KR100904593B1

KR100904593B1 - Ｅｇ-ｖｅｇｆ 핵산 및 폴리펩티드 및 사용 방법

Info

Publication number: KR100904593B1
Application number: KR1020087001861A
Authority: KR
Inventors: 나폴레온 페라라; 콜린 와타나베; 윌리암 아이. 우드
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2009-06-25
Also published as: KR20080074236A; KR100961345B1; KR20080011474A; KR20100029069A

Abstract

본 발명은 본원에서 EG-VEGF로 표시되는 신규한 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본원에서는, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본원에서는 EG-VEGF의 조절자의 스크린 방법을 제공한다. 또한, 본원에서는, 세포 증식 및 화학주성의 조절에 관한 방법 및 관련 치료 방법을 설명한다.

폴리펩티드, EG-VEGF, 세포 증식, 화학주성

Description

ＥＧ-ＶＥＧＦ 핵산 및 폴리펩티드 및 사용 방법 {EG-VEGF NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE}

본 발명은 한 유형의 내피 세포에 대해 선택적으로 작용하는 신규의, 조직 한정적인 성장 및 분화 인자를 밝히고, 특징을 분석하는 것에 관한 것이다.

내피 세포

국소 미세환경은 조직 또는 기관 특이적 방법으로 혈관 내피 세포의 성장 성질 및 표현형에 매우 영향을 주지만, 국소으로 유익한 신호의 성질은 잘 알려져 있지 않다. 혈관 내피 세포 성장인자(VEGF) 및 표피 세포 특이 성장인자의 안지오포이에틴 패밀리가 다양한 생리적 병리적 환경에서의 혈관신생 및 배아 발생 (development)에 필수적이라는 강력한 증거가 있다[Ferrara and Alitalo, Nature Medicine, 5: 1359-1364 (1999) ; Carmeliet, Nature Medicine, 6: 389-395 (2000)]. 또한, 내피 세포 표현형 및 성장의 국소적, 조직-특이적, 조절에 대해 강력한 증거가 있다 [Aird et al., J. Cell Biol ., 138: 1117-1124 (1997) ; Stewart and Wiley, Dev . Biol ., 84: 183-192 (1981)]. 내피 세포의 형태학적 기능적 특징은 다른 기관간에 매우 다양하다 [Simionescu and Simionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988) pp. 355-398]. 더구나, 시험된 혈관신생 인자의 유형보다 도입 위치가 새로운 혈관의 성질을 더욱 크게 결정한다[Dellian et al., Am . J. Pathology , 149: 59-71 (1996); Roberts et al., Am . J. Pathology, 153: 1239-1248 (1998)]. 혈관구조 성질에 대한 국소 미세환경의 이러한 영향에 관한 분자적 기초는 알려져 있지 않지만, 특화된 기질(speicalized stroma)가 주요한 역할을 한다고 생각된다[Dellian, 앞의 문헌]. 생각할 수 있는 바로는, 세포 및 세포외 매트릭스 성분에 추가로, 조직 특이적으로 분비된 단백질을 포함할 수 있는 자극의 집적된 네트워크가 구조 및 기능을 결정하고, 남은 내피의 성장을 조절한다.

따라서, 내피 세포의 분화(differentiation) 및(또는) 성장에 영향을 주는 신규 분화 및 성장 인자를 규명하고 특징을 찾을 필요가 있다. 그러한 화합물은 혈관구조의 발생에 대한 우리의 지식을 넓힐 뿐 아니라, 혈관 조직과 연관된 상태의 진단 및 치료에 유용할 수 있다.

호르몬 분비 세포

과학 및 의료 요법에 진전이 있었지만, 질병에 대한 새로운 치료에 대한 사회적 필요는 여전히 있다. 새로운 치료를 찾기 위한 시도는 기관이 작동하는 방법을 연구하는 것이다. 특히 관심을 끄는 것은 신호 세포(signaling cell)가 기관의 행동을 조절하는 방법이다. 예를 들면, 엔도크린 세포는 호르몬이라고 불리우는 신호 분자를 분비하고, 이러한 호르몬 분비가 잘못되면 다양한 질환을 야기할 수 있다.

호르몬 분비로 특화된 세포는 테스토스테론 (정소의 라이디히세포), 에스트로겐 (난포의 내난포막세포) 및 프로게스테론 (파열된 난포의 황체세포)을 분비하는 생식선 세포를 포함한다. 의료분야에서 테스토스테론, 에스트로겐 및 프로게스테론의 외인 투여를 이용하는 다양한 치료가 있지만, 여전히, 이러한 호르몬을 생산하는 세포를 조절할 필요가 있다.

호르몬 분비로 특화된 다른 세포는 부신 세포 및 소화기 세포를 포함한다. 예를 들어, 부신 세포는 에피네프린, 노레피네프린 및 스테로이트 호르몬, 예를 들면 미네랄로코르티코이드 및 글루코코르티코이드를 분비한다. 특히 관심을 끄는 것은 부신 피질에서 만들어지고, 많은 유형의 세포의 신진대사에 영향을 주는 코르티졸이다. 소화기 세포는 인슐린을 분비하는 췌장 세포를 포함한다. 인슐린은 랑게르한스섬에서 분비되며, 탄화수소의 신진대에서 필수적이다. 인슐린은 당뇨병의 치료 및 조절에 사용되지만, 그러나, 당뇨병같은 질환의 효과적인 치료에 대한 요구는 여전히 있다. 장 및 기도에서 관심을 끄는 다른 호르몬은 세로토닌, 엔돌핀, 소마토스타틴, 가스트린, 세크레틴, 콜레키스토키닌, 글루카곤 및 봄베신이다.

호르몬 분비 세포, 특히 내분비샘내의 스테로이드 생성 내피 세포와 연관된 수많은 질병 및 질환이 있다. 따라서, 그러한 내피 세포에 특이적으로 영향을 주는 성장인자를 규명할 필요가 있다. 그러한 내피 세포 특이 성장인자는 그러한 세포 유형과 연관된 질환의 진단 및 치료, 및 그러한 질병의 치료 및 진단에 유용한 후보 약물을 밝히는 데에 유용한 도구가 될 것이다.

본 발명은 한 유형의 내피 세포에 대해 선택적으로 작용하는 신규의, 조직 한정적인 성장 및 분화 인자를 밝히고, 특징을 분석하는 것에 관한 것이다. 내분비선-유도 혈관 내피 세포 성장 인자(EG-VEGF)로 불리는 이 인자는 내분비선에서 유도된 모세관 내피 세포에서 증식, 이동 및 페네스트레이션(fenestration)을 유도하는 것으로 밝혀졌지만, 시험된 다른 다양한 유형의 내피 및 비-내피 세포에서는 효과를 보이지 않았다. 본원에서 자세히 기술된 것처럼, EG-VEGF 핵산 및 폴리펩티드는 호르몬을 만드는 조직과 연관된 병의 치료 및 진단 및 다양한 분석에서 사용될 수 있다.

한면으로 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합된, 본원에서 기술된 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 EG-VEGF 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제를 포함하는 물질의 조성에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 이 조성물은 혈관 내피 세포 성장인자(VEGF) 또는 그의 작용제 또는 길항제를 더욱 포함한다.

다른 면에서 본 발명은 용기, 용기 위의 라벨, 용기내 포함된 활성 약제를 포함하는 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 활성 약제는 EG-VEGF 폴리펩티드, EG-VEGF 폴리펩티드의 작용제 및 EG-VEGF 폴리펩티드의 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 용기상의 라벨은 조성물이 내피 세포를 만드는 호르몬과 연관된 상태를 치료하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 본 발명의 이러한 면의 한 실시태양에서, 상기 상태는 내분비샘내의 스테로이드 생성 내피 세포와 연관있다. 두번째 실시태양에서, 조직은 난소, 고환, 자궁목(cervical), 부신, 태반 또는 전립선 조직이다. 이러한 병은 바람직하게 불임증, 다낭성 난소 증후군 또는 암이다.

다른 면에서, 본 발명은 EG-VEGF와 결합하는 화합물을 규명하는 방법을 제공한다. 이 방법은 후보 화합물을 EG-VEGF와 접촉시키고, 후보 화합물이 EG-VEGF과 결합하는 지를 결정하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 분석은 경합적 결합 분석(competitive binding assay), 즉, EG-VEGF와 결합하는 것으로 알려진 분자와 경합하는 후보 화합물의 능력을 측정하는 것이다. 분석은, 예를 들면 후보 화합물을 전체 세포에 또는 EG-VEGF의 코딩 서열을 발현하는 세포 멤브레인 부분과 접촉시키는 세포기반 분석(cell-based assay)일 수 있다.

또한, 본 발명은 EG-VEGF의 생물학적 활성을 조절하는 화합물을 규명하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 후보 화합물을 EG-VEGF와 접촉시키는 단계 및 EG-VEGF의 생물학적 활성에 변화가 생기는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 한 실시태양에서, 화합물은 EG-VEGF의 생물학적 활성을 나타내고, 다른 실시태양에서 EG-VEGF의 생물학적 활성을 증가시켰다. 생물학적 활성은 예를 들면 세포 증식 또는 생존에 참여한 키나아제의 인산화를 유도하는 능력일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 키나아제는 MAP키나아제이고, 더욱 바람직하게는 ERK1 또는 ERK2이다. 다른 실시태양에서 생물학적 활성은 세포 증식, 화학주성의 유도, 혈관신생, 세포 분화의 유도 또는 내피 세포 페네스트레이션의 유도이다. 앞에서와 마찬가지로, 분석은 예를 들면 후보 분자를 전체 세포 또는 EG-VEGF의 코딩 서열을 발현하는 세포 멤브레인 부분과 접촉시키는 세포기반 분석일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 세포는 EG-VEGF를 발현하도록 설계된 재조합 숙주세포이다. 별법으로, 후보 분자를 분리된 EG-VEGF와 접촉시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, EG-VEGF는 고체 지지물상에서 움직이지 못한다.

다른 면에서, 명확히는 본 발명은 상기 설명된 분석중 하나에 의해 EG-VEGF와 결합하거나, EG-VEGF의 생물학적 활성을 조절하는 능력을 갖는 것으로 규명된 화합물을 포함한다.

EG-VEGF의 수용체를 규명하는 방법을 본원에서 추가로 제공한다. 본 발명은 EG-VEGF와 세포 멤브레인 물질을 포함하는 조성물을 콤바인하는 것을 포함하며, 여기서, EG-VEGF는 세포 멤브레인 물질상의 수용체와 콤플렉스를 이루고, 수용체는 EG-VEGF 수용체로 규명된다. 본 발명의 이 면의 한 실시태양에서, EG-VEGF는 그 수용체와 결합하고, EG-VEGF와 수용체는 가교된다.

본 발명의 다른 면은 세포 또는 조직중 생물학적 활성을 자극하는 방법에 관한 것이다. 이것은 세포 증식을 자극하는 방법, 세포에서 화학주성을 유도하는 방법, 호르몬을 만드는 조직에서 혈관신생을 유도하는 방법, 세포에서 세포 분화를 유도하는 방법, 및 세포에서 페네스트레이션을 유도하는 방법을 포함한다. 이러한 각각의 방법에서, 생물학적 활성은 세포 또는 조직을 원하는 생물학적 활성을 유도할 효과적인 양의 EG-VEGF 또는 EG-VEGF 작용제와 접촉시키거나, 또는 생물학적 활성을 유도할 충분한 양의 EG-VEGF 또는 EG-VEGF작용제를 인코팅하는 핵산을 세포 또는 티슈로 도입시켜 자극한다. 세포는 바람직하게 내피 세포, 특히 호르몬을 만드는 내피 세포 또는 조직이다.

본 발명은 또한 세포 또는 호르몬을 만드는 조직을 생물학적 활성을 억제할 충분한 양의 EG-VEGF와 접촉시켜서, 또는 EG-VEGF 길항제가 인코딩된 핵산을 세포로 도입시켜 상기 설명된 모든 생물학적 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가적인 면은 환자(individual)를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 호르몬을 만드는 조직과 관련된 병에 대해 개체를 치료하는 방법, 환자의 번식력을 조절하는 방법, 환자의 EG-VEGF에 민감한 세포의 암을 치료하는 방법, 환자의 생식기관의 암을 치료하는 방법 및 환자의 난소낭을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 이러한 면의 방법의 실시태양에서, 그 방법은 병을 치료하거나, 번식력을 조절하거나, 암을 치료하거나 난소낭을 치료하는 데 효과적인 양의 EG-VEGF 또는 그의 작용제 또는 길항제를 포함하는 조성물을 그 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 그 방법은 상태를 치료하는 데 효과적인 양의 EG-VEGF 또는 그의 작용제 또는 길항제가 인코딩된 핵산을 포함하는 조성물을 그 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 특별한 실시태양에서, 모낭 성숙을 억제하여 번식력을 조절한다. 다른 실시태양에서는 배란을 억제하여 번식력을 조절한다. 다른 실시태양에서는 그 환자는 다낭성 난소 증후군, 또는 그런 위험을 갖으며, 번식력을 유지하도록 번식력이 조절된다. 치료되는 암은, 예를 들면 난소암, 고환암, 전립선암, 또는 자궁암일 수 있다.

이하에서 기술되는 바람직한 실시태양은 발명의 모든 면에 적합하다.

한 실시태양에서, EG-VEGF 폴리펩티드는 본래의 서열(native sequence) EG- VEGF이다. 다른 실시태양에서 본래의 서열 EG-VEGF는 인간이다. 다른 실시태양에서, EG-VEGF는 본래의 서열 EG-VEGF의 조각이다. 다른 실시태양에서, EG-VEGF는 천연 서열 EG-VEGF의 아미노산 서열 변종(variant)이고, 바람직하게는 도 2에서 약 1 내지 또는 약 20 내지 약 105까지의 아미노산 잔기(amino acid residue)의 서열과 약 85%이상의 서열 동일성을 갖는다(서열 번호: 2). 더 다른 실시태양에서, 아미노산 서열 변종은 보전적 치환 변이(conservative substitution variant)이다. 다른 실시태양에서, EG-VEGF는 본래의 서열 EG-VEGF의 아미노산 서열 변종의 조각이다. 다른 실시태양에서 EG-VEGF는 융합 단백질(fusion protein)로서 존재한다.

상기에 설명된 조성물 및 방법은 또한 VEGF 폴리펩티드의 용도를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서 VEGF 폴리펩티드는 본래의 서열 VEGF이다. 다른 실시태양에서 본래의 서열 VEGF는 인간이다. 다른 실시태양에서 VEGF는 본래의 서열 VEGF의 조각이다. 다른 실시태양에서, VEGF는 본래의 서열 VEGF의 아미노산 서열 변종이다. 다른 실시태양에서, 아미노산 서열 변종은 본래의 서열 VEGF의 서열과 약 85%이상의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시태양에서, 아미노산 서열 변종은 보존적 치환 변이이다. 다른 실시태양에서 VEGF는 본래의 서열 VEGF의 아미노산 서열 변종의 조각이다. 다른 실시태양에서 VEGF는 융합 단백질로서 존재한다.

한 실시태양에서, EG-VEGF 작용제 또는 VEGF 작용제는 각각 항-EG-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체이고, 명확히는 항체 조각을 포함한다. 다른 실시태양에서 EG-VEGF 또는 VEGF 작용제는 작은 분자이다.

유사하게, EG-VEGF 또는 VEGF 길항제는, 예를 들면 각각 항-EG-VEGF 또는 항 -VEGF 항체, 명확히는 항체 조각을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서 EG-VEGF 또는 VEGF 길항제는 작은 분자이다.

한 실시태양에서, EG-VEGF의 코팅 서열을 나타내는 세포 멤브레인 부분 또는 전체 세포는 EG-VEGF를 발현하도록 설계된 재조합 숙주세포이다.

본 발명의 다른 실시태양 및 변화는 이하에 상세히 주어질 발명의 설명에 의해 명확해질 것이다.

본 발명에 따른 EG-VEGF 핵산 및 폴리펩티드는 호르몬을 만드는 조직과 연관된 병의 치료 및 진단, 및 다양한 분석에 사용할 수 있다.

I. 정의

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 기술적 및 학술적 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Dictionary of Microbiolgy and Molecular Biology 2nd ed., J.Wiley & Sons(New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)]을 참고하라. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들은 하기와 같이 정의된다.

"EG-VEGF 폴리펩티드", "EG-VEGF 단백질" 및 "EG-VEGF"(또한, "VRPA 폴리펩티드", "VRPA 단백질" 및 "VRPA"라는 용어는 동일한 폴리펩티드를 기술하기 위해 앞서 사용되었다.)라는 용어는 본원에서 사용될 때, 천연 서열 EG-VEGF 및 EG-VEGF 폴리펩티드 변이체(이는 본원에서 추가 정의됨)를 포함한다. EG-VEGF 폴리펩티드는 다양한 소스, 예를 들어 인간 조직 유형으로부터 또는 다른 소스로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.

"천연 서열 EG-VEGF"는 천연으로부터 유도된 EG-VEGF로서 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 EG-VEGF는 천연으로부터 단리될 수 있고, 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 EG-VEGF"라는 용어는 구체적으로 EG-VEGF의 천연 발생한 절단형 또는 분비형(즉, 세포외 도메인 서열), 천연 발생한 변이형(즉, 임의로 절단된 형) 및 천연 발생한 알레릭 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 천연 서열 EG-VEGF는 도 2(서열 번호:2)의 아미노산 1 내지 105개를 포함하는 성숙 또는 전장의 천연 서열 EG-VEGF이다. 또한, 도 2(서열 번호:2)에 개시된 EG-VEGF 폴리펩티드는 아미노산 위치 1로서 본원에서 지정된 메티오닌 잔기로 시작됨을 나타내지만, 도 2(서열 번호:2)중의 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류중에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 EG-VEGF 폴리펩티드를 위한 시작 아미노산 잔기로서 사용될 수 있다는 것을 생각할 수 있고, 가능하다.

