KR20050044485A - 안지오포이에틴-유사 단백질 3 ａｎｇｐｔｌ3을 함유하는조성물 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

안지오포이에틴-유사 단백질 3 ａｎｇｐｔｌ3을 함유하는조성물 및 이를 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Angptl3 폴리펩타이드를 제조 및 사용하는 방법 및 수단에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 간재생 및 혈관형성을 유도하는데 있어서의 Angptl3 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 추가의 방법은 간질환의 진단 및 치료시에 Angptl3 폴리펩타이드의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명에서는 본 발명의 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 제공한다.

Description

안지오포이에틴-유사 단백질 3 ＡＮＧＰＴＬ3을 함유하는 조성물 및 이를 사용하는 방법 {COMPOSITION COMPRISING AND METHOD OF USING ANGIOPOIETIN-LIKE PROTEIN 3 ANGPTL3}
본 발명은 Angptl3 폴리펩타이드 및 이러한 단백질 분자를 제조하고 사용하는 방법 및 수단, 및 Angptl3 폴리펩타이드를 결합시키는 항체에 관한 것이다.
새로운 혈관의 성장은 배 및 생후 생장의 정상적인 생리학적 과정중의 전제조건이다. 혈관형성이라고 불리우는 과정인 기존에 존재하는 모세관으로부터 새로운 혈관의 이러한 증식은 또한 고체종양, 당뇨성 망막증, 건선, 염증 및 류마티스성 관절염의 병리학적 발생에 중요한 역할을 한다 (Ferrara, Recent Prog. Horm. Res. 55:15-35 (2000), discussion 35-6).
혈관형성은 혈관내피성장인자 (VEGF) 및 섬유아세포성장인자 (FGF)와 같은 성장인자에 따라서 좌우될 뿐만 아니라, 인테그린을 포함하는 세포유착분자 (cell adhesion molecules; CAMs)에 의해서 영향을 받는다. 동물모델에서 특이적 유착수용체를 코드화한 다양한 유전자의 불활성화 또는 차단항체의 투여는 내피세포의 혈관형성성 반응에 대하여 상당한 효과를 가졌다 (Elicieri and Cheresh, Mol. Med. 4:741-50 (1998)).
세포유착 단백질의 인테그린 부류는 적어도 22개의 상이한 αβ 헤테로다이머성 조합체로 발현되는 15개의 α 및 8개의 β 서브유니트로 조성된다 (Byzova et al., Mol. Cell., 6(4):851-60 (2000)). 이들 중에서, 조합체의 적어도 6개 (αvβ3, αvβ5, α5β1, α2β1, αvβ1 및 α1β1)가 혈관형성에 연관되었다 (Hynes and Bader, Thromb. Haemost., 78(1)83-7 (1997); Hynes et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 32(5):501-10 (1999)). 인테그린은 세포 사이의 간극 및 기저막에 존재하는 세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포유착 및 그 단백질상에서의 이동을 촉진시킨다.
인테그린 αvβ3은 특히 비트로넥틴, 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐, 반빌브란트 인자, 오스테오폰틴 및 MMP2의 단편 (PEX)을 포함하는 광범한 종류의 세포외 매트릭스 단백질에 대한 수용체이다 (참조예: Eliceiri and Cheresh, Cancer J. Sci. Am. 6 Suppl 3:S245-9 (2000)). 그의 불규칙적인 리간드 결합거동에도 불구하고, αvβ3는 성숙조직내에서는 광범하게 발현되지 않고, 일부의 혈관, 장 및 자궁 평활근 세포상에 존재한다 (Brem et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35:3466-74 (1994)). 이 수용체는 또한 특정의 활성화된 백혈구상에서, 대식세포 및 골흡수중에 결정적 역할을 나타내는 파골세포상에서 발현된다 (McHugh, et al., J. Clin. Invest., 105:433-40 (2000)). 가장 현저하게는, αvβ3는 저산소증 및 혈관내피성장인자 A (VEGF-A)와 같은 사이토킨에 노출된 내피세포상에서 상향조절되게 된다 (Suzuma et al., Invest Ophthalmo. Vis. Sci. 39:1029-35 (1998); Walton et al., J. Cell. Biochem. 78:674-80 (2000)). 생체내에서, αvβ3의 증가된 발현은 종양 과립화 조직내에서, 창상 치유, 황반변성 및 그밖의 혈관신생성 질환중에 혈관세포상에서 관찰되었다. 종양 혈관형성의 다양한 시험관내 및 생체내 모델에서, 모노클로날 항체 또는 리간드 길항제에 의한 αvβ3의 차단은 무딘 혈관형성을 유도하였다 (Brooks et al., Cell 79:1157-64 (1994); Eliceiri and Cheresh, Mol. Med. 4:741-50 (1998)).
종양 성장 또는 심근경색 이후의 측부혈관의 형성과 같은 병리학적 상태에서 혈관형성의 조절에 연관된 기전에 촛점을 맞춘 방대한 수의 보고가 있지만, 놀랍게도 간 재생중의 혈관형성 과정의 역할에 대하여는 거의 알려지지 않았다. 부분적인 간절제술 이후에, 간세포 및 비실질성 세포 둘다는 혈관내피성장인자를 발현하였으며 (Mochida et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 226:176-9 issn: 0006-291x (1996)), 이것은 VEGF가 유도성 혈관형성을 이용함으로써 간 재생에서 역할을 할 수 있음을 시사하는 것이다. 그러나, VEGF에 대한 중성화 항혈청은 손상후에 회복율을 변화시키지 않았으며, 이 모델에서 증식성 내피세포 및 간세포의 감소를 유도하였다 (Taniguchi et al., J. Histochem. Cytochem. 49:121-30 (2001)). 이를 지지하여, 혈관형성 억제제 TNP-470의 첨가는 부분 간절제술 이후에 창상치유를 손상시키지 않았으며, 이것은 TNP470-민감성 혈관형성은 간 재생중에 필요하지 않음을 시사하는 것이다 (Tanaka et al., Br. J. Surg., 83(10):1444-7 (1996)).
간 재생에 연관되는, 특히 간 재생중의 혈관형성의 과정중에 연관되는 신규의 인자를 확인하는 것이 필요하다.
도 1은 Angptl3의 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: 1) (DNA 16451)이다.
도 2A 및 2B는 Angptl3의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2)이다.
도 3A는 Angptl3 (SEQ ID NO: 2)의 영역 구조 및 안지오포이에틴-1 (ANG1) 및 안지오포이에틴-2 (ANG2)를 비교한 것이다.
도 3B는 인간 ANG2, ARP1, Angptl3 또는 조절배지의 gD-에피토프 태그된 버젼 (version)을 함유하는 조정배지 (conditioned medium)로 배양한 HMVEC 세포의 FACS 분석의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ANG1, ANG2, ARP1, Angptl3 및 Tie1 수용체 또는 Tie2 수용체 각각의 gD-태그된 버젼을 코드화한 플라스미드로 공형질감염된 293개의 세포를 사용하여 공-면역침전 실험의 결과를 나타낸 것이다. 상등액을 SDS-PAGE에 의해서 분할된 Tie1 또는 Tie2 단백질에 대한 항체로 면역침전시키고, PVDF 막에 대해 블럿팅하여 각각 gD 태그 또는 Tie 수용체에 대한 항체와 함께 배양하였다.
도 5A-C는 Angptl3의 피브리노겐 영역의 상동성 모델링을 나타낸 것이다. (A) 흰색으로 인간 피브리노겐 (3FIB)의 γ-쇄의 C 말단의 x-선 구조 및 녹색으로 Angptl3의 피브리노겐-유사 영역의 모델화된 구조를 중첩시킨 리본 다이아그램 (ribbon diagram). 알파 나선은 실린더로 나타내었으며, 베타 스트랜드 (strand)는 화살표로 나타내었다. 두가지 구조에서 상이한 부분은 표지하였다. (B) 녹색으로 나타낸 Angptl3의 피브리노겐-유사 영역의 모델화된 구조의 리본 다이아그램. α5β3내에 포함된 부분 P1, P2 및 P3는 노란색으로 강조하였다. (C) 인간 피브리노겐의 γ-쇄의 C-말단 (3FIB) (SEQ ID NO: 27) 및 Angptl3의 피브리노겐-양 영역 (SEQ ID NO: 28) 및 인간 안지오포이에틴 1 (SEQ ID NO: 29), 2 (SEQ ID NO: 30) 및 4 (SEQ ID NO: 31). 친수성 및 하전된 잔기는 청색으로 표시되었으며, 방향족/소수성 잔기는 오렌지색으로 나타내었다. 공통서열 (consensus sequence)은 정렬한 아래에 표시하였으며, 보존된 친수성/하전 및 방향족/소수성 돌연변이는 각각 청색 및 오렌지색 사각형으로 표식하였다. 본 발명자의 시험에서 사용된 펩타이드에 상응하는 잔기는 황색 박스로 표시하였다. 넘버링 (numbering)은 3FIB x-선 구조에 상응한다.
도 6A-C는 Angptl3이 분비된 당단백질이라는 증거를 나타낸다. (A) 면역진화성 정제된 인간 Angptl3의 쿠마시 (coomassie)-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔. (B) 일시적으로 형질감염된 CHO 세포로부터 면역친화성 정제된 쥐의 Angptl3의 은-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔. (C) PNGase-F 처리의 존재 (+) 또는 부재 (-) 하에서 재조합 Angptl3 단백질의 분자량 비교. gD 태그된 hAngptl3에 대해 예상된 분자량은 60 kDa이다. 웨스턴 블럿을 항-gD 항체를 사용하여 수행하였다.
도 7A-E는 Angptl3에 의한 내피세포 결합시에 사용되는 영역의 작용적 분석 및 생물학적 반응의 매개체 (mediator)로서 αvβ3-인테그린의 확인을 나타낸 것이다. (A) HMVEC 유착은 4 시간 동안 200 nM MA로 자극하기 전에 펩타이드 p1, p2 및 p3 (총 100 μM 또는 250 μM), 대조군 (NL6-PP2-scr, 250 μM) 또는 RGD 또는 RGE 펩타이드 (250 μM)의 배합물과 전배양한 후에 시험하였다. 200 nM PMA의 존재하 및 펩타이드의 부재하에서 유착은 100％의 값이 지정되었다. (B) 인테그린 αIIbβ3, αvβ3, αvβ1 또는 αvβ5글 과발현하는 293 세포의 유착은 20 ㎍/㎖ hAngptl3 또는 BSA로 피복된 미량역가 플레이트에서 시험하였다. 세포는 37℃에서 유착하도록 하였으며, 4 시간 후에 정량분석하였다. (C) 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 증가량의 hAngptl3로 피복시키고, 비특이적 결합은 37℃에서 1 시간 동안 3％ BSA에 의해서 차단시키고, 웰은 HMVEC 세포를 피복시키기 전에 PBS로 세척하였다. 제시된 데이타는 별개의 실험들의 평균치와 SD이다. (D) HMVEC는 200 nM PMA로 자극하기 전에 25 ㎎/㎖ 차단항체 항-α5β1 (JBS5), 항-αvβ3 (LM609) 또는 항-αvβ5 (P1F6)의 존재 또는 부재하에서 전배양하였다. 음성 대조군으로는 유착을 10 mM EDTA의 존재하에서 수행하였다. (E) 25 ㎍/㎖ 차단항체 항-αvβ3 (LM609) 또는 항-αvβ5 (P1F6)의 존재 또는 부재하에서 16 시간 동안 비자극되거나 hAngptl3 자극된 (50 ㎍/㎖) HMCECs의 이동.
도 8A-C는 Angptl3이 발생중에 간세포내에서 발현되고, 질병이 걸린 간에서 강력하게 상향조절된다는 것을 나타낸다. (A) hAngptl3의 노던블럿 분석은 인간 다중-조직 블럿 (multi-tissue blots) (Clontech)을 사용하여 수행되었으며, 간 및 신장에서 hAngptl3의 발현을 나타내었다. 각각의 레인 (lane)은 성숙 세립체 (adult grain) (BR), 심장 (HT), 골격근 (SM), 결장 (CO), 흉선 (TH), 비장 (SP), 신장 (KD), 간 (LI), 소장 (SI), 태반 (PL), 폐 (LU), 및 말초혈액 백혈구 (PBL)로부터 유래하는 RNA 2 ㎍을 함유한다. (B) hAngptl3의 발현은 간경변증으로부터 및 아세트아미노펜에 의한 독성 손상 이후의 조직내의 간세포내에서 강력하게 상향조절된다. 간종양 샘플내에서 변화는 관찰되지 않았다. (C) 태자 마우스 간의 동일계 하이브리드화 (in situ hybridization)는 간세포내의 E15 및 E18에서의 mAngptl3의 발현을 나타내었으며, 적혈구 선조세포, 내피세포 및 거핵세포내에서는 발현되지 않음을 나타낸다.
도 9A-E는 랫트 각막에서 생체내 혈관생성의 유도에 대한 CCLF1의 효과를 나타낸 것이다. (A) 완충액 (대조군), (B) 쥐의 Angptl3 (500 ng), (C) VEGF (100 ng), (D) 쥐의 Angptl3 (500 ng) 및 VEGF (100 ng)으로 처리한 하이드론 펠릿 (hydron pellets)을 이식한 후 6 일에 랫트 각막의 대표적인 편평-마운트 프토마이크로그래프 (flat-mount phtomicrographs). (E) 대조군, VEGF (100 ng), mAngptl3 (500 ng), mAngptl3 (500 ng) 및 표시한 바와 같은 배합물에 대한 생체내 혈관생성 반응의 요약 데이타. 데이타는 평균±SE, n=5 동물/그룹으로 나타내었다. 대조군과 비교한 p < 0.005 (비모수값 (nonparametric values)에 대한 만-휘트니 (Mann-Whitney) 시험).
도 10A-B는 0 일에 아데노바이러스성 감염시키고 4 일에 CCl4 처리한 후, 7 일에 아스파르테이트 트랜스퍼라제 (AST)의 혈청 레벨에 의해서 평가된 것으로서 CCl4 유도된 간독성에 있어서 쥐의 Angptl3의 예방적 효과를 나타낸 것이다. 도 10A는 0 일에 아데노바이러스성 감염시키고 4 일에 CCl4 처리한 후, 7 일에 시험한 모든 구조물 (constructs)의 혈청 레벨을 나타낸다. 도 10B는 0 일에는 지시된 바와 같은 바이러스성 벡터 및 4 일에는 CCl4로 처리한 후, 7 일에 마우스의 혈청내에서 AST의 레벨을 나타낸 것이다. (P < 0.0001)
도 11A-B는 C57/B16 야생형 마우스의 간에서 쥐 Angptl3를 장기간 발현시킨 후에 혈청 AST 레벨의 증가를 나타낸 것이다. 도 11A는 0 일에 지시된 바이러스성 구조물에 의한 처리 및 4 일에 CCl4 처리한 후, 다양한 시점에 마우스의 혈청내의 AST 레벨을 나타낸다. 도 11B는 아데노바이러스성 감염시킨지 2 주후에 RAG2 녹-아웃 (knock-out) 마우스의 혈청에서 ALT 및 AST 레벨의 증가를 나타낸다. 결과는 평균±SEM으로 나타낸다. 그룹당, 동물의 수는 6이었다 (P < 0.0001).
도 12A-D는 Angptl3-발현 아데노바이러스성 벡터의 경피 투여에 대한 반응으로 K5-Angptl3 유전자도입 마우스의 피부 또는 야생형 FVB 마우스에서 혈관 누출의 증가를 나타낸 것이다. 도 12A는 유전자도입 또는 동복 매치된 (litter matched) 야생형 대조 마우스의 다양한 기관으로부터 분리된 RNA의 실시간 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸 것이다. 피부에서의 도입유전자 (transgene) 발현은 간에서 검출된 내인성 Angptl3 발현 레벨의 약 10％에 도달하였다. 도 12B는 생후 다양한 시점에서 유전자도입 또는 동복 매치된 야생형 대조 마우스의 피부생검 (skin biopsy)으로부터 분리된 RNA의 실시간 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸 것이다. 도 12C는 11 주령의 유전자도입 또는 동복 매치된 야생형 대조 마우스에 대하여 수행하여 혈관투과성의 레벨을 측정하는 에반스 블루 시험 (Evans Blue assay)의 결과를 나타낸 것이다. 유전자도입 마우스는 기본조건 (왼쪽 패널) 뿐만 아니라 겨자유로 공격한 경우 (오른쪽 패널)에 혈관 투과성에서 유의적인 증가를 나타내었다. 혈관외유출된 에반스 블루 염료의 양은 610 ㎚ 흡광에서 광선 분광광도계에 의해 측정하여 조직의 습윤중량 1 ㎎당, 염료 함량으로 표현하였다 (아래 패널). 결과는 평균±SEM으로 나타내며, 그룹당, 동물의 수는 6이었다 (P < 0.05). 도 12D는 지시된 아데노바이러스성 구조물 1×109 Pfu로 피내주사한 FVB 마우스의 주사후 6 일에 수행된 에반스 블루 시험의 결과를 나타낸 것이다. Angptl3 (p < 0.05) 또는 VEGF (p < 0.005)로 처리한 마우스의 피부는 대조처리된 마우스 (LacZ)와 비교하여 기본조건 (왼쪽 패널)하에서 혈관 투과성의 유의적인 증가를 나타내었다. 혈관외유출된 에반스 블루 염료의 양은 610 ㎚에서 광선 분광광도계로 측정하여 조직의 습윤중량 1 ㎎당, 염료 함량으로 표현하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내며, 그룹당, 동물의 수는 6이었다 (P < 0.05).
도 13은 재조합 쥐 Angptl3 (mAngptl3)에 대한 새로 분리된 쥐 간세포의 결합의 레벨을 나타낸 것이다. 배양접시 (culture dishes)에 대한 간세포 유착물을 재조합 mAngptl3, 피브로넥틴 또는 BSA 대조물의 지시된 농도로 피복하였다. 비특이적 결합은 37℃에서 1 시간 동안 3％ BSA로 차단하였으며, 웰은 세포를 피복시키기 전에 PBS로 세척하였다. 제시된 데이타는 총 3회의 독립적인 실험의 3개조에서 수행된 하나의 대표적인 실험의 평균±SD를 나타낸다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
A. 정의
용어 "간질환"은 본 명세서에서 가장 넓은 개념으로 사용되며, 근원적 원인과 무관하게 어떠한 형태의 간손상과도 연관된 간의 질환을 의미한다. 따라서, 간질환은 예를들어, 감염성 또는 자가면역 과정으로부터, 간에 대한 기계적 또는 화학적 손상으로부터, 또는 암으로부터 야기될 수 있으며, 이들은 모두 "간질환"의 정의내에 포함된다. 간에 대한 화학적 손상은 알콜, 사염화탄소, 트리클로로에틸렌, 과량의 철, 과량의 약물, 약물 부작용 등과 같은 다양한 독소에 의해서 야기될 수 있다.
용어 "염증과 연관된 조직 손상" 및 그의 문법적 변형어는 본 명세서에서, 적어도 부분적으로 염증으로부터 야기되거나 염증반응에 의해서 수반되는 조직손상을 나타내는 의미로 사용된다. 조직은 예를들어, 간 조직 또는 심장 조직일 수 있으며, 조직 손상은 예를들어, 염증성 간질환 또는 심장질환과 연관되는 것일 수 있다.
용어 "염증성 간질환"은 본 명세서에서, 병인론이 근원적 원인이 감염성 또는 자가면역 과정, 간에 대한 화학적 손상 등인지 여부와는 무관하게 간에 대한 염증세포의 활성화 및 점증 (recruitment)을 포함하는 모든 간질환을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 염증성 간질환에는 알콜성 간염 및 간경변증, 바이러스성 간염, 간의 허혈성 재관류 손상, 패혈증 및 원발성 담즙성 간경변증 (PBC)이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다 (참조: Lawson et al., Toxicol Sci 54:509-16 (2000)).
용어 "만성 간질환"은 본 명세서에서 Angptl3의 과발현을 특징으로 하는 간질환을 나타내는 것으로 사용되며, 간의 염증성 질환 및 간종양을 포함하지만, 제한되지는 않는다. 간의 염증성 질환에는 예를들어, 알콜성 간경변증 및 원발성 담즙성 간경변증 (PBC)과 같은 간경변증, 간섬유증, 만성 간염, 즉 만성 자가면역 간염, 만성 알콜성 간염, 비-알콜성 지방간염 (NASH, 또한 지방증으로도 알려짐), 바이러스성 간염 A, B, C, D, E 및 G, 독성 대사성 간손상, 지방간, 간의 허혈성 재관류 손상 및 패혈증이 포함된다. 간종양에는 예를들어, 간세포암, 담관암 및 간의 전이성 암이 포함된다.
용어 "급성 간질환"은 본 명세서에서 병력이 일반적으로 6 개월을 초과하지 않는 단기간의 간질환을 나타내는 것으로 사용된다. 이 정의내에는 예를들어, 급성 간염, 즉 급성 자가면역 간염 및 급성 알콜성 간염, 및 급성 간부전증이 포함된다. 특히 이 정의내에는 Angptl3의 과발현을 특징으로 하지 않는 단기간의 간질환이 포함된다.
용어 "심장질환"은 본 명세서에서 병인론이 염증성 반응을 포함하고, 그의 발생에 있어서의 위험인자가 염증인 모든 심장질환을 나타내는 것으로 사용된다. 그 정의에는 구체적으로 Angptl3의 증가된 발현을 특징으로 하는 모든 심장질환이 포함된다. 이 정의내에 포함되는 심장질환에는 관상동맥 질환, 비대성 심근증, 비-특이적 비대증 및 확장성 심근증과 같은 심근증, 심근염, 울혈성심부전 (CHF), 및 심장발작 등이 포함되나, 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 것으로 "알콜성 간염"에는 과도한 알콜 섭취로 인한 급성 및 만성 간염이 포함되며, 비정상적인 실험실 시험이 질병의 유일한 표시인 경증의 간염에서부터 황달 (빌리루빈 저류에 의해서 야기된 노란 피부), 간성 뇌증 (간부전에 의해서 야기되는 신경성 기능부전), 복수 (복부내에 유체 축적), 출혈성 식도정맥류 (식도내의 정맥류성 정맥), 이상 혈액응고 및 혼수와 같은 합병증을 갖는 중증의 간부전까지의 범위일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "바이러스성 간염"은 간염 A, B, C, D, E 또는 G 감염으로 인한 간염을 의미한다.
간염 A 바이러스 (HAV)는 통상적으로 발열, 권태감, 오심, 식욕부진 및 복부 불쾌감의 갑작스런 발현에 이어서 수일 이내에 황달이 이어지는 것을 특징으로 하는 경미한 질병을 야기시키는 피코르나비리다에 (Picornaviridae) 과의 엔테로바이러스 그룹의 바이러스이다.
