレット化する。−
回０．５ｍｌの上澄み液アリコートを対のチューブから
排除し、そしてポリプロピレンチューブ内で計数する。
計数の最小回数はバンクグラウンド上で４回である。ペ
レットの生成は視覚的に判定する。実験の結果は実施例
Ｉにおける結果に類似している。
レットの生成は視覚的に判定する。実験の結果は実施例
Ｉにおける結果に類似している。
沈殿実験用の調製に際して、実施例■におけるようニａ
ｌｌ製したｐＳＴ ５００ｍｇを脱イオン水（ｄｌ１２
０）５０１中で再構成する。この物質をｐｌ＋７．４の
炭酸塩緩衝液に対して徹底的に透析し、そしてその溶液
は室温における１５００ｘｇの遠心分離により透明にな
る。
ｌｌ製したｐＳＴ ５００ｍｇを脱イオン水（ｄｌ１２
０）５０１中で再構成する。この物質をｐｌ＋７．４の
炭酸塩緩衝液に対して徹底的に透析し、そしてその溶液
は室温における１５００ｘｇの遠心分離により透明にな
る。
中性ｐｓＴ溶液の１０ｍ１アリコートを等容量のＺｎＣ
Ｉｚ２．４ｍｌまたはＣｕＣ１ｚ ２．４ｍＭと組合わ
せる。室温における攪拌１時間後、この懸濁液を３０分
間１５，０００×ｇの遠心分離によってペレット化する
。各ペレットを一８０℃で凍結し、そしてｄＨｚｏ ２
０ｍ＋１中で５０χ希釈した中性ｐ）ＩのｐＳＴ溶液２
０ｍ ｌから成るシェル凍結対照試料と共に凍結乾燥す
る。
Ｉｚ２．４ｍｌまたはＣｕＣ１ｚ ２．４ｍＭと組合わ
せる。室温における攪拌１時間後、この懸濁液を３０分
間１５，０００×ｇの遠心分離によってペレット化する
。各ペレットを一８０℃で凍結し、そしてｄＨｚｏ ２
０ｍ＋１中で５０χ希釈した中性ｐ）ＩのｐＳＴ溶液２
０ｍ ｌから成るシェル凍結対照試料と共に凍結乾燥す
る。
凍結乾燥試料の乾量および蛋白質純度百分率を測定して
、非沈殿、凍結乾燥処理に関連する各沈殿法の効率を計
算せしめる。
、非沈殿、凍結乾燥処理に関連する各沈殿法の効率を計
算せしめる。
ｐｓ’ｒの生物活性に関する金属塩の効果を測定するた
めに、実施例■におけるように下垂体切除を施したラッ
トを使用して成長アラサイを行う。
めに、実施例■におけるように下垂体切除を施したラッ
トを使用して成長アラサイを行う。
この試験を行うために、若い（試験開始時期において３
６日齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグル
ープに分ける。これらのラットは体重によりグループ分
けし、それらグループの体重および分布は、各グループ
の平均開始体重が略等しくなるようにバランスさせる。
６日齢）雌の下垂体切除したラットを１０匹づつのグル
ープに分ける。これらのラットは体重によりグループ分
けし、それらグループの体重および分布は、各グループ
の平均開始体重が略等しくなるようにバランスさせる。
各グループのラットに処置を割り当てる。
これらのラットには９日間毎日、ソマトトロピンあるい
は対照溶液のいずれかを皮下注射する。
は対照溶液のいずれかを皮下注射する。
その注射は頭骨下方の層中下領域近傍に施す。ソマトト
ロピンを可溶化させるために、下記のパーロウの緩衝液
を使用する。
ロピンを可溶化させるために、下記のパーロウの緩衝液
を使用する。
１ 、８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨＩＯ，１３に上昇させ
たＮａ１ｌＣＯｉ（０，０３Ｍ）、ＮａＣ１（０，１５
Ｍ）ｎ、 ８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ９，５に上昇させ
たＮａ１ｌＣＯ＋（０，０３Ｍ）、ＮａＣ１（０、１５
Ｍ）既知量のｐｓ’ｒをｐＨ１０，８の緩衝液中に溶解
し、２ＮＨＣＩをもってｐＨ９，５に調整し、そしてρ
１１９．５ ｌＷ衝液による容量とする。
たＮａ１ｌＣＯｉ（０，０３Ｍ）、ＮａＣ１（０，１５
Ｍ）ｎ、 ８Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ９，５に上昇させ