"EG-VEGF 변종 폴리펩티드"는 (a) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 105, (b) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF의 X 내지 105(여기서, X는 도 2(서열 번호 2)의 14 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 아미노산 서열의 또다른 특정적으로 얻어진 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 하기 정 의된 바와 같은 활성 EG-VEGF 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 EG-VEGF 변종 폴리펩티드는 예를 들어, 도 2(서열 번호 2)의 N 및(또는) C 말단에서 및 1 개 이상의 내부 도메인에서 1 개 이상의 아미노산 잔기를 첨가하거나 삭제한 EG-VEGF를 포함한다. 일반적으로, EG-VEGF 변종 폴리펩티드는 (a) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 105, (b) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF의 X 내지 105(여기서, X는 도 2(서열 번호 2)의 14 내지 24개의 임의의 아미노산 잔기임), 또는 (c) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 아미노산 서열의 또다른 특정적으로 얻어진 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 81% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 82% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 83% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 84% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 86% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 87% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 88% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 89% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 91% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 92% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 93% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 94% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 96% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 98% 이상의 아미 노산 서열 동일성 및 더 바람직하게는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일반적으로, EG-VEGF 변종 폴리펩티드는 약 10개 이상의 아미노산 길이, 흔히 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 30개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 40개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 50개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 60개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 70개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 80개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 90개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 100개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 150개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 200개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 250개 이상의 아미노산 길이, 더 흔히 약 300개 이상의 아미노산 길이 또는 그 이상을 갖는다.

본원에서 확인된 EG-VEGF 폴리펩티드 서열에 관한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 최대 퍼센트 서열 동일성을 얻기 위해서 필요하다면 갭을 도입시키고, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적인 치환을 고려하지 않은 후, EG-VEGF 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중의 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당업계내의 다양한 방법, 예를 들어, 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN), 얼라인-2 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어 같은 공중 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 얻어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 얻는데 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 얼라인-2를 이용하여 하기와 같이 얻을 수 있고, 여 기서, 얼라인-2 프로그램을 위한 완전한 소스 코드는 도 20에서 제공된다. 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크사(Genetech. Inc.)가 저자이며, 도 20중에 나타낸 소스 코드는 미국 저작권청(Washington D.C., 20559 소재)에 사용자 참고문서와 함께 제출되었으며, 이는 미국 등록저작권 제 TXU510087로 등록되었다. 얼라인-2 프로그램은 제넨테크사(South San Francisco, California)를 통해 공중 입수가능하거나, 본원에서 제공하는 소스 코드로부터 컴파일(compile)될 수 있다. 얼라인-2 프로그램은 사용을 위해 유닉스 작동 시스템, 바람직하게는 디지탈 유닉스 V4.0D 상에서 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 얼라인-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 변화될 수 없다.

본원의 목적을 위해서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 비한 또는 대비한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(이는 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 비한 또는 대비한 특정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 달리 표현될 수 있음)은 다음 식과 같이 계산된다:

100 × 분수 X/Y

여기서, X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 얼라인-2에 의해 동일한 쌍으로서 계수된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B중의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B 에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않다는 것이 이해될 것이다. % 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 도 3A-B는 "비교단백질"로 지정된 아미노산 서열 대 "PRO"로 지정된 아미노 산 서열의 % 아미노산 서열 동일성을 계산하는 방법을 나타내었다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기와 같이 얻어진다. 그러나, % 아미노산 서열 동일성은 또한 서열 비교 프로그램 NCBI-블라스트2(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3398-3402(1997))을 사용하여 결정할 수 있다. NCBI-블라스트2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-블라스트2는 몇개의 검색 파라미터를 사용할 수 있고, 여기서, 모든 이들 파라미터는 디펄트(default) 값(예를 들어, [unmask=yes, strand=all, expected occurrence=10, minimum low complexity length=15/5, multi-pass e-value=0.01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment =25 및 scoring matrix=BLOSUM62]을 포함함)으로 설정된다.

NCBI-블라스트2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 비한 또는 대비한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(이는 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 비한 또는 대비한 특정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 달리 표현될 수 있음)은 다음 식과 같이 계산된다:

100 ×분수 X/Y

여기서, X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-블라스트 2에 의해 동일한 쌍으로서 세어지는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B중의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동 일하지 않은 경우, B 에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않다는 것이 이해될 것이다.

"EG-VEGF 변종 폴리뉴클레오티드" 또는 "EG-VEGF 변이 핵산 서열"은 (a)도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF 폴리펩티드 잔기 1 또는 약 20 내지 105를 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 105(여기서, X는 도 2(서열 번호 2)의 14 내지 24개의 임의의 아미노산 잔기임)를 코딩하는 핵산 서열, 또는 (c) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 아미노산 서열의 또다른 특정적으로 얻어진 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖고 하기 정의된 바와 같은 활성 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 일반적으로, 이러한 EG-VEGF 변종 폴리뉴클레오티드는 (a) 잔기 1 또는 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF 폴리펩티드 약 20 내지 105개를 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 105개(여기서, X는 도 2(서열 번호 2)의 14 내지 24개의 임의의 아미노산 잔기임)를 코딩하는 핵산 서열, 또는 (c) 도 2(서열 번호 2)에 나타낸 또다른 특정적으로 얻어진 아미노산 서열의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 81% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 82% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 83% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 84% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 85% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 86% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 87% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 88% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 89% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 91% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 92% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 93% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 94% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 96% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 핵산 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 98% 이상의 핵산 서열 동일성 및 더 바람직하게는 약 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖을 수 있다. EG-VEGF 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 EG-VEGF 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.

일반적으로, EG-VEGF 변종 폴리뉴클레오티드는 약 30이상의 뉴클레오티드 길이, 흔히 약 60 이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 90이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 120이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 150이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 180이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 210이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 240이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 270이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 300이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 450이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 600이상의 뉴클레오티드 길이, 더 흔히 약 900이상의 뉴클레오티드 길이 및 그 이상이다.

본원에서 확인된 EG-VEGF 폴리펩티드 코딩하는 핵산 서열에 관한 "퍼센트(%) 핵산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 최대 퍼센트 서열 동일성을 얻기 위해서 필요하다면 갭을 도입시킨후, EG-VEGF 폴리펩티드 코딩하는 핵산 서열중의 뉴클레오 티드와 동일한 후보 서열중의 뉴클레오티드의 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 핵산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당업계내의 다양한 방법, 예를 들어, 블라스트, 블라스트-2, 얼라인, 얼라인-2 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어 같은 공중 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 얻어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 얻는데 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 핵산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 얼라인-2를 이용하여 하기와 같이 얻을 수 있고, 여기서, 얼라인-2 프로그램을 위한 완전한 소스 코드는 하기에 제공된다. 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크사(Genetech. Inc.)가 저자이며, 하기에 나타낸 소스 코드는 미국 저작권청(Washington D.C., 20559 소재)에 사용자 참고문서와 함께 제출되었으며, 이는 미국 등록저작권 제 TXU510087호로 등록되었다. 얼라인-2 프로그램은 제넨테크사(South San Francisco, California)를 통해 공중 입수가능하거나, 하기 제공하는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. 얼라인-2 프로그램은 이용을 위해 유닉스 작동 시스템, 바람직하게는 디지탈 유닉스 V4.0D 상에서 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 얼라인-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 변화될 수 없다.

본원의 목적을 위해서, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 비한 또는 대비한 주어진 핵산 서열 C의 % 핵산 서열 동일성(이는 주어진 핵산 서열 D에 대한, 비한 또는 대비한 특정한 % 핵산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 달리 표현될 수 있음)은 다음 식과 같이 계산된다:

100 ×분수 W/Z

여기서, W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 얼라인-2에 의해 동일한 쌍으로서 계수된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D중의 뉴클레오티드의 전체 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 % 핵산 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 핵산 서열 동일성과 같지 않다는 것이 이해될 것이다. % 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 도 3C-D는 "비교 DNA"로 지정된 핵산 서열 대 "프로-DNA"로 지정된 핵산 서열의 % 핵산 서열 동일성을 계산하는 방법을 나타내었다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 % 핵산 서열 동일성 값은 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기와 같이 얻어진다. 그러나, % 핵산 서열 동일성은 또한 서열 비교 프로그램 NCBI-블라스트2(Altschul et al., Nucleic Acids Res . 25:3389-3402(1997))을 사용하여 결정할 수 있다. NCBI-블라스트2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-블라스트2는 몇개의 검색 파라미터를 사용할 수 있고, 여기서, 모든 이들 파라미터는 디펄트(default) 값(예를 들어, [unmask=yes, strand=all, expected occurrence=10, minimum low complexity length=15/5, multi-pass e-value=0.01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment =25 및 scoring matrix=BLOSUM62]을 포함함)으로 설정된다.

NCBI-BLAST2가 서열 비교를 위하여 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 비한, 또는 대비한 주어진 핵산 서열 C의 % 핵산 서열 동일성 (주어진 핵산 서 열 D에 대한, 비한 또는 대비한 특정한 % 핵산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 달리 일컬어질 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:

100 ×분수 W/Z

여기서 W는 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 C 및 D의 프로그램의 정렬에서 동일한 쌍으로 계수된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D 중의 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 % 핵산 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 핵산 서열 동일성과 같지 않을 것으로 이해될 것이다.

다른 실시태양에서, EG-VEGF 변종 폴리뉴클레오티드는 활성 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하고, 도 2 (서열 번호:2)에 나타낸 전장 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 바람직하게는 가혹한 혼성화 및 세척 조건 하에서 혼성화할 수 있는 핵산 분자이다. EG-VEGF 변종 폴리펩티드는 EG-VEGF 변종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 것일 수 있다.

"양성"이라는 용어는, 상기한 대로 수행되는 아미노산 서열 동일성 비교의 경우, 비교되는 서열에서 동일한 아미노산 잔기 뿐만 아니라 유사한 성질을 갖는 것을 포함한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성 값을 얻은 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산과 동일한 것 또는 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환이 있는 것 (하기 표 1에 정의됨)이다.

본원의 목적을 위하여, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 비한 또는 대비한 주어진 아미노산 서열 A의 양성의 % 값 (주어진 아미노산 서열 B에 대한, 비한 또 는 대비한 특정 % 양성 값을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 언급될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:

100 ×분수 X/Y

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 상기 정의한 바와 같은 양성 값을 얻은 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 양성은 A에 대한 B의 % 양성과 같지 않을 것으로 이해될 것이다.

"단리된"이라는 용어는 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기재하기 위하여 사용될 때 그의 자연적 환경의 구성성분으로부터 동정되고 분리되고(되거나) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 그가 자연적으로 결합된 모든 성분과의 결합이 없다. 자연적 환경의 오염된 성분은 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 용도에 통상적으로 간섭할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질 또는 비단백질 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 비환원 또는 환원 조건 하에서 코마시 블루 (Coomassie blue) 또는 바람직하게는 실버 스테인을 사용하는 SDS-PAGE에 의한 동질성까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 그대로 있는 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 EG-VEGF 자연적 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 보통은 단리된 폴리펩티드 는 1 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 EG-VEGF 코딩 핵산의 천연 공급원에서 보통 결합되는 1 이상의 오염된 핵산 분자로부터 동정되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연적으로 결합되는 모든 성분과의 결합이 없다. 단리된 EG-VEGF를 코딩하는 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 것이다. 단리된 핵산 분자는 그러므로 천연 세포에 존재하는 EG-VEGF 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자는, 예를 들면 핵산 분자가 천연 세포와는 다른 염색체 위치에 있는 보통 EG-VEGF를 발현하는 세포 내에 함유되어 있는 EG-VEGF 코딩 핵산 분자를 포함한다.

"조절 서열"이라는 용어는 특정 숙주 개체 내의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 말한다. 원핵세포에 적합한 조절 서열은 예를 들면 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인헨서를 사용하는 것으로 알려졌다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 프리서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인헨서는 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된다"는 것은 연결되는 DNA 서열이 근접해 있고, 분비 리더의 경우에는 근접해 있고 리딩 페이스 (reading phase)에 있다. 그러나, 인헨서는 근접해 있을 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서의 결합 (ligation)에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상의 방법에 따라 사용한다.

"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 예를 들면 단일 안티-EG-VEGF 모노클로날 항체 (효능제, 길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토픽 특이성을 갖는 안티-EG-VEGF 항체 조성물, 단일 사슬 안티-EG-VEGF 항체, 및 안티-EG-VEGF 항체의 단편 (하기 참조)을 포함한다. 본원에 사용되는 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 집단, 즉 그 집단을 이루는 각 항체가 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일한 집단으로부터 얻은 항체를 말한다.

혼성화 반응의 "가혹도(stringency)"는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 탐침의 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 의존한 실험적 계산이다. 일반적으로, 더 긴 탐침은 적당한 어닐링(annealing)을 위한 더 높은 온도를 필요로 하는 반면, 더 짧은 탐침은 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 변성된 DNA가 그의 용융 온도 미만의 환경에서 상보 가닥이 존재할 때 재어닐링되는 능력에 의존한다. 탐침과 혼성화가능한 서열 간의 원하는 상동성의 정도가 더 높을 때, 사용될 수 있는 상대 온도가 더 높다. 그 결과, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 더 가혹하게 만드는 경향이 있고, 낮은 온도는 덜 가혹하게 하는 경향이 있다. 혼성화 반응의 가혹도에 대한 더 자세한 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조하라.

본원에 기재된 "가혹한 조건" 또는 "매우 가혹한 조건"은 (1) 낮은 이온 농도 및 세척을 위한 높은 온도, 예를 들면 50℃에서 0.015 M 염화 나트륨/0.0015 M 구연산 나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 중 포름아미드와 같은 변성화제, 예를 들면 42℃에서 0.1% 소혈청 알부민/0.1% 피콜 (Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750mM 염화나트륨, 75 mM 구연산 나트륨을 포함하는 pH 6.5의 50 mM 인산 나트륨 완충액을 포함하는 50% (v/v) 포름아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 ×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 구연산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨 (pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5 ×데나르트 (Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 스펌 DNA (50 g/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃의 0.2 ×SSC (염화 나트륨/구연산 나트륨) 및 55℃의 50% 포름아미드로 세척한 후, 55℃의 EDTA를 함유하는 0.1 ×SSC로 이루어지는 매우 가혹한 세척을 하는 것으로 정의될 수 있다.

"중등도의 가혹한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 방법으로 정의될 수 있고, 상기한 것보다 덜 가혹한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들면 온도, 이온 강도 및 % SDS)을 포함한다. 중등도의 가혹한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 ×SSC (150 mM NaCl, 15mM 구연산 삼나트륨), 50 mM 인산 나트륨 (pH 7.6), 5 ×데나르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 mg/ml 변성 및 전단된 연 어 스펌 DNA를 포함하는 용액 내에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 약 37-50℃의 1 ×SSC에서 필터를 세척한다. 당업자는 탐침 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위하여 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 것이다.

본원에 사용된 "태그된 (tagged) 에피토프"라는 용어는 "태그 폴리펩티드"에 융합된 EG-VEGF 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 그가 융합되는 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않도록 바람직하게는 상당히 특이적이다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 갖고 보통 약 8 내지 50 개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 10 내지 20 개의 아미노산 잔기)를 갖는다.

본원에 사용되는 용어 "면역어드헤신 (immunoadhesin)"이라는 용어는 이형 단백질의 결합 특이성 ("adhesin")을 면역글로불린 일정 도메인 (constant domain)의 이펙터 (effector) 기능과 결합시키는 항체-유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외 (즉 "이형")의 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 일정 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 근접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신에서 면역글로불린 일정 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들면 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2를 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻 을 수 있다.

본원의 목적을 위해서 "활성의" 또는 "활성"은 천연의 또는 자연발생하는 EG-VEGF의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 EG-VEGF의 형태를 말하고, 여기서 "생물학적" 활성은 천연의 또는 자연발생하는 EG-VEGF가 소유하는 항원 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력 이외에 천연의 또는 자연발생하는 EG-VEGF에 의해 야기되는 생물학적 기능 (억제성 또는 흥분성)을 말하고, "면역학적"활성은 천연의 또는 자연발생하는 EG-VEGF가 소유하는 항원 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력을 말한다. 생물학적 활성은 구체적으로 세포 증식 및 주화성의 조절을 포함한다. 바람직한 생물학적 활성은 내피 세포의 생산, 성장, 분화 및(또는) 이동을 조절하는 능력이다. 더욱 바람직하게는, 생물학적 활성은 내분비선 내의 모세혈관 내피 세포, 바람직하게는 스테로이드 생산 세포에서 증식, 이동 및(또는) 투과 (fenestration)를 유도하는 능력이다. 다른 바람직한 생물학적 활성은 내분비선, 특히 내분비선 내의 스테로이드 생산 조직에서 혈관생성을 촉진하고(하거나) 혈관 투과성을 조절하는 능력이다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은 세포 증식 및(또는) 생존에 관여된, MAP 키나아제, 예를 들면 ERK1 또는 ERK2와 같은 신호 분자의 인산화를 유도하는 능력이다.

"혈관생성"이라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 내피 전구 세포가 이동, 증식, 세포-세포 결합, 집합 및 형태형성 (morphogenesis) (혈관형성 (vasculogenesis)이라고도 불림)을 통하여 혈관으로 디노보 (de novo) 집합되는 것과 같이, 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 생성을 포함한다.

"길항제"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 본원에 개시된 천연 EG-VEGF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 봉쇄, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함한다. 같은 방식으로, "효능제"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고 본원에 개시된 천연 EG-VEGF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 모든 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는 구체적으로 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 EG-VEGF 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변종체, 펩티드, 작은 유기 분자 등을 포함한다. EG-VEGF 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 EG-VEGF 폴리펩티드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키고 EG-VEGF 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 1 이상의 생물학적 활성에 있어서 감지할 수 있는 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

"치료"는 치료 및 예방 조치 모두를 말하고, 여기서 그 목적은 목적하는 병리 상태 또는 장애를 예방하거나 완화 (감소)시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애를 갖고 있는 대상 및 장애를 갖기 쉬운 대상 또는 장애가 예방될 대상을 의미한다. 예를 들면, 종양 (예를 들면, 암)의 치료에 있어서, 치료제는 종양 세포의 병리를 직접 감소시키거나 종양 세포가 다른 치료제, 예를 들면 방사선 및(또는) 화학요법에 의한 치료에 더 민감하도록 할 수 있다.

"스테로이드 생성 (steroidogenesis)"은 호르몬에 의해 유도되고 CAMP로 매개되는, "스테로이드 생성 세포"에서의 스테로이드 호르몬 생합성의 급성 조절이고, "스테로이드 생성 세포"는 콜레스테롤이 세포 저장소로부터 미토콘드리아 외막으로 이동하고, 콜레스테롤의 프레그네놀론으로의 전환이 일어나는 내막으로 콜레 스테롤이 전위 (translocation)되는 것을 특징으로 한다.

"스테로이드 생성 조직"은 스테로이드 생성 절차에 의해 스테로이드 호르몬을 생산하는 조직을 말한다. 그 예는 부신, 생식 기관, 소화관 및 기도의 조직을 포함한다.

"만성" 투여는 급성 방식과는 반대로 연속 방식으로 약제를 투여함으로써 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 행해지는 것이 아니고, 오히려 성질상 주기적인 치료이다.