간염 B 바이러스 (HBV)는 헤파드나비리다에 (Hepadnaviridae) 과의 대부분 이본쇄인 DNA 바이러스이다. HBV는 인간에게서 간염을 야기시키며, 이 과의 관련된 바이러스는 오리, 줄다람쥐 및 우드척 (woodchuck)에서 간염을 야기시킨다. HBV 게놈은 4개의 유전자를 갖는다: 바이러스성 DNA-폴리머라제, 엔벨로프 (envelope) 단백질, 프리-코어 (pre-core) 단백질 (바이러스성 캡시드로 진행됨) 및 단백질 X를 각각 코드화한 pol, env, pre-core 및 X. 단백질 X의 기능은 명확하지 않지만, 이것은 숙주세포 유전자의 활성화 및 암의 발생에 연루될 수 있다. HBV는 급성 및 만성 간염을 야기시킨다. 만성적으로 감염될 기회는 연령에 따라 좌우된다. 감염된 신생아의 약 90％ 및 감염된 소아의 50％는 만성적으로 감염되게 된다. 반대로, HBV로 감염된 면역적격성 성인의 단지 약 5％ 내지 10％ 만이 만성 간염 B를 발현한다.
간염 C 바이러스 (HCV)는 플라비비리다에 (Flaviviridae) 과의 양성 일본쇄 RNA 바이러스이다. 게놈은 대략 10,000 뉴클레오타이드이며, 약 3,000개의 아미노산의 단일 폴리프로테인 (polyprotein)을 코드화한다. 폴리프로테인은 숙주세포 및 바이러스성 프로테아제에 의해서 3개의 주된 구조단백질 및 바이러스 복제에 필요한 몇개의 비구조 단백질로 처리된다. 약간 상이한 게놈 서열을 갖는 HCV의 몇개의 상이한 유전자형은 예후 및 치료에 대한 반응에 있어서의 차이와 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. HCV에 의해서 급성적으로 감염된 개체의 약 85％는 만성적으로 감염되게 된다. 따라서, HCV는 만성 (6 개월 이상 동안 더 지속함) 간염의 주원인이다. 일단 만성적으로 감염되면, 바이러스는 치료 없이는 결코 거의 낫지 않는다. 드문 경우에, HCV 감염은 임상적으로 급성질병 및 간부전 까지도 야기시키지만, 급성 감염의 대부분의 경우는 임상적으로 검출할 수 없다.
간염 D 바이러스 (HDV, 델타 바이러스라고도 불리움)는 작은 원형 RNA 바이러스이다. HDV는 복제 결핍성이며, 따라서 또 다른 바이러스의 부재하에서는 증식할 수 없다. 인체에서 HDV 감염은 HBV 감염의 존재하에서만 일어난다.
간염 E 바이러스 (HEV)는 통상적으로, 간염 A 질환과 임상적으로 구별할 수 없는 간염을 야기시킨다. 증상에는 권태감, 식욕부진, 복부통증, 관절통, 및 발열이 포함된다. 간염 E는 통상적으로 오염된 음료수와 연관된 유행성 및 산발성-풍토병성 형태 둘다로 나타난다.
간염 G 바이러스 (HBV)는 HCV와 관련되지만 HCV와는 다르며, 급성 및 만성 간염을 야기시킬 수 있는 비교적 새로 발견된 플라비바이러스 (flavivirus)이다.
허혈성 재관류 손상은 신체의 일부분에 대한 혈액의 흐름이 일시적으로 정지되고 (허혈), 그후에 복구되는 (재관류) 경우에 일어난다. 상호교환적으로 사용되는 용어 "허혈 재관류 손상" 및 "허혈성 재관류 손상"은 세포의 산소 박탈과 연관된 초기 손상, 및 세포에 산소가 재공급되는 경우에 염증성 반응과 연관된 후속 손상을 의미한다. 허혈 재관류 손상은 특정의 대동맥류의 수복 및 기관 이식과 같은 특정의 수술 과정중에 일어날 수 있다. 손상은 혈액 공급이 단절된 신체의 부분에서 일어날 수 있거나, 또는 허혈의 기간중에 혈액이 충분히 공급된 부분에서 일어날 수 있다. 간의 허혈성 재관류 손상은 예를들어, 간 및 담낭의 수술적 절제로 인해서 일어날 수 있으며, 임상적으로는 급성 간세포 손상 및 괴사를 포함하는 간부전과 같은 합병증으로 표시된다.
"원발성 담즙성 간경변증 (PBC)"은 간내의 소담관 (small bile ducts)의 염증성 파괴를 특징으로 하는 질병이다. PBC는 결국 간의 경변증으로 진행한다. PBC의 병인론은 완전히 이해되지는 않았지만, 자가항체의 존재로 인하여 이것은 일반적으로 자가면역 질환인 것으로 생각되며, 그러나 감염성 인자와 같은 그밖의 다른 병인론이 완전히 배제되지는 않았다. PBC로 진단된 환자의 약 90％는 가장 통상적으로는 40 내지 60 세의 연령인 여성이다.
"패혈증"은 간 또는 담도를 포함하는 신체의 어떤 부분에서나 기원할 수 있는 세균성 감염의 결과이다. 패혈증은 특히 약화된 면역시스템을 갖는 사람에게서는 치명적인 상태일 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "혈관형성"은 새로운 혈관이 기존의 혈관구조로부터 발생하고, 진행하는데 내피세포의 증식 및 운동성 둘다를 필요로 하는 과정을 나타낸다.
용어 "경변증"은 본 명세서에서, 해부학적으로 섬유증과 조합된 간내의 산재된 소결절을 특징적으로 나타내는 병적인 간의 상태를 나타내기 위해서 사용된다. 경변증은 만성 알콜남용, 만성 바이러스성 간염 대사성 및 담즙성 질환과 연관된 것을 포함하는 만성 간질환의 필수적인 형태를 위한 최종적인 공통경로이다.
용어 "Angptl3 폴리펩타이드", "Angptl3 단백질" 및 "Angptl3"는 상호교환적으로 사용되며, 천연서열 Angptl3 및 Angptl3 폴리펩타이드 변이체 (본 명세서에서 추가로 정의된다)를 포함한다. Angptl3 폴리펩타이드는 인간의 조직 형태로부터 또는 또 다른 공급원으로부터와 같은 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성방법에 의해서 제조될 수 있다. Angptl3는 이전에는 "FLS139", "NL6" 또는 "CCFL1"으로도 불리웠다. 따라서, Angptl3에 대한 모든 언급은 또한 FLS139, NL6 및 CCFL1 폴리펩타이드를 의미하는 것으로도 파악하여야 한다.
"천연서열 Angptl3" 또는 "천연 Angptl3"는 자연으로부터 유도된 Angptl3 분자와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 천연서열 Angptl3는 천연으로부터 분리될 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성방법에 의해서 생산될 수 있다. 용어 "천연서열 Angptl3" 또는 "천연 Angptl3"는 구체적으로 Angptl3의 천연적으로 존재하는 절단되거나 분비된 형태 (예를들어, 세포외 영역 서열), 천연적으로 존재하는 변이체 형태 (예를들어, 대신으로 스플리싱된 형태) 및 천연적으로 존재하는 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 한가지 구체예에서, Angptl3의 천연서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 460을 포함하는 성숙 또는 전장 (full-length) 천연서열 Angptl3이다. SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 폴리펩타이드는 본 명세서에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타내었지만, SEQ ID NO: 2에서 아미노산 위치 1의 상류나 하류에 위치하는 또 다른 메티오닌 잔기가 Angptl3 폴리펩타이드에 대한 출발 아미노산 잔기로 사용될 수도 있다는 것도 생각할 수 있으며, 가능하다. 또한, 용어 "천연서열 Angptl3" 및 "천연 Angptl3"는 구체적으로 개시 메티오닌이 없는 폴리펩타이드를 포함한다.
상호교환적으로 사용되는 용어인 "Angptl3 변이체" 또는 "Angptl3 변이체 폴리펩타이드"는 이하에서 (a) SEQ ID NO: 2의 Angptl3 폴리펩타이드의 잔기 1 내지 460 또는 그의 비-인간 포유동물 동족체, 또는 (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 그의 비-인간 포유동물 동족체의 아미노산 서열의 또 다른 특이적으로 유도된 단편의 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것으로 정의된 활성 Angptl3 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 Angptl3 변이체 폴리펩타이드는 예를들어, SEQ ID NO: 2의 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 내부 영역내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 추가되거나, 결실된 Angptl3 폴리펩타이드를 포함한다. 통상적으로, Angptl3 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 Angptl3 폴리펩타이드 또는 그의 비-인간 포유동물 동족체의 잔기 1 내지 460과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 81％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 83％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 84％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 86％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 87％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 88％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 89％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 91％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 92％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 93％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 94％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 더 더욱 바람직하게는 약 99％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. Angptl3 변이체 폴리펩타이드는 천연 Angptl3 폴리펩타이드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, Angptl3 변이체 폴리펩타이드는 길이가 적어도 약 10개의 아미노산, 종종 길이가 적어도 약 20개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 30개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 40개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 50개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 60개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 70개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 80개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 90개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 100개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 150개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 200개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 250개의 아미노산, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 300개의 아미노산, 또는 그 이상이다. 특히 바람직한 Angptl3 변이체는 SEQ ID NO: 2의 천연 인간 Angptl3 서열의 아미노산 부분 281 내지 193, 415 내지 430 및 442-460, 또는 비-인간 포유동물 Angptl3 동족체의 상응하는 부분(들)중의 적어도 하나를 보유하거나, 또는 이러한 부분내에 단지 보존적 아미노산 치환 만을 함유한다.
용어 "피브리노겐 영역" 또는 "피브리노겐-유사 영역"은 Angptl3의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2)에서 대략 위치 238에서부터 대략 위치 460까지의 아미노산을 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서에서 동정된 Angptl3 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (％)"는 최대 퍼센트의 서열 동일성에 도달하기 위해서 필요에 따라 서열을 정렬시키고 갭 (gaps)을 도입시킨 후에 Angptl3 서열내의 아미노산 잔기와 동일한 후보서열내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬 (alignment)은 본 기술분야의 숙련된 기술의 범위내에 있는 다양한 방법으로, 예를들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메가라인 (Megaline; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공연히 이용이 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 비교할 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 정렬을 수득하는데 필요한 모든 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하는데 적절한 파라메터를 결정할 수 있다. 그러나, 이러한 목적으로 아미노산 서열 동일성 ％값은 후술하는 바와 같이 서열비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 수득하며, 여기에서 ALGIN-2 프로그램에 대한 완전한 원시코드 (source code)는 도 4A-Q에 제시된다. ALGIN-2 서열비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍사 (Genentech, Inc.)에 의해서 제작되었으며, 도 4A-Q에 제시된 원시코드는 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되었으며, 여기에서 이것은 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALGIN-2 프로그램은 제넨텍사 (Genetech, Inc., South San Francisco, California)를 통해서 공공연히 이용할 수 있거나, 도 4A-Q에 제시된 원시코드로부터 편집될 수도 있다. ALGIN-2 프로그램은 유닉스 (UNIX) 구동시스템, 바람직하게는 디지탈 유닉스 V4.0D상에 사용하기 위해서 편집되어야 한다. 모든 서열비교 파라메터는 ALGIN-2 프로그램에 의해서 설정되며, 변화되지 않는다.
본 발명에서의 목적에 따라, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대비한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 ％ (이것은 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대비한 특정의 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 함유하는 소정의 아미노산 서열 A로 대체하여 표현될 수도 있다)는 다음과 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배 (여기에서, X는 서열정렬 프로그램 ALGIN-2에 의하여 A 및 B의 이 프로그램 정렬에서 동일한 매치로 측정된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동등하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
구체적으로 다른 식으로 언급되는 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 상술한 바와 같이 ALGIN-2 서열비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 ％는 또한 서열비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))을 사용하여 결정될 수도 있다. NCBI-BLAST2 서열비교 프로그램은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터 다운로드될 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇가지 검색 파라메터를 사용하는데, 여기에서 이들 검색 파라메터는 모두 예를들어, 비차폐 (unmask) = 유 (yes), 스트랜드 (strand) = 모두 (all), 예상된 발생수 (expected occurrences) = 10, 최소 저복잡성 길이 (minimum low complexity length) = 15/5, 멀티-패스 (multi-pass) e-값 = 0.01, 멀티-패스에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 (dropoff) = 25, 및 측정 매트릭스 (scoring matrix) = BLOSUM62를 포함하는 기정값 (default values)으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열비교를 위해서 사용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대비한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 ％ (이것은 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대비한 특정의 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 함유하는 소정의 아미노산 서열 A로 대체하여 표현될 수도 있다)는 다음과 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배 (여기에서, X는 서열정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의하여 A 및 B의 이 프로그램 정렬에서 동일한 매치로 측정된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동등하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
"Angptl3 변이체 핵산 서열"은 이하에서 정의하는 바와 같은 활성 Angptl3 폴리펩타이드를 코드화하며, 이하에서 (a) SEQ ID NO: 2의 Angptl3 아미노산 서열 또는 그의 비-인간 포유동물 동족체의 잔기 1 내지 460을 코드화한 핵산 서열, 또는 (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 그의 비-인간 포유동물 동족체의 또 다른 특이적으로 유도된 단편을 코드화한 핵산 서열과 약 80％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자이다. 통상적으로, Angptl3 변이체 폴리뉴클레오타이드는 (a) SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 460를 코드화한 핵산 서열, 또는 이러한 인간 폴리펩타이드의 비-인간 포유동물 동족체와 약 80％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 81％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 83％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 84％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 86％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 87％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 88％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 89％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 91％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 92％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 93％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 94％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상의 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상의 핵산 서열 동일성, 및 더 더욱 바람직하게는 약 99％ 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 수 있다.
통상적으로, Angptl3 변이체 핵산 서열은 길이가 적어도 약 30개의 뉴클레오타이드, 종종 길이가 적어도 약 60개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 90개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 120개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 150개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 180개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 210개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 240개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 270개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 300개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 450개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 600개의 뉴클레오타이드, 더욱 종종은 길이가 적어도 약 900개의 뉴클레오타이드, 또는 그 이상이다.
본 명세서에서 동정된 Angptl3 폴리펩타이드-코드화 핵산 서열에 관한 "핵산 서열 동일성 퍼센트 (％)"는 최대 퍼센트의 서열 동일성에 도달하기 위해서 필요에 따라 서열을 정렬시키고 갭을 도입시킨 후에 Angptl3 폴리펩타이드-코드화 핵산 서열내의 뉴클레오타이드와 동일한 후보서열내의 뉴클레오타이드의 백분율로 정의된다. 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬은 본 기술분야의 숙련된 기술의 범위내에 있는 다양한 방법으로, 예를들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메가라인 (Megaline; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공연히 이용이 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 비교할 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 정렬을 수득하는데 필요한 모든 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하는데 적절한 파라메터를 결정할 수 있다. 그러나, 이러한 목적으로 핵산 서열 동일성 ％값은 후술하는 바와 같이 서열비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 수득한다. ALGIN-2 서열비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍사 (Genentech, Inc.)에 의해서 제작되었으며, 원시코드는 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되었으며, 여기에서 이것은 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALGIN-2 프로그램은 제넨텍사 (Genetech, Inc., South San Francisco, California)를 통해서 공공연히 이용할 수 있다. ALGIN-2 프로그램은 유닉스 (UNIX) 구동시스템, 바람직하게는 디지탈 유닉스 V4.0D를 통해서 공공연히 이용할 수 있다. 모든 서열비교 파라메터는 ALGIN-2 프로그램에 의해서 설정되며, 변화되지 않는다.
본 발명에서의 목적에 따라, 소정의 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대비한 소정의 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 ％ (이것은 소정의 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대비한 특정의 핵산 서열 동일성 ％를 갖거나 함유하는 소정의 핵산 서열 C로 대체하여 표현될 수도 있다)는 다음과 같이 계산된다: 분수 W/Z의 100배 (여기에서, W는 서열정렬 프로그램 ALGIN-2에 의하여 C 및 D의 이 프로그램 정렬에서 동일한 매치로 측정된 뉴클레오타이드의 수이며, Z는 D에서 뉴클레오타이드의 총수이다). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동등하지 않은 경우에, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 ％는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 ％와 동등하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
구체적으로 다른 식으로 언급되는 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 핵산 서열 동일성 ％ 값은 상술한 바와 같이 ALGIN-2 서열비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다. 그러나, 핵산 서열 동일성 ％는 또한 서열비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))을 사용하여 결정될 수도 있다. NCBI-BLAST2 서열비교 프로그램은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터 다운로드될 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇가지 검색 파라메터를 사용하는데, 여기에서 이들 검색 파라메터는 모두 예를들어, 비차폐 = 유, 스트랜드 = 모두, 예상된 발생수 = 10, 최소 저복잡성 길이 = 15/5, 멀티-패스 e-값 = 0.01, 멀티-패스에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25, 및 측정 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 기정값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 서열비교를 위해서 사용되는 상황에서, 소정의 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대비한 소정의 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 ％ (이것은 소정의 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대비한 특정의 핵산 서열 동일성 ％를 갖거나 함유하는 소정의 핵산 서열 C로 대체하여 표현될 수도 있다)는 다음과 같이 계산된다: 분수 W/Z의 100배 (여기에서, W는 서열정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의하여 C 및 D의 이 프로그램 정렬에서 동일한 매치로 측정된 뉴클레오타이드의 수이며, Z는 D에서 뉴클레오타이드의 총수이다). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동등하지 않은 경우에, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 ％는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 ％와 동등하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
또 다른 구체예에서, Angptl3 변이체 폴리뉴클레오타이드는 활성 Angptl3 폴리펩타이드를 코드화하며, SEQ ID NO: 2의 전장 Angptl3 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 바람직하게는, 엄밀한 하이브리드화 (stringent hybridization) 및 세척조건하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자이다. Angptl3 변이체 폴리펩타이드는 Angptl3 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해서 코드화된 것일 수 있다.
상술한 바와 같이 수행된 아미노산 서열 동일성 비교와 관련하여 용어 "양성 (positive)"은 동일할 뿐만 아니라 유사한 특성도 갖는 비교된 서열내의 아미노산 잔기를 포함한다. 대상이 되는 아미노산 잔기에 대하여 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 대상이 되는 아미노산 잔기와 동일하거나, 대상이 되는 아미노산 잔기의 바람직한 치환체인 것이다.
본 발명에서의 목적에 따라, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대비한 소정의 아미노산 서열 A의 양성 ％값 (이것은 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대비한 특정의 양성 ％를 갖거나 함유하는 소정의 아미노산 서열 A로 대체하여 표현될 수도 있다)는 다음과 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배 (여기에서, X는 서열정렬 프로그램 ALGIN-2에 의하여 A 및 B의 이 프로그램 정렬에서 동일한 매치로 측정된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다). 아미노산 서열 A 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 양성 ％는 A에 대한 B의 양성 ％와 동등하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 개념으로 사용되며, 구체적으로는 예를들어, 단일 항-Angptl3 모노클로날 항체 (작용제, 길항제 및 중화항체를 포함), 폴리에피토프 특이성 (polyepitopic specificity)을 갖는 항-Angptl3 항체 조성물, 단일쇄 항-Angptl3 항체, 및 항-Angptl3 항체의 단편 (이하 참조)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동족성인 항체의 집단으로부터 선택된 항체를 의미하며, 즉 집단을 이루는 개개 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 존재하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동족성인 항체의 집단으로부터 선택된 항체를 의미하며, 즉 집단을 이루는 개개 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 존재하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
"항체 단편"은 완전 항체 (intact antibody)의 일부분, 바람직하게는 완전 항체의 항원 결합성 또는 가변적 부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아버디 (diabodies); 선형 항체 (linear antibody) (Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 ([1995]); 단일쇄 항체분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 (multispecific) 항체가 포함된다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라 불리우며, 각각 단일 항원-결합부위를 갖는 두개의 동일한 항원-결합 단편, 및 명칭이 용이하게 결정화하는 그의 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두개의 항원-결합부위를 가지며, 여전히 항원을 교차결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생산한다.
"Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이 부분은 밀접한 비공유적 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변영역의 다이머로 구성된다. 이것은 각각의 가변영역의 3개의 CDRs가 상호작용하여 VH-VL 다이머의 표면상에서 항원-결합부위를 규정하는 배열로 존재한다. 집합적으로, 6개의 CDRs는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일의 가변영역 (또는 항원에 대하여 특이적인 3개의 CDRs 만을 함유하는 Fv의 반)이라도 전체 결합부위보다는 더 낮은 친화성이지만 항원을 인식하고 결합시키는 능력을 갖는다.
Fab 단편도 또한 경쇄의 고정영역 (constant domain) 및 중쇄의 제 1 고정영역 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 중쇄 CH1 영역의 카복시 말단에 항체 힌지 (hinge) 부분으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 몇개의 잔기를 부가함으로써 Fab' 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 고정영역의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 또 다른 화학적 커플링도 또한 공지되어 있다.
모든 척추동물종으로부터의 항체 (면역글로부린)의 "경쇄 (light chain)"는 그들의 고정영역의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (.) 및 람다 (.)로 불리우는 두개의 명백히 상이한 형태중의 하나를 지정할 수 있다.
중쇄의 고정영역의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로부린은 다양한 부류로 지정될 수 있다. 이들에는 5 가지 주부류의 면역글로부린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들중의 몇가지는 서브클래스 (subclass)(아이소타입 (isotype)), 예를들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로부린의 다양한 부류에 상응하는 중쇄 고정영역은 각각 ., ., ., ., 및 .,라고 불리운다. 면역글로부린의 다양한 부류의 서브유니트 구조 및 삼차원 배열은 잘 알려져 있다.
용어 "다이아버디 (diabodies)"는 두개의 항원-결합부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 (VH-VL) 내의 경쇄 가변영역 (VL)에 연결된 중쇄 가변영역 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄상의 두개의 영역 사이에서 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커 (linker)를 사용함으로써 영역들은 또 다른 쇄의 상보적 영역과 짝을 지어 두개의 항원-결합부위가 생성되도록 강요된다. 다이아버디는 예를들어, 문헌 (EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))에 더 상세히 기술되어 있다.