たＮａ１ｌＣＯ＋（０，０３Ｍ）、ＮａＣ１（０、１５
Ｍ）既知量のｐｓ’ｒをｐＨ１０，８の緩衝液中に溶解
し、２ＮＨＣＩをもってｐＨ９，５に調整し、そしてρ
１１９．５ ｌＷ衝液による容量とする。
一つのグループの１０匹のラットは負の対照として使用
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射する。第二のグループは凍結乾燥
したブタ・ソマトトロピンの溶液をもって注射する。そ
の他のグループは本発明による遷移金属−沈殿ρＳＴの
選択された投与量から成る溶液をもって注射する。これ
らラットはｌ、２．９および１０日１に重量測定し、そ
してそれらの体重を記録する。試験期間の最終日（１０
日１）において、ラット体重ゲインデータを分析する。
し、そしてソマトトロピンを可溶化させるために用いる
ビヒクルをもって注射する。第二のグループは凍結乾燥
したブタ・ソマトトロピンの溶液をもって注射する。そ
の他のグループは本発明による遷移金属−沈殿ρＳＴの
選択された投与量から成る溶液をもって注射する。これ
らラットはｌ、２．９および１０日１に重量測定し、そ
してそれらの体重を記録する。試験期間の最終日（１０
日１）において、ラット体重ゲインデータを分析する。
実施例 Ｘ
ｐ１１９．０の６０ｍＭエタノールアミン緩衝液中５９
０ｍｇ ／１の濃度における精製Δ７ｒｐＳＴ ４３リ
ツトルを発酵培地中で成長させたエシェリヒア・コリ（
Ｅ、Ｃｏ１１）ＩＩＢｌｏｌから得た。この溶液を、１
個の２６立方フイート隔膜カートリツジであって、公称
分子量カットオフ約５，０００ダルトンであるものを備
えたクロスフロー（ｃｒｏｓｓ−ｆ ｌｏｗ）限外濾過
ユニット［「ロミコン（Ｒｏｍｉｃｏｎ）ＨＰ Ｊ ］
内で約８１０ｍｇ ／ｌに濃縮した。
０ｍｇ ／１の濃度における精製Δ７ｒｐＳＴ ４３リ
ツトルを発酵培地中で成長させたエシェリヒア・コリ（
Ｅ、Ｃｏ１１）ＩＩＢｌｏｌから得た。この溶液を、１
個の２６立方フイート隔膜カートリツジであって、公称
分子量カットオフ約５，０００ダルトンであるものを備
えたクロスフロー（ｃｒｏｓｓ−ｆ ｌｏｗ）限外濾過
ユニット［「ロミコン（Ｒｏｍｉｃｏｎ）ＨＰ Ｊ ］
内で約８１０ｍｇ ／ｌに濃縮した。
ｐＨ９，０のエタノールアミン緩衝液中で得られた濃縮
生成物溶液を同じＩＩＦユニット内でｐＨ８，０乃至１
０．０において６ｘ容１（７）５０χ炭酸塩緩衝液（Ｎ
ａｚＣＯ：＋ ０．２１ｍＭ、Ｎａ１ｌＣＯ＋ ０．２
５ｍＭ）に対してダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅ
ｒ） Ｌｔた。得られた生成物リチンテート（ｒｅ ｔ
ｅｎ ｔａ ｔｅ）であって、ｐｌ＋８．０を超える５
ｏｚ炭酸塩緩衝液中に存在するものは僅かに白濁（ＯＤ
ｓｗｓ＝０．０１） Ｌ、そして０．１ μｍの隔膜を
有する１個の５平方フイートの隔膜カートリッジを備え
たクロスフロー微孔質濾過ユニット［［アミコン（Ａｍ
ｉｃｏｎ）ＤＣ−１０Ｊ ］内で透明になった。
生成物溶液を同じＩＩＦユニット内でｐＨ８，０乃至１
０．０において６ｘ容１（７）５０χ炭酸塩緩衝液（Ｎ
ａｚＣＯ：＋ ０．２１ｍＭ、Ｎａ１ｌＣＯ＋ ０．２
５ｍＭ）に対してダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅ
ｒ） Ｌｔた。得られた生成物リチンテート（ｒｅ ｔ
ｅｎ ｔａ ｔｅ）であって、ｐｌ＋８．０を超える５
ｏｚ炭酸塩緩衝液中に存在するものは僅かに白濁（ＯＤ
ｓｗｓ＝０．０１） Ｌ、そして０．１ μｍの隔膜を
有する１個の５平方フイートの隔膜カートリッジを備え
たクロスフロー微孔質濾過ユニット［［アミコン（Ａｍ
ｉｃｏｎ）ＤＣ−１０Ｊ ］内で透明になった。
８００ｍｇ／Ｉ ＳＴ濃度において２６リソトルおよび
ｐＨ９，０の上記透明溶液に、０．２μｍ濾過２．４ｍ