치료의 목적을 위한 "포유류"는 인간, 다른 고등 영장류, 가축 및 양육 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들면 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 오리, 토끼 등을 포함하는 포유류로 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

본원에 사용되는 "종양"은 악성 또는 양성의 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.

"암" 및 "암성"이라는 용어는 통상적으로 조절되지 않는 세포 성장이 특징인 포유류에서의 생리 상태를 지칭하거나 묘사한다. 본원에서 특히 관심있는 암의 예는 생식 기관의 암, 예를 들면 난소암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암; 전립선암; 부신 피질 (예를 들면, 부신피질암) 및 부신 수질의 암을 포함하는 부신의 암; 갑상선암; 부갑상선암; 췌장암; 및 자궁내막암을 포함한다.

질병의 "병리"는 환자의 건강을 위협하는 모든 현상을 포함한다. 암에 있어서는, 이는 제한 없이 비정상 또는 비조절성 세포 증식, 전이, 인접 세포의 정상 기능의 방해, 사이토킨 또는 다른 분비물의 비정상적 수준으로의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화 등을 포함한다.

1 이상의 추가적 치료제와 "조합으로" 투여한다는 것은 동시 (일시) 투여 및 임의의 순서의 연속적 투여를 포함한다.

본원에 사용된 "담체"는 사용된 용량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유류에 비독성인 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 생리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충 수용액인 경우가 많다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충액, 예를 들면 인산, 구연산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량 (10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 아미노산, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 당알콜, 예를 들면 만니톨 또는 소르비톨; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 및(또는) 비이온성 계면 활성제, 예를 들면 TWEEN^TM, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스 (PLURONICS^TM)을 포함한다.

"항체 단편"은 손상되지 않은 항체의 부분, 바람직하게는 손상되지 않은 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디 (diabodies); 직선 항체 (linear antibodies) (Zapata et al., Protein Eng . 8(10): 1057-1062 (1995)); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 (multispecific) 항체를 포함한다.

항체의 파파인 분해에 의해 각각 단일 항원-결합 부위를 포함하는, "Fab" 단편으로 불리는 두개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (쉽게 결정화되는 능력을 나타내는 표시임)이 생산된다. 펩신 처리하면 두개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원과 교차결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 갖는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하고 비-공유적으로 결합되어 있는 하나의 중쇄 (heavy-chain) 및 하나의 경쇄 (light-chain) 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이는 각 가변 도메인의 세개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 한정하는 배위로 있다. 총체적으로, 6 개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 단지 세개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)이라도 전체 결합 부위에 비하여 낮은 친화성으로이지만 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 일정한 도메인 및 중쇄의 제1 일정 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 1 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇의 잔기가 첨가됨으로써 Fab' 단편과 구별된다. Fab'-SH는 본원에서 일정 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올기를 갖는 Fab'를 의미한다. F(ab')₂ 항체 단편은 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 원래 생성되었다.

임의의 척추동물로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 이들의 일정 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파 및 람다로 불리는 두 개의 뚜렷이 구별되는 유형 중의 하나로 정해질 수 있다.

이들의 중쇄의 일정 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 다른 부류로 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 다섯개의 주요 부류가 있고 (IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM), 이들 중 일부는 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2와 같이 다시 소부류 (isotype)로 나누어질 수 있다.

"단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. sFv의 검토를 위해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조하라.

"디아바디 (diabodies)"라는 용어는 두개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 말하는 것으로서, 이 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL)에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일 사슬 상에서 두 도메인 간에 쌍을 이루기에는 너무 작은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 다른 사슬의 상보 도메인과 쌍을 이루게 되며 두 개의 항원 결합 부위를 생성한다. 디아바디는 예를 들면 EP 404,097호; WO 93/11161호; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리되고(되거나) 회수된 것이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정하여 95 중량% 초과의 항체, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 15 잔기 이상의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 얻기 충분한 정도, 또는 (3) 쿠마지 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의하여 균일한 정도로 정제될 수 있다.

본원에서 사용된 "라벨"이라는 용어는 "라벨링된" 항체를 얻을 수 있도록 항체에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 라벨은 단독으로 검출될 수 있거나 (예: 방사성동위원소 라벨 또는 형광 라벨), 또는 효소성 라벨의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.

"고상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상의 예로는 부분적으로 또는 완전히 유리 (예: 조절형 공극 유리), 폴리사카라이드 (예: 아가로즈), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 들 수 있다. 특정 실시태양에서, 정황에 따라서, 고상은 검정 플레이트의 웰을 포함할 수 있고, 기타 정제 칼럼 (예: 친화도 크로마토그래피 칼럼)이 있다. 상기 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기술된 것과 같은 이산성 입자의 불연속 고상을 포함한다.

"리포솜"은 포유동물에 대한 약물 (예; EG-VEGF 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)의 송달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 소포체이다. 리포솜의 성분은 생물막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형태로 통상적으로 배열된다.

"소분자"는 본원에서 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.

본원에서 사용된 용어 "혈관 내피 세포 성장 인자", "VEGF", "VEGF 폴리펩티드" 및 "VEGF 단백질"은 천연 서열 VEGF 및 VEGF 변종 (이하 추가 정의함)을 포함한다. VEGF 폴리펩티드는 다양한 원천, 예를 들면 인간 조직 유형, 또는 다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합법 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다.

"천연 서열 VEGF"는 천연으로부터 유래한 VEGF와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 VEGF는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성적 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 VEGF"는 구체적으로 VEGF의 자연 발생 절단 또는 분비형 (예: 세포외 도메인 서열), 자연 발생 변종형 (예: 별도 스플라이싱 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변종을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에서, 천연 서열 VEGF는 예를 들면 미국 특허 제5,332,671호 및 동 제 5,240,848호; PCT 공개 WO 98/10071, 문헌[Leung et al., Science246:1306-1309 (1989); 및 Keck et al., Science248:1309-1312 (1989)]에 기술된 것과 같은 각각 121, 145, 165, 189 및 206 아미노산 잔기로 이루어지는 5개의 공지된 동형 중 하나이다.

"VEGF 변종 폴리펩티드"는 천연 서열 VEGF의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 하기 정의하는 활성 VEGF 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 VEGF 변종 폴리펩티드는 예를 들면, 천연 서열의 N- 및(또는) C-말단에서 뿐만 아니라 1 이상의 내부 도메인 중에서 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가 또는 결실된 VEGF 폴리펩티드를 포함한다.

VEGF에 대한 서열 동일성 (아미노산 또는 핵산)은 EG-VEGF에 대하여 구체적으로 기술된 동일한 접근법을 사용하여 측정된다. 유사하게, 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 EG-VEGF의 아고니스트 또는 길항제에 대한 정의가 VEGF 아고니스트 및 길항제에 적용될 수 있다.

II. 본 발명의 조성물 및 방법

A. 전장 EG - VEGF 폴리펩티드

본 발명은 EG-VEGF (또는 UNQ600)으로 본원에서 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 신규하게 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 하기 실시예에서 보다 상세히 개시되는 바와 같이 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA가 확인되고 단리되었다. 별도 발현 주기에서 생산되는 단백질은 상이한 PRO 숫자를 얻으나, UNQ 숫자는 모든 주어진 DNA 및 코딩되는 단백질에 대해 특징적이고 변화될 수 없음을 주목하였다. 그러나, 간단하게는, 본원에서 DNA60621-1516에 의해 코딩되는 단백질 뿐만 아니라 상기 EG-VEGF의 정의에 포함되는 모든 추가 천연 상동체 및 변종이 이들의 기원 또는 제조 양식에 관계없이 "EG-VEGF"로 지칭될 수 있다.

하기 실시예에 개시하는 바와 같이, 본원에서 DNA60621-1516로 지정된 cDNA 클론은 ATCC에 기탁되었다. 클론의 실제 뉴클레오티드 서열은 당업계에 통상적인 방법을 사용하여 기탁된 클론을 서열분석하는 것에 의해 당업자가 용이하게 측정할 수 있다. 본원의 EG-VEGF 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산에 대하여, 본 출원인은 당시 이용가능한 서열 정보로 최선의 확인가능한 리딩 프레임인 것으로 여겨지는 것이 무엇인지를 확인하였다.

상기 ALIGN-2 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 전장 천연 서열 EG-VEGF (도 2 및 서열 번호 2에 나타냄)가 블랙 맘보(black mambo) 독의 단백질인 EG-VEGF_DENPO와 일정한 아미노산 서열 동일성을 가짐을 발견하였다. 그러나, 모든 공지된 포유동물 단백질에 대한 유의한 서열 동일성은 밝혀지지 않았다.

B. EG - VEGF 변종

본원에 기술된 전장 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드 이외에, EG-VEGF 변종을 제조할 수 있는 것으로 여겨진다. EG-VEGF 변종은 적합한 뉴클레오티드 변화의 EG-VEGF DNA로의 도입, 및(또는) 요망되는 EG-VEGF 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키거나 막 고정(anchoring) 특성을 변화시키는 것과 같이 EG-VEGF의 후해독 과정을 변경할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

천연 전장 서열 EG-VEGF 또는 본원에 기술된 EG-VEGF의 다양한 도메인에서의 변이는 예를 들면 미국 특허 제5,364,934호에 나타낸 보존성 및 비보존성 돌연변이에 대한 모든 기술 및 지침을 사용하여 제조될 수 있다. 변이는 천연 서열 EG-VEGF와 비교하여 EG-VEGF의 아미노산 서열에서 변화를 야기하는 EG-VEGF를 코딩하 는 서열 1 이상의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 EG-VEGF의 도메인 1 이상의 모든 다른 아미노산 내의 1 이상의 아미노산의 치환에 의한 것이다. 요망되는 활성에 부정적인 영향을 주지않고 어느 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 측정하는 지침은 EG-VEGF의 서열을 상동적 공지 단백질 분자와 비교하고 고상동성 영역에 일어나는 아미노산 서열 변화를 최소화하는 것에 의해 알 수 있다. 아미노산 치환은 류신의 세린으로의 대체와 같이 1개의 아미노산을 유사한 구조적 및(또는) 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것에 의해 일어날 수 있다 (즉, 보존성 아미노산 대체). 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산의 범위일 수 있다. 허용되는 변이는 서열 중의 아미노산을 계획적인 삽입, 결실 또는 치환하고, 얻은 변종을 전장 또는 완전 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 시험하는 것에 의해 측정될 수 있다.

본원에서는 EG-VEGF 폴리펩티드 단편이 제공된다. 이러한 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있거나, 또는 예를 들면 전장 천연 서열과 비교하여, 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 단편은 EG-VEGF 폴리펩티드의 요망되는 생물학적 활성에 대해 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된다.

EG-VEGF 단편은 모든 여러 통상적 기술에 의해 제조될 수 있다. 요망되는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 별도 접근법은 특정 아미노산 잔기에 의해 한정된 부위에서 단백질을 분해하는 것으로 알려진 효소로 단백질을 처리하거나, 또는 적합한 제한 효소로 DNA를 소화시키고 요망되는 단편을 단리하는 것에 의한 것 등 효소적 소화에 의해 EG-VEGF 단편을 생성하는 것을 포함한다. 또 다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 요망되는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리 및 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 요망되는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 이용된다. 바람직하게는 EG-VEGF 단편은 도 2 (서열 번호 2)에 나타낸 천연 EG-VEGF 폴리펩티드와 1 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.

특정 실시태양에서, 중요 보존성 치환은 바람직한 치환을 표제로 하여 표 1에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성을 일으킨다면, 추가의 실질적 변화, 표 1에서 명명한 예시적 치환 또는 아미노산 분류로 하기 추가로 기술한 것이 도입되고 산물이 스크리닝된다.

기원 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys;gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucine	leu
Leu (L)	norleucine; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucine	leu

EG-VEGF의 기능 또는 면역학적 특성의 실질적 변형은 (a) 치환 부분에서의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 쉬트 또는 나선형 입체형태, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 체적을 유지하는 효과가 상당히 상이한 치환을 선택하는 것에 의해 이루어진다. 자연 발생 잔기는 공통적 측쇄 성질에 기초하여 하기 군으로 나누어진다:

(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 측쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존성 치환은 이들 분류 중 하나의 일원을 다른 군으로 교환하는 것을 수반한다. 상기 치환된 잔기는 또한 보존성 치환 부위, 또는 더욱 바람직하게는, 나머지 (비보존) 부위로 도입될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이발생, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이발생과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 변이를 일으킬 수 있다. 위치 지정 돌연변이발생 [Carter et al., Nucl . Acids Res ., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl . Acids Res ., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이발생 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이발생 [Wells et al., Philos . Trans. R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지 기술을 클론된 DNA에 수행하여 EG-VEGF 변종 DNA를 얻을 수 있다.

스캐닝 아미노산 분석을 적용하여 또한 근접(contiguous) 서열을 따른 1 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 상대적으로 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 이상의 측쇄가 없고 변종의 주쇄 입체배열을 변화시킬 가능성이 적으므로 [Cunningham and Wells, Science, 244; 1081-1085 (1989)] 상기 군 중에서 통상적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다. 알라닌은 가장 흔한 아미노산이므로 또한 통상적으로 바람직하다. 나아가, 이는 숨겨진 위치 및 노출된 위치 모두에서 흔히 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol . Biol ., 150:1(1976)]. 알라닌 치환으로 적합한 양의 변종을 얻지 못한다면, 이소테릭(isoteric) 아미노산이 사용될 수 있다.

C. EG - VEGF 의 변형

EG-VEGF의 공유적 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 공유적 변형의 한 유형은 EG-VEGF의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도제와 EG-VEGF 폴리펩티드의 표적화 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이기능제(bifunctional agent)로의 유도는 예를 들면 항-EG-VEGF 항체의 정제 방법에 유용한 수불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 EG-VEGF를 가교결합하는 것 (및 그 역의 경우)에 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는, 예를 들면 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (예: 4-아지도살리실산과의 에스테르), 호모이기능성 이미도에스테르 (3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함함), 이기능성 말레이미드 (예: 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄) 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피온이미데이트)와 같은 시약을 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 및 트레오닐 잔기의 히드록실기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

본 발명의 범위 내에 포함되는 EG-VEGF 폴리펩티드의 공유적 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 본원에서 천연 서열 EG-VEGF에서 발견되는 1 이상의 탄수화물 부분을 결실 (잠재 글리코실화 부위를 제거하거나, 또는 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 없애는 것에 의함), 및(또는) 천연 서열 EG-VEGF에 존재하지 않는 1 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 부위의 성질 및 비율에서의 변화를 포함하는, 천연 단백질의 글리코실화에서의 정량적 변화를 포함한다.

EG-VEGF 폴리펩티드로의 글리코실화 부위의 첨가는 아미노산 서열을 변경하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, (O-결합 글리코실화 부위에 대하여) 천연 서열 EG-VEGF로 1 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가 또는 치환하는 것에 의해 변경을 일으킬 수 있다. EG-VEGF 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통해, 구체적으로 요망되는 아미노산으로 해독될 수 있도록 코돈을 생성하도록 미리선택된 염기에서 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시키는 것에 의해 임의로 변경될 수 있다.

EG-VEGF 폴리펩티드 상의 탄수화물의 수를 증가시키는 다른 방법은 폴리펩티드에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 상기 방법은 당업계, 예를 들면 WO 87/05330 (1987년 9월 11일 공개), 및 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev . Biochem ., pp.259-306 (1981)]에 기술되어 있다.

EG-VEGF 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화에 대한 표적으로 작용하는 아미노산 서열을 코딩하는 코돈의 돌연변이적 치환에 의해 이루어질 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[Hakimuddin, et al., Arch . Biochem . Biophys., 259:52 (1987); 및 Edge et al., Anal . Biochem ., 118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드상의 탄수화물 부분의 효소적 분해는 문헌[Thotakura et al., Meth . Enzymol ., 138:350 (1987)]에 기술된 바와 같은 여러 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

EG-VEGF의 공유적 변형의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,182호 또는 제4,179,337호에 나타낸 방식으로 여러 비단백성 중합체 (예: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌) 중 하나에 EG-VEGF 폴리펩티드를 연결하는 것을 포함한다.

본 발명의 EG-VEGF는 또한 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 EG-VEGF를 포함하는 키메릭 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수 있다.

일 실시태양에서, 이러한 키메릭 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 EG-VEGF의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 EG-VEGF의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. EG-VEGF의 이러한 에피토프-태그된 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토그 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화도 매트릭스에 의해 EG-VEGF가 용이하게 정제되게 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 [Field et al., Mol . Cell. Biol ., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evans et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]을 들 수 있다. 다른 태그 플로펩티드로는 플래그(Flag)-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; 튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem ., 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:6393-6397 (1990)]을 들 수 있다.

별법적 실시태양에서는, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과의 EG-VEGF의 접합(fusion)을 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("면역접착"이라고도 함)에 대하여, 상기 접합은 IgG 분자의 Fc 영역에 대하여 될 수 있다. Ig 접합은 Ig 분자 내의 1 이상의 가변 영역의 위치에서 EG-VEGF의 가용성(결실 또는 불활성화된 막통과부위(transmembrane domain)) 형태의 치환을 포함하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시태양에서는, 면역글로불린 접합은 IgG1 분자의 경첩(hinge), CH2 및 CH3, 또는 경첩, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 또한, 면역글로불린 접합의 생성에 대해서는 미국특허 제5,428,130호(1995. 6.27 허여)을 참조하라.

D. EG - VEGF 의 제조

하기 기재는 기본적으로 EG-VEGF 핵산을 함유하는 벡터로 변형 또는 트랜스펙셔닝된 세포를 배양하여 EG-VEGF를 생성하는 것에 관한 것이다. 물론, 당업계에 잘 알려진 별법을 이용하여 EG-VEGF를 제조하는 것도 고려된다. 예를 들어, EG-VEGF 서열, 또는 그의 부분들을 고상 기술(solid-phase)을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다(문헌 [Stewart et al., Solid - Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 생체내 단백질 합성을 수동기술을 이용하거나 자동화에 의해 행할 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 제조자 지시(manufacturer's instructions)를 이용하는 어플라이드 바이오시스템 펩티드 신시사이저(Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City, CA))를 이용하여 행할 수 있다. EG-VEGF의 다양한 부분들은 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 결합시켜, 전장 EG-VEGF를 생성할 수 있다.

1. EG - VEGF 코딩 DNA 의 단리

EG-VEGF 코딩 DNA를 EG-VEGF mRNA를 지니고 이것을 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 EG-VEGF DNA는 실시예에 기재된 바와 같이, 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 얻을 수 있다. EG-VEGF 코딩 유전자도 게놈 라이브러리로부터, 또는 공지된 합성 방법(예; 자동화 핵산 합성)에 의해 얻을 수 있다.