"분리된" 항체는 그의 천연환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그의 천연환경의 오염성분은 항체의 진단적 또는 치료학적 사용을 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬 및 그밖의 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 (1) 로우리 방법 (Lowry method)에 의해서 측정된 것으로서 항체의 95 중량％ 이상으로, 가장 바람직하게는 99 중량％ 이상으로, 또는 (2) 스피닝컵 서열분석기 (spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원성 또는 비환원성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 동종성이 되도록 정제할 수 있다. 분리된 항체에는 재조합 세포내에서의 동일계 항체가 포함되는데, 이것은 항체의 천연환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 수 있기 때문이다. 그러나, 통상적으로는 분리된 항체는 적어도 하나의 정제단계에 의해서 정제할 수 있다.
용어 "가변적 (variable)"은 가변영역의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열에서 광범위하게 상이하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변영역 전체에 걸쳐서 균등하게 분포되지는 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변영역내 둘다에서 상보성-결정 부분 (CDRs) 또는 과가변적 부분이라고 불리우는 3개의 절편내에 집중된다. 가변영역의 더욱 고도로 보존된 부분은 외곽구조 (framework; RR) 부분이라고 불리운다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변영역은 4개의 FR 부분을 포함하는데, 주로 3개의 CDRs에 의해서 연결되어 .-시트 규조를 연결하고 일부의 경우에는 .-시트 구조의 일부분을 형성하는 루프를 형성하는 .-시트 배열을 채택한다. 각각의 쇄에서 CDRs는 FR 부분에 의해서 서로 근접하여 함께 유지되며, 또 다른 쇄로부터의 CDRs와 함께 항체의 항원-결합부위의 형성에 기여한다 (참조: Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)). 고정영역은 항원에 항체를 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포독성에 있어서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 (effector) 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "고가변적 부분"은 항원-결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 고가변적 부분은 "상보적 결정부분" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변영역내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변영역내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) 및/또는 "고가변적 루프 (hypervariable loop)"로부터의 이러한 잔기 (즉, 경쇄 가변영역내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91096 (L3) 및 중쇄 가변영역내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Clothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 [1987])를 포함한다. "외곽구조" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에서 정의한 바와 같은 고가변적 부분 잔기 이외의 가변영역 잔기이다.
비-인간 (예를들어, 쥐) 항체의 "인간화된 (humanized)" 형태는 비-인간 면역글로부린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라성 면역글로부린, 면역글로부린 쇄 또는 그의 단편 (예를들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 그밖의 항원-결합 서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화된 항체는 수용자 (recipient)의 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로부린 (수용자 항체)이다. 몇가지 경우에, 인간 면역글로부린의 Fv FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해서 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체내에도 존재하지 않으며, 도입된 CDR 또는 외곽구조 서열내에도 존재하지 않는 잔기를 함유할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 정련하고 최대화시키기 위해서 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로는 두개의 가변영역 모두를 함유하는데, 여기에서 CDR 부분의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로부린의 부분에 사응하며, FR 부분의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로부린 서열의 부분이다. 인간화된 항체는 또한, 최적으로 면역글로부린 고정부분 (Fc)의 적어도 일부분, 일반적으로 인간 면역글로부린의 부분을 포함한다. 더 상세한 것은 문헌 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988]; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))을 참고로 한다. 인간화된 항체는 항체의 항원-결합부분이 짧은 꼬리 원숭이 (macaque monkeys)를 목적하는 항원으로 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유도된 프리마타이즈드 (PRIMATIZED™) 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "면역유착 (immunoadhesion)"은 이종 단백질의 결합 특이성 ("유착")을 면역글로부린 고정영역의 효과기 기능과 결합시키는 항체-유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역유착은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 (즉, "이종"임) 및 면역글로부린 고정영역 서열의 융합을 포함한다. 면역유착 분자의 어드헤신 (adhesin) 부분은 일반적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합부위를 함유하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신내의 면역글로부린 고정영역 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 서브타입 (subtypes), IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 모든 면역글로부린으로부터 수득될 수 있다.
하이브리드화 반응의 "엄밀도 (stringency)"는 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 전문가에 의해서 용이하게 결정될 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 좌우되는 실험적 계산치이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적절한 어니일링 (annealing)을 위해서 더 높은 온도를 필요로 하는 반면에, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 하이브리드화는 일반적으로 상보적 스트랜드가 그들의 융점 이하의 환경에 존재하는 경우에 재어니일링시키는 변성된 DNA의 능력에 따라 좌우된다. 프로브와 하이브리드화성 서열 사이의 목적하는 상동성 (homology)의 정도가 높을수록 사용될 수 있는 상대적 온도는 더 높다. 그 결과, 더 높은 상대적 온도는 반응온도를 더 엄밀하게 만드는 경향이 있는 반면에 더 낮은 온도는 그보다 덜하다. 하이브리드화 반응의 엄밀성의 추가의 상세한 사항 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995))을 참고로 한다.
본 명세서에서 정의된 것으로서 "엄밀한 조건" 또는 "고엄밀도 조건"은 (1) 세척을 위해서 낮은 이온강도 및 높은 온도, 예를들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 나트륨시트레이트/0.1％ 나트륨 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 하이브리드화중에 포름아미드와 같은 변성제, 예를들어 42℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 나트륨시트레이트에 의한 pH 6.5에서 0.1％ 소혈청알부민/0.1％ 피콜 (Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액을 함유하는 50％ (v/v) 포름아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 나트륨피로포스페이트, 5×덴하르트 용액 (Denhardt's solution), 초음파처리된 연어정자 DNA (50 .g/㎖), 0.1％ SDS 및 10％ 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/나트륨시트레이트)로 및 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척하고, 이어서, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 고엄밀도 세척하는 조건에 의해서 확인될 수 있다.
"중등도로 엄밀한 조건 (moderately stringent condition)"은 문헌 (Sambrook et al.., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)에서 기술한 바와 같이 확인될 수 있으며, 상술한 조건보다는 덜 엄밀한 세척용액 및 하이브리드화 조건 (예를들어, 온도, 이온강도 및 ％SDS)의 사용을 포함한다. 중등도로 엄밀한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리나트륨시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5×덴하르트 용액을 함유하는 용액중에서 37℃로 밤새 배양하고, 이어서 필터를 37-50℃의 1×SSC중에서 세척하는 것이다. 숙련된 전문가는 프로브 길이 등과 같은 인자들을 조절하는데 필요한 것으로서 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조정하는지를 인지할 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "태그된 에피토프 (epitope tagged)"는 "태그 (tag) 폴리펩타이드"에 융합된 Angptl3 폴리펩타이드로 이루어진 키메라성 폴리펩타이드를 의미한다. 태그 폴리펩타이드는 항체가 그에 대항하여 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 가지지만, 이것이 융합되는 폴리펩타이드이 활성을 저해하지 않도록 충분히 짧다. 태그 폴리펩타이드는 바람직하게는 또한, 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차반응하지 않도록 상당히 독특하다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 통상적으로는 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.
본 명세서에서 Angptl3 분자에 관한 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 혈관 내피세포의 유착 및/또는 이동과 같이 천연 a'vβ3 인테그린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그 수용체에 의해서 매개되는 세포성 반응을 조절하는 분자의 능력을 나타내는 것이다. 이와 관련하여, 용어 "조절하는"은 촉진 및 억제 둘다를 포함하며, 따라서 본 발명의 (천연 및 변이체) Angptl3 분자는 천연 a'vβ3 인테그린 수용체의 작용제 및 길항제 둘다를 포함한다. 본 발명에서 Angptl3 리간드의 바람직한 생물학적 활성에는 혈관신생 (혈관형성)의 촉진 또는 억제, 및 특히 간 재생중의 혈관형성 과정에의 연관이 포함된다.
용어 "작용제"는 본 발명의 천연 Angptl3 분자의 펩타이드 및 비-펩타이드 동족체 및 이러한 천연 Angptl3 분자를 특이적으로 결합시키는 항체를 나타내는 것으로 사용되며, 단 이들은 천연 Angptl3 수용체 (a'vβ3)를 통해서 신호를 하는 능력을 갖는다. 즉, 용어 "작용제"는 Angptl3 수용체 (a'vβ3)의 생물학적 역할과 관련하여 정의된다. 바람직한 작용제는 예를들어, 간 재생중에 혈관신생 (혈관형성)의 촉진과 같이 상기 정의한 바와 같은 천연 Angptl3의 바람직한 생물학적 활성을 갖는다.
용어 "길항제"는 천연 Angptl3 분자의 펩타이드 및 비-펩타이드 동족체, 항체를 나타내는 의미로 사용되며, 단 이들은 이들이 Angptl3 또는 그의 수용체 αvβ3를 결합시키는 능력이 있는지 여부와 무관하게 Angptl3의 생물학적 기능을 억제하는 능력을 갖는다. 따라서, Angptl3 또는 그의 수용체에 결합하는 능력을 갖는 길항제에는 항-Angptl3 및 항-αvβ3 항체가 포함된다. 바람직한 항체는 혈관 내피세포의 유착 및/또는 이동의 억제제이며, 특히 혈관형성, 특히 악성 종양 성장, 간 또는 심장 질환의 염증성 질환과 연관된 혈관형성의 억제제이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "종양"은 악성이든 양성이든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다.
용어 "암 (cancer)" 및 "암성 (cancerous)"은 일반적으로 비조절된 세포성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 의미하거나 기술하는 것이다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 암의 더욱 특정한 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선암, 신장암, 외음암, 갑상선암, 간암종, 및 다양한 형태의 두경부암이 포함된다.
"치료"는 표적화된 병리학적 상태 또는 질병을 예방하거나, 느리게하는 (감소시키는) 것을 목적으로 하는 치료학적 치료 및 예방적 또는 방지적 수단 둘다를 의미한다. 치료가 필요한 상태에는 질병이 이미 있는 상태 및 질병에 걸릴 경향이 있는 경우 또는 질병이 방지되어야 하는 경우가 포함된다. 종양 (예를들어, 암) 치료시에, 치료제는 종양세포의 병리학을 직접적으로 감소시킬 수 있거나, 종양세포가 다른 치료제, 예를들어 방사선 및/또는 화학요법에 의한 치료에 더 민감하도록 만드는 것일 수 있다.
암의 "병리학"은 환자의 웰빙 (well-being)을 손상시키는 모든 현상을 포함한다. 이것에는 비정상적이거나 조절이 불가능한 세포성장, 전이, 이웃하는 세포의 정상기능에 의한 간섭, 비정상적인 수준으로 사이토킨 또는 그밖의 다른 분비 생성물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
"만성적 (chronic)" 투여는 장기간 동안 초기 치료학적 효과를 유지하도록 급성적 모드와는 반대로 연속적인 모드로 약제를 투여하는 것을 의미한다. "간헐적 (intermittent)" 투여는 중단이 없이 연속적으로 수행하는 것이 아니라, 오히려 사실상 순환적인 치료이다.
치료를 목적으로 하는 "포유동물"은 인간, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등과 같은 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 및 애완용 동물을 포함하여 포유동물로 분류되는 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
하나 또는 그 이상의 추가의 치료제와 "병용하는 (in combination with)" 투여는 동시 (공동) 및 어떠한 순서로든지 연속적 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "담체 (carriers)"는 사용된 용량 및 농도에서 그에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 무독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형체 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 약제학적으로 허용되는 담체는 pH 완충된 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 그밖의 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산과 같은 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로부린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 그밖의 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 트윈 (TWEEN™), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉 (PLURONICS™)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
"리포좀 (liposome)"은 포유동물에 대한 약물 (예를들어, PRO10282 폴리펩타이드 또는 그에 대한 항체)의 송달에 유용한 다양한 형태의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포체 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이층 (bilayer) 형태로 배열된다.
"소분자 (small molecule)"는 본 명세서에서 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.
본 명세서에 기술된 Angptl3 폴리펩타이드의 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발시킬 수 있는 양이다. 특히, Angptl3 폴리펩타이드 또는 그의 작용제의 "유효량"은 내피세포, 예를들어 혈관 내피세포의 유착 및/또는 이동과 같이 αvβ3 Angptl3 수용체에 의해서 매개된 세포성 반응을 조절할 수 있는 양이다. 이 용어는 혈관생성, 특히 간 재생과 연관된 혈관형성을 야기시킬 수 있는 양을 포함한다.
종양의 치료와 관련하여, 예를들어 천연 Angptl3 폴리펩타이드의 길항제가 사용되는 경우에 "치료학적 유효량"은 다음과 같은 효과중의 하나 또는 그 이상을 야기시킬 수 있는 양을 의미한다: (1) 성장의 지연 및 완전한 정지를 포함하는 어느 정도까지의 종양 성장의 억제; (2) 종양세포의 수에 있어서의 감소; (3) 종양 크기의 감소; (4) 말초기관내로의 종양세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 전이의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (6) 종양의 퇴행 또는 거부를 야기시킬 수는 있지만 반드시 그런 것은 아닌 항-종양 면역반응의 증진; 및/또는 (7) 질병과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감. 종양의 치료를 목적으로 하는 Angptl3 폴리펩타이드 길항제의 "치료학적 유효량"은 실험적으로 및 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
"혈관 내피 성장인자" 또는 "VEGF"는 저산소증에 의해서 자극되며 종양 혈관생성에 필요한 것으로 나타난 내피세포-특이적 마이토젠 (mitogen)이다 (Senger et al., Cancer 46:5692-5632 (1986); Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Schweiki et al., Nature 359:843-845 (1992); Plate et al., Nature 359:845-848 (1992)). 본 명세서에서 사용된 이 용어는 인간 VEGF121 및 VEGF165 이소형태를 포함하는 모든 VEGF 이소형태를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
B. 인간 Angptl3의 비-인간 포유동물 동족체
천연 인간 Angptl3의 분리는 실시예 1 및 또한 PCT 공보 WO 99/15654에 기술되어 있다. Angptl3 DNA는 또한, 1997년 9월 18일에 ATCC (American Type Culture Collection)에 지정번호 FLS139-DNA16451-1078로 기탁되어 ATCC 수탁번호 209283을 지정받았다.
다른 비-인간 포유동물 동족체, 또는 스플라이스 (splice) 또는 그밖의 천연적으로 존재하는 변이체를 동정하기 위해서는, 라이브러리를 목적하는 유전자 또는 그 유전자에 의해서 코드화된 단백질을 동정하도록 디자인된 프로브 (예를들어, 인간 Angptl3 서열 또는 적어도 약 20-80 염기의 올리고뉴클레오타이드에 대한 항체)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브에 의한 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 것은 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989))에 기술된 바와 같은 표준공정을 사용하여 수행될 수 있다. 다른 천연 Angptl3 폴리펩타이드를 코드화 한 유전자를 분리하기 위한 대체방법은 PCR 방법을 사용하는 것이다 (Sambrook et al., 상기 참조; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
프로브로 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열은 가양성 (false positive)이 최소화되도록 충분한 길이를 가져야 하며, 충분히 명백해야 한다. 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는, 스크리닝할 라이브러리에서 DNA에 하이브리드화시키면 결실될 수 있도록 표지된다. 표지하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지물, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용이 포함된다. 중등도의 엄밀도 및 고도의 엄밀도를 포함하는 하이브리드화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 참조)에 제시되어 있다.
이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 동정된 서열은 진뱅크 (GenBank)와 같은 공공 데이타베이스 또는 그밖의 다른 사적인 서열 데이타베이스에 기탁되고 여기에서 이용할 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬될 수 있다. 분자의 규정된 부분내에서의 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 코드화 서열을 갖는 핵산은 최초로 본 명세서에 기술된 추론된 아미노산 서열을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 필요에 따라 문헌 (Sambrook et al., 상기 참조)에 기술된 바와 같은 통상적인 프라이머 연장공정을 사용하여 전구체를 검출하고, cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 중간체를 처리함으로써 수득될 수 있다.
C. Angptl3 변이체
천연 인간 Angptl3는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를들어 1999년 4월 1일에 공개된 PCT 공개공보 WO 99/15654에 기술되어 있다. 천연 전장 서열 Angptl3 (SEQ ID NO: 2)에서 또는 본 명세서에 기술된 Angptl3 아미노산 서열의 다양한 영역에서의 변이는 예를들어, 예를들어 미합중국 특허 제 5,364,934 호에 기술된 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 기술 및 지침을 사용하여 이루어질 수 있다. 변이는 SEQ ID NO: 2의 천연 서열과 비교하여 Angptl3의 아미노산 서열에서 변화를 야기시키는 Angptl3 폴리펩타이드를 코드화한 하나 또는 그 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 천연 또는 변이체 Angptl3 서열의 영역중의 하나 또는 그 이상에서 적어도 하나의 아미노산을 다른 아미노산에 의해서 치환시킴으로써 이루어진다. 목적하는 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 어떤 아미노산 잔기를 삽입, 치환 또는 결실시킬를 결정하는데 있어서의 지침은 Angptl3의 서열을 동족성인 공지의 단백질 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성의 부분에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화시킴으로써 찾아낼 수 있다. 아미노산 치환은 세린에 의한 로이신의 치환, 즉 보존적 아미노산 치환과 같이 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체시킨 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 15개의 아미노산의 범위에서 이루어질 수 있다. 허용된 변이는 서열내에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성된 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해서 나타나는 활성에 대하여 시험함으로써 결정될 수 있다.
따라서, Angptl3 폴리펩타이드 단편은 본 명세서에 제공된다. 이러한 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있거나, 예를들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우에 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정의 단편은 Angptl3 폴리펩타이드의 목적하는 생물학적 활성에 대하여 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된다.
SEQ ID NO: 2의 천연 인간 Angptl3의 피브리노겐 영역의 상동성 모델링 및 실시예 5에 기술된 바와 같은 Angptl3에 의한 내피세포 결합에 사용된 영역의 기능적 분석이 본 발명에서 Angptl3 변이체를 디자인하는데 유용하다. Angptl3의 피브리노겐-유사 영역의 모델화된 구조를 기초로 하여, 천연 인간 Angptl3 (SEQ ID NO: 2)의 부분 P1: 아미노산 281-293 (SEQ ID NO: 14); P2: 아미노산 442-460 (SEQ ID NO: 15); 및 P3 아미노산 281-293 (SEQ ID NO: 17)은 αvβ3 결합에 연루되는 것으로 확인되었다. 수용체 결합 및 수용체를 통해서 활성화시키고 시그날을 발생시키는 능력을 보유하기 위해서 P1, P2 및 P3 부분은 실질적으로 보유되어야 하거나, 단지 보존적 치환 만이 이들 부분에서 수행되어야 한다. 다른 한편, Angptl3 길항제를 디자인하기 위해서는, 이들 부분의 하나 또는 그 이상내에서 더욱 유의적인 아미노산 변경이 이루어지도록 하는 것이 필요할 수 있다. Angptl3 변이체의 디자인은 도 5B에 나타낸 리본 다이아그램 및 도 5C에 나타낸 서열 정렬에 의해서 더 지지되며, 여기에서 친성 및 하전된 잔기는 청색으로 표시되고, 방향족 및 소수성 잔기는 오렌지색으로 표시된다.
상기 언급한 바와 같이, 특정의 구체예에서 보존적 치환은 본 발명의 Angptl3 변이체를 제조하는데 중요하다. 이러한 보존적 치환은 바람직한 치환의 표제제목하에서 표 1에 나타내었다. 이러한 치환이 생물학적 활성에 변화를 야기시킨다면, 표 1에서 예시적 치환으로 이름붙여지거나 아미노산 부류와 관련하여 후술하는 바와 같은 더 실질적인 치환이 도입되며, 생성물은 스크리닝한다.
원래의 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; lys; arg gln
Asp (D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르로이신 leu
Leu (L) 노르로이신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르로이신 leu
Angptl3 변이체 폴리펩타이드의 기능 또는 면역학적 동일성에서의 실질적인 변형은 (a) 예를들어, 시트 또는 나선형 배열로서, 치환의 영역내의 폴리펩타이드 골격구조의 구조, (b) 표적부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지하는데 대한 그들의 효과에 있어서 유의적으로 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 천연적으로 존재하는 잔기는 공통 측쇄 특성을 기초로하여 다음의 그룹들로 구분된다:
(1) 소수성: 노르로이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류중의 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대하여 교환시키는 것을 수반할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 또한, 보존적 치환부위내로, 또는 더욱 바람직하게는 잔류 (비-보존적) 부위내로 도입시킬 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오타이드-매개된 (부위-지향된) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발과 같이 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 부위-지향된 돌연변이유발 (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), 카셋트 (cassette) 돌연변이유발 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한선택 돌연변이유발 (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) 또는 그밖의 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA상에서 수행하여 Angptl3 변이체 DNA를 생성시킬 수 있다.
Angptl3 단편은 통상적인 다수의 기술중의 어떤 것에 의해서나 제조될 수 있다. 목적하는 펩타이드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 대체 방법에는 효소분해에 의해서, 예를들어 단백질을 특정한 아미노산 잔기에 의해서 정의된 부위에서 단백질을 분할하는 것으로 알려진 효소로 처리하거나, DNA를 적합한 제한효소로 분해시키고 목적하는 단편을 분리시킴으로써 Angptl3 단편을 생성시키는 것이 포함된다. 또 다른 적합한 기술에는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해서 목적하는 폴리펩타이드 단편을 코드화한 DNA 단편을 분리하고 증폭시키는 것이 포함된다. DNA 단편의 목적하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오타이드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머 (primers)에서 사용된다. 바람직하게는, Angptl3 폴리펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 2의 천연 Angptl3와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
스캐닝 아미노산 분석을 또한 사용하여 인접한 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산 중에서 비교적 작은 중성 아미노산이 있다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 알라닌은 베타-탄소를 넘어서 측쇄를 제거하며, 변이체의 주쇄 배열을 변화시킬 가능성이 적기 때문에, 알라닌이 일반적으로 이들 그룹중에서 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). 알라닌은 또한 가장 통상적인 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 이것은 빈번하게는 매몰 및 노출된 위치 둘다에서 발견된다 (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). 알라닌 치환이 변이체의 적당한 양을 수득하지 않는다면, 이소테릭 (isoteric) 아미노산이 사용될 수 있다.
Angptl3 변이체, 천연 및 변이체 Angptl3 폴리펩타이드의 공유적 변형, Angptl3 (변이체 포함)에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 면역유착에 대한 추가의 상세한 사항은 예를들어, WO 99/15654에 제시되어 있다.
D. Angptl3 폴리펩타이드의 용도
이하의 실시예에서 기술하는 바와 같이, 성인조직 (adult tissue)에서 Angptl3의 발현분석은 간 특이적 발현 및 질병, 경변성 간 또는 독성 간손상 이후의 간세포에서 강력한 상향조절을 입증하였다. 또한, Angptl3의 생체내 투여는 혈관 투과성의 증가 및 간손상으로부터의 단기간 예방적 효과를 유도하였지만, Angptl3의 연장된 발현은 간손상과 연관되었다. 더더욱, Angptl3은 생체내에서의 랫트 각막 시험에서 시험하였을 때 혈관생성을 유도하였다. 질병 간 검체에서 검출된 현저한 발현에 조합된 후자의 시험에서 Angptl3에 의한 혈관 성장의 로부스트 유도 (robust induction)는 이 인자가 간 재생중에 혈관생성 과정의 조절시에 중요한 역할을 나타낸다는 것을 강력하게 시사한다.