Ｍ ＺｎＣＩｚ ３．７リツトルを、その添加が５乃至
３０分間で完了するような速度で穏やかに混合かつ添加
した。この実験におけるＺｎ”＋添加量がもたらすＺｎ
／ＳＴモル比は約１０であった。更にＺｎ−Δ７ｒｐＳ
Ｔ沈殿物を回収する前に、この溶液を更に２０分間混合
した。
ｐＨ９，０の上記透明溶液に、０．２μｍ濾過２．４ｍ
Ｍ ＺｎＣＩｚ ３．７リツトルを、その添加が５乃至
３０分間で完了するような速度で穏やかに混合かつ添加
した。この実験におけるＺｎ”＋添加量がもたらすＺｎ
／ＳＴモル比は約１０であった。更にＺｎ−Δ７ｒｐＳ
Ｔ沈殿物を回収する前に、この溶液を更に２０分間混合
した。
０．０８χ濃度および粒度２−５μｍの得られたＺｎ−
Δ７ｒｐＳＴ懸濁液を、０．１μ隔膜カツトオフをもっ
てクロスフロー微孔質濾過ユニット中で約２−５％に濃
縮した。
Δ７ｒｐＳＴ懸濁液を、０．１μ隔膜カツトオフをもっ
てクロスフロー微孔質濾過ユニット中で約２−５％に濃
縮した。
得られた懸濁液は更に、連続ボウル型（ｂｏｗｌ−ｔｙ
ｐｅ）遠心分離機により約２５０，０００ｍｇ ／ ｌ
に濃縮された。或いはこの得られた懸濁液を直接喧霧乾
燥してもよく、または更にクロスフロー微孔質濾過ある
いはディスク−スタック（ｄ １ｓｃ−ｓ ｔａｃｋ）
遠心分離機によって約１００．０００ｍｇ ／Ｉに濃縮
することも可能である。
ｐｅ）遠心分離機により約２５０，０００ｍｇ ／ ｌ
に濃縮された。或いはこの得られた懸濁液を直接喧霧乾
燥してもよく、または更にクロスフロー微孔質濾過ある
いはディスク−スタック（ｄ １ｓｃ−ｓ ｔａｃｋ）
遠心分離機によって約１００．０００ｍｇ ／Ｉに濃縮
することも可能である。
次に、得られたペーストを厚さ約２ＣＩＩ＋に広げ、そ
して最高生成物温度が２５℃に制限された温度をもって
２日間凍結乾燥した。一般に粒度１０−２００μｍおよ
び嵩密度約０．５を有する凍結乾燥物質はデリバリ・シ
ステムへの直接製剤用に適用している。
して最高生成物温度が２５℃に制限された温度をもって
２日間凍結乾燥した。一般に粒度１０−２００μｍおよ
び嵩密度約０．５を有する凍結乾燥物質はデリバリ・シ
ステムへの直接製剤用に適用している。
犬１」Ｌ−進Ｌ
５ｏｚ炭酸塩緩衝液をｐＨ７，４におけるトリス緩衝液
２ｍＭで置換した以外は実施例Ｘを反復した。最終生成
物の特性および沈殿効率はトリスおよび５０％炭酸塩緩
衝液の間では類似していた。
２ｍＭで置換した以外は実施例Ｘを反復した。最終生成
物の特性および沈殿効率はトリスおよび５０％炭酸塩緩
衝液の間では類似していた。
特許出願人 インターナショナル・ミネラルズ・アンド
・ケミカル・コーポレイション 手続補正書（自発） 昭和 ６篭３・１４Ｅ１
・ケミカル・コーポレイション 手続補正書（自発） 昭和 ６篭３・１４Ｅ１
Claims (34)
- （１）水溶液に、ソマトトロピンと不溶性錯体を形成す
るのに足る量をもって遷移金属の塩を添加する工程と、
前記溶液から前記錯体を分離する工程とを含んで成るこ
とを特徴とする希薄水溶液からソマトトロピンを回収す
る方法。 - （２）希薄水溶液が、脳下垂体ホモジネートまたは発酵
培養液からソマトトロピンの精製により得られるもので
ある請求項１記載の方法。 - （３）回収されるソマトトロピンが組換えソマトトロピ
ンである請求項１記載の方法。 - （４）回収される組換えソマトトロピンが組換えブタ・
ソマトトロピンである請求項３記載の方法。 - （５）回収されるソマトトロピンが、成熟蛋白質の最初
の７個のアミノ−末端アミノ酸が削除されているブタ・
ソマトトロピンの生物学的に活性なフラグメントである
請求項４項記載の方法。 - （６）回収されるソマトトロピンが組換えウシ・ソマト
トロピンである請求項３項記載の方法。 - （７）回収されるソマトトロピンが、成熟蛋白質の最初
の４個のアミノ−末端酸が削除されているウシ・ソマト
トロピンの生物学的に活性なフラグメントである請求項