라이브러리들은 그에 의해 코딩된 단백질 또는 관련 유전자를 동정하기 위해 고안된 탐침(probe)(예; 적어도 약 20-80 염기의 EG-VEGF 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 항체)으로 선별할 수 있다. 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같이, 표준 방법을 이용하여 행할 수 있다. EG-VEGF 코딩 유전자를 단리하는 별법적 수단은 PCR 방법을 이용하는 것이다(상기 문헌(Sambrook 등); 문헌 [Dieffenbach et al., PCR Primer : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).

하기 실시예들은 cDNA 라이브러리를 선별하는 기술을 설명한다. 탐침으로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열들은 거짓 양성반응을 최소화하기에 충분한 길이이어야 하고, 충분히 명백해야 한다. 올리고뉴클레오티드는 선별되는 라이브러리 중의 DNA에 대해 혼성화시 검출될 수 있도록, 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, ³²P-표지 ATP와 같은 방사표지, 비오틴화(biotinylation) 또는 효소 표지의 이용을 포함한다. 적당한 엄밀도(stringency) 및 높은 엄밀도를 포함하는 혼성화 조건을 상기 문헌(Sambrook 등)에서 제공하고 있다.

상기 라이브러리 선별법에서 동정된 서열들은 GenBank와 같은 공공 데이터베이스 또는 기타 사설 서열 데이터베이스에서 기탁되고 이용가능한 기타 공지된 서열과 비교 및 제휴될 수 있다. 당업계에 공지된 방법 및 본 명세서에서 기술한 방법을 이용하여 분자의 정의된 영역 내 또는 전장 서열에 걸쳐 서열 동일성(아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)을 결정할 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 처음으로 본 명세서에 개시된 연역에 의한 아미노산 서열을 이용하는 선별된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선별하고, 필요하다면 상기 문헌(Sambrook 등)에서 기술한 바와 같은 통상적 프라이머 연장 방법을 이용하여 cDNA로 역전사되지는 않는 mRNA의 전구체 및 가공 중간체를 검출하여 얻을 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 변형

숙주 세포는 EG-VEGF 생성을 위해 본 명세서에서 기술되고 프로모터 유도, 트랜스포먼트(transformant) 선택 또는 목적 서열 코딩 유전자 증폭에 적절하게 변형된 통상적 영양 배지 중에서 배양된 발현 또는 클로닝 벡터로 트랜스펙셔닝되거나 변형된다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 과도한 실험 없이 당업계의 숙련자라면 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 극대화하기 위한 이론, 프로토콜 및 실용적 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 상기 문헌(Sambrook 등)에서 볼 수 있다.

진핵세포 트랜스펙션 및 원핵세포 변형 방법은 당업계의 통상적인 숙련자에게 공지되어 있다(예; CaCl₂, CaPO₄, 리포좀-매개 및 전기충격요법 (electroporation)). 사용되는 숙주 세포에 따라, 그 세포에 적당한 표준 기술을 이용하여 변형을 수행한다. 상기 문헌(Sambrook 등)에서 기술한 바와 같이, 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리 또는 전기충격요법이 원핵세포에 일반적으로 사용된다. 문헌 [Shaw et al., Gene , 23:315 (1983)] 및 WO89/05859(1989. 6.29 공개)에 기재된 바와 같이, 특정 식물 세포의 변형에 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로의 감염을 이용한다. 그러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, [Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주계의 일반적 양태는 미국특허 제4,399,216호에 기재된 바 있다. 대체로, 이스트로의 변형은 [Van Solingen et al., J. Bact ., 130: 946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc . Natl . Acad . Sci, (USA), 76: 3829 (1979)]의 방법에 따라 행한다. 그러나, 핵 마이크로주사, 전기충격요법, 접촉 세포와의 세균 원형질체(protoplast) 접합 또는 폴리양이온(예; 폴리브렌(polybrene), 폴리오르니틴(polyornithine))에 의한 방법과 같이, DNA를 세포내로 도입하는 기타 방법도 이용할 수 있다. 포유동물 세포 변형을 위한 다양한 기술을 위해, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)]을 참조하라.

본 발명에서 DNA를 클로닝 및 발현시키는데 적합한 숙주 세포로는 원핵세포, 이스트 또는 고등 진핵세포가 있다. 적합한 원핵세포로는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 진세균(eubacteria), 예를 들면, E.콜리와 같은 장내세균과(Enterobacteriaceae)를 포함하지만 이에 한하지 않는다. E.콜리 K12 균주 MM294(ATCC 31,446); E.콜리 X1776(ATCC 31,537); E.콜리 균주 W3110(ATCC 27,325) 및 K5 772(ATCC 53,635)와 같은 다양한 E.콜리 균주가 공개적으로 이용가능하다. 기타 적합한 원핵 숙주 세포로는 에스케리챠(예; E.콜리), 엔테로박터, 에르위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라(예; 살모넬라 티피무리움), 세라티아(예; 세라티아 마르세스칸스) 및 시겔라 뿐만 아니라 B. 섭틸리스 및 B.리케니포르미스(예; B.리케니포르미스 41P(1989. 4.12자로 공개된 DD 266,710에 개시))와 같은 바실리, P.아에루기노사와 같은 슈도모나스 및 스트렙토미세스가 있다. 이러한 예들은 제한적이라기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효를 위한 통상적 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모체(parent) 숙주이다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 최소량의 단백질 가수분해 효소를 분비한다. 예를 들면, 균주 W3110은 변성되어 숙주에 내재성인 단백질 코딩 유전자의 유전학적 변이를 초래하는데, 그러한 숙주의 예로는 완전 유전형 tonA를 갖는 E.콜리 W3110 균주 1A2; 완전 유전형 tonA ptr3을 갖는 E.콜리 W3110 균주 9E4; 완전 유전형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan'을 갖는 E.콜리 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244); 완전 유전형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan'을 갖는 E.콜리 W3110 균주 37D6; 카나마이신이 없는(non-kanamycin) 내성 degP 결실 변이를 갖는 균주 37D6인 E.콜리 W3110 균주 40B4; 및 미국특허 제4,946,783호(1990. 8.7 허여)에 개시된 돌연변이 세포질주위(periplasmic) 프로테아제를 갖는 E.콜리 균주가 있다. 별법으로는, 생체내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 기타 핵산 중합효소 반응이 적합하다.

원핵세포 이외에, 사상성 진균(filamentous fungi) 또는 이스트와 같은 진핵 미생물이 EG-VEGF 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 이외에는 스키조사카로미세스 폼베(Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139, 383(1985. 5. 2 공개)); 클루이베로미세스 숙주(미국특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991), 예를 들면 K.락티스(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742[1983]), K.프라길리스(ATCC 12,424), K.불가리쿠스(ATCCD 16,045), K.위케라미(ATCC 24,178), K.왈티(ATCC 56,500), K.드로소필라룸(ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8:135(1990)), K.테르모토레란스 및 K.마르시아누스; 야로위아(EP 402,226); 피치아 파스토리스(EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다; 트리코데르마 레에시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Case et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76:5259-5263 [1979]); 스완니오미세스, 예를 들면, 스완니오미세스 옥시덴탈리스(EP 394,538(1990. 10.31 공개)); 및 사상성 진균류, 예를 들면, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움(WO 91/00357, 1991. 1.10 공개). 및 아스페르길루스 숙주, 예를 들면, A. 니둘란스(Ballance et al., Biochem . Biophys . Res . Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 A.니게르(Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985])가 있다. 메틸로트로픽(methylotropic) 이스트는 본 발명에 적합하며, 한세눌라, 칸디다, 클로에케라, 피치아, 사카로미세스, 토룰롭시스 및 로도토룰라로 이루어진 속으로부터 선택된 메탄올에서 성장할 수 있는 이스트를 포함하지만 이에 한하지 않는다. 이러한 부류의 이스트의 예인 특정 종의 목록을 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 볼 수 있다.

글리코실화 EG-VEGF의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 차이니스 햄스터 난소세포(CHO) 및 COS 세포가 있다. 더 특정한 예로는 SV40에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양액 중에서 생육을 위해 서브클로닝된 293 세포(Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)); 마우스 지주세포(TM4, Mather, Biol . Reprod., 23:243-251 (1980)); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선종양(MMT 060562, ATCC CCL51)이 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 당업계의 숙련자 능력 범위 내에 있다.

3. 복제가능한 벡터의 선택 및 이용

EG-VEGF 코딩 핵산(예; cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터내에 삽입될 수 있다. 다양한 벡터들이 공개적으로 이용가능하다. 예를 들어, 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스성 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입시킬 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계의 공지기술을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클라아제 부위(들)에 삽입된다. 벡터 성분들은 일반적으로 1 이상의 신호 서열, 복제 기점, 1 이상의 표지 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 한하지 않는다. 1 이상의 이러한 성분들을 함유하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련자에게 공지된 표준 연결(ligation) 기술을 이용한다.

EG-VEGF는 직접적 재조합 뿐만 아니라, 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특정 분열 부위를 갖는 기타 폴리펩티드일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 접합 폴리펩티드로서 재조합으로 생성할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터에 삽입되는 EG-VEGF 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 상기 신호 서열은 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더(leader)의 군으로부터 선택된 원핵성 신호 서열일 수 있다. 이스트 분비의 경우, 신호 서열은 예를 들어 이스트 전화효소 리더, 알파 인자 리더(사카로미세스 및 클루이베로미세스 - 인자 리더 포함, 후자는 미국특허 제5,010,182호에 기재되어 있음) 또는 산 포스파타제 리더, C.알비칸스 글루코아밀라제 리더(EP 362,179, 1990. 4. 4 공개) 또는 WO 90/13646(1990. 11.15 공개)에 기재되어 있는 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열은 바이러스 분비 리더뿐만 아니라, 동일 또는 관련 종들의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열과 같이, 단백질의 직접 분비에 이용될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터 모두 벡터로 하여금 1 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 상기 서열들은 다양한 박테리아, 이스트 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하며, 2 플라스미드 기점은 이스트에 적합하고, 다양한 바이러스 기점들(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터 클로닝에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 대체로 선택 유전자(선택가능한 표지로 칭하기도 함)를 함유할 것이다. 전형적 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 테트라시클린에 내성을 제공하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합배지(예; 바실리를 위한 D-알라닌 라세마제 코딩 유전자)로부터 이용가능하지 않은 필수 영양물을 제공하는 단백질들을 코딩한다.

포유동물 세포를 위한 적합한 선택가능한 표지의 예는 DHFR 또는 티미딘 키나아제와 같은 EG-VEGF 코딩 핵산을 취할 수 있는 세포를 동정할 수 있는 것들이다. 야생형 DHFR을 이용할 경우 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고 전파된, DHFR 활성 결핍 CHO 세포주이다. 이스트에 사용하기에 적합한 선택 유전자는 이스트 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다[Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al, Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판 성장 능력이 결핍된 이스트의 돌연변이 균주(예; ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)])에 대한 선택 표지를 제공한다.

발현 및 클로닝 벡터들은 일반적으로 mRNA 합성을 지도하는 EG-VEGF 코딩 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터들은 잘 알려져 있다. 원핵 숙주로 사용하기에 적합한 프로모터로는 락타마제 및 락토스 프로모터 시스템[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터[deBoer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80:21-25 (1983)]가 있다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 EG-VEGF 코딩 DNA에 작동가능하게 연결된 신-달가노(Shine-Dalgarno(S.D.)) 서열을 함유할 것이다.

이스트 숙주와 사용하기 위한 적합한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나아제를 위한 프로모터[Hitzeman et al., J. Biol . Chem., 255:2073 (1980)] 또는 기타 당분해효소[Hess et al., J. Adv . Enzyme Reg ., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 엔올라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이성화효소, 3-포스포글리세레이트 자리옮김 효소, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 이성화효소, 포스포글루코스 이성화효소 및 글루코키나아제가 있다.

생육 조건에 의해 조절되는 전사의 추가 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 기타 이스트 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소들이다. 이스트 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 73,657에 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터 EG-VEGF 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두(fowlpox) 바이러스(UK 2,211,504, 1989. 7. 5 공개), 아데노바이러스(예; 아데노바이러스 2), 소의 파필로마 바이러스, 조류육종 바이러스, 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, B형간염 바이러스 및 유인원바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 및 열쇼크 프로모터로부터 얻어지는 프로모터에 의해 조절되나, 단 상기 프로모터들은 숙주 세포계와 상용성이다.

고등 진핵세포에 의한 EG-VEGF 코딩 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 안에 삽입하여 증가시킬 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 그 전사를 증가시키는, 일반적으로 약 10 내지 300bp인 DNA의 시스-작용 요소이다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자로부터 공지되어 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, -페토프로테인 및 인슐린). 그러나, 대체로, 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예로는 복제 기점의 후기 쪽에 대한 SV40 인핸서(bp 100-270), 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 쪽에 대한 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 인핸서는 EG-VEGF 코딩 서열에 대하여 5' 또는 3'위치에서 벡터로 분리될 수 있지만, 프로모터로부터 5'부위에 위치하는 것이 바람직하다.

또한, 진핵 숙주 세포(이스트, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 생물로부터의 핵형성된 세포)에 사용되는 발현 벡터는 mRNA를 안정화하고, 전사 종결시키는데 필요한 서열들을 함유할 것이다. 상기 서열들은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 번역되지 않은 영역으로서 통상적으로 5'로부터 이용가능하며, 때때로 3'으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 EG-VEGF 코딩 mRNA의 비번역된 부분 중 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양물에서 EG-VEGF의 합성에 적용하기에 적합한 기타 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.

4. 유전자 증폭/발현 검출

유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 서열에 기초하여, mRNA의 전사를 정량화하는 통상적 서던 블로팅(southern blotting), 노던(northern) 블로팅[Thomas, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트(dot) 블로팅(DNA 분석), 또는 동일반응계 혼성화(적절하게 표지된 탐침 이용)에 의해 직접적으로 샘플에서 측정할 수 있다. 별법으로는, DNA 중복부위(duplex), RNA 중복부위 및 DNA-RNA 혼성 중복부위 또는 DNA-단백질 중복부위를 포함하는 특정 중복부위를 인지할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 항체들은 차례로 표지될 수 있고, 표면에 중복부위의 형성시, 중복부위에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록, 중복부위가 표면에 결합되는 곳에서 분석을 행할 수 있다.

별법으로는, 유전자 발현은 세포 또는 조직 부분의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석과 같은 면역글로불린 방법에 의해 측정하여, 유전자 생성물의 발현을 직접 정량화할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 단클론성이거나 다클론성일 수 있고, 임의의 포유동물에게서 제조할 수 있다. 편리하게는, 항체는 EG-VEGF 폴리펩티드 음성 서열에 대하여 또는 본 명세서에서 제공하는 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대하여 또는 EG-VEGF DNA에 접합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대하여, 제조할 수 있다.

5. 폴리펩티드의 정제

EG-VEGF의 형태들은 배양 배지 또는 숙주세포 용혈물로부터 회수될 수 있다. 막부착되었다면, 적합한 세제용액(예, 트리톤-X-100)이나 효소적 분해를 이용하여 막으로부터 해리시킬 수 있다. EG-VEGF의 발현에 사용되는 세포는, 냉동-해동 순환법, 초음파분해법, 기계적 분해 또는 세포 용혈제와 같은 다양한 물리 화학적 수단으로 파괴시킬 수 있다.

EG-VEGF를 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하는 것이 소망스러울수 있다. 적합한 정제 공정의 예로는 다음과 같은 것이 있다: 이온교환칼럼상에서 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE과 같은 양이온교환칼럼상에서 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 설페이트 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 이용한 겔투과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질A 세파로스 칼럼; 및 에피토프-태그된 형태의 EG-VEGF를 부착시키기 위한 금속 킬레이트된 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지된 것이며, 예를 들어 문헌들[Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Valag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 스텝들은 예를 들어 사용된 생산 공정의 성격 및 생산되는 특정 EG-VEGF 성격에 의존적일 것이다.

E. EG - VEGF 의 용도

EG-VEGF를 코딩하는 핵산서열(또는 그 상보물)은 분자 생물학 분야에서 다양한 응용성을 갖는다. 그 예로는 염색체 맵핑 및 유전자 맵핑과, 안티센스 RNA 및 DNA 생성에서의 혼성화 프로브를 포함한다. EG-VEGF 핵산은 본문에 기재된 재조합 기술에 의해 EG-VEGF 폴리펩티드의 제조에 또한 유용할 것이다.

EG-VEGF 유전자의 전장 천연서열(SEQ ID NO:1) 또는 그 일부는 EG-VEGF는, cDNA 라이브러리의 혼성화 프로브로서 사용되어 전장 EG-VEGF cDNA를 단리하거나 또는 도1(SEQ ID NO:1)에 공개된 EG-VEGF와 소망하는 서열 동일성을 갖는 다른 cDNA 서열(예를 들어, 천연적으로 생성된 EG-VEGF의 변이체 또는 타종으로부터의 EG-VEGF를 코딩하는 것)을 단리하는데 사용될 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50개의 염기일 것이다. 혼성화 프로브는 SEQ ID NO:1의 핵산 서열 중 적어도 부분적으로 신규한 부위로부터 유도될 수 있는데, 이러한 부위는 과도한 실험없이도 결정될 수 있거나 또는 EG-VEGF 천연서열의 프로모터, 인핸서 요소들 및 인트론을 포함하는 유전자 서열로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 스크리닝법은 공지의 DNA 서열을 이용하여 약 40개 염기의 선택된 프로브를 합성하여 EG-VEGF 유전자의 코딩 부위를 단리하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는, ³²P 또는 ³⁵S, 또는 프로브에 아비딘/바이오틴 커플링 시스템에 의해 커플링된 알칼린 포스퍼타제와 같은 효소적 표지, 등의 다양한 표지로 표지화될 수 있다. 본 발명의 EG-VEGF 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 유전자 DNA 또는 mRNA의 라이브러리들을 스크리닝하여 상기 프로브가 이들 라이브러리의 어떤 군들과 혼성화하는지 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에 더 자세히 기술된다.

본 출원에서 공개된 임의의 EST 서열도 하기 공개된 방법을 이용하여 유사하게 프로브로 사용될 수 있다.