따라서, Angptl3 및 Angptl3 작용제는 급성 간질환의 위험에서 피검자의 치료, 예방 및/또는 확인, 및 급성 간손상 이후의 간 재생 및/또는 조직에서의 혈관형성의 유도에 유용한 것으로 믿어진다. 급성 간손상은 만성, 알콜성 또는 바이러스성 간염, 간에 대한 화학적 또는 기계적 손상, 만성 감염, 간경변증, 원발성 또는 전이성 간암에 기인할 수 있는 간절제술 또는 방광암과 같은 염증성 간질환과 연관될 수 있다. 조직내의 혈관생성은 감염성 또는 자가면역 과정, 기계적 또는 화학적 손상 또는 암 또는 전이성 암의 결과로 손상된 심장조직 또는 간조직과 연관될 수 있다.
따라서, Angptl3 길항제는 Angptl3의 증가된 Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직손상, 만성 간질환 및/또는 Angptl3의 증가된 발현을 특징으로하는 심장질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 것으로 믿어진다. Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직손상에는 근원적 원인이 감염성 또는 자가면역 질환, 또는 간에 대한 화학적 손상 등인지 여부와는 무관하게, 만성 간질환과 연관된 염증을 제한함이 없이 병인론이 간에 대한 염증성 세포의 활성화 및 점증을 포함하는 염증과 연관된 간조직 손상이 포함된다. 즉, Angptl3의 과발현을 특징으로하는 간조직 손상에는 알콜성 간경변증 및 원발성 담증성 간경변증 (PBC)와 같은 간경변증, 간 섬유증, 만성 감염, 예를들어, 만성 자가면역 감염, 만성 알콜성 간여 및 비-알콜성 지방간염 (NASH), 바이러스성 간염 A, B, C, D, E 및 G. 독성 대사성 간손상, 지방간, 간의 허혈성 재관류 손상 및 패혈증, 및 간종양, 무제한적인 간세포성 암종, 간외의 담도암, 담관암 및 간의 전이성 암이 포함된다. Angptl3의 증가된 발현과 연관된 심장조직 손상, 또는 병인론으로 염증성 반응을 포함하거나, 발생시에 염증이 위험인자인 심장질환에는 Angptl3의 증가된 발현과 연관된 심장조직 손상, 무제한적인 관상동맥 질환, 비-특이적 비대증 및 확장된 심근증과 같은 심근증, 심근염, 울혈성 심부전증 (CHF), 및 심근경색이 포함된다. 검토를 위해서는 문헌 (Lawson et al., Toxicol Sci 54:509-16 (2000), 상기 참조)을 참고로 한다.
또한, Angptl3 길항제는 조직에서 혈관 투과성을 원치않는 증가를 억제하는데 유용한 것으로 믿어진다. 조직은 간 또는 심장 조직일 수 있다. 혈관 투과성의 증가는 조직 손상에 따른 소혈관의 증가된 투과성일 수 있으며, 독소에 대한 노출로 인한 혈관내피의 괴사로 이어질 수 있거나, 또는 만성 염증과 같은 염증, Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직손상, 만성 간질환 및/또는 Angptl3의 증가된 발현을 특징으로하는 심장질환의 치료 및/또는 예방과 연관될 수 있다.
더우기, Angptl3 길항제는 과도한 알콜 섭취로 인하여 일어난 만성 알콜성 간염의 예방 및/또는 치료에 유용한 것으로 믿어진다. 알콜성 간염은 비정상적인 실험실 시험이 질병의 유일한 표시인 경증의 간염에서부터 황달 (빌리루빈 저류에 의해서 야기된 노란 피부), 간성 뇌증 (간부전에 의해서 야기되는 신경성 기능부전), 복수 (복부내에 유체 축적), 출혈성 식도정맥류 (식도내의 정맥류성 정맥), 이상 혈액응고 및 혼수와 같은 합병증을 갖는 중증의 간부전까지의 범위일 수 있다.
또한, 본 발명에는 간에 영향을 미치는 T-세포 매개된 질환이 포함된다. T 세포로부터의 자가면역 손상은 세포독성 T 세포에 의해서 직접적으로, 및 T 헬퍼 (helper) 세포에 의해서 간접적으로 매개된다. 본 명세서에서 그의 치료방법이 고려된 자가면역 질환에는 자가면역 간염 및 원발성 담즙성 간경변증이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 자가면역 간염 (또한, 자가면역 만성 활동성 간염으로도 공지됨)은 간세포 괴사 및 염증이 지속하는 것을 특징으로하는 만성 질환이며, 치료하지 않는 경우에는 간경변증 및 궁극적으로는 간부전증으로 진행한다. 원발성 담즙성 간경변증은 간내 또는 담즙 시스템의 자가면역 질환이며, 손상된 담즙분비와 연관된다. 자가면역 항체 및 T 세포는 이 질병과 연관된 간에 대한 조직손상을 매개하는 것으로 믿어진다.
Angptl3 길항제는 또한 간의 허혈성 재관류 손상의 치료에 유용하다. 전술한 바와 같이, 허혈성 재관류 손상은 일반적으로 신체의 일부분에 대한 혈액의 흐름이 일시적으로 정지되고 (허혈), 그후에 복구되는 (재관류) 경우에 일어난다. 손상은 혈액 공급이 단절된 신체의 부분에서 일어날 수 있거나, 또는허혈의 기간중에 혈액이 충분히 공급된 부분에서 일어날 수 있다. 간의 허혈성 재관류 손상은 예를들어, 간 및 담낭의 수술적 절제와 같은 다양한 근원적 원인으로 인해서 일어날 수 있으며, 임상적으로는 급성 간세포 손상 및 괴사를 포함하는 간부전과 같은 합병증으로 표시된다.
Angptl3 길항제에는 표적 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩타이드, 포스포펩타이드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중나선 (triple helix) 분자 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
예를들어, 안티센스 RNA 및 RNA 분자는 표적화된 mRNA에 대해 하이브리드화하고 단백질 전사를 방지함으로써 mRNA의 해독을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우에, 해독 개시부위, 예를들어 표적 유전자 뉴클레오타이드 서욜의 약 -10 및 +10 위치 사이로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드가 바람직하다.
리보자임은 RNA의 특이적 분할을 촉진시킬 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA에 대한 서열-특이적 하이브리드화에 이어서 엔도뉴클레오라이틱 분할 (endonucleolytic cleavage)에 의해서 작용한다. 잠재적 RNA 표적내의 특이적 리보좀 분할부위는 공지의 기술에 의해서 확인될 수 있다. 추가의 상세한 사항은 예를들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT 공개공보 WO 97/33551 (1997년 9월 18일에 공개됨))을 참고로 한다.
전사를 억제하기 위해서 사용된 삼중나선 형성에 있어서 핵산 분자는 단일-나선이고, 데옥시뉴클레오타이드로 구성되어야 한다. 이들 올리고뉴클레오타이드의 염기 조성은 이것이 일반적으로 듀플렉스 (duplex) 중의 하나의 나선상에서 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 스트레치 (stretches)를 필요로하는 후그스틴 염기쌍 규칙 (Hoogsteen base pair rules)을 통해서 삼중나선 형성을 촉진시키도록 디자인된다. 추가의 상세한 사항은 예를들어, 문헌 (PCT 공개공보 WO 97/33551, 상기 참조)을 참고로 한다.
본 발명에서 Angptl3 폴리펩타이드 (그들의 작용제 및 길항제를 포함)를 치료제로 사용하는 경우에, 이들은 공지의 방법에 따라 제제화되어 약제학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있으며, 이렇게 함으로써 Angptl3 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체 비히클과의 혼합물로 배합된다. 치료학적 제제는 저장을 위해서 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성성분을 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합시킴으로써 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용지에 대해 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 그밖의 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산과 같은 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로부린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 그밖의 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 트윈 (TWEEN™), 플루로닉 (PLURONICS™) 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
생체내 투여를 위해서 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 동결건조 및 재조제하기 전 또는 후에 멸균여과막을 통해서 여과함으로써 성취된다.
본 발명에서 치료학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근포트 (sterile access port)를 갖는 용기, 예를들어 피하 주사바늘에 의해서 꿰뚫을 수 있는 스토퍼 (stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 (bag) 또는 바이알에 배치시킨다.
투여의 경로는 공지의 방법에 따라, 예를를들어 정맥내, 복강내, 대뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의해서 주사 또는 주입, 국소 투여 또는 서방성 시스템에 의해서 이루어진다.
본 발명의 약제학적 조성물이 용량 및 목적하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라서 달라질 수 있다. 적절한 용량 또는 투여의 경로는 통상적인 의사의 전문적 기술의 범위내에서 잘 결정된다. 동물실험은 인체 치료를 위한 유효용량을 결정하는데 확실한 지침을 제공한다. 유효용량의 종간 스케일링 (interspecies scaling)은 문헌 (Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96)에서 주장된 원리에 따라 수행될 수 있다.
Angptl3 폴리펩타이드 또는 그의 작용제 또는 길항제의 생체내 투여가 사용되는 경우에, 통상의 투약량은 투여의 경로에 따라서 포유동물 체중 ㎏당, 약 10 ng으로부터 100 ㎎까지, 바람직하게는 약 .1 g/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일로 변화할 수 있다. 특정한 용량 및 송달의 방법에 관한 지침은 문헌 (참조예: 미합중국 특허 제 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 호)에 제시되어 있다. 다양한 제제가 다양한 치료 화합물 및 다양한 질병에 대하여 효과적일 수 있으며, 예를들어 하나의 기관 또는 조직을 표적화한 투여는 또 다른 기관 또는 조직에 대한 것과는 상이한 방식의 투여를 필요로 할 수 있는 것으로 예상된다.
예를들어, 어떤 특정 간질환의 치료를 위한 유효용량을 결정하기 전에 환자의 통상적인 임상적 및 실험실적 평가에 의해서 질환의 중증도를 결정한다. 치료의 잇점은 간 기능을 매주, 2 주일 또는 개월과 같은 규칙적인 간격으로 수행되는 임상적 및 실험실적 평가에 의해서 추적함으로써 평가된다.
Angptl3 폴리펩타이드를 Angptl3 폴리펩타이드의 투여가 필요한 질환 또는 질병의 치료에 적합한 방출특성을 갖는 제제로 서방성 투여하는 것이 바람직한 경우에는 Angptl3 폴리펩타이드의 마이크로캅셀화가 고려된다. 서방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캅셀화는 인간 성장호르몬 (rhGH), 인터페론-γ (rhIFN-γ), 인터류킨-2 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 [참조예: Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미합중국 특허 제 5,654,010 호].
이들 단백질의 서방성 제제는, 폴리-락틱-코글리콜산 (PLGA) 폴리머의 생체적합성 및 광범한 생물분해성 특성으로 인하여 이 폴리머를 사용하여 개발되었다. PLGA의 분해생성물인 락트산과 글리콜산은 인간의 신체내에서 빠르게 제거된다. 더구나, 이 폴리머의 분해성은 그의 분자량 및 조성물에 따라서 수개월로부터 수년까지 조정될 수 있다 [참조: Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41].
Angptl3 치료제를 다른 치료학적 레지멘 (regimen)과 조합하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를들어, Angptl3 폴리펩타이드 또는 그의 작용제에 의한 치료는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 또는 섬유아세포 성장인자 (FGF)와 같은 그밖의 다른 혈관생성 인자들의 투여와 조합될 수 있다.
E. 제조 물품
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상술한 질병의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는 예를들어 병, 바이알, 시린지 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태를 진단하거나 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근포트를 가질 수 있다 (예를들어, 용기는 피하 주사바늘로 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 (bag) 또는 바이알일 수 있다). 조성물내의 활성약제는 통상적으로 본 명세서에서 확인된 유전자 생성물을 활성을 저해할 수 있는 항종양제, 예를들어 항체이다. 용기상의, 또는 용기와 연관된 라벨은 조성물이 선택된 상태를 진단하거나 치료하는데 사용된다는 것을 시사한다. 제조 제품은 추가로, 포스페이트-완충된 식염수, 링거 용액 (Ringer's solution) 및 덱스트로즈 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충제를 함유하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 이것은 또한, 그밖의 다른 완충제, 희석제, 필터, 주사바늘, 시린지 및 사용설명서가 있는 포장 삽입물을 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 그밖의 다른 물질을 포함할 수 있다.
F. 진단적 용도
Angptl3는 염증성 간질환에서 상향조절되기 때문에, 정상조직에 비해서 그의 과발현은 이러한 질환의 진단적 마커로서 사용될 수 있다.
유전자 증폭 및/또는 발현은 예를들어, mRNA의 전사를 정량화하는 통상적인 사우던 블럿팅 (Southern blotting), 노던 블럿팅 (Northern blotting) (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블럿팅 (dot blotting) (DNA 분석), 또는 본 명세서에 제시된 서열을 기초로하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 동일계 하이브리드화에 의해 샘플내에서 직접적으로 측정될 수 있다. 대용으로, DNA 듀플렉스 (duplexes), RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하는 특이적 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수도 있다. 항체는 또한 표지될 수 있으며, 시험은 듀플렉스를 표면에 결합시키면 표면상에 듀플렉스가 형성되어 듀플렉스에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있도록 하여 수행될 수 있다.
예를들어, 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하여 Angptl3 단백질의 발현을 정성적으로 또는 정량적으로 섬출할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 항체는 바람직하게는 검출가능한, 예를들어 형광성의 표지물이 장치되며, 결합은 광학현미경, 유세포분석 (flow cytometry), 형광측정법 (fluorimetry), 또는 본 기술분야에서 공지된 그밖의 다른 기술에 의해서 모니터될 수 있다. 이들 기술은 증폭된 유전자가 세포 표면 단백질, 예를들어 성장인자를 코드화하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합시험은 필수적으로 상기 항목 5에 기술된 바와 같이 수행된다.
Angptl3 단백질에 대한 항체 결합의 동일계 검출은 예를들어, 면역형광법 또는 면역전자현미경에 의해서 수행될 수 있다. 이러한 목적으로, 조직 검체를 환자로부터 떼어내고, 바람직하게는 생물학적 샘플상에 항체를 피복시킴으로써 표지된 항체를 검체에 적용한다. 이 방법은 또한, 검사된 조직에서 마커 유전자 생성물의 분포를 측정하는 것을 허용한다. 광범한 종류의 조직학적 방법을 동일계 검출에 용이하게 이용할 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
차등적 유전자 발현을 정량하기 위한 가장 민감하고 가장 융통성이 있는 방법중의 하나는 약물 치료의 존재 또는 부재하에서 다양한 샘플 집단, 정상 및 종양 조직에서의 mRNA 레벨을 비교하여 유전자 발현의 패턴을 특정화하고, 밀접하게 관련된 mRNAs를 구별하고, RNA 구조를 분석할 수 있는 RT-PCR이다.
제 1 단계는 표적 샘플로부터 mRNA를 분리하는 것이다. 출발물질은 일반적으로 질병 조직 및 상응하는 정상 조직으로부터 각각 분리된 총 RNA이다. 따라서, mRNA는 예를들어, 동일한 형태의 정상조직과의 비교를 위해서 질병에 걸린 조직의 동결되거나 자료화된 파라핀-매립되고 고정된 (예를들어, 포르말린-고정된) 샘플로부터 추출될 수 있다. mRNA 추출을 위한 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols of Molecula Biology, John Wiley and Sons (1997))을 포함한 분자생물학의 표준교과서에 기술되어 있다. 파라핀 매립된 조직으로부터 mRNA를 추출하는 방법은 예를들어, 문헌 (Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987) 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995))에 기술되어 있다. 특히, mRNA 분리는 퀴아겐 (Qiagen)과 같은 시판품 제조자로부터의 정제 키트, 완충제 셋트 및 프로테아제를 사용하여 제조자의 설명서에 따라서 수행될 수 있다. 예를들어, 배양물중의 세포로부터의 총 RNA는 퀴아겐 RNeasy 미니-칼럼 (Qiagen RNase mini-columns)을 사용하여 분리될 수 있다. 조직 샘플로부터의 총 RNA는 RNA Stat-60 (Tel-Test)을 사용하여 분리될 수 있다.
RNA는 PCR에 대한 주형으로 작용할 수 없기 때문에, RT-PCR에 의한 다양한 차등 유전자 발현분석에서 제 1 단계는 RNA 주형을 cDNA로 역전사시키고, 이어서 이것을 PCR 반응에서 지수적으로 증폭시키는 것이다. 두개의 가장 통상적으로 사용되는 역전사효소는 아빌로 골수아구증 바이러스 역전사효소 (avilo myeloblastosis virus reverse transcriptase; AMV-RT) 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase; MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 일반적으로 환경 및 발현 프로파일링 (profiling)의 목표에 따라서 특정의 프라이머 (primers), 랜덤 헥사머 (random hexamers), 또는 올리고-dT 프라이머 (oligo-dT primers)를 사용하여 준비된다. 예를들어, 추출된 RNA는 GeneAmp RNA PCR 키트 (Perkin Elmer, CA, USA)를 사용하여 제조자의 설명서에 따라서 역전사시킬 수 있다. 그후에, 유도된 cDNA를 후속 PCR 반응에서 주형으로 사용할 수 있다.
PCR 단계는 다양한 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있지만, 일반적으로는 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖지만 3'-5' 엔도뉴클레아제 활성은 결여된 Taq DNA 폴리머라제를 사용한다. 따라서, TaqMan PCR은 일반적으로 Taq 또는 Tth 폴리머라제의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하여 그의 표적 앰플리콘 (amplicon)에 결합된 하이브리드화 프로브를 하이브리드화시키지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 어떠한 효소라도 사용될 수 있다. 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 대표적인 앰플리콘 (amplicon)을 생성시킨다. 제 3의 올리고뉴클레오타이드 또는 프로브는 두개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 검출하도록 디자인된다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해서 연장될 수 없으며, 리포터 (reporter) 형광염료 및 켄처 (quencher) 형광염료로 표지된다. 두개의 염료가 이들이 프로브상에 있어서 서로 근접하게 위치하는 경우에 리포터 염료로부터의 레이저-유도된 방출은 켄칭 염료에 의해서 켄칭된다. 증폭반응중에, Taq DNA 폴리머라제 효소는 주형-의존적 방식으로 프로브를 분할한다. 생성된 프로브 단편은 용액중에서 해리하며, 유리된 리포터 염료로부터의 시그날은 제 2의 형광단의 켄칭효과를 받지 않는다. 리포터 염료의 하나의 분자는 각각의 합성된 새로운 분자에 대하여 유리되며, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다.
TaqMan RT-PCR은 예를들어, 아비 프리즘 7700 서열 검출 시스템 (ABI PRIZM 7700™ Sequence Detection System™; Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 또는 라이트사이클러 (Lightcycler; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)와 같은 시판품으로 이용할 수 있는 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 5' 뉴클레아제 공정은 아비 프리즘 7700 서열 검출 시스템 (ABI PRIZM 7700™ Sequence Detection System™)과 같은 실시간 정량적 PCR 장치상에 수행한다. 시스템은 열순환기 (htermocycler), 레이저, 전하-커플링 장치 (charge-coupled device; CCD), 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 시스템은 열순환기상의 96-웰 포맷 (format)에서 샘플을 증폭시킨다. 증폭중에, 레이저-유도된 형광성 시그날은 96 웰 모두에 대하여 광학섬유 케이블을 통해서 실시간으로 수집하고, CCD에서 검출된다. 시스템은 설비를 구동시키고 데이타를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5'-뉴클레아제 시험 데이타는 일차적으로 Ct 또는 역치 사이클 (threshold cycle)로 표현된다. 상기 언급한 바와 같이, 형광값은 매 사이클중에 기록하며, 증폭반응중의 그 시점에 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광시그날이 통계학적으로 유의적인 것으로 최초로 기록된 시점이 역치 사이클 (Ct)이다. ΔCt 값은, 질병이 있는 조직으로부터 유래하는 세포에서의 RNA의 발현을 정상세포로부터의 발현과 비교하는 경우에 핵산 샘플내의 특정한 표적 서열의 출발 카피의 상대적 수의 정량적 측정치로 사용된다.
오차 및 샘플-대-샘플 변화의 영향을 최소화하기 위해서, RT-PCR은 통상적으로 내부표준을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부표준은 다양한 조직중에서의 일정 레벨로 표현되며, 실험적 처리에 의해서 영향을 받지 않는다. 유전자 발현의 패턴을 정규화시키기 위해서 가장 빈번하게 사용되는 RNAs는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트-데하이드로게나제 (GAPDH) 및 β-액틴에 대한 mRNAs이다.
차등 유전자 발현은 또한 마이크로어레이 (microarray) 기술을 사용하여 동정되거나 확인될 수도 있다. 이 방법에서는, 해당 뉴클레오타이드 서열을 마이크로칩 기질 (microchip substrate) 상에 도포하거나 정렬시킨다. 그후에 정렬된 서열을 해당 세포 또는 조직으로부터의 특이적 DNA 프로브와 하이브리드화시킨다.
마이크로어레이 기술의 특정한 구체예에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입물은 밀집 어레이내의 기질에 적용된다. 바람직하게는 적어도 10,000개의 뉴클레오타이드 서열을 기질에 적용한다. 10,000개의 요소 각각에서 마이크로칩상에 고정된 마이크로어레이 적용된 유전자가 엄밀한 조건하에서 하이브리드화하는데 적합하다. 형광적으로 표지된 cDNA 프로브는 해당 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의해 형광성 뉴클레오타이드의 혼입을 통해서 생성될 수 있다. 칩상에 적용된 표지된 cDNA 프로브는 어레이상의 DNA의 각각의 스포트 (spot)에 대하여 특이적으로 하이브리드화한다. 엄밀하게 세척하여 비특이적으로 결합된 프로브를 제거한 후에 칩은 공초점 레이저 현미경 검사에 의해서 스캐닝한다. 각각의 어레이 적용된 요소의 하이브리드화의 정량분석은 상응하는 mRNA 풍부성의 평가를 가능하게 한다. 이중 색상 형광을 사용하여, RNA의 두개의 공급원으로부터 생성된 별도로 표지된 cDNA 프로브를 페어 (pair) 방식으로 어레이에 하이브리드화시킨다. 따라서, 각각의 구체화된 유전자에 상응하는 두개의 공급원으로부터의 전사물의 상대적 풍부성은 동시에 측정된다. 하이브리드화의 소형화된 스케일은 다수의 유전자에 대한 발현 패턴의 편리하며 신속한 평가를 제공한다. 이러한 방법은 세포당, 몇개의 카피수로 발현되는 희귀 전사물을 검출하고, 발현 레벨에서 적어도 대략 2배의 차이로 재현가능하게 검출하는데 필요한 감수성을 갖는 것으로 나타났다 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(20):106-49 (1996)). 핵산의 하이브리드화의 방법 및 마이크로어레이 기술은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
이하의 실시예는 단지 설명을 목적으로 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하고자하는 것은 아니다,
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 참고문헌들은 본 발명에 그대로 참고로 포함된다.