４記載の方法。 - （８）回収されるソマトトロピンが組換えヒツジ・ソマ
トトロピンである請求項３記載の方法。 - （９）回収されるソマトトロピンが、家禽からの組換え
ソマトトロピンである請求項３記載の方法。 - （１０）回収されるソマトトロピンが、魚からの組換え
ソマトトロピンである請求項３記載の方法。 - （１１）回収されるソマトトロピンが 組換えヒト・ソマトトロピンである請求項３記載の方法
。 - （１２）回収されるソマトトロピンが天然のソマトトロ
ピンである請求項１記載の方法。 - （１３）回収されるソマトトロピンが天然のウシ・ソマ
トトロピンである請求項１２記載の方法。 - （１４）回収されるソマトトロピンが天然のブタ・ソマ
トトロピンである請求項１２記載の方法。 - （１５）前記金属が亜鉛、銅、マンガン、鉄またはコバ
ルトから構成される請求項１記載の方法。 - （１６）前記金属が亜鉛である請求項１５記載の方法。
- （１７）前記遷移金属塩が、遷移金属の塩化物、硫酸塩
、酢酸塩または酒石酸塩を含んで構成される請求項１記
載の方法。 - （１８）前記遷移金属の塩が、塩化亜鉛、塩化第二銅、
塩化マンガン、塩化第一鉄または塩化第一コバルトを含
んで構成される請求項１記載の方法。 - （１９）前記塩が塩化亜鉛である請求項１７記載の方法
。 - （２０）不溶性錯体が水溶液から濾過され、かつ乾燥さ
れる請求項１記載の方法。 - （２１）不溶性錯体が遠心分離により水溶液から分離さ
れ、かつ乾燥される請求項１記載の方法。 - （２２）分離された不溶性錯体が真空下または凍結乾燥
により乾燥される請求項１、２０または２１項記載の方
法。 - （２３）前記不溶性錯体が温度０℃乃至２５℃において
乾燥される請求項２２記載の方法。 - （２４）前記希薄水溶液がｐＨ約６．８乃至約９．８の
範囲内にあり、かつソマトトロピンの量を超える遷移金
属塩のモル過剰が存在している請求項１記載の方法。 - （２５）前記希薄水溶液のｐＨが約６．８乃至９．０の
範囲に及んでいる請求項２４記載の方法。 - （２６）前記遷移金属塩の濃度が１．０リットル溶液中
、ソマトトロピン０．０２５ミリモル当たり少なくとも
約０．１２ミリモルである請求項２４記載の方法。 - （２７）得られた不溶性錯体が、ソマトトロピンのモル
当たり少なくとも約１乃至約８モルの金属を含有してい
る請求項１記載の方法。 - （２８）得られた不溶性錯体が約０．３乃至約８重量％
の遷移金属を含有している請求項１記載の方法。 - （２９）得られた不溶性錯体が約０．３乃至約７重量％
の遷移金属を含有している請求項２８記載の方法。 - （３０）前記希薄水溶液が、炭酸塩緩衝液、トリスＨＣ
Ｉ５０ｍＭまたはエタノールアミン６０ｍＭを含んで成
る緩衝液を含有している請求項１記載の方法。 - （３１）使用される緩衝液がｐＨ値約７．４乃至９．８
に調整される請求項２８記載の方法。 - （３２）遷移金属塩とソマトトロピンの生物学的に活性
なフラグメントとからなる組成物。 - （３３）前記生物学的に活性なフラグメントがΔ７−ブ
タ・ソマトトロピンである請求項３２記載の組成物。 - （３４）前記生物学的に活性なフラグメントがΔ４−ウ
シ・ソマトトロピンである請求項３２記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US929187A | 1987-01-30 | 1987-01-30 | |
| US009291 | 1987-01-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63216898A true JPS63216898A (ja) | 1988-09-09 |
Family
ID=21736749
Family Applications (1)
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