기타 EG-VEGF 핵산의 유용한 단편으로는 표적 EG-VEGF mRMA(센스) 또는 EG-VEGF DNA(안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일가닥 핵산 서열(RNA 또는 DNA)를 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드 등이 있다. 본 발명에 따른 안티센스 또는 센스 뉴클레오티드는 EG-VEGF DNA의 코딩 부위의 단편을 함유한다. 상기 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은 예를 들어, 문헌[Stein and Cohen, Cancer Res . 48:2659, 1988; van der Krol et al. Bio Techniques 6:958, 1988]에 기재되어 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에의 결합으로 듀플렉스가 형성되면, 이는 듀플렉스의 분해 증가, 전사 또는 해독의 미성숙 종결 또는 기타 다른 수단을 포함하는 다양한 수단의 하나에 의해 표적 유전자의 전사 또는 해독이 중단되는 결과를 가져온다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 EG-VEGF 단백질의 발현을 방해하는데 사용될 수 있다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 개질된 당-포스포디에스테르 골격(또는 WO91/06629호에 개시된 것과 같은 다른 당 링키지)을 더 가질 수 있는데, 여기서 당 링키지는 내생 뉴클리아제에 내성을 갖는다. 이렇게 당 링키지를 갖는 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 안정하지만(즉, 효소 분해에 내성을 갖지만) 여전히 표적 핵산 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유하고 있다.

센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예로는, WO90/10048호에 기재된 것과 같은 유기 부분에 공유적으로 연결된 올리고뉴클레오티드, 폴리-(L-라이신)과 같은 표적 핵산 서열에 대한 친화도를 증가시키는 기타 부분과 공유적으로 연결된 올리고뉴클레오티드 등이 있다. 나아가, 여전히 에립티신과 같은 인터컬레이팅제(intercalating agent) 및 알킬화제 또는 금속 착물을 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착시켜 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 대한 결합 특이성을 개질시킬 수도 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, CaPO₄-매개된 DNA 트랜스팩션, 전기투과, 또는 엡스타인 바 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 이용하는 등의 임의의 유전자 전달 방법에 의해 표적 유전자 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 방법에서는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입된다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포를 상기 재조합 레트로바이러스 벡터와 생체내 또는 생체 외에서 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스의 예로는 생쥐 레트로바이러스 M-MuLV로부터 유도된 것들, N2(M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스) 또는 DCT5A, DCT5B, DCT5C라고 명명된 더블 카피 벡터 (WO 90/13641 참조) 등이 있으나 이에 국한되지 않는다.

센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 WO91/04753호에 기재된 바와 같이, 리간드 결합 분자와 접합을 형성하여 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자로는 세포 표면 수용체, 성장인자, 기타 사이토카인, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 기타 리간드 등이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 바람직하기로는, 리간드 결합 분자의 접합은 리간드 결합 분자와 그의 대응하는 분자 또는 수용체와의 결합능을 실질적으로 방해하거나, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그 접합된 변형물의 세포내 도입을 방해하지 않는 것이다.

별법으로, WO90/10448호에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 형성으로 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산 서열을 포함하는 세포내로 도입시킬 수 있다. 상기 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 내생 리파제에 의해 세포내에서 바람직하게는 해리된다.

상기 프로브를 PCR 기술에 사용하여 밀접하게 관련된 EG-VEGF 코딩 서열의 동정을 위한 서열의 풀을 생성시킬 수도 있다.

EG-VEGF를 코딩하는 핵산 서열은 또한 그 EG-VEGF를 코딩하는 유전자의 맵핑을 위한 혼성화 프로브의 구축 및 유전 질환을 갖는 개인의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브의 구축에 사용될 수 있다. 본문에 제공된 핵산서열은, 공지된 기술, 즉, 인시튜 혼성화, 공지된 염색체 마커와의 연관분석 및 라이브러리들과의 혼성화 스크리닝을 포함하는 공지된 기술을 이용하여 하나의 염색체 또는 하나의 염색체의 특정 부위에 맵핑될 수 있다.

본 발명은 또한, EG-VEGF 단백질에 결합할 수 있는 다른 단백질 또는 분자들을 동정하기 위한 아세이(assay)에 EG-VEGF를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 방법으로, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제들을 동정할 수 있다. 이러한 결합 상호작용에 관여하는 단백질들은 또한 결합 상호작용의 억제제 또는 아고니스트인 펩티드 또는 소분자의 스크리닝에 사용될 수 있다. 또한, EG-VEGF 수용체는 연관 리간드(들)의 단리에 사용될 수 있다. 스크리닝 아세이는 천연 EG-VEGF 또는 EG-VEGF에 대한 수용체의 생물학적 활성과 유사한 선두 화합물을 찾도록 디자인될 수 있다. 이러한 스크리닝 아세이는 화학물질 라이브러리의 하이-쓰루풋 스크리닝을 가능하게 하는 스크리닝이어서 특히 소분자 의약 후보물질을 동정하는데 적합한 것을 포함할 것이다. 상정되는 소분자들로는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 상기 아세이들은, 단백질-단백질 아세이, 생화학 스크리닝 아세이, 면역아세이 및 세포계 아세이를 포함하는 당업계에 잘 알려진 다양한 형식으로 수행될 수 있다.

EG-VEGF를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 그들의 개질된 형태들은 트랜스제닉 동물 또는 녹아웃 동물의 생성에 사용될 수 있고, 이는 이어서, 치료적으로 유용한 의약의 개발 및 스크리닝에 유용하다. 트랜스제닉 동물(예, 마우스, 랫)은 트랜스유전자를 함유하는 세포를 가진 동물로서, 트랜스유전자는 태생전, 예를 들어, 배아 단계에서 동물이나 동물의 조상에게 도입되었다. 트랜스유전자는 트랜스제닉 동물이 발생할 때부터 세포의 게놈 속에 삽입된 DNA이다. 일 실시태양에서는, EG-VEGF를 코딩하는 cDNA를 사용하여 EG-VEGF를 코딩하는 유전체 DNA를 확립된 기술로 클로닝하고 이 유전체 서열을 사용하여 EG-VEGF를 코딩하는 DNA를 발현시키는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. 트랜스제닉 동물의 생성방법, 특히 마우스나 랫의 생성방법은 당업계에 통상적인 것이고, 예를 들어 미국특허 4,736,866호 및 미국특허 4,870,009호에 기재되어 있다. 전형적으로, 조직-특이적 인핸서를 사용하여 EG-VEGF 트랜스유전자의 삽입을 위한 특정세포를 표적화할 것이다. 배아 단계에서 동물의 생식선에 도입된 EG-VEGF를 코딩하는 트랜스유전자의 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여, EG-VEGF를 코딩하는 DNA의 상승된 발현의 효과를 검사할 수 있다. 이러한 동물들은 예들 들어 과발현과 관련된 병리상태로부터의 보호를 부여한다고 생각되는 의약에 대한 시험 동물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 본 측면에 따르면, 동물을 의약으로 치료할 때, 트랜스유전자를 함유하는 비치료 동물들과 비교하여 감소된 병리상태의 발생은 병리상태의 치료적 예방을 의미하는 것일 것이다.

별법으로, EG-VEGF의 인간 이외의 유사체를 이용하여, 동물의 배아 줄기 세포에 도입된 EG-VEGF를 코딩하는 변형된 유전자와 내생 유전자 사이의 상동 재조합의 결과 EG-VEGF를 코딩하는 결손 또는 개질된 유전자를 갖는 EG-VEGF 녹아웃 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, EG-VEGF를 코딩하는 cDNA를 이용하여 확립된 기술에 따라 EG-VEGF를 코딩하는 유전체 DNA를 클로닝한다. EG-VEGF를 코딩하는 유전체 DNA의 일부를 결손시키거나 또는 예를 들어 삽입을 모니터링하는데 사용될 수 있도록 선택가능한 마커를 코딩하는 다른 유전자로 치환될 수 있다. 전형적으로, 수킬로베이스의 변형되지 않은 인접 DNA(모두 5' 또는 3' 말단)가 벡터내에 포함된다[예를 들어, 상동 재조합 벡터의 기재로는 Thomas and Capecchi, Cell, 51:503(1987)참조]. 상기 벡터를 배아 줄기세포에 도입하고(전기투과에 의해), 도입된 DNA가 내생 DNA와 상동 재조합된 세포를 선택한다[예를 들어, Li et al., Cell, 69:915(1992)참조]. 선택된 세포를 포배기 동물(마우스, 랫)에게 주입하여 응집 키메라를 형성하도록 한다[Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach , E.J. Robertson, ed.(IRL, Oxford, 1987), pp113-152]. 그다음 키메라 배아를 적합한 가임신 암컷 수양 동물에게 이식할 수 있고, 상기 배아는 녹아웃 동물을 창조한다. 생식 세포에 상동 재조합 DNA를 함유하는 후손은 표준적인 기술로서 동정할 수 있고, 이는 동물의 모든 세포가 상동 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 교배시키는데 사용한다. 녹아웃 동물은 예를 들어 특정 병리 상태에 대한 방어능력과 EG-VEGF 폴리펩티드의 부재로 인한 병리 상태의 발생으로 특징지워질 수 있다.

EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 유전자 치료에 사용될 수 있다. 유전자 치료에의 응용에서는, 예를 들어 결손 유전자를 대체하여 치료적으로 유효한 유전적 산물을 생체내에서 합성하기 위하여 유전자가 세포내로 도입된다. "유전자 치료"란 단일 처치로 지속적인 효과가 달성되는 통상적인 유전자 치료와, 치료적으로 효과적인 DNA 또는 mRNA의 한 번 또는 반복적인 투여를 수반하는 유전자 치료제의 투여를 포함한다. 안티센스 RNA 또는 DNA는 생체내 특정 유전자의 발현을 차단하는 치료제로서 사용될 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포 막의 제한된 흡수에 의해 야기되는 세포내 낮은 농도에도 불구하고, 세포내로 도입되어 억제제로서 작용할 수 있다는 것이 이미 밝혀졌다[Zamecnik et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 83:4143-4146{1986)]. 상기 올리고뉴크레오티드는 예를 들어 그 음전하의 포스포디에스테르 기를 비하전된 기로 치환함으로써 막 흡수를 향상시키도록 개질될 수 있다.

살아 있는 세포에 핵산을 도입하는데 사용가능한 다양한 기술들이 존재한다. 이 기술들은 핵산이 생체외에서 배양된 세포내로 전달되는지 아니면 의도된 숙주의 세포내로 인비보(in vivo)로 전달되는지에 따라 달라진다. 생체외에서 포유동물 세포 내로의 핵산 전달에 적합한 기술들로는 리포좀, 전기투과, 미세주사, 세포융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 있다. 현재 선호되는 인비보 유전자 전달 기술로는 바이러스(전형적으로는 레트로바이러스) 벡터의 트랜스팩션과 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개된 트랜스팩션[Dzau et al ., Treands in Biotechnology 11, 205-210(1993)] 등이 있다. 어떤 경우에는, 표적 세포 또는 세포 표면 막 단백질 특이 항체나, 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 등과 같은, 표적세포로 표적화하는 물질과 함께 핵산원을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀을 사용하는 경우에는, 표적화 및(또는) 흡수를 용이하게 하기 위하여, 엔도시토시스(endocytosis)와 관련된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질, 예를 들어, 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그 단편, 순환시 내재화(internalization)을 거치는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 지정하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 사용할 수 있다. 수용체-매개된 엔토시토시스 기술은 예를 들어 문헌들[Wu et al., J. Biol . Chem. 262, 4429-4432(1987); Wagner et al., Proc . Natil . Acad . Sci . USA 87 3410-3414(1990)]에 기재되어 있다. 유전자 마킹과 유전자 치료 프로토콜에 대하여는 문헌[Anderson et al., Science 256, 808-813(1992)]를 참조한다.

또한, 본문에 기재된 EG-VEGF 폴리펩티드는 단백질 전기영동 목적을 위한 분자량 마커로서 사용될 수도 있다.

본문에 기재된 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 핵산 분자들은 염색체 동정에 유용하다. 관련하여, 실제 서열 데이터에 기초하여 상대적으로 소수의 염색체 마킹 물질이 현재 이용가능하기 때문에, 새로운 염색체 마커의 동정에 대한 지속적인 요구가 있다. 본 발명의 각 EG-VEGF 핵산 분자는 염색체 마커로서 사용될 수 있다.

본 발명의 EG-VEGF 폴리펩티드 및 핵산 분자들은, 본 발명의 EG-VEGF 폴리펩티드가 다른 조직에 비해 한 조직에 차별적으로 발현될 수 있어서 조직 타이핑에도 사용될 수 있다. EG-VEGF 핵산 분자들은 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석에 프로브로서 사용용도를 가질 것이다.

본문에 기재된 EG-VEGF 폴리펩티드 및 그 조절자들은 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 EG-VEGF 폴리펩티드 및 EG-VEGF 조절자는 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위하여 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있고, 여기서 EG-VEGF 산물은 제약학적으로 허용되는 담체 비히클과 혼합된다. 치료적 조성물은 소망하는 순도를 갖는 활성 성분을 임의로 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed(1980) 동결건조 조성물 또는 수용액 형태의 장기 보존용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 사용자에게 비독성이고, 이들은, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충용액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 잔기 10개 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로부린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 수지; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기니 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올; 소듐과 같은 염형성 카운터이온; 및(또는) TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

인비보 투여에 사용되어질 조성물은 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 필터 막을 통한 여과와 그 이전 또는 이후의 동결건조 및 재구성에 의해 쉽게 달성된다.

본문에서 치료적 조성물은 일반적으로, 예를 들어 정맥주사 용액 백, 또는 피하주사용 바늘에 의해 침투가능한 뚜껑을 갖는 바이알과 같은 멸균 접근 포트를 갖는 용기에 담겨진다.

투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어, 주사 또는 정맥내, 복강내, 대뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 병변내 경로 주입, 국소 투여 또는 서방 시스템에 따른다.

본 발명의 제약 조성물의 용량 및 소망하는 약물 농도는 고려되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적당한 용법 및 투여 경로의 결정은 통상적인 의사의 지식범위 내이다. 동물 실험은 인간 치료를 위한 유효 용량의 결정에 신빙성 있는 가이드를 제공한다. 문헌[Mordenti, J. 및 Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al, Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp42-96]에 기재된 원리에 따라 종간 유효 용량의 스케일링이 수행될 수 있다.

EG-VEGF 폴리펩티드 또는 그 아고니스트 또는 길항제의 인비보 투여를 채택하는 경우, 통상적 용량은 투여경로에 따라 일일, 포유동물의 단위 체중당 약 10 ng/kg 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 약 1 g/kg/day 내지 10 mg/kg/day이다. 특별한 용량 및 전달방법에 대한 가이드는 문헌에 제공되어 있고, 예를 들어, 미국특허 제 4,657,760; 5,206,344; 5,225,212호를 참조하라. 상이한 치료 화합물 및 상이한 질병에는 상이한 조성물이 효과적인 것으로 예상되고, 예를 들어 하나의 기관이나 조직으로 표적화하는 투여가 다른 기관이나 조직의 투여와는 다른 방법으로 송달되는 것이 필요할 수 있다.

EG-VEGF 폴리펩티드의 투여를 필요로 하는 질병 또는 질환의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 조성물에서 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 그 조절자의 서방 투여가 소망스러운 경우에는, EG-VEGF 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 상정될 수 있다. 서방을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터루킨-2 및 MN rgp120에 대하여 성공적으로 수행된 적이 있다[Johnson et al., Nat . Med ., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed . Ther ., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology , 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach , Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp.439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국특허. 5,654,010].

이들 단백질의 서방 조성물은, 그 생체적합성 및 광범위한 생분해특성으로 인하여 폴리-락틱 코글리코릭 에시드(PLGA) 중합체의 사용으로 개발되었다. PLGA의 분해 산물인 락트산 및 글리코릭 에시드는 인체 내에서 재빨리 제거될 수 있다. 더구나, 이 중합체의 분해성은 그 분자량 및 조성에 따라 수개월에서 수년까지 조절할 수 있다[Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M.Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41].

본원에 제공된 치료제는 다수의 치료에 사용될 수 있다. 치료는 호르몬 생성 조직 또는 내분비샘과 관련된 질환을 가진 개체를 치료하는 것을 포함한다. 한 측면에서, EG-VEGF 또는 EG-VEGF 효현제가 질환을 치료하는데 유효한 양으로 이를 필요로 하는 개체에 투여된다. EG-VEGF는 폴리펩티드 또는 핵산 형태로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 질환은 특정 호르몬을 생성하는 세포 수의 증가를 요구하는 것이다. 이러한 질환의 예는 당뇨병을 포함한다. 다른 질환으로는 난소, 고환, 자궁, 전립선 및 태반과 같은 생식 기관에서 세포 수를 증가시키는 것이 요구되는 것들을 포함한다.

바람직하게는, EG-VEGF 길항제가 호르몬 생성 조직 또는 내분비샘과 관련된 질환을 가진 개체에 투여된다. EG-VEGF 길항제가 투여되는 경우에, 바람직하게는, 상기 질환은 특정 호르몬을 생성하는 세포 수의 감소 또는 세포 증식의 감소를 요구하는 것이다. 예를 들면, EG-VEGF 길항제를 생식 능력을 조절하는데 유효한 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 생식 능력을 조절하는 방법이 제공된다. 한 태양에서, 난포 성숙 및(또는) 배란을 억제함으로써 생식 능력이 조절된다. 별법으로, 개체가 다낭 난소 증후군을 가지고 있거나 가질 위험성이 있을 경우에, 일반적으로 상기 증후군을 치료하지 않음으로써 초래되는 불임증을 예방함으로써 생식 능력을 유지시키기 위해 EG-VEGF 길항제가 개체에 투여된다. 개체는 질환이 유전이고 가족에게서 빈번할 경우 상기 질환의 위험성이 있거나, 또는 질환의 초기 증상을 가진다. 또한, EG-VEGF 길항제는 호르몬 생성 조직의 과다증식, 감염 및 과도한 혈관형성과 관련된 낭 및 다른 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 처리될 수 있는 스테로이드 호르몬 의존성 질환은 지질성 선천 부신 과다형성, 불임증, 성적 성숙, 안드로겐 의존성 종양, 성조숙, 맥쿤-알브라이트(McCune-Albright) 증후군, 선천 부신 형성저하증 또는 저생식샘자극호르몬 생식샘저하증을 추가로 포함한다.

본원에 제공된 약물 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 구체적인 질환은 암, 특히, 스테로이드, 예를 들어, 안드로겐 의존성 암이다. 본원에 제공된 바람직한 암 치료 방법은 EG-VEGF 길항제를 암을 치료하는데 유효한 양으로 암을 가지고 있거나 가질 위험성이 있는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 태양에서, 암은 난소, 고환, 전립선 및 자궁으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 것이다.