발명의 요약
본 발명은 Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직 손상을 치료하기 위하여 인간 Angptl3 서열에 대한 서열 동일성 (identity)을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드 또는 그의 작용제 (agonist)를 사용하는데 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조직 손상, 바람직하게는 간 또는 심장 조직 손상의 위험이 있는 인간 피검자의 치료 (예방 포함) 또는 확인시의 Angptl3의 용도에 관한 것이다. 따라서, Angptl3는 간 재생중의 혈관형성 과정을 조절하는데 연관되는 것으로 믿어진다.
본 발명은 SEQ ID NO: 2의 Angptl3 또는 그의 포유동물 동족체 (homologue)의 길항제로 조직을 치료하는 것을 포함하여 Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한가지 구체예에서, 이 치료는 예방 및, 더욱 특히는 조직 손상의 진행의 예방을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 조직은 바람직하게는 인간 간조직이다. 길항제는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2의 Angptl3의 길항제이다. 조직 손상은 바람직하게는 염증 또는 간종양과 연관된다. 염증은 바람직하게는 간경변증, 간섬유증, 만성 간염, 바이러스성 간염 A, B, C, D, E 및 G, 독성 대사성 간손상, 지방간, 간의 허혈성 재관류 손상 및 패혈증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 만성 간질환과 연관된다. 간경변증은 알콜성 간경변증 또는 원발성 담즙성 간경변증 (PBC)이다. 간염은 만성 자가면역 간염, 만성 알콜성 간염 및 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 간종양은 간세포암, 담관암 및 간의 전이성 암으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 조직은 바람직하게는 심장 조직이다. 조직 손상은 바람직하게는 염증과 연관된다. 조직 손상은 바람직하게는 Angptl3의 증가된 발현을 특징으로하는 심장 질환과 연관된다. 또 다른 관점에서, 조직 손상은 그의 병인론이 염증성 반응이거나 그의 발생시에 염증이 위험인자인 심장질환과 연관된다. 심장질환은 바람직하게는 관상동맥 질환, 심근증, 심근염, 울혈성심부전 (CHF) 및 심근경색으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 심근증은 바람직하게는 비-특이적 비대증 및 확장성 심근증으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 길항제는 항-Angptl3 항체, 항-αvβ3 항체, 면역유착 (immunoadhesion) 또는 소분자 (small molecule)이다. 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 단일쇄 항체이다. 모노클로날 항체는 바람직하게는 키메라성이거나, 인간화되거나, 인간의 것이다. 면역유착은 적어도 면역글로부린 서열에 융합된 αvβ3의 리간드-결합 부분을 포함하거나, 또는 적어도 면역글로부린 서열에 대해 사용된 Angptl3의 수용체-결합 부분을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 Angptl3 또는 그의 포유동물 동족체의 길항제의 유효량을 필요한 포유동물 피검체에게 투여하는 것을 포함하여 포유동물 피검체에게서 만성 간질환을 치료하는 방법을 포함한다. 하나의 구체예에서, 포유동물 피검체는 인간이다. 치료는 예방 및 더욱 특히는 간질환의 진행의 예방을 포함한다. 투여된 길항제는 SEQ ID NO: 2의 Angptl3의 길항제 또는 항체, 특히 항-Angptl3 항체 또는 항-αvβ3 항체이다. 만성 간은 Angptl3의 증가된 발현을 특징으로 한다. 간질환은 간경변증, 간섬유증, 만성 간염, 바이러스성 간염 A, B, C, D, E 및 G, 독성 대사성 간손상, 지방간, 간의 허혈성 재관류 손상 및 패혈증으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 Angptl3 또는 그의 포유동물 동족체의 길항제의 유효량을 피검체에게 투여하는 것을 포함하여 포유동물 피검체에게서 심장질환을 치료하는 방법을 포함한다. 하나의 구체예에서, 포유동물 피검체는 인간이다. 치료는 예방 및 더욱 특히는 심장질환의 진행의 예방을 포함한다. 투여된 길항제는 SEQ ID NO: 2의 Angptl3의 길항제이다. 심장질환은 관상동맥 질환, 심근증, 심근염, 울혈성심부전 (CHF) 및 심근경색으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 길항제는 항-Angptl3 항체 또는 항-αvβ3 항체이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 그의 작용제를 함유하는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 필요한 포유동물 피검체에게 투여하는 것을 포함하여 급성 간질환을 치료하는 방법을 포함한다. 하나의 구체예에서, 포유동물 피검체는 인간이다. 치료는 예방 및 더욱 특히는 급성 간질환의 진행의 예방을 포함한다. 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 서열에 대하여 98％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 그의 작용제를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 서열의 아미노산 부분 281-293 (P1, SEQ ID NO: 14), 442-460 (P2, SEQ ID NO: 15), 및 415-430 (P3, SEQ ID NO: 17)을 포함한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 서열의 피브리노겐 영역을 포함한다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 이 방법은 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 추가의 치료제는 혈관내피성장인자 (VEGF) 또는 섬유아세포 성장인자 (FGF)이다. 작용제는 Angptl3 또는 αvβ3을 특이적으로 결합시키는 작용제 항체이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 그의 작용제를 함유하는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 필요한 포유동물 피검체에게 투여하는 것을 포함하여 급성 간손상 이후에 간 재생을 유도하는 방법을 포함한다. 포유동물 피검체는 바람직하게는 인간이다. 인간 피검체는 만성, 알콜성 또는 바이러스성 간염, 패혈증, 원발성 담즙성 간경변증 (PBC) 또는 원발성 또는 전이성 간암과 같은 염증성 간질환으로 진단될 수 있거나, 간에 대한 화학적 또는 기계적 손상을 입었거나, 또는 만성 간염, 간경변증, 원발성 또는 전이성 간암 또는 방광암과 같은 어떠한 원인으로 인해서 간절제술을 시행하였다. 또 그 대신으로, 환자는 화학제, 또는 그밖의 환경적 또는 그밖의 다른 공지의 인자에 노출되어 간손상을 야기시키고, 이러한 손상이 발생되기 전에 치료될 수 있다. 예방적 치료는 특히 본 발명의 범주내에 포함된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 인간 Angptl3 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 그의 작용제를 함유하는 폴리펩타이드의 유효량으로 조직을 치료하는 것을 포함하여 조직에서 혈관형성을 유도하는 방법을 포함한다. 하나의 구체예에서, 조직은 심장 조직 또는 감염성 또는 자가면역 과정, 기계적 또는 화학적 손상 또는 암 또는 전이성 암의 결과로 손상을 입은 병이 든 간 조직일 수 있는 간 조직이다. 예방적 치료 및 더욱 특히는 질병의 진행의 예방은 특히 본 발명의 범주내에 포함된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 Angptl3 또는 그의 포유동물 동족체의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하여 조직에서 혈관 투과성의 원치않는 증가를 억제하는 방법을 포함한다. 혈관 투과성의 증가는 조직 손상에 따른 소혈관의 투과성에서의 증가일 수 있거나, 독소에 노출시킴에 의한 혈관내피의 괴사를 수행할 수 있다. 증가된 혈관 투과성은 염증, 바람직하게는 만성 염증과 연관된다. 조직은 간 조직 또는 심장 조직이다. 예방적 치료 및 더욱 구체적으로 질병의 진행의 예방은 특히 본 발명의 범주내에 포함된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 심혈관 질환의 위험이 있는 인간 피검체를 바람직하게는 심각한 손상이 일어나기 전에 확인하는 방법을 포함한다. 이 방법은 정상 심장 조직내의 Angptl3 또는 그의 발현생성물의 레벨에 대비하고 피검체의 심장 조직내의 Angptl3 또는 그의 발현생성물의 레벨에 대비하여 피검체의 심장 조직내에서 Angptl3 mRNA 또는 그의 발현생성물의 레벨을 측정하고, 피검체의 심장 조직내의 Angptl3 mRNA 또는 그의 발현생성물의 레벨이 정상 심장 조직에 비해서 증가하였다면 피검체가 위험이 있는 것으로 확인하는 단계를 포함한다. 심장 조직 샘플은 심혈관 질환의 위험이 의심되는 피검체로부터, 바람직하게는 인간 환자로부터 채취될 수 있으며, 차등 유전자 발현분석 (differential gene expression analysis)에 적용하여 위험이 있는 심장 조직 샘플에서의 Angptl3의 발현을 정상 심장 조직으로부터 채취된 제 2의 심장 샘플에서의 발현과 비교하여 SEQ ID NO: 1의 인간 Angptl3 유전자의 상향조절을 검출할 수 있다. 차등 유전자 발현분석은 노던 블럿팅 (northern blotting), 동일계 하이브리드화 (in situ hybridization), 역전사 폴리머라제 연쇄반응 (RT-PCR)을 포함하는 공지의 기술에 의해서, 또는 마이크로어레이 (microarray) 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 간 손상의 위험이 있는 인간 피검체를 바람직하게는 심각한 손상이 일어나기 전에 확인하는 방법을 포함한다. 이 방법은 정상 간 조직내의 Angptl3 또는 그의 발현생성물의 레벨에 대비하여 피검체의 간 조직내에서 Angptl3 mRNA 또는 그의 발현생성물의 레벨을 측정하고, 피검체의 간 조직내의 Angptl3 mRNA 또는 그의 발현생성물의 레벨이 정상 간 조직에 비해서 증가하였다면 피검체가 위험이 있는 것으로 확인하는 단계를 포함한다. 간 조직 샘플은 간 손상의 위험이 의심되는 피검체로부터, 바람직하게는 인간 환자로부터 채취될 수 있으며, 차등 유전자 발현분석 (differential gene expression analysis)에 적용하여 위험이 있는 간 샘플에서의 Angptl3의 발현을 정상 간 조직으로부터 채취된 제 2의 간 샘플에서의 발현과 비교하여 SEQ ID NO: 1의 인간 Angptl3 유전자의 상향조절을 검출할 수 있다. 차등 유전자 발현분석은 노던 블럿팅, 동일계 하이브리드화, 역전사 폴리머라제 연쇄반응 (RT-PCR)을 포함하는 공지의 기술에 의해서, 또는 마이크로어레이 (microarray) 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
모든 치료학적 적용 (예방 포함)시에, Angptl3 폴리펩타이드 또는 그의 작용제 또는 길항제는 추가의 혈관형성 인자, 예를들어 혈관내피성장인자 (VEGF) 또는 섬유아세포 성장인자 (FGF)와 같은 추가의 치료제와의 배합물로 투여될 수도 있다.
실시예에 언급된 시판품으로 이용할 수 있는 시약은 다른 식으로 지시되지 않는 한은 제조자의 설명에 따라 사용되었다. 이하의 실시예 및 명세서 전체에 걸쳐서 ATCC 수탁번호로 확인된 이들 세포의 공급원은 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA)이다.
실시예 1
Angptl3의 동정
Angptl3은 클론텍 래보래토리즈 (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA USA, catalog no. 64018-1)로부터 입수한 인간 태아 간 mRNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 문헌 ("Instruction Manual: Superscript™ Lambda System for cDNA Synthesis and λ cloning," cat. No. 19643-014, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)에 기술된 프로토콜에 따라서 동정되었다. 전체적인 절차는 다음의 단계들로 요약될 수 있다: (1) 제 1 스트랜드 합성; (2) 제 2 스트랜드 합성; (3) 어댑터 (adaptor) 첨가; (4) 효소적 분해; (5) cDNA의 겔 분리; (6) 벡터내로 연결 (ligation); 및 (7) 형질전환.
제 1 스트랜드 합성:
폴리 A+mRNA (7i l, 5i g)가 첨가된 멸균 1.5 ㎖ 미소원심분리관에 Not1 프라이머-어댑터 (Life Tech., 2 ㎕, 0.5 ㎍/㎕)를 첨가하였다. 반응관을 70℃로 5 분 동안, 또는 mRNA의 이차구조를 변성시키기에 충분한 시간 동안 가열하였다. 그후, 반응물을 얼음상에서 냉각시키고, 5×제 1 스트랜드 완충제 (Life Tech., 4i l), 0.1 M DTT (2i l) 및 10 mM dNTP Mix (Life Tech., 1 il)를 첨가한 다음에 37℃로 2 분 동안 가열하여 온도를 평형화시켰다. 그후, 슈퍼스크립트 II (Superscript II™) 역전사효소 (Life Tech, 5il)를 첨가하고, 반응관을 잘 혼합하여 37℃에서 1 시간 동안 배양하고, 얼음상에 배치시킴으로써 종결시켰다. 반응물의 최종 농도는 다음과 같았다: 50 mM 트리스-HCl (pH 8.3); 75 mM KCl;3 mM MgCl2; 10 mM DTT; 500 μM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각; 50 ig/㎖ Not1 프라이머-어댑터; 5 ig (250 ig/㎖) mRNA; 50,000 U/㎖ (250 ig/㎖) 슈퍼스크립트 II (Superscript II™) 역전사효소.
제 2 스트랜드 합성:
얼음상에서, 제 1 스트랜드 합성으로부터의 반응관에 다음의 시약들을 첨가하고, 반응물을 잘 혼합시키고, 온도가 16℃ 이상으로 되지 않도록 주의하면서 16℃에서 2 시간 동안 반응시켰다: 증류수 (93 il), 5×제 2 스트랜드 완충액 (30 il); dNTP 혼합물 (3 il); 10 U/i1 이. 콜라이 (E. coli) DNA 리가제 (1 il); 10 U/il 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (4 il); 2 U/il 이. 콜라이 RNase H (1 il). 10 U T4 DNA 폴리머라제 (2 il)를 첨가하고, 반응물을 추가로 5 분 동안 16℃에서 계속해서 배양하였다. 반응물의 최종 농도는 다음과 같았다: 25 mM 트리스-HCl (pH 7.5); 100 mM KCl; 5 mM MgCl2; 10 mM (NH4)2SO4; 0.15 mM β-NDA+; 250 iM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각; 1.2 mM DTT; 65 U/㎖ DNA 리가제; 250 U/㎖ DNA 폴리머라제 I; 13 U/㎖ Rnase H. 반응은 얼음상에 배치시키고, 0.5 M EDTA (10 il)를 첨가함으로써 정지시킨 다음에, 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1, 150 il)을 통해서 추출하였다. 수성상을 분리하고, 수집하여 5 M NaCl (15 il) 및 무수 에탄올 (-20℃, 400 il)로 희석하고, 2 분 동안 14,000×g으로 원심분리하였다. 생성된 DNA 펠릿으로부터 상등액을 주의해서 제거하고, 펠릿을 70％ 에탄올 (0.5 ㎖)에 재현탁시키고, 다시 2 분 동안 14,000×g으로 원심분리하였다. 상등액을 다시 제거하고, 펠릿은 스피드백 (speedvac)에서 건조시켰다.
어댑터 첨가:
상기의 제 2 스트랜드 합성으로부터 수득한 cDNA 펠릿에 다음의 시약들을 첨가하고, 반응물을 온화하게 혼합하여 16℃에서 16 시간 동안 배양하였다: 증류수 (25 il); 5×T4 DNA 리가제 완충액 (10 il); Sal I 어댑터 (10 il); T4 DNA 리가제 (5 il). 반응의 최종 조성은 다음과 같았다: 50 mM 트리스-HCl (pH 7.6); 10 mM MgCl2; 1 mM ATP; 5％ (w/v) PEG 8000; 1 mM DTT; 200 ig/㎖ Sal I 어댑터; 100 U/㎖ T4 DNA 리가제. 반응물을 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1, 50 il)을 통해서 추출하고, 수성상을 분리하여, 수집하고, 5 M NaCl (8 il) 및 무수 에탄올 (-20℃, 250 il)로 희석하였다. 그후, 이것을 20 분 동안 14,000×g으로 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠릿은 0.5 ㎖ 70％ 에탄올중에 재현탁시키고, 다시 2 분 동안 14,000×g으로 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 제거하고, 생성된 펠릿을 스피드백에서 건조시키고 다음 단계에 운반하였다.
효소적 분해:
전 단락으로부터 Sal I 어댑터를 사용하여 제조된 cDNA에 다음의 시약들을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다: DEPC-처리된 물 (41 il); Not1 제한 완충액 (REACT, Life Tech., 5 il), Not1 (4 il). 이 반응물의 최종 조성은 다음과 같았다: 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0); 10 mM MgCl2; 100 mM MaCl; 1,200 U/㎖ Not1.
cDNA의 겔 분리:
cDNA를 5％ 아크릴아미드 겔상에서 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 크기 분류하고, 분자량 마커와 비교하여 측정한 것으로서 1 Kb 보다 큰 모든 단편을 겔로부터 잘라내었다. 그후, cDNA를 겔로부터 0.1×TBE 완충액 (200 il)내로 전기용출시키고, 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1, 200 il)로 추출하였다. 수성상을 분리하여 수집하고, 20 분 동안 14,000×g으로 원심분리하였다. DNA 펠릿으로부터 상등액을 제거하고, 이 펠릿을 70％ 에탄올 (0.5 ㎖)에 재현탁시키고, 2 분 동안 14,000×g으로 다시 원심분리하였다. 상등액을 다시 버리고, 펠릿을 스피드백에서 건조시키고 증류수 (15 il)에 재현탁시켰다.
pRK5 벡터내로 cDNA의 연결:
다음의 시약들을 함께 첨가하고, 16℃에서 16 시간 동안 배양하였다: 5×T4 리가제 완충액 (3 il); pRK5 (Xhol, Notl 분해된 벡터, 0.5 ig, 1 il); 전 단락으로부터 제조된 cDNA (5 il); 및 증류수 (6 il). 이어서, 추가의 증류수 (70 il) 및 10 ㎎/㎖ tRNA를 첨가하고, 전체 반응물을 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1)을 통해서 추출하였다. 수성상을 분리하여 수집하고, 5 M NaCl (10 il) 및 무수 에탄올 (-20℃, 250 il)로 희석하였다. 그후, 이것을 20 분 동안 14,000×g으로 원심분리하고, 펠릿을 70％ 에탄올 (0.5 ㎖)에 재현탁시켜 2 분 동안 14,000×g으로 다시 원심분리하였다. 그후, DNA 펠릿을 스피드백에서 건조시키고, 후속 절차에서 사용하기 의해 증류수 (3 il)내로 용출시켰다.
박테리아내로 라이브러리 연결체의 형질전환:
미리 제조된 연결된 cDNA.pRK5 벡터 DNA를 얼음상에서 냉각시키고, 여기에 전기감응성 (electrocompetent) DH10B 박테리아 (Life Tech., 20 il)를 첨가하였다. 그후, 박테리아 벡터 혼합물을 제조자의 추천에 따라서 전기천공하였다. 이어서 SOC 배지 (1 ㎖)를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 그후, 형질전환체를 앰피실린을 함유하는 20 표준 150 ㎜ LB 플레이트상에 피복시켜 16 시간 동안 (37℃) 배양하여 콜로니가 성장하도록 하였다. 그후 양성 콜로니를 긁어내고, 표준 CsCl-구배 프로토콜을 사용하여 박테리아 펠릿으로부터 DNA를 분리하였다 (예를들어, Ausubel et al., 2.3.1).
Angptl3의 동정
Angptl3은 문헌 (Klein R.D. et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113 및 Jacobs (1996년 7월 16일에 허여된 미합중국 특허 제 5,563,637 호))에 보고된 방법을 포함하여 본 기술분야에서 공지된 표준방법에 의해서 인간 태아 간 라이브러리에서 동정할 수 있다. 문헌 (Klein et al. 및 Jacobs)에 따라, 신규의 분비되고 막-결합된 포유동물 단백질을 코드화한 cDNAs는 리포터 시스템으로서 효모 인버타제 유전자를 사용하여 이들의 분비성 리더서열 (secretory leader sequence)을 검출함으로써 동정한다. 효소 인버타제는 슈크로즈를 글루코즈 및 프럭토즈로 파괴시키고, 라피노즈를 슈크로즈 및 멜리비오즈로 파괴하는 반응을 촉진시킨다. 분비된 인버타제를 생산할 수 없는 효모 세포는 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 슈크로즈를 함유하는 배지상에서는 빈약하게 성장하기 때문에, 인버타제의 분비된 형태는 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에 의한 슈크로즈의 이용을 위해서 요구된다. 클라인 (Klein R.D., 상기 참조)과 야콥스 (Jacobs, 상기 참조) 둘다는 효모 인버타제의 천연 시그날 서열을 기능적으로 치환시키는 포유동물 시그날 서열의 공지된 능력을 이용한다. 포유동물 cDNA 라이브러리는 비분비된 효모 인버타제를 코드화한 DNA에 연결되며, 연결된 DNA는 분리하여 인버타제 유전자를 함유하지 않는 효모 세포내로 형질전환된다. 포유동물 시그날 서열에 연결된 비분비된 효모 인버타제 유전자를 함유하는 재조합체는 탄소 공급원으로서 슈크로즈 만을 함유하거나, 라피노즈 만을 함유하는 배지상에서 성장하는 그들의 능력을 기초로하여 동정된다. 그후, 동정된 포유동물 시그날 서열을 사용하여 상응하는 분비된 단백질을 코드화한 전장 클론을 분리시키기 위한 제 2의 전장 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 클로닝은 예를들어, 발현 클로닝에 의해서, 또는 본 기술분야에서 공지된 그밖의 다른 기술에 의해서 수행될 수도 있다.
Angptl3의 동정을 위해서 사용된 프라이머는 다음과 같다:
OLI114 CCACGTTGGCTTGAAATTGA (SEQ ID NO: 3)
OLI115 CCTCCAGAATTGATCAAGACAATTCATGATTTGATTCTCTATCTCCAGAG (SEQ ID NO: 4)
OLI116 TCGTCTAACATAGCAAATC (SEQ ID NO: 5)
Angptl3의 뉴클레오타이드 서열은 도 1 (SEQ ID NO: 1)에 나타내었으며, 그의 아미노산 서열은 도 2A 및 2B (SEQ ID NO: 2)에 나타내었다. Angptl3은 TIE-2 수용체의 두개의 공지의 인간 리간드 (h-TIE2L1 및 h-TIE2L2) 및 인간 안지오포이에틴 1,2 및 4 (ANG1, ANG2, ANG4, 도 5C)과 높은 정도의 서열 상동성을 나타내는 피브리노겐-유사 영역 (도 3A 및 도 5A-C)을 함유한다.