세포 증식, 세포 증식의 억제, 화학주성의 방법, 및 화학주성을 억제하는 방법이 생체내 또는 시험관내로 수행될 수 있음은 물론이다. 어떤 경우에는, 특정 세포형의 증식을 자극하기 위해 EG-VEGF를 세포 샘플에 시험관내로 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. EG-VEGF 처리된 샘플은 선별 분석에 사용되거나, 또는 치료를 필요로 하는 개체 또는 동물 모델에 이식될 수 있다.

본 발명은 또한, EG-VEGF 폴리펩티드를 모방 또는 증진(효현제)시키거나, 또는 EG-VEGF 폴리펩티드의 효과를 방지(길항제)하는 것을 동정하기 위한 화합물 선별 방법을 포괄한다. EG-VEGF 효현제 및 길항제는 본원에서 EG-VEGF 조절체로도 지칭된다. 길항제 후보 약물의 선별 분석은 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 EG-VEGF 폴리펩티드와 결합 또는 착체를 형성하거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포성 단백과의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하도록 디자인된다. 본원에서 제공된 선별 분석은 화학적 라이브러리를 고 처리량으로 선별하여, 이들을 소 분자 후보 약물을 동정하는데 특히 적합하게 하는 분석을 포함한다. 일반적으로, 결합 분석 및 활성 분석이 제공된다.

상기 분석은 당업계에서 잘 특성화된 단백-단백 결합 분석, 생화학적 선별 분석, 면역분석 및 세포를 기초로 한 분석을 포함하여, 다양한 형태로 수행될 수 있다.

길항제를 위한 모든 분석은 2 개의 성분이 상호작용하도록 하는 조건 및 충분한 시간 동안 후보 약물이 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩된 EG-VEGF 폴리펩티드와 접촉하는 것을 요구한다는 점에서 공통된다.

결합 분석에서, 상호작용은 결합하는 것이고, 형성된 착체는 반응 혼합물에서 단리되거나 또는 검출될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 후보 약물은 공유 또는 비공유 결합에 의해 고체상, 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된다. 비공유 결합은 일반적으로, 고체 표면을 EG-VEGF 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 달성된다. 별법으로, 고정될 EG-VEGF 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들면, 모노클론 항체를 사용하여 이것을 고체 표면에 고정시킬 수 있다. 상기 분석은 검출가능한 표지에 의해 식별될 수 있는 비고정된 성분을 고정된 성분, 예를 들면, 고정된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완결된 경우, 미반응 성분은 예를 들어, 세척에 의해 제거되고, 고체 표면 상에 고정된 착체가 검출된다. 원래 비고정된 성분이 검출가능한 표지를 가질 경우, 고체 상에 고정된 표지의 검출은 착체 형성이 일어났다는 것을 나타낸다. 원래 비고정된 성분이 표지를 가지고 있지 않은 경우, 착체 형성은, 예를 들면, 고정된 착체에 특이적으로 결합하는 식별된 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다.

후보 화합물이 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 특정 EG-VEGF 폴리펩티드와 상호작용하나, 이에 결합하지 않을 경우, 이의 상기 폴리펩티드와의 상호작용은 단백-단백 상호작용을 검출하는 잘 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 교차결합, 공동 면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동 정제와 같은 보통의 방법들을 포함한다. 게다가, 단백-단백 상호작용은 문헌(chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991))에 개시된 바와 같이 필드 및 동료(Fields and Song, Nature(London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))에 의해 기술된 효모 기재의 유전 시스템을 사용함으로써 모니터될 수 있다. 효모 GAL4와 같은 다수의 전사 활성인자들은 2 개의 물리적으로 구분된 분자 도메인으로 구성되고, 하나는 DNA-결합 도메인으로, 다른 하나는 전사 활성화 도메인으로 작용한다. 상기 간행물에 기술된 효모 발현 시스템(일반적으로 "투 하이브리드 시스템"으로 지칭됨)은 이 성질을 이용하고, 하나에서는 표적 단백이 GAL4의 DNA 결합 도메인에 융합되고, 다른 하나에서는 후보 활성화 단백이 활성화 도메인에 융합되는 투 하이브리드 단백을 사용한다. GAL4 활성화된 프로모터의 조절 하에서 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백-단백 상호작용을 거쳐 GAL4 활성의 재건에 의존한다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 집락은 갈락토시다아제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출된다. 투 하이브리드 방법을 사용하여 2 개의 특이적 단백 사이의 단백-단백 상호작용을 동정하기 위한 완전 키트(MATCHMAKER, 상표)가 클론테크(Clontech)로부터 상업적으로 입수가능하다. 이 시스템은 또한, 특이적 단백 상호작용에 포함된 지도 단백 도메인, 및 상기 상호작용에 중요한 정확한 아미노산 잔기에 확장될 수 있다.

본원에서 동정된 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험될 수 있다: 보통, 2 개의 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간 동안 유전자 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물이 제조된다. 결합을 억제할 수 있는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 반응을 실시한다. 게다가, 제3 반응 혼합물에 위약이 첨가되어, 양성 대조군으로서 기능할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합(착체 형성)이 상기에 기술된 바와 같이 모니터된다. 대조군 반응(들)에서는 착체가 형성되나, 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 착체가 형성되지 않는 것은 시험 화합물이 시험 화합물 및 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다.

효현제 및 길항제를 분석하기 위해, EG-VEGF 폴리펩티드가 선별될 화합물과 함께 세포에 첨가될 수 있다. EG-VEGF에 의해 조절되는 것으로 알려진 특정 활성이 관찰되고, EG-VEGF 폴리펩티드의 존재 하에서, 이 활성을 증진 또는 억제할 수있는 화합물의 능력은 상기 화합물이 각각 EG-VEGF 폴리펩티드의 효현제 또는 길항제임을 나타낸다. 별법으로, 효현제 및 길항제는 경쟁적 억제 분석에 적합한 조건 하에서, EG-VEGF 폴리펩티드 및 후보 화합물을 막 결합된 EG-VEGF 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 결합시킴으로써 검출될 수 있다. EG-VEGF 폴리펩티드는 예를 들어, 방사활성에 의해 식별되어, 수용체에 결합된 EG-VEGF 폴리펩티드 분자 수를 사용하여 잠재적인 효현제 또는 길항제의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.

EG-VEGF 수용체를 코딩하는 유전자는 리간드 팬닝(panning) 및 FACS 분류와 같은 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 동정될 수 있다 (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2):Chapter 5 (1991)). 바람직하게는, 폴리아데닐화 RNA가 EG-VEGF 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 제조되고, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리가 풀(pool)로 나누어져 CDS 세포 또는 EG-VEGF 폴리펩티드에 반응하지 않는 다른 세포를 트랜스펙션시키는데 사용되는 발현 클로닝이 사용된다. 유리 슬라이드 상에서 성장된 트랜스펙션된 세포는 식별된 EG-VEGF 폴리펩티드에 노출된다. EG-VEGF 폴리펩티드는 요오드화 또는 부위 특이적 단백 키나아제에 대한 인식 부위의 포함을 포함하여 다양한 수단에 의해 식별될 수 있다. 고정화 및 배양 후, 슬라이드를 방사선사진 분석한다. 양성 풀을 동정하고, 서브풀(subpool)을 제조하고, 상호작용 서브 풀링 및 재선별 방법을 사용하여 재트랜스펙션시켜, 추정되는 수용체를 코딩하는 단일 클론을 얻는다.

수용체 동정을 위한 별도의 방법으로서, 식별된 EG-VEGF 폴리펩티드가 수용체 분자를 발현하는 세포 막 또는 추출물과 광친화 결합될 수 있다. 교차 결합된 물질은 PAGE에 의해 분해되고, X-선 필름에 노출된다. 수용체를 함유하는 식별된 착체가 절단되고, 펩티드 단편으로 분해되고, 단백 마이크로-염기서열분석될 수 있다. 마이크로-염기서열분석으로부터 얻어진 아미노산 서열은 cDNA 라이브러리를 선별하기 위한 축퇴 올리고뉴클레오티드 프로브 셋을 디자인하여 추정되는 수용체를 코딩하는 유전자를 동정하는데 사용될 것이다.

길항제를 위한 또다른 분석에서, 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제제가 후보 화합물의 존재 하에서, 식별된 EG-VEGF 폴리펩티드와 배양될 것이다. 이어서, 이 상호작용을 증진 또는 차단할 수 있는 화합물의 능력이 측정될 수 있을 것이다.

잠재적 길항제의 더 구체적인 예는 면역글로불린과 EG-VEGF 폴리펩티드와의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 특히, 폴리- 및 모노클론 항체 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항이디오타입 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메릭 또는 인간화 판을 포함하는 항체, 및 인간 항체 및 항체 단편을 포함한다. 별법으로, 잠재적 길항제는 밀접하게 관련된 단백, 예를 들면, 수용체를 인식하나 어떠한 효과도 부여하지 않음으로써 EG-VEGF 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 EG-VEGF 폴리펩티드의 변이된 형태일 수 있다.

또다른 잠재적 EG-VEGF 폴리펩티드 길항제는 예를 들어, RAN 또는 DNA 분자가 표적화된 mRNA와 부합하여 단백 해독을 방지함으로써 mRNA의 해독을 직접 차단하는, 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조체이다. 안티센스 기술은 삼중 나선 형성, 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있고, 두 방법 모두 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합에 기초한다. 예를 들면, 성숙 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분이 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인하는데 사용된다. DNA 올리고뉴클레오티드는 해독에 관여된 유전자 영역에 상보적으로 디자인(삼중 나선 - Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991) 참조)되어, EG-VEGF 폴리펩티드의 전사 및 생성을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 하이브리드화하고, mRNA 분자의 EG-VEGF 폴리펩티드로의 해독을 차단한다 (안티센스 - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press:Boca Raton, FL, 1988)). 상기에 기술된 올리고뉴클레오티드는 또한, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 EG-VEGF 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있도록 세포로 전달될 수 있다. 안티센스 DNA가 사용될 경우, 예를 들어, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10번 사이의 해독 개시 부위로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.

잠재적 길항제는 EG-VEGF 폴리펩티드의 활성 부위인 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 또는 다른 관련된 결합 부위에 결합하여 EG-VEGF 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소 분자를 포함한다. 소 분자의 예는 소 펩티드 또는 펩티드양 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티드성 유기 또는 무기 화합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 태양에서, 효현제의 과다발현이 활성이 양성 되먹임에 의해 조절되는 길항제로서 기능할 수 있다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA로의 서열 특이적 하이브리드화에 이어, 핵산 중간 분해적 절단에 의해 작용한다. 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기술에 의해 동정될 수 있다. 더 자세한 사항에 대해서는, 문헌[예를 들어, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT 간행물 WO 97/33551 (1997. 7. 18. 공개)]을 참조한다.

해독을 억제하는데 사용되는 삼중 나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일 가닥이어야 하고, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 이것이 일반적으로 이중 나선의 한 가닥 상의 푸린 또는 피리미딘의 상당한 신장을 요구하는 후그스틴(Hoogsteen) 염기-짝짓기 규칙을 거쳐 삼중 나선 형성을 촉진하도록 디자인된다. 더 자세한 사항에 대해서는, 상기 PCT 간행물 WO 97/33551을 참조한다.

상기 소 분자들은 상기에 논의된 선별 분석 중의 임의의 하나 이상 및(또는) 당업자에게 잘 공지된 임의의 다른 선별 기술에 의해 동정될 수 있다.

본원에 제공된 모든 분석은 광범위한 후보 생체활성 물질을 선별하는데 사용될 수 있음은 물론이다. 용어 "후보 생체활성 물질", "후보 물질" 또는 "후보 약물", 또는 본원에서 사용된 문법적 동등물은 핵산 서열 및 단백 서열을 포함한 EG-VEGF 서열의 세포 활성 표현형 또는 발현을 직간접적으로 변화시킬 수 있는 생체활성 물질에 대해 시험될 임의의 분자, 예를 들어, 단백, 올리고펩티드, 소 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드, 푸린 유사체 등을 나타낸다.

후보 물질은, 일반적으로 이들이 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 100 달톤 초과 및 약 2,500 달톤 미만인 소 유기 분자이기는 하지만, 다수의 화학적 군을 포괄할 수 있다. 소 분자는 본원에서 50 kD 내지 2000 kD의 분자량을 갖는 것으로 추가로 정의된다. 또다른 태양에서, 소 분자는 1500 kD 미만, 또는 1200 kD 미만, 또는 750 kD 미만, 또는 500 kD 미만의 분자량을 갖는다. 한 태양에서, 본원에서 사용된 소 분자는 약 100 내지 200 kD의 분자량을 갖는다. 후보 약물은 단백과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 관능기를 포함하고, 일반적으로 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실기, 바람직하게는 화학적 관능기 중의 2 개 이상을 포함한다. 후보 약물은 종종 고리형 탄소 또는 헤테로고리형 구조 및(또는) 상기 관능기 중의 하나 이상으로 치환된 방향족 또는 다방향족 구조를 포함한다. 후보 물질은 또한, 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 푸린, 피리미딘, 이들의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합물을 포함한 셍체분자 중에서 발견된다. 펩티드가 특히 바람직하다.

후보 물질은 합성 또는 천연 화합물 라이브러리를 포함한 광범위한 공급원으로부터 얻어진다. 예를 들면, 무작위화 올리고뉴클레오티드의 발현을 포함하여, 광범위한 유기 화합물 및 생체분자의 무작위 및 지정 합성에 다수의 수단이 이용가능하다. 별법으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물 라이브러리가 이용가능하거나 용이하게 생성된다. 또한, 천연 또는 합성 라이브러리 및 화합물이 보통의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형된다. 공지의 약물이 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화와 같은 지정 또는 무작위 화학적 변형을 받아 구조적 유사체를 생성할 수 있다.

바람직한 태양에서, 후보 생체활성 물질은 단백이다. 본원에서 "단백"은 단백, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하는, 2 개 이상의 공유 결합 아미노산을 의미한다. 단백은 천연 아미노산 및 펩티드 결합 또는 합성 펩티드양 구조로 구성될 수 있다. 따라서, 본원에서 "아미노산" 또는 "펩티드 잔기"는 천연 및 합성 아미노산 둘 다를 의미한다. 예를 들면, 호모-페닐알라민, 시트룰린 및 노르루신이 본 발명의 목적을 위해 고려되는 아미노산이다. 또한, "아미노산"은 프롤린 및 히드록시프롤린과 같은 이미노산 잔기를 포함한다. 측쇄는 (R) 또는 (S) 배열일 수 있다. 바람직한 태양에서, 아미노산은 (S) 또는 L-배열이다. 비천연 측쇄가 사용될 경우, 비아미노산 치환이 예를 들어, 생체내 분해를 방지하거나 지연시키기 위해 사용될 수 있다.

바람직한 태양에서, 후보 생체활성 물질은 천연 단백 또는 천연 단백 단편이다. 따라서, 예를 들면, 단백을 함유하는 세포 추출물, 또는 단백성 세포 추출물의 무작위 또는 지정 소화물이 사용될 수 있다. 이런 식으로, 원핵 및 진핵 단백 라이브러리가 본 발명의 방법에서의 선별을 위해 제조될 수 있다. 이 태양에서, 박테리아, 진균, 바이러스 및 포유류 단백이 특이 바람직하고, 포유류 단백이 바람직하며, 인간 단백이 특히 바람직하다.

바람직한 태양에서, 후보 생체활성 물질은 약 5 내지 약 30 개의 아미노산으로 된 펩티드이고, 약 5 내지 약 20 개의 아미노산이 바람직하고, 약 7 내지 약 15 개의 아미노산이 특히 바람직하다. 펩티드는 상기에서 약술된 천연 단백의 소화물, 무작위 펩티드 또는 "편향된" 무작위 펩티드일 수 있다. "무작위" 또는 문법적 동등물은 각 핵산 및 펩티드가 본질적으로 각각 무작위 뉴클레오티드 및 아미노산으로 구성되어 있다는 것을 의미한다. 일반적으로, 상기 무작위 펩티드(또는 핵산, 하기 기술됨)는 화학적으로 합성되므로, 이들은 임의의 위치에서 임의의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 합성 방법은 무작위 단백 또는 핵산을 생성하고, 서열 길이에 걸쳐 모든 또는 대부분의 가능한 조합물의 형성을 허용함으로써 무작위화 후보 생체활성 단백성 물질 라이브러리를 형성하도록 디자인될 수 있다.

한 태양에서, 라이브러리는 임의의 위치에서 서열 우선성 또는 상수 없이 완전히 무작위화된다. 바람직한 태양에서, 라이브러리는 편향된다. 즉, 서열 내의 일부 위치가 일정하게 되거나, 또는 제한된 수의 가능성으로부터 선택된다. 예를 들, 바람직한 태양에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 소정의 군, 예를 들면, 소수성 아미노산, 친수성 잔기, 입체적으로 편향된 (작거나 또는 큰) 잔기 내에서 핵산 결합 도메인의 생성, 교차 결합을 위한 시스테인의 생성, SH-3 도메인을 위한 프롤린, 인산화 부위를 위한 세린, 트레오닌, 티로신 또는 히스티딘 등, 또는 푸린 등 쪽으로 무작위화된다.

바람직한 실시 태양에서, 생활성 후보 물질은 핵산이다. 본 명세서에서 "핵산", "올리고뉴클레오티드" 또는 이와 동등한 용어들은 2개 이상의 뉴클레오티드가 서로 공유 결합되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 포함하지만, 아래와 같은 몇몇 경우에는 예를 들면 포스포라미드(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925(1993) and references therein; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800(1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579(1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487(1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805(1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988); Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141(1986), 포스포로티오에이트(Mag et al., Neucleic Acids Res. 19:1437(1991), 미국 특허 5,644,048), 포스포로디티오에이트(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321(1989)), O-메틸포스포로아미다이트 결합(Eckstein, Oligonecleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), 펩티드 핵산 백본 및 결합(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895(1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008(1992); Nielsen, Nature, 365:566(1993); Carlsson et al., Nature 380:207(1996)) 등과 같은 다른 백본을 가질 수 있는 핵산 유사 물질을 포함할 수도 있다. 상기한 모든 문헌은 본 명세서에 참고로 인용한다. 또 다른 핵산 유사 물질에는 양이온 백본(Denpcy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097(1995)), 비이온 백본(미국 특허 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141, 4,469,863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423(1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597(1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research," Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook; Masmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395(1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17(1994); Tetrahedron Lett. 37:743(1996)), 비리보스 백본(미국 특허 5,235,033, 5,034,506; Chapter 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research," Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook에 기재되어 있는 것들을 포함)을 갖는 것들이 포함된다. 1개 이상의 탄소환당을 포함하는 핵산도 핵산의 정의에 포함된다(Jenkins et al., Chem. Soc. Rev.(1995) pp 169-176). 몇몇 핵산 유사 물질은 문헌[Rawls, C & E News June 2, 1997, page 35]에 기재되어 있다. 상기 모든 문헌은 본 명세서에 참고로 인용한다. 이러한 리보스-포스페이트 백본의 변형은 라벨과 같은 추가의 잔기를 부가하는 것을 촉진하거나 생체 환경에서 이러한 분자들의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 행해질 수 있다. 또한, 천연 핵산 및 핵산 유사 물질의 혼합물을 사용할 수도 있다. 핵산은 앞에서 설명한 것처럼 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 일부를 포함할 수도 있다. 핵산은 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 하이브리드일 수 있다. 여기서, 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 임의의 조합 및 염기(예, 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크사타닌, 하이포크사타닌, 이소시토신, 이소구아닌 등)의 임의의 조합을 함유한다.

일반적으로 단백질에 관해 앞에서 설명하였듯이, 핵산 생활성 후보 물질은 천연 핵산, 랜덤 핵산, 또는 바이어스된 랜덤 핵산이다. 예를 들면, 단백질에 대해 앞에서 설명한 것처럼 원핵 게놈 또는 진핵 게놈의 소화를 이용할 수 있다.

바람직한 실시 태양에서, 생활성 후보 물질은 유기 화학 잔기이다. 매우 다양한 유기 화학 잔기를 문헌으로부터 얻을 수 있다.

바람직한 실시 태양에서, 앞에서 설명하였듯이 각 유전자 및 유전자 생성물(단백질)에 대해 스크리닝을 행할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 유전자 또는 단백질은 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이 특수한 조직 및 이러한 조직에 관련된 조건에 따라 특이적으로 발현된 단백질인 것으로 확인되었다. 따라서 한 실시 태양에서는 먼저 EG-VEGF에 결합할 수 있는 후보 물질을 발견하기 위해 스크리닝을 행하고, 다음, EG-VEGF 활성을 변화시킬 수 있는 능력을 평가하는 분석에 이러한 후보 물질을 이용할 수 있다. 따라서, 당업자라면 알 수 있듯이 수행할 수 있는 매우 많은 종류의 분석 방법이 있다.

한 실시 태양에서, EG-VEGF, 바람직하게는 고체 지지체에 고정된 EG-VEGF를 다수의 생활성 후보 물질과 접촉시키고, EG-VEGF에 결합한 후보 물질을 다음 연구를 위해 선택한다. 생활성 후보 물질이 라벨링되어 있으면 생활성 후보 물질이 EG-VEGF와 결합하는 것을 직접적으로 측정할 수 있다. 생활성 후보 물질은 방사선으로 라벨링하는 것이 바람직하다. 또는, 형광 물질로 라벨링할 수도 있다. 생활성 후보 물질이 라벨링되어 있지 않다면, EG-VEGF와의 결합은 결합 응답에 관한 측정치에 기초하여 간접적으로 결정할 수 있다. 또는, 생활성 후보 화합물의 상호 작용은 생활성 후보 화합물이 라벨링된 공지의 리간드의 결합을 억제하는 능력에 기초하여 평가할 수도 있다.

EG-VEGF 활성을 변화시키는 물질을 스크린할 수도 있다. 바람직한 실시 태양에서, EG-VEGF 활성을 변화시킬 수 있는 생활성 물질을 스크리닝하는 방법은 생활성 후보 물질을 EG-VEGF 샘플에 첨가하는 단계와 EG-VEGF 생물학적 활성의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. "EG-VEGF 활성의 변화"는 활성의 증가, 활성의 감소, 또는 존재하는 활성의 종류 또는 유형의 변화를 포함한다. 따라서, 이러한 실시 태양에서, 생활성 후보 물질은 EG-VEGF에 결합하여야 할 뿐 아니라(반드시 필요한 것은 아님), 본 명세서에서 정의한 것과 같은 생물학적 또는 생화학적 활성의 변화를 일으켜야 한다. 이러한 방법에는 EG-VEGF의 존재, 분산, 활성 또는 양의 변화를 측정하기 위해 앞에서 일반적으로 설명한 것과 같은 시험관내 스크리닝 방법 및 생체내 세포 스크리닝이 포함된다.

따라서, 이러한 실시 태양에서 상기 방법은 샘플과 생활성 후보 물질을 결합하는 것 및 EG-VEGF 활성에 대한 영향을 측정하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 "EG-VEGF 단백질 활성" 또는 이와 동등한 용어는 세포 증식, 주화성/이동 활성, 신생 혈관 형성, 세포 분화 및 세포 창(cell fenestration)을 포함하는(여기에 한정되는 것은 아니다), EG-VEGF 단백질의 1개 이상의 생물학적 활성을 의미한다. 이러한 활성은 바람직하게는 호르몬 생성 조직 및 세포, 바람직하게는 스테로이드 합성 세포에 특이적이다. 특이 활성을 위한 바람직한 세포 종류에는 생식계 세포(난소, 정소, 전립선, 자궁, 태반 등)가 포함된다. 이자 세포 및 부신 피질 세포도 바람직하다. EG-VEGF 활성 억제는 1종 이상의 EG-VEGF 단백질 활성의 억제이다.

한 바람직한 실시 태양에서는 EG-VEGF 단백질의 활성이 증가하고, 다른 바람직한 실시 태양에서는 EG-VEGF 단백질의 활성이 감소한다. 따라서 어떤 실시 태양에서는 길항제인 생활성 물질이 바람직하고 다른 실시 태양에서는 효현제인 생활성 물질이 바람직할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, EG-VEGF 서열을 함유하는 세포는 EG-VEGF에 대한 약 후보 물질의 영향을 평가함으로써 약 스크리닝 분석에 사용될 수 있다. 세포 종류에는 정상적인 세포가 포함되고, 바람직하게는 비정상적인 증식율을 갖는 세포(예, 암 세포)가 포함되고, 가장 바람직하게는 인간 암 세포가 포함된다.

EG-VEGF 활성을 평가하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 배양 세포 또는 1차 세포를 사용하는 성장 및 생존 분석을 포함한다. 이러한 분석에 있어서는, 종종 장시간에 걸쳐 성장 및 생존을 위해 세포 집단을 모니터링하고, 다양한 농도의 생활성 물질과 함께 배양한 샘플 또는 생활성 물질 없이 배양한 샘플을 비교한다. 세포 수는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸림 브로마미드(MTT), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움(MTS)[미국 특허 5,185,450] 및 알래마 블루(Alamar Blue, 물질 대사 활성 세포의 존재 하에 형광 화합물 또는 착색 화합물로 변함)와 같은 물질을 사용하여 정량할 수 있다. 또는, 세포 단백질에 결합하는 염료(예, 설포르호다민 B(SRB) 또는 크리스탈 바이올렛)을 사용하여 세포 수를 정량할 수 있다. 또는, 입자 계수기(예, Beckman Coulter 제조 Coulter Counter^TM)를 사용하여 직접 세포를 세거나 현미경을 사용하여 혈구 계수기에서 세포를 관찰하여 셀 수도 있다. 바람직하게는, 혈구 계수기를 사용하여 센 세포는 산 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 트리판 블루 용액에서 관찰한다. 세포 수를 정량하는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 분석법은 괴사 상태에 있는 세포를 포함하여 임의의 세포에 대해서도 수행할 수 있다.

단백질이 직접 또는 간접적으로 세포 집단의 배열 또는 이동 방향을 자극할 수 있다면, 이것은 특정 세포 집단에 대해 주화성 활성을 갖는다. 바람직하게는, 이러한 단백질은 세포의 이동을 직접 자극할 수 있는 능력을 갖는다. 아래에 설명하는 바와 같이, EG-VEGF는 주화성 활성을 갖는다. EG-VEGF의 주화성 활성의 변화는 세포 주화성을 측정하기 위한 공지의 분석법(예, 아래 실시에에서 설명하는 이동 분석)을 사용하여 쉽게 측정할 수 있다.

바람직한 실시 태양에서, 상기 방법은 앞에서 정의한 생활성 후보 물질을 EG-VEGF를 포함하는 세포에 첨가하는 것을 포함한다. 바람직한 셀 종류에는 거의 모든 세포가 포함된다. 이러한 세포는 핵산, 바람직하게는 EG-VEGF 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유한다. 바람직한 실시 태양에서, 후보 물질 라이브러리를 다수의 세포에 대해 시험한다.

한 측면에서, 이러한 분석은 호르몬, 항체, 펩티드, 항원, 사이토킨, 성장 인자, 액션 프로텐셜, 약물 제제(예, 화학 요법제, 방사선, 발암제), 또는 다른 세포(즉, 세포-세포 접촉)와 같은 생리학적 신호에 노출하거나 하지 않고 또는 노출하기 전 또는 후에 평가한다. 다른 예에서는, 상이한 세포 사이클 단계에서 측정한다.

본 발명에서 제공하는 EG-VEGF 서열은 진단 방법에 이용될 수도 있다. EG-VEGF의 과대 발현은 생식 기관의 포낭 또는 암의 징조일 수도 있다. 또한, 돌연변이 EG-VEGF 또는 기능을 상실한 EG-VEGF를 찾기 위해 환자의 샘플을 분석할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 샘플을 환자와 비교하는 것, 그리고 EG-VEGF 발현을 대조군의 발현과 비교하는 것을 포함한다.

F. 항- EG - VEGF -항체

본 발명은 또한 항-EG-VEGF-항체를 제공한다. 이러한 항체의 예에는 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 양특이성 항체(bispecific antibody), 및 이종혼성 항체가 포함된다.

1. 다클론 항체

항-EG-VEGF 항체는 다클론 항체를 포함할 수 있다. 다클론 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다클론 항체는 예를 들면 면역 제제 및 필요하다면 보조제를 1회 이상 주사하여 포유 동물에서 배양할 수 있다. 전형적으로, 상기 면역 제제 및(또는) 보조제는 다수의 피하 주사 또는 복강 주사에 의해 포유 동물에 주사할 수 있다. 상기 면역 제제에는 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 이들의 융합 단백질이 포함된다. 상기 면역 제제를 면역 업계에 공지된, 면역시켜야 할 포유 동물의 단백질과 혼성하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 면역 단백질의 예에는 열쇠 구멍 삿갓 조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 송아지 티로글로불린, 및 콩 트립신 억제제가 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 사용할 수 있는 보조제의 예에는 프로이드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)가 포함된다. 당업자는 과도한 시행 착오 없이 면역 프로토콜을 선택할 수 있다.

2. 단클론 항체

항-EG-VEGF 항체는 또한 단클론 항체일 수도 있다. 단클론 항체는 하이브리도마법(예, 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)]에 기재된 방법들)으로 제조할 수 있다. 하이브리도마법에서는 쥐, 햄스터, 또는 다른 적당한 숙주 동물을 면역 제제를 사용하여 전형적인 방법으로 면역시켜 면역 제제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 또는, 상기 림프구는 실험관내에서 면역될 수도 있다.

상기 면역 제제는 전형적으로 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 이들의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 인간 유래 세포가 요구되는 경우라면 말초혈 림프구(PBLs)를 사용하고, 인간이 아닌 포유 동물 공급원이 요구되는 경우라면 지라 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 다음, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합 제제를 사용하여 상기 림프구를 불멸 세포주와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸 세포주는 일반적으로 형질 전환된 포유 동물 세포이고, 특히 설치 동물, 송아지, 및 인간 유래 골수종 세포이다. 일반적으로, 생쥐 또는 쥐 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불멸 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적절한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 부모 세포가 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이 효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족한 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미놉테린, 및 티미딘("HAT 배지")를 포함한다. 이들 물질은 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방해한다.

바람직한 불멸 세포주는 효과적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의해 항체를 높은 수준으로 안정하게 발현시킬 수 있도록 하고, 배지(예, HAT 배지)에 민감한 것들이다. 더 바람직한 불멸 세포주는 쥐 골수종 세포주이다. 이것은 예를 들면 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, California 소재) 및 American Type Culture Collection(Manassas, Virginia 소재)로부터 얻을 수 있다. 인간 골수종 세포주 및 쥐-인간 이종 골수종 세포주는 인간 단클론 항체의 생산을 위해 발표되어 왔다(Kozbor, J. Immunol ., 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).

다음, EG-VEGF에 대한 단클론 항체의 존재를 알아 보기 위해 하이브리도마를 배양한 배양 배지를 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역 침전법 또는 실험관내 결합 분석(예, 방사선 면역 분석법(RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA))으로 측정할 수 있다. 이러한 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들면 Munson과 Pollard의 스캐차드 분석(Scatchard analysis)으로 측정할 수 있다.

원하는 하이브리도마 세포가 확인되고 나면, 희석 방법을 제한하여 상기 클론을 서브클로닝하고 표준적인 방법(Goding, 상기 문헌)을 사용하여 성장시킬 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지는 예를 들면 Dulbecco의 Modified Eagle's 배지 및 RPMI-1640 배지이다. 또는, 하이브리도마 세포를 포유 동물의 복수와 같은 생체내에서 성장시킬 수도 있다.

서브클론이 분비한 단클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법(예, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 이동, 또는 친화도 크로마토그래피)을 사용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리 또는 정제할 수 있다.

단클론 항체는 또한 재조합 DNA법(예, 미국 특허 4,816,567에 기재되어 있는 방법들)으로 만들 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 분리하여 통상적인 방법(예, 쥐 항체의 중사슬 및 경사슬을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)으로 서열을 판독할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA를 위한 바람직한 공급원으로서 기능한다. 일단 분리하고 나면, DNA를 발현 벡터에 넣고, 이것을 숙주 세포(예, 다른 방법으로는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포)에 형질 감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성한다. 상기 DNA는 또한 인간의 중사슬 및 경사슬 불변 영역의 코딩 서열을 쥐의 상동 서열(미국 특허 4,816,567; Morrison et al., 상기 문헌) 대신 치환해 넣거나 또는 비면역글로불린 폴리펩티드 코딩 서열의 전부 또는 일부를 상기 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시켜 변형시킬 수 있다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 영역을 치환하거나 또는 본 발명 항체의 1 항체 결합 자리의 가변 영역을 치환하여 2가 키메릭 항체를 만들 수도 있다.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 만드는 방법은 당업게에 공지되어 있다. 예를 들면, 이러한 방법들 중 한 방법은 면역글로불린 경사슬 및 변형된 중사슬의 재조합 발현을 포함한다. 일반적으로 중사슬은 중사슬 가교 결합이 일어나는 것을 방지하기 위해 Fc 영역의 임의의 지점에서 자를 수 있다. 또는, 가교 결합을 방지하기 위해 적절한 시스테인 잔기를 없애거나 다른 아미도산 잔기로 대체할 수 있다.

1가 항체를 만들기 위해서는 시험관내 방법도 적절하다. 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 항체를 소화시켜 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조할 수 있다.

3. 인간 항체 및 인간화 항체

본 발명 항-EG-VEGF 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비인간(예, 쥐) 항체의 인간화된 형태는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 이들의 단편(예, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 하위 서열)이다. 인간화 항체에는 수용체의 상보적 결정 영역(CDR) 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 비인간종(예, 쥐, 생쥐 또는 토끼)의 CDR 잔기(제공자 항체)로 치환한 인간 면역글로불린(수용체 항체)이 포함된다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기를 대응하는 비인간 잔기로 치환한다. 인간화 항체는 또한 수용체 항체 또는 이입되는 CDR 또는 골격 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 그리고 전형적으로는 2개의 가변 영역을 실질적으로 전부 포함하고, 여기서 모든 CDR 영역 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고, 모든 FR 영역 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 염기 서열의 FR 영역이다. 인간화 항체는 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린 불변 영역의 일부를 포함한다(Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988); and Presta, Curr . Op . Struct . Biol ., 2:593-596(1992)).

비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계예 공지되어 있다. 일반적으로 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 도입한 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "이입" 잔기라 불리고, 전형적으로는 "이입" 가변 영역에서 얻을 수 있다. 인간화는 실질적으로 하기하는 Winter와 그의 공동 연구자들(Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988))이 개발한 방법대로 인간 항체의 CDR 또는 CDP 서열을 설치류 CDR 또는 CDP 서열로 치환함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 원형 그대로의 인간 가변 영역보다 실질적으로 적은 영역이 대응하는 비인간종의 서열에 의해 치환된 키메릭 항체(미국 특허 4,816,567)이다. 실질적인 관점에서, 인간화 항체는 약간의 CDR 잔기 및 가능하다면 약간의 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 자리 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.

인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 생산할 수 있다. 이러한 방업에는 파지 전시 라이브러리가 포함된다(Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227:381(1991); Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581(1991)). 인간 단클론 항체를 제조하기 위해서 Cole 등과 Boerner 등의 기술을 이용할 수 있다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) and Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95(1991)). 유사하게, 인간 면역글로불린 유전자 좌(locus)를 유전자 도입 동물(예, 내생 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 쥐)에 도입함으로써 인간 항체를 만들 수 있다. 도입하고 나면 인간 항체가 생성되는 것을 관찰할 수 있다. 이것은 모든 면(예, 유전자 재배열, 유전자 조합, 항체 레퍼토리)에서 인간에서 관찰할 수 있는 것과 매우 유사하다. 이러한 방법은 예를 들면 미국 특허 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,623,425, 5,661,016 및 과학 간행물(Marks et al., Bio/Technology10, 779-783(1992); Lonberg et al., Nature368 856-859(1994); Morrison, Nature368, 812-13(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology14, 845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology14, 826(1996); Lonberg and Huszar, Intern . Rev . Immunol. 13, 65-93(1995))에 기재되어 있다.

4. 양특이성 항체

양특이성 항체는 2 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론성이고 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명의 경우, 결합 특이성 중 하나는 EG-VEGF에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 아단위(subunit)에 대한 것이다.

양특이성 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 양특이성 항체의 재조합에 의한 제조는 2개의 중쇄(heavy chain)가 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공발현에 기초한 것이다 [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄/경쇄의 무작위 배분(random assortment)으로 인해, 이들 하이브리도마(quadroma)는 항체 분자 중 하나만이 코렉트(correct) 양특이성 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성한다. 코렉트 분자의 정제는 통상적으로 친화 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일 공개된 WO제93/08829호 및 트라우넥커(Traunecker) 등의 문헌[EMBO J., 10:3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.