Angptl3의 클론은 부다페스트 협약 (Budapest Treaty)의 조건하에서 1997년 9월 18일에 ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852)에 기탁되었으며, 수탁번호 ATCC 209281로 지정되었다.
실시예 2
Angptl3의 발현
인간 Angptl3을 진핵성 발현벡터 pRK5tkNEO 및 파밍겐 (PharMingen, CA)으로부터 구입한 pVL1393의 유도체인 바큘로바이러스 벡터 pHIF내에서 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 리포펙틴 (Lipofectin)(GIBCO-BRL, MD)을 사용하여 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; "Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)내에 바큘로골드 (BaculoGold™) DNA (PharMingen, CA)와 함께 공형질감염시켰다. 4 일 후에, 세포를 수확하고, 상등액을 사용하여 2×106 Sf9 세포를 감염시켰으며, 바큘로바이러스를 증폭시켰다. 증폭시킨지 72 시간 후에, 세포를 수확하고, 상등액 10 ㎖를 사용하여 40 시간 동안 7.5×105 H5 세포/㎖를 감염시켰다. 수확하고, 0.45 ㎛ 셀룰로즈 아세테이트 필터를 통해서 여과한 후에, 상등액을 정제하였다. 마우스 Angptl3은 대규모 일시적 형질감염 실험에서 챠이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포내에서 과발현시켰다. 인간 Angptl3은 면역친화성 크로마토그라피를 이용하여, 현탁액내에서 성장한 바큘로바이러스-감염된 곤충세포의 상등액으로부터 정제되었다. 칼럼은 글리코페이스 (glycophase)-CPG (controlled pore glass)에 항-gD Fab를 커플링시킴으로써 생성되었다. 청정화된 (1000×g 5 분, 그 이후에 0.2 ㎛ 여과됨) 배지를 4℃에서 밤새 부하시켰다. 칼럼을 용출액의 280 ㎚에서의 흡광도가 기준선으로 복귀될 때까지 PBS로 세척하고, pH 3.0에서 50 mM Na 시트레이트로 용출시켰다. 용출된 단백질을 1 mM HCl에 대하여 투석하고 (Spectra-pore; MWCO 10,000), -70℃에서 동결시켰다. 마우스 Angptl3을 함유하는 일시적으로 발현된 CHO 배양물을 10,000 MWCO 막 (Amicon)을 사용하여 청정화하고 농축시켰다. 이 용적을 인간 Angptl3에 대하여 전술한 바와 같이 글리코페이스-CPG 칼럼에 커플링된 항-gD Fab 상에 통과시켰다. 용출된 풀 (pool)을 10 mM Na 아세테이트 (pH 5.0)에 의해서 < 5 mS의 전도도로 희석하고, S 세파로즈 패스트 플로우 (S Sepharose Fast Flow)(Amersham Pharmacia Biotech, NJ) 상에 부하시켰다. 칼럼을 용출액의 280 ㎚에서의 흡광도가 기준선으로 복귀될 때까지 10 mM Na 아세테이트 pH 5.0으로 세척하고, 10 mM Na 아세테이트 pH 5.0 중의 20 칼럼 용적 구배 0-0.5 M NaCl로 용출시켰다. 0.45 M-0.5 M NaCl로 용출된 마우스 Angptl3을 함유하는 분획을 역상 C-4 크로마토그라피 (Vydac, CA)를 이용하여 더 정제하였다. 분획들을 0.1％ 트리플루오로아세트산 구배로 산성화시켰다. 67％ 아세토니트릴로 용출된 마우스 mAngptl3을 동결건조시키고 -70℃에서 저장하였다. 정제된 단백질의 동정은 N-말단 서열분석에 의해서 입증되었다. LPS 농도는 시판 키트를 사용하여 증명되었으며, 인간 또는 쥐 Angptl3 제제 모두에 대하여 < 5 Eu/㎖인 것으로 결정되었다.
실시예 3
Angptl3을 결합시키는 항체의 제조
본 실시예는 Angptl3을 특이적으로 결합시키는 모노클로날 항체의 제조를 설명하는 것이다.
모노클로날 항체를 생산하는 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를들어 문헌 (Goding, 상기 참조)에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 면역원에는 본 발명의 정제된 리간드 동족체, 이러한 리간드 동족체를 함유하는 융합단백질, 및 세포 표면상에서 재조합 리간드 동족체를 발현하는 세포가 포함된다. 면역원의 선택은 과도한 실험이 없이 숙련된 기술자에 의해서 이루어질 수 있다.
Balb/c와 같은 마우스를 완전 프로인트 아쥬번트 (complete Freund's adjivant)내에 유화된 면역원으로 면역시키고, 1-100 마이크로그램의 양으로 피하 또는 복강내로 주사하였다. 또 다른 방법으로, 면역원은 MPL-TDM 아쥬번트 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)내에 유화시키고, 동물의 뒷발바닥에 주사하였다. 그후, 면역된 마우스를 선택된 아쥬번트내에 유화된 추가의 면역원으로 10 내지 12 일후에 추가자극하였다. 그후에, 몇주일 동안 마우스는 또한 추가의 면역화 주사로 추가자극할 수도 있다. 혈청 샘플은 항체를 검출하기 위해서 ELISA 검정방법을 시험하기 위한 안와후방 출혈에 의해 마우스로부터 주기적으로 수득할 수 있다.
적합한 항체 역가를 검출한 후에, 항체에 대해서 "양성 (positive)"인 동물에게 소정의 리간드를 최종 정맥내 주사에 의하여 주입할 수 있다. 3 내지 4 일 후에, 마우스를 치사시키고, 비장세포를 수확한다. 그후, 비장세포를 (35％ 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) ATCC No. CRL 1597로 이용할 수 있는 P3X63AgU.1과 같은 선택된 쥐의 골수종 세포 라인에 대해 융합시킨다. 융합은 하이브리도마 세포를 생성시키며, 그후에 이것을 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직배양 플레이트내에 피복시켜 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제한다.
하이브리도마 세포는 항원에 대한 반응성에 대하여 ELISA에서 스크리닝할 수 있다. 본 발명에서 TIE 리간드 동족체에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 본 기술분야에서의 숙련된 기술의 범위내이다.
양성 하이브리도마 세포를 유전적 동계 (syngeneic)의 Balb/c 마우스에게 복강내 주사하여 항-TIE-리간드 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 생산할 수 있다. 대체방식으로, 하이브리도마 세포는 조직배양 플라스크 또는 롤러병 (roller bottle)내에서 성장시킬 수도 있다. 복수내에서 생산된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전을 사용하고, 이어서 겔 배제 크로마토그라피를 수행함으로써 성취될 수 있다. 대체방식으로, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합을 기본으로하는 친화성 크로마토그라피가 사용될 수도 있다.
실시예 4
내피세포 결합
안지오포이에틴은 그들의 N-말단 피브리노겐 (FBN)-유사 영역을 통해서 내피세포 특이적 티로신 키나제 수용체 Tie2에 결함함으로써 혈관형성을 조절하는 분비된 인자이다. 이 부류의 분비된 리간드에 존재하는 C-말단 코일드-코일 (coiled-coil) 영역이 리간드 올리고머화에 필요한 것으로 확인되었다 (Procopio et al., J. Biol. Chem. 274:30196-201 (1999)).
안지오포이에틴과 유사하게, Angptl3은 N-말단 시그날 펩타이드에 이어서 코일드-코일 영역 및 C-말단 FBN-유사 영역으로 구성되는 분비된 당단백질이다 (도 3A).
Angptl3과 안지오포이에틴의 구조적 유사성으로 인하여, Angptl3은 배양물중에서 Tie2 수용체를 발현하는 일차 내피세포에 결합하는 능력에 대하여 시험하였다. 셀시스템 (Cell System; Kirkland, WA)으로부터 구입하는 것으로 공급자에 의한 추천에 따라 10％ 소태자혈청 및 미토겐을 함유하는 CS-C 완전배지내에서 유지되는 인간 미소혈관 내피세포 (HMVECs)를 Tie2 리간드 안지오포이에틴 1 및 2 (Ang1 및 Ang2) 및 안지오포이에틴 관련된 단백질 1 (ARP1)각각의 (gD)-태그된 버젼을 발현하는 일시적으로 형질감염된 293 세포로부터 조절된 배지와 함께 배양하였다. ARP1은 코일드-코일 및 피브리노겐-유사 영역으로 구성되지만 Tie2를 결합시킬 수 없는 구조적으로 관련된 분바이며, 음성 대조군으로 사용되었다. 도 3B에서 보는 바와 같이, Ang2 및 Angptl3은 ARP1에 대한 결합이 관찰되지 않는 조건하에서 HMVEC에 강력하게 결합하였다. 이들 발견내용은 내피세포에 대한 Angptl3의 결합이 특이적인 것을 입증하였으며, Angptl3의 결합을 매개하는 내피세포상의 수용체의 존재를 의미하는 것이었다.
안지오포이에틴 1, 2 및 3 (Ang1, Ang2 및 Ang3)에 대한 수용체인 Tie2 또는 Tie2에 대하여 높은 서열 상동성을 갖는 오르판 (orphan) 수용체인 Tie1이 Angptl3에 결합하는지 여부를 시험하기 위하여, Tie1 및 Tie2 각각에 대한 전장 수용체 작제물과 함께 Ang1 및 Ang2, Angptl3 및 ARP1의 에피토프 (gD)-태그된 버젼을 위한 발현벡터로 일시적으로 형질감염된 293 세포를 사용하여 면역침강 실험이 수행되었다. 전체 세포 추출물은 새로 첨가된 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액 (1×PBS; 1％ NP40; 0.5％ 나트륨 데옥시콜레이트; 0.1％ SDS; PMSF 100 ㎍/㎖; 아프로티닌 30 ㎕/㎖; 나트륨 오르토바나데이트 1 μM)내에서 용해시킴으로써 제조되었다. 추출물을 Tie1 또는 Tie2 (Santa Curz Biotechnology, San Diego, CA)에 대해 특이적인 항체와 함께 배양하고, 생성된 면역침강물을 SDS-PAGE 및 면역블럿팅 (immunoblotting)에 의해서 분석하였다. 구체적으로, SDS-PAGE에 의해서 분할되고 PVDF 막에 대해 블럿팅된 단백질을 gD 태그 또는 Tie 수용체 각각에 대한 항체와 함께 배양하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, Tie1 및 Tie2는 Ang1 및 Ang2에 대한 Tie2 결합을 허용하는 실험적 조건에서 Angptl3을 결합시키지 않았다. 이들 발견사항은 Angptl3이 Tie2에 대한 리간드도, Tie1에 대한 리간드도 아님을 입증하는 것이었으며, 세포 결합시험에서 관찰된 강력한 결합을 매개하는 내피세포상의 다른 수용체의 존재를 시사하였다.
흥미롭게도, "종양-유사" 조건을 모사한 저산소증 또는 VEGF에 세포를 노출시키면 Angptl3의 결합은 유의적으로 증가하였다 (데이타는 도시되지 않음). 이들 조건은 이미 내피세포상에서의 인테그린 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌으며 (Suzuma et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39:1028-35 (1999)), 그 반면에 Tie1 및 Tie2 수용체 레벨은 변화되는 것으로 나타나지 않았다 (Mandriota and Pepper, Circ. Res. 83:852-9 (1998) 및 Oh et al., J. Biol. Chem. 274:15732-9 (1999)).
실시예 5
FBN-Angptl3의 분자 모델링
Angptl3의 FBN-유사 영역은 인간 피브리노겐의 γ쇄의 C-말단과 39.6％ 서열 동일성을 갖는다. Angptl3이 내피세포에 결합하는 생물학적 기능 및 분자 메카니즘을 조사하기 위하여, Angptl3의 FBN-유사 영역의 동물 모델은 FBN 영역에 대한 X-선 결정학 및 상동성 모델링 기술에 의해서 제공된 구조정보를 이용하여 성립되었다. FBN 영역은 이하의 3개의 잘 정의된 영역으로 구성된 독특한 주름 (fold)을 갖는다: 짧은 나선에 의해서 측면에 인접하는 두개의 스트랜드화 역평형 β-시트에 의해서 형성된 N 말단 영역; 두개의 짧은 나선을 갖는 5-스트랜드화 역평행 β-시트 및 그의 표면중의 하나에 대향하여 정렬된 헤어핀 루프 (hairpin loop)에 의해서 형성된 중앙 영역; 및 주로 루프로 구성된 제 3 영역 (도 5B).
FBN-Angptl3 모델을 성립시키기 위해서, FBN-Angptl3 서열과 몇개의 FBN 영역 구조 사이의 서열-구조 정렬은 clustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22:4673-80 (1994)) 및 스레딩 (threading)(ProCeryon Biosciences Inc.)을 사용하여 수행되었다. 이 정렬로부터 3FB (PBD 코드)를 모델 구성을 위한 주형 구조로 선택하였다. 프로그램인 프로체크 (PROCHECK)(Laskowski et al., J. Biomol. NMR 8:477-86 (1996))를 사용하여 PDB내에 침착된 구조의 참고 데이타베이스와 비교하는 경우에 평균 입체화학적 품질 이상인 모델의 기하학적 품질을 평가하였다. 최종 FBN-Angptl3 모델은 주형과 비교하는 경우에 모든 Cα원자에 대하여 1.95 Å의 r.m.s.d.를 가졌다. FBN 영역의 전반적인 주름은 FBN-Angptl3내에서 보존되며, 단 아미노산 위치 220-224, 289-306 및 357-363의 루프 부분에서 약간의 차이가 있다 (도 5A 및 B).
인간 피브리노겐 감마쇄에 대한 연구로 백혈구상에서 주로 발현되는 인테그린인 인테그린 αMβ2에 대한 결합에 연루된 두개의 부분이 확인되었다 (Ugarova et al., J. Biol. Chem. 273:22519-27 (1998)). 선형 아미노산 서열의 관점에서 분리된 두가지 부분은 FBN 영역의 삼차원적 구조에서 두개의 인접한 역평형 β-스트랜드를 형성한다 (P1, 잔기 190-202; P2, 잔기 377-395). 피브리노겐 감마쇄 (P3, 346-358) 및 테나신-C 내의 상이한 부분도 또한 인테그린 αvβ3에 대한 결합에 연루되는 것으로 밝혀졌다 (Yokoyama et al., J. Biol. Chem. 275:16891-8 (2000)). 본 발명의 FBN-Angptl3 모델 및 인간 피브리노겐 감마쇄의 FBN 영역은 이들 부분 (P1: 38-50; P2: 199-214; P3: 346-361)(도 5A)에서 높은 정도의 구조적 유사성을 가지며, 여기에서 넘버링은 3FIB (PDB 코드)의 넘버링에 따른다. Angptl3 (SEQ ID NO: 2)의 아미노산 넘버링에 따라서, P1은 성숙 단백질 아미노산 서열에서 아미노산 281-293 (SEQ ID NO: 14)에 상응하며; P2는 아미노산 442-460 (SEQ ID NO: 15)에 상응하고; P3는 아미노산 415-430 (SEQ ID NO: 17)에 상응한다.
Angptl3의 FBN-유사 영역내의 부분이 결합의 원인이 되었는지 여부의 가설을 시험하기 위해서, 몇가지 펩타이드를 디자인하여 합성하였다 (표 2). P3 서열은 상이한 영역들 사이에서 가장 구조적 다양성을 갖는 부분을 코드화한다. 동일한 부분으로부터 유도된 몇가지 스크램블되고 전화된 펩타이드를 대조 펩타이드로 사용하였다 (표 2). 아미노-말단 gD 에피토프로 태그된 재조합 인간 Angptl3 단백질은 실시예 2에 기술한 바와 같이 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성되었다 (도 6A).
재조합 Angptl3의 글리코실화 상태는 제조자의 설명 (New England Biolabs, MA)에 따르는 PNGase-F 처리에 의해서 측정되었다. 정제된 단백질 (50 ng)을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 (10％ 트리스-글리신, Invitrogen, CA)을 통해서 전기영동하고, 표준방법을 사용하여 니트로셀룰로즈 막 (Invitrogen, CA)에 전기이동시켰다. 막을 PBS중의 5％ w/v 인스탄트 무지방 분유 (instant nonfat milk powder) 중에서 배양하여 차단시키고, 차단 완충액중의 1 ㎍/㎖ 모노클로날 항-gD (클론 5B6.K6)와 함깨 4℃에서 밤새 배양하였다. 막을 PBS/0.05％ 트윈 (Tween) 20으로 세척하고, 이어서 실온에서 1 시간 동안, 호스래디쉬 퍼옥시다제-커플링된 당나귀 항-마우스 항체 (horseradish peroxidase-coupled donkey anti-mouse antibodies)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA)와 함께 배양하였다. Angptl3 단백질은 제조자의 프로토콜 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ)에 따라 화학발광 검출에 의해서 가시화시켰다. 면역침강, 일시적 형질감염 및 FACS 분석은 전술한 바와 같이 수행되었다 (Klein et al., Nature 387:717-21 (1997)).
PNGase와의 배양시에 Angptl3 밴드의 이동성에 있어서의 감소는 재조합 단백질이 글리코실화되었음을 시사하였다 (도 6C). 유사한 관찰은 안지오포이에틴에 대해서도 이미 이루어졌었다. 도 7A에서 입증되는 바와 같이, 유착시험에 대한 3 가지 펩타이드 모두의 첨가는 Angptl3에 대한 내피세포의 결합을 완전히 차단하였다. 인테그린 αvβ3은 RGD 유착성 서열의 관점에서 그의 리간드중의 몇가지를 인식할 수 있다. Angptl3의 피브리노겐-유사 영역이 이러한 RGD 서열을 코드화하지 않는다는 본 발명자들의 관찰을 지지하는 것으로, RGD 펩타이드의 첨가는 HMVEC 유착을 단지 부분적으로 파괴시키는 반면에, RGE-펩타이드는 효과를 갖지 않았다. 이 결과는 αvβ3과 Angptl3 상호작용의 단지 일부분이 RGD-의존적 방식으로 매개된다는 것을 시사하였다. 결과적으로, 이들 데이타는 Angptl3의 FBN-유사 영역내의 3개의 부분은 모두 수용체 결합부위의 일부분임을 시사한다.
명칭 서열 SEQ ID NO
NL6_P1* PWTLIQHRIDGSQ 14
NL6_PP1 PWTLIQHRIDGSQ 14
NL6_P2* YSIKSTKMLIHPTDSESFE 15
NL6_PP2 YSIKSTKMLIHPTDSES 16
NL6_P3* GKYNKPRAKSKPERRR 17
NL6_PP3 GKYNKPRAKSKPER 18
NL6_P32 GKYNKPRAKSKPE 19
대조 펩타이드 명칭 서열 SEQ ID NO
NL6_PP1_inv QSGDIRHQILTWP 20
NL6_PP1_src PQWSTGLDIIQRH 21
NL6_PP2_inv SESDTPHILMKTSKISY 22
NL6_PP2_src YSSEISKDSTTPKHMIL 23
NL6_PP3_inv REPKSKARPKNYKG 24
NL6_PP3_src GRKEYPNKKSPKRA 25
FBG_P1 GWTVFQKRLDGSV 26
FBG_P2 YSMKKTTMKIIPFNRL 10
FBG_P3 GVYYQGGTYSKAS 12
실시예 6
세포유착시험
A. Angptl3 세포유착을 매개하는 인테그린의 동정
Angptl3에 결합하는 잠재적 인테그린을 동정하기 위하여, 재조합 Angptl3 단백질을 4℃에서 밤새 96-웰 편평-바닥 미량역가 플레이트 (flat-bottomed microtiter plate)상에 피복시키고, PBS 중의 100 ㎍/㎖ BSA로 37℃에서 1 시간 동안 차단시켰다. IIbIIIa (αIIBβ3), αvβ3, αvβ1 및 αvβ5를 포함하여 다양한 인테그린 헤테로다이머 (heterodimers)로 안정적으로 형질감염된 다양한 293 세포 라인을 Angptl3 피복된 플레이트를 결합시키는 그들의 능력에 관하여 시험하였다. 세포를 수확하고, 1％ BSA, 1 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2를 함유하는 혈청-비함유 CS-C 배지내에서 105 세포/㎖로 희석하였다. 세포를 차단 항체 (blocking antibody) 또는 펩타이드의 존재 또는 부재하에, 37℃에서 15 분 동안 전배양하고, 그후에 200 nM PMA로 자극하였다. 세포 현탁액 (104 세포/㎖)을 피복된 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 선택된 시간 동안 배양하였다. 비-유착된 세포를 PBS 세척에 의해서 제거하고, 세포 부착은 랜드그린 (Lanndegren)의 PNAG 방법 (Landegren, U., J. Immunol. Methods, 67:379-388 (1984))을 사용하여 측정하였다. 결과는 3 개의 웰의 평균 OD405 값으로 나타낸다.
시험한 안정한 세포 라인중에서, αvβ3를 발현하는 세포는 다른 세포 라인에 비해서 Angptl3에 대한 유착에서 현저한 증가를 나타내었다 (도 7B). 따라서, 이들 결과는 재조합 인간 Angptl3이 αvβ3 인테그린에 특이적으로 결합하는 것을 입증한다. 이것은 저산소증 및 VEGF에 노출된 내피세포가 Angptl3에 더 효과적으로 결합하였다는 이전의 관찰결과와 일치한다.
B. αvβ3에 의한 Angptl3 세포유착의 매개
인테그린은 그들의 리간에 의해서 활성화되면 세포유착 및 이동과 같은 생물학적 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 실험은 Angptl3이 일차 인간 내피세포에 대해 이러한 효과를 나타내는지 여부 및 αvβ3가 이들 반응을 매개하는데 충분하였는지 여부를 시험하도록 디자인되었다. 내피세포 유착시험으로 시험하였을 때, Angptl3은 배양한지 4 시간 이내에 로부스트 (robust) 용량-의존적 유착을 유도하였다 (도 7C). 관찰된 레벨은 세포를 αvβ3에 대한 프로토타입 리간드 (prototypic ligand)인 비트로넥틴상에 피복시킨 경우에 수득된 레벨과 동등하였다 (데이타는 나타내지 않음).
αvβ3 인테그린이 Angptl3 세포유착을 매개하는데 충분하였는지 여부를 측정하기 위하여, 차단 항체 또는 억제성 펩타이드를 세포유착시험에서 유착을 억제하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 기능차단 항체는 Angptl3-피복된 웰과 함께 배양하기 전에 내피세포에 첨가하였다. α5β1 또는 αvβ5에 대한 기능차단 항체의 존재는 Angptl3 (20 ㎍/㎖)으로 피복된 배양접시에 대한 HMVECs의 유착을 손상시키지 않았지만, αvβ3 특이적 항체는 유착을 완전히 차단하였다 (도 7D). 일반적 대조군으로는, 그들의 리간드에 결합하는 인테그린을 파괴하는 EDTA (10 mM)를 결합실험에 첨가하였다. 도 7D에서 보는 바와 같이, 2가 양이온에 대한 인테그린 의존성의 저해는 내피세포 유착을 완전히 파괴시켰다.
실시예 7
세포 이동시험 (Cell Migration Assay)
내피세포에 대한 인테그린 활성의 또 다른 특질은 리간드 자극에 대한 그들의 이동반응 (migratory response)이기 때문에, 내피세포의 이동의 유도에 대한 Angptl3의 효과를 시험하기 위해서 이동시험이 개발되었다.
Angptl3은 문헌 (T.V. Bryzova et al., Exp. Cell Res., 254:299-308 (2000))에 기술된 이동시험에서 시험하였다. 이동시험은 8 ㎛ 공극 크기를 갖는 HTS 멀티웰 조직배양 삽입물 (HTS Multiwell tissue culture inserts) (Becton Dickinson, NJ)을 이용한다. Angptl3 단백질을 PBS 중에서 50 ng/㎕로 희석하고, 막필터의 표면을 밑칠하는데 사용하였다. 3％ BSA/PBS로 전코팅한 후에, 필터를 500 ㎕ 혈청-비함유 CS-C 배지, 1％ BSA, 1mM CaCl2 내에 배치시켰다. HMVECs를 PBS로 3회 세척하고, 수확하여 상술한 바와 같이 보충된 혈청-비함유 배지내에 105 세포/㎖로 현탁시켰다. 세포를 PMA (200 nM)로 자극하기 전에 차단 항체 (25 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에 37℃에서 15 분 동안 전배양하였다. 세포 현탁액 (250 ㎕)을 상부 챔버에 첨가하고, 세포를 5％ CO2 가습배양기내의 37℃에서 밤새 이동하도록 하였다. 배양한 후에, 상부 웰에 잔류하는 세포를 면봉 (swab)을 사용하여 제거하고, 막의 하부 표면으로 이동한 세포를 메탄올로 고정시키고 YO-PRO-1 요오다이드 (분자 프로브)로 염색하였다. 이동 결과는 오픈랩 (Openlab) 소프트웨어 (Improvision, MA)를 사용하여 세포의 평균수/현미경 시야로 정량화하였다.
내피세포에 대해서 Angptl3을 16 내지 20 시간 노출시킨 후에, BSA 대조처리군에 비해서 세포 이동에 있어서 2.5 배의 증가가 관찰되었다 (도 7E). 가장 중요하게는, 이러한 이동은 αvβ3에 대한 길항적 항체를 투여함으로써 차단되었지만, 다른 인테그린을 차단하는 대조 항체에 의해서는 차단되지 않았다. 결론적으로, Angptl3은 일차 인간 내피세포의 이동을 강력하게 유도하며, 두가지 활성은 모두 αvβ3에 대한 길항적 항체에 의해서 차단되었다.
실시예 8
Angptl3의 조직 발현
A. 동일계 하이브리드화 (In situ hybridization)
동일계 하이브리드화는 전술한 바와 같이 수행되었다 (Lu, Cell Vision 1:169-176 (1994)). PCR 프라이머로는
상부: 5' T7 프로모터: GGATTCTAATACGACTCACT ATAGGGC (SEQ ID NO: 6) + GGCATTCCTGCTGAATGTACC (hAngptl3 특이적 서열, SEQ ID NO: 7) 3' 및 하부: 5' T3 프로모터: CTATGAAATT AACCCTCACTAAAGGGA (SEQ ID NO: 8) + ACCACACTCATCATGCCACCA (hAngptl3 특이적 서열, SEQ ID NO: 9) 3'가 인간 Angptl3의 506-bp 단편을 증폭시키기 위해서 디자인되었으며,
상부: 5' T7 프로모터: GGATTCTAATACGACTCACTATCGGGA (SEQ ID NO: 6) + 5' GATGACCTTCCTGCCGACTG (mAngptl3 특이적 서열, SEQ ID NO: 11) 3' 및 하부: T3 프로모터: CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGA (SEQ ID NO: 8) + 5' GTCATTCCACCACCAGCCA (mAngptl3 특이적 서열, SEQ ID NO: 13). 프라이머는 증폭된 생성물로부터 센스 또는 안티센스 리보프로브 (riboprobes) 각각의 시험관내 전사가 이루어지도록 27 뉴클레오타이드 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제 개시부위를 코드화한 연장부를 포함하였다. 5 ㎛ 두께의 인간 조직 절편을 파라핀제거하고, 20 ㎍/㎖ 프로테이나제 K 중의 37℃에서 15 분 동안 제단백하고, 2 ×SSC로 세정하여 에탄올의 구배농도를 통해 탈수시킨 다음에, 1-4 시간 동안 전하이브리드화 완충액중에서 배양하였다. 마우스 조직을 4 ㎍/㎖ 프로테이나제 K중의 37℃에서 30 분 동안 분해시키고, 상술한 바와 같이 처리하였다. 33P-UTP-표지된 센스 및 안티센스 프로브는 55℃에서 밤새 절편에 대해 하이브리드화되었다. 비결합된 프로브를 20 ㎎/㎖ RNaseA 중에서 30 분 동안, 37℃로 배양하고, 이어서 55℃에서 0.1×SSC 중에서 2 시간 동안 고엄밀성 세척하고 에탄올의 구배농도를 통해서 탈수시킴으로써 제거하였다. 슬라이드를 NBT2 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion)(Eastman Kodak, NY)중에 침지시키고, 건조제를 함유하는 밀봉된 플라스틱 슬라이드 박스내에서 4 주일 동안 4℃로 노출시키고, 발색시키고, 헤마톡실린 및 에오신으로 대비염색하였다.
도 8C에서는 E15 및 E18 마우스 배자로부터의 배자 간의 절편에서 관찰된 간세포 특이적 발현을 나타내었다. 여기에서는 분석된 배자 절편내의 적혈구 선조, 내피세포 또는 거핵세포상에서 Angptl3의 발현은 없었다.
B. 노던 블럿 (Northern Blots)
성인 인간 조직에서의 Angptl3 발현을 연구하기 위해서, 다조직 (multi-tissue) 노던 블럿을 상술한 바와 같은 코드화 서열의 5' 말단을 덮는 방사성표지된 프로브로 프로브 처리하였다. 간에서 독점적으로 발현되는 것으로 확인된 쥐의 오르토로그 (orthologue) Angptl3에 의한 이전의 관찰결과 (Conklin et al., Genomics 62:477-82 (1999))와 대비하여 인간 Angptl3의 발현은 성인의 간 및 신장에서 발견되었지만, 신장에서 관찰된 시그날은 유의적으로 더 낮았다 (도 8A). 폐 및 뇌를 포함하는 그밖의 다른 분석된 성인 조직중의 어떤 것에서도 발현은 나타나지 않았으나, 예외적으로 골격근 조직에서는 약간의 약한 시그날이 있었다. Angptl3 mRNA 발현의 세포성 국재화는 인간 및 마우스 검체로부터 유도된 다양한 정상 및 질병조직에 대한 동일계 하이브리드화 실험에 의해서 조사되었다. 조직은 모든 주기관, 골수, 및 간경변증, 전이성 간 선암 및 아세트아미노펜 유도된 간독성의 증례로부터 유도된 절편과 같은 병리학적 간 조직을 포함하였다. 도 8B에서 보는 바와 같이, 약간의 배경 발현 (background expression) 노던 블럿 데이타를 증명하는 정상 성인 간에서 발견되었다. 분석된 간종양 샘플내에서 발현에는 변화가 없었지만, 간경변증과 같은 염증과 연관되어 질병에 걸린 간으로부터 및 독성 손상 이후의 간으로부터 유도된 절편에서는 강력한 유도가 관찰되었다. 고배율 사진에서 보는 바와 같이, 간세포 특이적 발현은 정상 및 질병에 걸린 간 조직 둘다에서 관찰되었다 (도 8C). 발현은 기질세포에서, 림프구에서, 및 질병조직 내 또는 주위의 내피세포에서는 검출되지 않았다.
요약하면, 이들 데이타는 배자 발생중에 Angptl3에 대한 간세포 특이적 발현패턴, 및 염증과 연관된 질병에 걸린 간의 다양한 증례에서 강력한 간세포 특이적 상향조절을 입증한다.
C. 유전자 발현 프로파일링 (Gene Expression Profiling)
유전자 발현 분석은 암 및 비-암을 포함하는 정상 및 질병 상태를 나타내는 인간의 젠로직 데이타베이스 (GeneLogic database)를 사용하여 Angptl3에 대하여 수행하였다.
젠로직 유전자 발현 데이타베이스를 사용하여, 인간 간 절편의 동일계 하이브리드화에 의해서 나타나는 간질환의 상태에서 증가된 발현이 확인되었다 (도 8B). Angptl3의 기초 레벨은 간을 제외하고는 대부분의 조직 및 기관에서 낮았다. 정상 및 병리학적 상태 사이에서 Angptl3의 발현 레벨에 있어서의 유의적인 증가는 간, 심장 및 갑상선에서 존재하였다. 다양한 형태의 간질환을 앓고 있는 환자로부터 유도된 샘플을 사용한 Angptl3 발현에 대한 더욱 상세한 서브타입 분석은 간경변증의 과정중에 Angptl3의 강력한 발현으르 증명하였다. 흥미롭게도, 젠로직 데이타베이스 분석은 병리적 간에서 뿐아니라 관상 심장혈관 및 비대성 심근증과 같은 심장 질환에서도 Angptl3 발현의 강력한 유도를 밝혀내었다. Angptl3의 증가된 발현 레벨과 연관된 질병 형태는 공통적으로 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 라미닌을 포함하는 다양한 세포외 매트릭스 단백질로 구성된 섬유증 조직의 형성을 공유하며, 여기에서 이들 ECM 분자는 모두 특이적 인테그린 형태에 결합하는 것으로 알려져 있다.
실시예 9
Angptl3의 생체내 혈관형성 활성에 대한 시험
Angptl3이 랫트 각막에서 생체내 혈관형성 반응을 유도할 수 있는지 여부를 시험하기 위해서, 쥐 및 인간 Angptl3 (500 ng) 및 인간 VEGF (100 ng)을 함유하는 히알우론 펠릿을 전술한 바와 같이 별도로 또는 조합하여 이식하였다 (Xin et al., J. Biol. Chem., 274:99116-9121 (1999)). 부형제 (대조군), 쥐 또는 인간 Angptl3 (500 ng), VEGF (100 ng), 또는 쥐 또는 인간 Angptl3 (500 ng) 및 VEGF (100 ng)의 배합물을 함유하는 히알우론 펠릿을 250 내지 300 g 숫컷 스프라그-도울리 (Sprague-Dawley) 랫트의 각막에 이식하였다. 모든 히알우론 펠릿은 수크랄페이트 100 ng을 함유하였다. 6 일째에, 동물을 안락사시키고, 형광 이소티오시아네이트-덱스트란을 주사하여 혈관구조가 가시화되도록 하였다. 각막 총마운트 (whole mounts)를 적출된 눈으로 만들고, 컴퓨터-보조 화상분석 (computer-assisted image analysis)(Image Pro-Plus 2.0, Silver Spring, MD)을 사용하여 혈관신생 영역에 대하여 분석하였다. 각막 혈관형성 시험에서 시험한 경우의 안지오포이에틴 1 및 2의 효과에 촛점을 맞춘 이전의 보고 (Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998))와 대비하여, 재조합 Angptl3 단독으로는 펠릿을 이식한지 5 일후에 강력한 혈관형성 반응을 강력하게 유도하였다. 도 9A 및 B에서 보는 바와 같이, 쥐 Angptl3은 재조합 인간 단백질과 비교하는 경우애 혈관형성을 유도하는데 있어서 약간 더 강력하였지만, 두가지 반응은 모두 VEGF에 대하여 수득된 레벨과 동등하였다. VEGF와의 배합치료시에는 상가적이지만 상승적이지는 않은 효과가 관찰되었다 (도 9B). 이들 결과는 두가지 리간드에 의해서 사용된 상호의존적인 시그날 형질도입 경로를 반영할 수 있다 (Byzova et al., Mol. Cell, 6:852-60 (2000)).
실시예 10
Angptl3의 생체내 생물학적 활성
A. Angptl3의 정맥내 및 피내 투여의 일시적 예방효과 및 장기적 효과
방법
아데노바이러스 생성: 아데노바이러스성 CMV-gD-mAngptl3, CMV-lacZ 및 mVEGF164는 필수적으로 제조자의 설명서에 따라서 애드이지 (AdEasy) 아데노바이러스성 벡터 시스템 (Stratagene)을 사용하여 생성되었다. 쥐 Angptl3 또는 VEGF를 코드화한 재조합 아데노바이러스성 벡터는 Angptl3 또는 VEGF의 코드화 부분을 스트라타젠 (Stratagene)에 의해 제공되는 애드-이지 (Ad-Easy) 벡터 작제 키트의 폴리링커 (polylinker) 부위에 클로닝시킴으로써 작제하였다. mAngptl3 또는 VEGF의 코드화 부분은 pShuttleCMV 벡터의 NotI 및 HindIII 부위 사이에 클로닝되었다. 공급된 pShuttleCMV-lacZ와 함께 이들 벡터는 BJ5183 전기감응성 박테리아 (Stratagene)내에서 E1 및 E3 부분에 대해 결실된 Ad5 게놈을 함유하는 애드이지 (AdEasy) 벡터와 함께 재조합되었다. 일차 바이러스성 저장물은 재조합된 애드이지 (AdEasy) 플라스미드를 숙주 HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시킴으로써 제조되었다. 아데노바이러스성 저장물은 또한 HEK293 세포내에서 증폭되고, 비라킷트 아데노 정제키트 (Virakit Adeno purification kit)(Virapur)를 사용하여 정제되었다. 아데노바이러스 역가는 아가로즈-피복된 플라그 시험에 의해서 수득되었다.
1. Angptl3의 단기간 정맥내 투여의 예방적 효과
독성 손상으로부터 간의 보호에 대한 단기간 시험을 위해서, 아데노바이러스성 작제물을 12 마리의 성숙한 BalbC 마우스에게 꼬리정맥 주사를 통해서 투여하여 mAngptl3 및 LacZ 코드화 대조 바이러스 1×109 Pfu 및 VEGF 코드화 바이러스 1×107 Pfu의 용량으로 처리한지 빠르게는 2 일후부터 3 주일까지 간에서 단백질의 연속적인 로부스트 발현이 이루어지도록 하였다. 아데노바이러스성 벡터로 처리한지 5 일후에, 마우스를 두개의 서브그룹 (n = 6)으로 소분류하고, 이들을 비히클 (올리브유) 또는 간손상을 유도하는 강력한 간독성제인 CCl4 (사염화탄소)에 의한 처리에 적용하였다. 비히클 및 CCl4는 둘다 4 ㎖/㎏으로 경구적 가바즈 (oral gavage)에 의해서 투여되었다. 48 시간후에, 동물들을 사망시키고, 혈액을 수거하고, 분석을 위해서 조직을 수확하여 고정시켰다. 마우스에서의 작제물 발현의 레벨은 아데노바이러스 감염시킨지 7 일후에 웨스턴 블럿 분석에 의해서 분석하였다 (도 10A).
결과
CCl4 유도된 간독성 괴사에 대한 Angptl3의 예방적 효과는 Angptl3를 코드화한 아데노바이러스로 처리한 마우스로부터 유래하는 혈청내에서 간부전의 표시자인 아스파르테이트 트랜스퍼라제 (AST)의 혈액 레벨의 유의적인 2.1 배 감소에 의해서 입증되었지만, 대조 작제물중의 어느 것에 의해서도 그렇지 않았다 (p < 0.0001)(도 10B). 따라서, 재조합 Angptl3의 일시적 투여가 간손상의 치료에 유익할 수 있다.
2. Angptl3의 장기간 정맥내 발현에 의한 유도된 간손상
증가된 Angptl3 레벨의 장기간 효과를 평가하기 위해서, 상술한 바와 같이 Angptl3을 코드화 한 아데노바이러스성 벡터로 처리한 마우스는 바이러스 형질도입 후의 2 주일의 기간중에 특정화되었다.
a. 혈액화학분석
간 기능을 나타내는 혈액화학 레벨은 아데노바이러스 형질도입시킨 후 2 주일의 기간 중에 야생형 C57B16 마우스로부터 채혈된 혈청 샘플에서 측정되었다. 혈액학 Cell-Cyn 13700, 및 혈액화학 레벨은 코바스 인테그라 (Cobas Integra) 400상에서 측정하였다.
도 11A에 나타낸 바와 같이, Angptl3을 코드화한 아데노바이러스성 벡터는 혈청 ALT 및 AST 레벨의 강력한 증가를 유도하였지만, LacZ 또는 안지오포이에틴을 코드화한 대조 바이러스는 유도하지 못하였다. 혈청 ALT 및 AST 레벨의 증가는 사염화탄소 처리에 의해서 관찰된 ALT 및 AST 레벨과 동등하였다. 따라서, Angptl3 활성의 저해는 간의 염증성 질환 또는 심장의 질환중에 잠재적 치료방법이 될 수 있다.
면역 시스템의 잠재적 기여를 더 평가하기 위해서, 간기능을 나타내는 혈액화학 레벨을 B- 및 T-세포가 결여된 면역-절충된 RAG2-녹아웃 마우스 및 B, T 및 천연 킬러 (NK) 세포가 결여된 SCID 마우스에서 측정하였다. 도 11B에서 보는 바와 같이, Angptl3을 코드화한 아데노바이러스성 벡터는 RAG2 마우스에서 AST 및 ALT 레벨을 유도하였으며, 이것은 Angptl3에 의해서 유도된 간기능에서의 변화가 완전한 면역 시스템의 존재와는 무관하게 일어나는 것임을 시사한다.
b. 간세포 증식
RAG2-녹아웃 및 SCID 마우스에 대해서 Angptl3을 발현하는 아데노바이러스성 벡터러 처리한 효과를 더 특정화하기 위해서, 처리된 마우스의 신장, 심장, 간, 폐 및 소장을 포함하는 다양한 포르말린-고정된 BrdU 혼입된 기관에서의 세포 증식을 Angptl3을 발현하는 아데노바이러스성 벡터 또는 대조 아데노바이러스성 벡터로 처리한 RAG2-녹아웃 및 SCID 마우스에서 정량화하였다. 세포 증식은 아데노바이러스 투여 (IV)한 후 14 일에 대조- 또는 Angptl3-처리된 마우스로부터 채취한 파라핀-포매된 절편상에서 세포주기의 S 상중에 세포를 검출하는 BrDU 염색을 수행함으로써 측정되었다. BrdU는 치사시키기 1 시간 전에 100 ㎎/㎏의 용량으로 동물에게 복강내 투여되었다. 37℃에서 0.05％ 트립신에 의한 20 분 처리 및 변성을 위해서 70℃에서 0.15 M 트리나트륨 시트레이트중의 95％ 포름아미드로 45 분 처리한 후에, 조직을 1:1000의 희석율로 IdU/BrdU (Caltag)에 대한 마우스 항체로 4℃에서 밤새 염색하였다. 마우스 IgG에 대한 비오티닐화 말 항체 (벡터)를 이차 시약으로 사용하고, 벡타스틴 ABC 표준 엘리트 키트 (Vectastin ABC Standard Elite kit; Vector Laboratories)를 사용하여 검출하였다. 마우스 이소타입 (Zymed)을 음성 대조군으로 사용하였다. 그후, 절편을 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 40× 대물렌즈를 사용하여 10 개의 무작위적으로 선택된 독립적인 시야에서 표지된 핵의 총수를 계수하였다. 각각의 시야는 0.063 ㎟의 면적을 포함하였다.
표 3에서 보는 바와 같이, 간세포 증식의 10 배 이상의 유도는 Angptl3을 발현하는 아데노바이러스성 벡터로 처리된 RAG2-녹아웃 및 SCID 마우스에서 관찰하였다.
RAG2녹아웃 마우스 스키드 베이지 누드 마우스(Scid beige nude mice)
PBS 13.0±5.3 9.0±6.2
Ad-LacZ (1×109 PFU) 3.5±1.3 3.3±1.7
Ad-Angptl3 (1×109 PFU) 81.2±24.9 67.2±20.1
c. 조직학적 분석
조직학적 분석은 아데노바이러스성 벡터로 감염시킨지 14 일 후에 C57/B16 마우스로부터 수확한 간 절편에 대하여 수행하였다. 간세포 및 염증성 침윤물내에서의 세포 증식을 나타내는 유사분열상의 증가는, LacZ를 코드화한 아데노바이러스성 벡터로 처리된 대조 마우스로부터 분리된 간과 비교하여 Angptl3을 코드화한 아데노바이러스성 벡터로 처리된 마우스로부터 분리된 간 절편에서 관찰되었다. Angptl3-처리된 동물의 간은 또한 대조-처리된 동물의 간 보다 유의적으로 더 컸다.
d. FACS 분석
면역세포상에서 발현된 LFA1 및 Mac-1은 시험관내에서 ELISA 시험으로 시험하는 경우에 재조합 Angptl3에 결합하지 않았지만 (Camenisch et al., 2002), 면역세포상에서 발현된 인테그린 부류의 다른 구성원들은 Angptl3과 연관될 수 있다.
염증성 세포가 CCLF1을 발현하는 아데노바이러스성 벡터로 처리된 마우스의 간에서 관찰된 조직 손상에 기여하는 가능성을 연구하기 위해서, 말초혈액 세포의 양을 세포 형태 특이적 마커에 대해 염색함으로써 다양한 가계의 존재에 관하여 FACS로 측정하였다. LacZ 또는 Ang1을 발현하는 대조 아데노바이러스성 벡터로 처리한 마우스에 검출된 양과 비교하여 Angptl3을 발현하는 아데노바이러스성 벡터로 처리된 마우스에서는 선조 (Sca1), T-세포 (CD4 및 CD8), B-세포 (B220), 대식세포 (Gr1/Mac1) 및 적혈구 세포 (Ter119)의 양에 있어서 유의적인 차이가 검출되지 않았다. 유사하게, 처리된 그룹들 사이에서 혈청 글리세라이드와 콜레스테롤의 양에서의 차이는 관찰되지 않았다.
c. 세포유착시험
간 손상을 매개하는데 연관된 세포성 기전을 더 조사하기 위해서 Angptl3-피복된 조직 배양접시상에서 간세포 및 내피세포에 의한 세포유착 실험을 실시예 6에 기술된 세포유착시험과 유사하게 수행하였다.
96-웰 편평-바닥 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)를 지시된 농도의 단백질로 4℃에서 밤새 피복시키고, PBS 중의 3％ BSA로 37℃에서 1 시간 동안 차단시켰다. 르카우터 (LeCouter) 등이 기술한 방법 (LeCouter et al., 2001)을 사용하여 성숙한 C57/B16 마우스의 간으로부터 제조된 새로 분리된 쥐 간세포 및 일차 인간 피부 내피세포 (HMVECs)를 수확하고, 200 nM PMA의 존재하에서 1％ BSA, 1 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2를 함유하는 혈청-비함유 CS-C 배지내에서 105 세포/㎖로 희석하였다. 세포 결합에 관한 정량적으로 유사한 결과가 PMA의 부재하에서 관찰되었다. 세포 현탁액 (104 세포/㎖)을 피복된 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 선택된 시간 동안 배양하였다. 비-유착된 세포를 PBS 세척에 의해서 제거하고, 세포 부착은 랜드그린 (Landegren)의 PNAG 방법 (Landegren, 1984)을 사용하여 측정하였다. 결과는 3 개의 웰의 평균 OD405 값으로 나타내었다.
도 13에서 나타낸 바와 같이, Angptl3-피복된 접시에 대한 HMVEC 유착은 피브로넥틴-피복된 플레이트에 대해 관찰된 유착의 레벨에 비해서 20％ 내지 50％ 사이였다. 피복-농도 의존적 간세포 유착도 또한 관찰되었다. 따라서, 간세포 및 내피세포는 Angptl3 처리된 마우스의 간에서 관찰된 생물학적 효과를 매개하는데 연관될 수 있다.
3. Angptl3의 피내 투여에 의한 증가된 혈관 투과성
성숙한 마우스에서의 일시적 Angptl3 발현에 의해 유도된 혈관 변화를 연구하기 위해서, 아데노바이러스성 발현벡터 (1×10-9 PFUs)를 10 ㎕의 총용적으로 마취하의 성숙한 FVB 마우스의 귀의 표피 피부세포에 투여하고, 에반스 블루 시험 (Evans Blue assay)을 사용하여 혈관 투과성에서의 변화에 대해서 더 분석하였다. 간략하면, 마우스는 전체 에반스 블루 시험의 시작부터 끝까지 마취되었다. 마취가 발현된 후에, 에반스 블루 (PBS중의 1％ 용액) 100 ㎕를 꼬리정맥 주사를 통해서 마우스에게 정맥내 투여하였다. 에반스 블루를 투여한 후의 60 분의 기간 후에 마우스를 120 mmHg의 압력하에 pH 3.5에서 시트레이트 완충액중의 1％ 포름알데히드로 좌심실로부터 관류하였다. 귀를 절제하여 평량하였다. 에반스 블루 염료를 귀로부터 포름알데히드 1 ㎖로 추출하였다. 혈관외유출된 에반스 블루의 양을 610 ㎚에서 광선 분광광도계로 측정하고, 조직의 습윤중량 1 ㎎당, 염료의 함량으로 표현하였다.
결과:
LacZ를 발현하는 대조 아데노바이러스성 벡터를 투여한 마우스에서의 혈관 투과성의 레벨에 대비하여 에반스 블루 시험에 의해서 측정된 혈관 투과성의 증가는 투여후, 6 일에 Angptl3 또는 VEGF (도 12D)를 발현하는 아데노바이러스성 벡터를 피내 투여한 마우스의 귀에서 관찰되었다.
B. K5-mAngptl3를 발현하는 유전자도입 마우스에서 증가된 혈관 투과성
대체방법에서는, 피부에서 Angptl3 발현의 증가된 레벨의 발육상 효과를 발육중에 및 성숙한 마우스에서 구성적으로 발현된 각질세포 특이적 프로모터의 조절하에서 쥐 Angptl3을 발현하는 유전자도입 마우스를 생성시킴으로써 연구하였다.
1. 파운더 유전자도입 마우스 (founder transgenic mouse)
파운더 유전자도입 마우스는 표준방법에 따라서 쥐 K5 프로모터의 조절하에서 Angptl3의 발현을 허용하는 작제물인 K5-gD-mAng5를 사용하여 제조되었다 (Filvaroff et al., 2002). K5-gD-mAng5 작제물의 생성을 위해서, Angptl3 유전자를 NotI-NotI로 절단하고, pNASSK5β NotI-NotI-SAP에 삽입하여 K5-gD-mAng5를 생성시켰다.
총 17개의 유전자도입 파운더 스트레인을 발생시켰다. 마우스 퍼프 (pups)를 다음의 프라이머를 사용하여 마우스 꼬리 DNA (QIAGEN, Santa Clarita, CA)의 PCR에 의해서 9 일령에 유전자형을 결정하였다:
gD-mAng5.311.F: ATATGCCTTGGCGGATGC (SEQ ID NO: 32); 및
gD-mAng5.578.R: ATGGACAAAATCTTTAAGTCCATGAC (SEQ ID NO: 33).
8 주령에 근육, 신장, 간, 비장, 피부, 뇌, 흉선 및 장을 포함하는 몇개의 조직의 조직생검을 행하여, Angptl3의 내인성 및 도입유전자 발현의 레벨의 결정을 위한 실시간 RT-PCR에 적용하였다. RT-PCR 분석을 위해서는 내인성 및 유전자도입 전사물을 측정할 수 있도록 디자인된 다음의 프로브 및 프라이머를 사용하였다:
MMAng5.1165.FP: FAM-CTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTTAMRA (SEQ ID NO: 34)
MMAng5.1144.F: GCTGGCAATATCCCTGGG (SEQ ID NO: 35)
MMAng5.1223.R: AGCTGTCCCTTTGCTCTGTGA (SEQ ID NO: 36)
쥐 K5 프로모터하에서 Angptl3을 발현하는 유전자도입 마우스들 사이의 차이의 통계학적 분석은 스투던트 t 시험 (Student's t test)에 의해서 측정되었으며, 여기에서 P < 0.05의 값은 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되며, P < 0.01의 값은 매우 유의적인 것으로 간주된다.
2. 자손 유전자도입 마우스
모든 유전자도입 파운더 마우스의 피부 조직생검으로부터의 유전자 발현 분석을 기초로하여, 5개의 가장 높게 Angptl3를 발현하는 파운더를 동정하고, C57/B16 마우스로 더 사육하기 위하여 선택하였다. 유전자형 빈도 분석은 도입유전자의 정상적인 멘델리안 빈도 분포를 나타내었으며, 유의적인 생후 치사율은 도입유전자 발현과 관련하여 관찰되지 않았다.
a. 도입유전자 발현
지시된 다양한 조직으로부터의 RNA를 분리하고, 특히 간에서의 내인성 발현에 비해 도입유전자 발현의 상대적 레벨을 실시간 RT-PCR에 의해서 평가하였다.
예상한 바와 같이, 쥐 Angptl3 발현의 증가된 레벨은 동복 교배된 야생형 대조군에 대비하여 유전자도입군의 피부에서 관찰되었다. 피부에서 Angptl3의 도입유전자 발현은 간에서의 내인성 Angptl3 발현 레벨의 약 10％에 도달하였다 (도 12A).
또한, 야생형 마우스와 비교한 경우에 12 주령의 유전자도입 마우스의 폐 및 뇌에서 중등도의 발현이 관찰되었다. 따라서, 폐 및 뇌에서의 발현은 이들 조직에서 K5 프로모터의 증가된 전사활성으로부터 야기될 수 있다.
성인 인간의 신장에서 노던 블럿 분석에 의해서 밝혀진 중등도의 Angptl3 발현 (도 8A)을 지지하여, 마우스 신장 RNA의 타크만 분석 (Taqman analysis)은 Angptl3의 중등도의 내인성 발현 레벨을 나타내었다.
시간의 경과에 따른 생후 도입유전자 발현을 모니터하기 위해서, 실시간 RT-PCR 분석은 3, 6 및 11 주령의 유전자도입 마우스의 피부 조직생검으로부터 분리된 RNA를 사용하여 수행되었다. 도 12B에서 보는 바와 같이, 도입유전자 발현의 일관된 레벨이 시험한 모든 발육단계에서 유전자도입 마우스의 피부에서 관찰되었다.
b. 혈관 투과성
도입유전자 발현 데이타를 기초로하여, 12 주령의 유전자도입 및 야생형 동복 교배된 야생형 대조군을 선택하고, 위에서 혈관형성 분자의 안지오포이에틴 부류의 두가지 구조적으로 관련된 구성원인 Ang1 및 Ang2에 대해 기술한 것과 유사한 에반스 블루 시험을 사용하여 혈관 투과성에 대한 시험에 적용하였다 (Maisonpierre et al., 1997; Thurston et al., 2000; Thursdton et al., 1999). 혈관 투과성은 상술한 바와 같은 에반스 블루 시험에 의해서 측정되었다. 에반스 블루 시험에 적용된 11 주령의 유전자도입 스트레인 둘다는 동복 교배된 야생형 스트레인에 비해서 기준 레벨 (도 12C)에서의 혈관 투과성에 있어서 2- 내지 3-배 증가 사이의 유의적인 증가를 가졌다. 그러나, 유전자도입 마우스와 동복 교배된 야생형 마우스 사이의 혈관 투과성 차이는 마우스를 에반스 블루 시험분석하기 전에 겨자유로 공격하는 경우에 덜 유의적이었다. 따라서, 그들의 야생형 동복 대조군과 비교하여 유전자도입 마우스에서의 혈관 투과성의 증가는 혈관 투과성의 조절에 있어서의 Angptl3의 역할을 시사할 수 있다.
물질의 기탁
전술한 바와 같이, 다음의 물질은 ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA)에 기탁되었다:
물질 ATCC 수탁번호 기탁일
Angptl3-DNA16451-1078 209281 9/18/97
이들 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 및 그에 따른 규칙 (부다페스트 협약)하에서 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물을 생존 배양물로 유지시키는 것을 보장한다. 기탁은 부다페스트 협약의 규정에 따라 ATCC에 의해서 이루어질 수 있으며, 해당 미합중국 특허가 허여되거나 미합중국 또는 외국 특허출원이 공개되면 어떤 것이든 먼저 되는 것에 따라서 공중에게 기탁물의 배양물의 자손을 영구적이며 비제한적으로 이용할 수 있도록 보장하며, 미국특허상표청의 35 USC §122에 따라 규정되고, 그에 따른 특허청장의 규칙 (886 OG 683에 특별히 관련한 37 C.F.R.§1.14을 포함)에 의해서 결정된 사람에게 자손을 이용할 수 있도록 보장하는 제넨텍 (Genentech, Inc.)과 ATCC 사이의 협정에 종속된다.
본 출원의 양수인은 기탁물의 배양물이 적합한 조건하에서 배양된 경우에 분실되거나 파괴되어 사망한 경우에는 기탁물을 동일물의 또 다른 것으로 고시에 의해서 즉시 교체하여야 한다. 기탁물의 이용성은 정부당국의 권리하에서 그의 특허법에 따라 허여된 권리에 위반하여 발명의 실시권으로서 해석되지는 않는다.
본 명세서는 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 구체예는 본 발명의 특정한 관점의 단일 예인 것으로 의도되는 것이기 때문에 본 발명은 기탁된 작제물로 범위가 제한되는 것은 아니며, 기능적으로 동등한 모든 작제물이 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 기탁은 기술된 설명이 그의 더 최상의 것을 포함하여 본 발명의 어떤 관점을 실시할 수 있기에는 부적합하다는 내용을 구성하지 않거나, 또한 특허청구의 범위를 이것을 나타내는 특정한 예로 제한하는 것으로 이해되지도 않는다. 실제로, 본 명세서에 기술되고 나타낸 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이며, 첨부된 특허청구범위의 범위내에 포함된다.
<110> Genentech, Inc. Ferrara, Napoleone Gerber, Hans-Peter Kowalski, Joe Pisabarro, Maria Teresa Sherman, Daniel Eric <120> COMPOSITION COMPRISING AND METHOD OF USING ANGIOGENIC FACTOR ANGIOPOIETIN-LIKE PROTEIN 3 ANGPTL3 <130> GENENT.086VPC <150> <151> <160> 36 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2042 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcggacgcgt gggtgaaatt gaaaatcaag ataaaaatgt tcacaattaa gctccttctt 60 tttattgttc ctctagttat ttcctccaga attgatcaag acaattcatc atttgattct 120 ctatctccag agccaaaatc aagatttgct atgttagacg atgtaaaaat tttagccaat 180 ggcctccttc agttgggaca tggtcttaaa gactttgtcc ataagacgaa gggccaaatt 240 aatgacatat ttcaaaaact caacatattt gatcagtctt tttatgatct atcgctgcaa 300 accagtgaaa tcaaagaaga agaaaaggaa ctgagaagaa ctacatataa actacaagtc 360 aaaaatgaag aggtaaagaa tatgtcactt gaactcaact caaaacttga aagcctccta 420 gaagaaaaaa ttctacttca acaaaaagtg aaatatttag aagagcaact aactaactta 480 attcaaaatc aacctgaaac tccagaacac ccagaagtaa cttcacttaa aacttttgta 540 gaaaaacaag ataatagcat caaagacctt 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Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccacgttggc ttgaaattga 20 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cctccagaat tgatcaagac aattcatgat ttgattctct atctccagag 50 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcgtctaaca tagcaaatc 19 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 6 ggattctaat acgactcact atagggc 27 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggcattcctg ctgaatgtac c 21 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 8 ctatgaaatt aaccctcact aaaggga 27 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 accacactca tcatgccacc a 21 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn Arg Leu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 11 gatgaccttc ctgccgactg 20 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Val Tyr Tyr Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Murine <400> 13 gtcattccac caccagcca 19 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln 1 5 10 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu 1 5 10 15 Ser Phe Glu <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu 1 5 10 15 Ser <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising inverted human sequence. <400> 20 Gln Ser Gly Asp Ile Arg His Gln Ile Leu Thr Trp Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising scrambled human sequence. <400> 21 Pro Gln Trp Ser Thr Gly Leu Asp Ile Ile Gln Arg His 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising inverted human sequence. <400> 22 Ser Glu Ser Asp Thr Pro His Ile Leu Met Lys Thr Ser Lys Ile Ser 1 5 10 15 Tyr <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising scrambled human sequence. <400> 23 Tyr Ser Ser Glu Ile Ser Lys Asp Ser Thr Thr Pro Lys His Met Ile 1 5 10 15 Leu <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising inverted human sequence. <400> 24 Arg Glu Pro Lys Ser Lys Ala Arg Pro Lys Asn Tyr Lys Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising scrambled human sequence. <400> 25 Gly Arg Lys Glu Tyr Pro Asn Lys Lys Ser Pro Lys Arg Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Trp Thr Val Phe Gln Lys Arg Leu Asp Gly Ser Val 1 5 10 <210> 27 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Asp Cys Gln Asp Ile Ala Asn Lys Gly Ala Lys Gln Ser Gly Leu 1 5 10 15 Tyr Phe Ile Lys Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Phe Leu Val Tyr Cys 20 25 30 Glu Ile Asp Gly Ser Gly Asn Gly Trp Thr Val Phe Gln Lys Arg Leu 35 40 45 Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys Asn Trp Ile Gln Tyr Lys Glu Gly 50 55 60 Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr Thr Glu Phe Trp Leu Gly Asn 65 70 75 80 Glu Lys Ile His Leu Ile Ser Thr Gln Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Leu 85 90 95 Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp Asn Gly Arg Thr Ser Thr Ala Asp Tyr 100 105 110 Ala Met Phe Lys Val Gly Pro Glu Ala Asp Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr 115 120 125 Ala Tyr Phe Ala Gly Gly Asp Ala Gly Asp Ala Phe Asp Gly Phe Asp 130 135 140 Phe Gly Asp Asp Pro Ser Asp Lys Phe Phe Thr Ser His Asn Gly Met 145 150 155 160 Gln Phe Ser Thr Trp Asp Asn Asp Asn Asp Lys Phe Glu Gly Asn Cys 165 170 175 Ala Glu Gln Asp Gly Ser Gly Trp Trp Met Asn Lys Cys His Ala Gly 180 185 190 His Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser 195 200 205 Thr Pro Asn Gly Tyr Asp Asn Gly Ile Ile Trp Ala Thr Trp Lys Thr 210 215 220 Arg Trp Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn 225 230 235 240 Arg Leu <210> 28 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 1 5 10 15 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 20 25 30 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 35 40 45 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 50 55 60 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 65 70 75 80 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 85 90 95 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 100 105 110 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 115 120 125 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 130 135 140 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 145 150 155 160 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 165 170 175 Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 180 185 190 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 195 200 205 His Pro Thr Asp Ser Glu Ser 210 215 <210> 29 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile 1 5 10 15 Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys 20 25 30 Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu 35 40 45 Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly 50 55 60 Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe 65 70 75 80 Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp 85 90 95 Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly 100 105 110 Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr 115 120 125 Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr 130 135 140 Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu 145 150 155 160 Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly 165 170 175 Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys 180 185 190 Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met 195 200 205 Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 210 215 <210> 30 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys 20 25 30 Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu 35 40 45 Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly 50 55 60 Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser 65 70 75 80 Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp 85 90 95 Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser 100 105 110 Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr 115 120 125 Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr 130 135 140 Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu 145 150 155 160 Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly 165 170 175 Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys 180 185 190 Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met 195 200 205 Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 210 215 <210> 31 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Asp Cys Ala Glu Ile Gln Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val 1 5 10 15 Tyr Thr Ile Gln Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys 20 25 30 Asp Leu Gln Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gln Arg Arg Glu 35 40 45 Asn Gly Thr Val Asn Phe Gln Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gln Gly 50 55 60 Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His 65 70 75 80 Gln Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Leu Arg Val Glu Leu Gln Asp 85 90 95 Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gln Tyr Glu His Phe His Leu Gly 100 105 110 Ser Glu Asn Gln Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser 115 120 125 Ala Gly Arg Gln Ser Ser Leu Val Leu Gln Asn Thr Ser Phe Ser Thr 130 135 140 Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gln Val Met 145 150 155 160 Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly 165 170 175 Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg 180 185 190 Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met 195 200 205 Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile 210 215 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Murine <400> 32 atatgccttg gcggatgc 18 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Murine <400> 33 atggacaaaa tctttaagtc catgac 26 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Murine <400> 34 ctcccagagc acacagacct gatgtttt 28 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Murine <400> 35 gctggcaata tccctggg 18 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Murine <400> 36 agctgtccct ttgctctgtg a 21 5 2

Claims (28)

  1. Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직 손상을 치료 또는 예방하는 의약을 제조하는데 있어서의 Angptl3의 길항제의 용도.
  2. 포유동물에게 Angptl3의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 Angptl3의 과발현을 특징으로하는 조직 손상을 치료 또는 예방하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 조직 손상이 염증, 간질환 또는 심장질환과 연관되는 방법 또는 용도.
  4. 제 3 항에 있어서, 간질환 또는 심장질환이 Angptl3의 증가된 발현을 특징으로하는 방법 또는 용도.
  5. 제 3 항 또는 4 항에 있어서, 간질환이 만성 간질환 또는 간종양인 방법 또는 용도.
  6. 제 5 항에 있어서, 만성 간질환이 간경변증, 만성 감염, 바이러스성 간염 A, B, C, D, E 또는 G, 독성 대사성 간손상, 지방간, 간의 허혈성 재관류 손상 또는 패혈증인 방법 또는 용도.
  7. 제 6 항에 있어서, 간염이 만성 자가면역 간염, 만성 알콜성 간염 또는 비-알콜성 지방간염인 방법 또는 용도.
  8. 제 5 항에 있어서, 간종양이 간세포암, 담관암 및 간의 전이성 암인 방법 또는 용도.
  9. 제 3 항 또는 4 항에 있어서, 심장질환이 관상동맥 질환, 심근증, 심근염, 울혈성심부전 또는 심장발작인 방법 또는 용도.
  10. 제 9 항에 있어서, 심근증이 비-특이적 비대증 및 확장성 심근증인 방법 또는 용도.
  11. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 길항제가 항-Angptl3 항체, 항-αvβ3 항체 또는 면역어드헤신인 방법 또는 용도.
  12. 제 11 항에 있어서, 항-Angptl3 항체 또는 항-αvβ3 항체가 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 또는 단일쇄 항체인 방법 또는 용도.
  13. 제 12 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편인 방법 또는 용도.
  14. 제 11 항에 있어서, 면역어드헤신이 면역글로부린 서열에 융합된 αvβ3의 리간드 결합부분을 포함하는 방법 또는 용도.
  15. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 예방이 조직 손상, 간질환 또는 심장질환의 진행을 방지하는 것을 포함하는 방법 또는 용도.
  16. 급성 간손상 이후의 조직 또는 간 재생시에 혈관형성을 유도하기 위한 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조시에 SEQ ID NO: 2에 대해 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 작용제의 용도.
  17. 포유동물에게 SEQ ID NO: 2에 대해 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 급성 간손상 이후의 조직 또는 간 재생시에 혈관형성을 유도하는 방법.
  18. 급성 간질환을 치료하는 방법에서 사용하기 의한 의약의 제조시에 SEQ ID NO: 2에 대해 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 작용제의 용도.
  19. 포유동물에게 SEQ ID NO: 2에 대해 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 간질환을 치료하는 방법.
  20. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2의 아미노산 부분 281 내지 293, 415 내지 430, 또는 442 내지 460중의 적어도 하나를 포함하는 방법 또는 용도.
  21. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열의 피브리노겐 영역을 포함하는 방법 또는 용도.
  22. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 용도.
  23. 제 22 항에 있어서, 추가의 치료제가 혈관형성 인자인 방법 또는 용도.
  24. 제 23 항에 있어서, 혈관형성 인자가 혈관 내피성장인자 (VEGF) 또는 섬유아세포 성장인자 (FGF)인 방법 또는 용도.
  25. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 Angptl3 또는 αvβ3 수용체에 특이적으로 결합하는 작용제 항체인 방법 또는 용도.
  26. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 또는 자가면역 과정, 기계적 또는 화학적 손상 또는 암이 간조직을 손상시키는 방법 또는 용도.
  27. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 간절제술을 받은 방법 또는 용도.
  28. 제 27 항에 있어서, 간절제술이 만성 간염, 간경변증, 원발성 또는 전이성 간암 또는 방광암인 방법 또는 용도.
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