원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 바람직하게, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 비롯한 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 대한 것이다. 1 이상의 융합체에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 자리를 갖는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 독립된 발현벡터에 삽입하고 적합한 숙주 유기체에 코트랜스펙션(co-transfectioin)시킨다. 양특이성 항체를 형성하는 것에 관한 더 자세한 사항은 예컨대 수레쉬(Suresh) 등의 문헌[Methods in Enzymology, 121:210 (1986)] 참조.

WO제96/27011호에 기재된 다른 방식에 따르면, 한 쌍의 항체 분자간의 계면을 조작함으로써, 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로다이머(heterodimer)의 분율을 최대로 할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 1 이상의 작은 아미노산 사슬을 더 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)으로 치환한다. 큰 아미노산 사슬을 더 작은 것(예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환함으로써 위 큰 측쇄(들)에 비해 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상성(compensatory) "공동(cavity)"을 제2 항체 분자의 계면 상에 형성하고, 이에 따라 호모다이머와 같은 다른 원치않는 말단 산물에 비해 헤테로다이머의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

양특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예, F(ab)₂ 양특이성 항체)로 제조가능하다. 항체 단편으로부터 양특이성 항체를 형성하는 기술은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학 결합을 사용해 양특이성 항체를 제조할 수 있다. 브렌난(Brennan) 등의 문헌[Science 229:81 (1985)]은 온전한 항체를 단백질 가수분해에 의해 절단하여 F(ab')₂ 단편을 발생시키는 절차를 개시하고 있다. 디티올 착화제로서 아비산나트륨의 존재 하에서 이들 단편을 환원시켜 인접한 디티올을 안정화하고 분자간 S-S 형성을 막는다. 이어서, 형성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨 후, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체를 혼합해 양특이성 항체를 형성한다. 제조된 양특이성 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 작용물질로 사용가능하다.

Fab' 단편은 E. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 결합되어 양특이성 항체를 형성할 수 있다. 살라비(Shalaby) 등의 문헌[J. Exp . Med. 175:217-225(1992)]은 E. 콜라이로부터 각각 분비되고 생체 밖에서 직접 화학 결합되어 양특이성 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 양특이성 항체는 인간 유방암 타겟에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시키는 것 뿐 만 아니라, ErbB2 수용체 및 정상적인 T 세포를 과발현시키는 세포에 결합될 수 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 직접 제조된 항체 양특이성 항체 단편을 제조하고 단리하는 각종 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 루이신 지퍼(leucine zipper)를 사용해 양특이성 항체를 제조해 왔다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992)]. 포스(Fos) 및 Jun(준) 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩타이드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 결합시켰다. 항체 호모다이머를 힌지 영역에서 환원시켜 모노머를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 또한, 이 방법을 항체 호모다이머의 제조에 사용할 수도 있다. 홀링거(Hollinger) 등의 문헌[Proc . Natl . Acad , Sci, USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 양특이성 항체 단편을 제조하는 다른 대안적인 메카니즘을 제공하였다. 그 단편은 너무 짧아 동일한 사슬 상의 두 도메인간의 짝이룸을 허용치 않는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인을 다른 단편의 보충적 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루게 함으로써 2개의 항원 결합 자리를 형성한다. 단쇄 F_V (sF_v) 다이머를 사용해 양특이성 항체 단편을 제조하는 다른 대안이 보고되었다. 그루버(Gruber) 등의 문헌[J. Immunol, 152:5368 (1994)] 참조. 2 보다 많은 수가(valency)를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 세특이성(trispecific) 항체를 제조할 수 있다. 터트(Tutt) 등의 문헌 [J. Immunol. 147:60 (1991)].

전형적인 양특이성 항체는 소정의 EG-VEGF 폴리펩티드 상에서 2개의 상이한 항원 결정부위(epitope)에 결합될 수 있다. 다른 대안으로는, 특정한 EG-VEGF 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포 방어 메카니즘을 집중시키기 위해 T-세포 수용체 분자(예, CD2, CD3, CD28 또는 B7)와 같은 백혈구 또는 Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) 및 Fc RIII(CD16)와 같은 IgG(Fc R)용 Fc 수용체 상에서 개시 분자(triggering molecule)에 결합하는 암(arm)에 항-EG-VEGF 폴리펩티드 암을 결합시킬 수 있다. 또한, 양특이성 항체를 사용해 특정 EG-VEGF 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성제를 국소화시킬 수 있다. 이들 항체는 EG-VEGF 결합 암 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이터(예, EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA)를 결합시키는 암을 갖는다. 관심있는 다른 양특이성 항체는 EG-VEGF 폴리펩티드를 결합시키고 나아가 조직 인자(TF)를 결합시킨다.

5. 헤테로콘주게이트 ( Heteroconjugate ) 항체

본 발명의 범주에는 또한 헤테로콘주게이트 항체가 포함된다. 헤테로콘주게이트 항체는 공유결합된 2개의 항체로 구성된다. 그러한 항체는 예를 들어, 원치않는 세포에 면역계 세포를 타겟으로 하고(미국특허 제4,676,980호) HIV 감염의 치료(WO제91/00360호, WO92/200373호, EP 03089]를 위해 제안되었다. 관련 가교제를 비롯해 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용해 항체를 세포 밖에서 제조하는 것도 고려된다. 예를 들어, S-S 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성해 면역독소를 구성할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있고 이들 물질은 미국특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

6. 이펙터 ( effector ) 기능 조작

암을 치료함에 있어 예를 들어 항체 효능을 증강시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써 이 영역에서 사슬간 S-S 결합 형성을 가능케 할 수 있다. 이렇게 발생된 호모다이머성 항체는 개선된 내재화 능력(internalization capability) 및(또는) 개선된 보체 매개 세포 소멸성 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 캐론(Caron) 등의 문헌[J. Exp Med ., 176:1191-1195(1992)] 및 쇼페즈(Shopes)의 문헌[J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)] 참조. 개선된 항암 활성을 갖는 호모다이머성 항체는 또한 울프(Wolff) 등의 문헌[Cancer Research, 53: 2560:2565 (1993)]에 기재된 것과 같은 헤테로이작용성(heterobifunctional) 가교제를 사용해 제조할 수 있다. 다른 대안으로, 두 Fc 영역을 갖고 이에 따라 개선된 보체 용해성 및 ADCC 능력를 가질 수 있는 항체를 조작할 수 있다. 스테벤손(Stevenson) 등의 문헌[Anti - Cancer Drug Design, 3:219-230(1989)].

7.면역콘주게이트( Immunoconjugate )

본 발명은 또한 화학요법제, 독소(예, 박타리아, 진균류, 식물 또는 동물 출처원 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성콘주게이트)에 콘주게이션된 항체를 포함하는 면역콘주게이트에 관한 것이다.

그러한 면역콘주게이트의 발생에 유용한 화학요법제는 전술한 바와 같다. 사용가능한 효소활성 독소 및 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합성 활성 단편, 엑소탁신 A 사슬[슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)], 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레루라이츠 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노미신, 엔노미신 및 트리코테세네즈를 들 수 있다. 각종 방사핵종이 방사콘주게이션된 항체의 제조에 유용하다. 그 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹l, ¹³¹ln, ⁹⁰γ및 ¹⁸⁶Re를 들 수 있다.

항체 및 세포독성제의 콘주게이트는 각종 이작용성 단백질-결합제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예, 글루타렐데하이드), 비스-아지도화합물(예, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용해 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 비테타(Vitetta) 등의 문헌[Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 것처럼 제조할 수 있다. 카본-14-표지화된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)가 항체에 방사핵종을 콘주게이션하기 위한 대표적인 킬레이트제이다. WO제94/11026호 참조.

다른 실시태양에서, 항체-수용체 콘주게이트를 환자에게 투여한 후 제거제(clearing agent)를 사용해 순환조(circulation)로부터 비결합 콘주게이트를 제거하고, 이어서 세포독성제(예, 방사핵종)에 콘주게이션된 "리간드" (예, 아비딘)을 투여함으로써, 종양의 예비타겟팅에 사용하기 위해 항체를 수용체(스트렙토비딘)에 콘주게이션시킬 수 있다.

8. 면역리포솜( Immunoliposome )

또한, 본 명세서에 기재된 항체는 면역리포솜으로 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 엡스테인(Epstein) 등의 문헌[Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:3688 (1985)], 황(Hwang) 등의 문헌[Proc . Natl Acad . Sci . USA, 77: 4030(1980)] 및 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올라민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상증발법에 의해 형성할 수 있다. 소정의 공극 크기를 갖는 필터에 리포솜을 압출시켜 원하는 직경의 리포솜을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 S-S 교환 반응을 통해 마틴(Martin) 등의 문헌[J. Biol . Chem ., 257: 286-288 (1982)]에 기재된 것과 같은 리포솜에 콘주게이션시킬 수 있다. 경우에 따라서, 화학요법제(예, 독소루비신)을 리포솜에 함유시킨다. 가비존(Gabizon) 등의 문헌[J. National Cancerlnst., 81(19): 1484(1989)]의 참조.

9. 항체의 제약 조성물

앞서 기술된 스크린 분석에 의해 동정된 다른 분자 외에 본 발명에서 동정된 항체 특이적 결합 EG-VEGF 폴리펩티드를 제약 조성물 형태로 각종 질환을 치료하기 위해 투여할 수 있다.

만약 EG-VEGF 폴리펩티드를 세포내적으로 타겟팅화하고 모든 항체를 억제제로 사용하는 경우, 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포솜을 사용해 항체 또는 항체 단편을 세포에 전달할 수 있다. 항체 단편을 사용하는 경우, 타겟 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체, 펩티드 분자의 가변 영역 서열에 기초하여, 타겟 단백질 서열을 결합시키는 능력을 갖는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 그러한 펩티드를 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술을 사용해 제조할 수 있다. 예를 들어, 마라스코(Marasco) 등의 문헌[Proc . Natl . Acad , Sci . USA, 90: 7889-7893(1993)] 참조. 또한, 본 발명에서 제제는 특정 적응증을 치료하기 위해 필요한 활성 화합물, 바람직하게는 상호 반작용을 일으키지 않는 보체 활성을 갖는 활성 화합물을 1종 보다 많이 포함할 수도 있다. 다른 대안으로 또는 그 외에, 본 발명의 조성물은 그 기능을 증가시키는 작용물질, 예컨대 세포독성제, 시토킨, 화학요법제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 그러한 분자들은 의도된 목적에 유효한 양으로 적합하게 함께 존재한다.

또한, 활성 성분은 콜로이드 약물전달 시스템(예, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 마이크로에멀젼에서 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면중합(예, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐에 가둘(entrapping) 수 있다. 그러한 기술은 레밍톤(Remington)의 상기 문헌(Pharmaceutical Sciences)에 기재되어 있다.

시험관 내 투여를 위해 사용되는 제제는 무균성이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제로서 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트리스(이 매트리스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태임)가 포함된다. 서방성 매트리스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(예, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올), 폴리악타이드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 난분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 난분해성 젖산-글리콜산 공중합체[예컨대, LUPRON DEPOT^TM (젖산-글리콜산 공중합체 및 류프로리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어)] 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체가 100 일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 어떤 하이드로겔은 더 단기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체에 장기간 잔류하는 경우, 37℃에서 습기에 노출되어 변성되거나 응집되고, 이에 따라 생활성의 손상 및 면역원성의 가능한 변화을 가져온다. 합리적인 방법이 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 설프히드릴 잔기를 바꾸고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 조절하고, 적합한 첨가제를 사용하고 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성할 수 있다.

G. 항- EG - VEGF 항체를 위한 용도

본 발명의 항-EG-VEGF 항체는 다양한 용도를 가진다. 예를 들어, 항-EG-VEGF 항체는 EG-VEGF에 대한 진단 분석, 예를 들어 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서 그 발현을 탐지하는데 사용가능하다. 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 기술, 예를 들어 불균일상 또는 균일상에서 수행된 경합적 결합 분석법, 직접적 또는 간접적 샌드위치 분석법 및 면역침전법을 사용할 수 있다[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. 진단 분석에 사용된 항체는 탐지가능한 부분으로 표지화될 수 있다. 탐지가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 탐지가능한 부분은 방사성동위원소(예, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S 또는 ¹²⁵l), 형광 또는 화학발광 화합물(예, 플루오레스세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린) 또는 효소[예, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 호세라디쉬 페록시다아제)일 수 있다. 항체를 탐지가능한 부분에 콘주게이션하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 헌터(Hunter) 등의 문헌[Nature, 144:945 (1962)], 데이비드(David) 등의 문헌[Biochemistry, 13:1014 (1974)], 페인(Pain) 등[J. Immunol . Meth ., 40:219(1981)] 및 니그렌(Nygren)[J. Histochem . and Cytochem., 30:407(1982)]에 기술된 방법들을 사용할 수 있다.

또한, 항-EG-VEGF 항체가 재조합 세포 배양물 또는 천연원으로부터의 EG-VEGF의 친화력 정화를 위해 유용하다. 이 방법에서, EG-VEGF에 대한 항체를 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 적합한 지지체(예, 세파덱스 수지 또는 여과지) 상에 고정할 수 있다. 이어서, 고정된 항체를 정제하고자 하는 EG-VEGF 함유 시료와 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합하는 EG-VEGF를 제외하고 시료 중의 거의 모든 물질을 제거할 적합한 용매에 지지체를 씻는다. 마지막으로, 항체에서 EG-VEGF를 방출할 다른 적합한 용매로 지지체를 씻는다. 더욱이, 항-EG-VEGF 항체는 치료제 및 진단제로서 유용하고 EG-VEGF 및 EG-VEGF 길항제와 관련해 앞서 논의한 증상의 치료 및(또는) 진단을 위해 사용될 수 있다.

아래 실시예는 오직 예시적인 목적을 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 것은 결코 아니다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전부를 참고문헌으로 인용한다.

<실시예>

하기 실시예에서 언급된 시판 시약은 달리 지시되지 않는 한 제조자 지침에 따라 사용되었다. 아래 실시예 및 명세서에서 ATCC 기탁번호에 의해 확인되는 세포의 출처원은 버지니아주 매나사스에 소재하는 에메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)이다.

실시예 1

인간 EG - VEGF 를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

DNA60621-1516은 공공(예, 젠뱅크) 및(또는) 사유(캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 린시테 파마슈티칼즈 인크로부터의 LIFESEQ^TM) 데이타베이스로부터의 클러스터링되고 어셈블링된 EST 단편 외에 EST에 사유의 신호서열 찾기 알고리듬(도 20A-Q) (캘리포니아 사우쓰 샌브란시스코에 소재하는 제네테크 인크에 의해 개발됨)을 적용하여 확인하였다. 시호서열 알고리듬은 고려중인 서열 또는 서열단편의 5'-말단에서 제1 및 임의로 제2 메티오닌 코돈(들)을 둘러싸는 DNA 뉴클레오티드의 특성에 기초해 분비 신호 스코어를 산출한다. 제1 ATG에 이은 뉴클레오티드는 어떠한 정지 코돈도 없이 35 이상의 확실한 아미노산에 대해 유전암호를 지정한다(code). 만약 제1 ATG가 필요한 아미노산을 갖는다면, 제2 ATG는 조사되지 않는다. 어느 쪽도 조건을 만족사키지 않는 경우, 후보 서열을 스코어링하지 않는다. EST 서열이 인가된 신호 서열을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련되는 것으로 알려진 한세트의 7 센서(평가 파라메터0를 사용해 ATG 코돈을 둘러싸는 DNA 및 대응하는 아미노산 서열을 스코어링한다.

상기한 신호 서열을 사용해 LIFESEQ^TM 데이타베이스(팔로 알토에 소재하는 린사이트 파마슈티칼즈)(DNA157032로 명명된 데이타베이스)로부터의 EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하는 공공 EST 데이타베이스(예, 젠뱅크) 및 사유 EST DNA 데이타베이스(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 린사이트 파마슈티칼즈 LIFESEQ^TM)를 비롯한 각종 발현서열택(EST) 데이타베이스와 상기 클러스터 서열을 비교하였다. 상동성 조사는 컴퓨터 프로그램 블라스트(BLAST) 또는 블라스트2[Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480(1996)]를 사용해 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않았던 70(또는, 일부 경우는 90) 이상의 블라스트 스코어를 초래한 비교치를 프로그램 "프랩(phrap)"(워싱톤 시애틀 워싱톤 대학 필 그린)을 사용해 일치(consensus) DNA 서열로 클러스터링하고 어셈블링하였다. 그로부터 얻어진 일치 서열을 도 4(서열번호 3)(여기서, 일치 서열은 DNA56748로 명명됨)에 나타내었다.

인사이트(Incyte) 데이터베이스로부터 관찰된 클론 번호 3476792 내에 포함된 DNA56748 및 EST 서열 간의 서열 유사성 측면에서, 클론 번호 3476792를 구입하고 cDNA 삽입체를 얻어 시퀀싱하였다. 클론 번호 3476792를 난소 조직의 라이브러리로부터 분리하였다. 조직을 절개하여 후장막이 자궁 내막증의 병소를 포함한다는 것을 발견하였다. 관련 종양 조직에 대한 병리학적 연구는 다양한 크기의 다수 자궁 근종을 나타내었다. 본원에서는 cDNA 삽입체가 전장 단백질을 코딩한다는 것이 발견되었다. cDNA 삽입체의 서열은 도1에 나타나고 본원에서는 DNA60621-1516으로 지정되었다.

클론 DNA60621-1516은 91-93번의 뉴클레오티드 위치의 뚜렷한 해독 개시 부위를 갖고 406-408번의 뉴클레오티드 위치의 정지 코돈에서 종결하는 단일 ORF를 포함한다 (도1). 예측된 폴리펩티드 전구체는 105개의 아미노산 길이이다 (도2). 도2의 전장 EG-VEGF 단백질은 약 11715 달톤의 예상 분자량과 약 9.05의 pl을 갖는다. 성숙 EG-VEGF는 인간 난소 라이브러리로부터 클론된 cDNA에 의해 코딩된 8600 달톤의 단백질이다. 1.4 킬로베이스의 cDNA는 잘 특정된 신호 서열을 갖는 105개의 아미노산의 단백질을 코딩한다. EG-VEGF는 콜리파제 폴드 모티브를 포함하는 시스테인 농후한 단백질이다. 성숙 단백질에서 기대되는 86개의 아미노산 중에서, 10개는 시스테인이다 (도15a 및 b). 단백질은 거대 연결 루프를 갖는 일련의 짧은 베타 가닥을 가지며, 그 거대 연결 루프는, 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 상호 작용 표면으로 작용하는 손가락 모양의 돌출을 갖는 편평한 폴드(fold)가 된다. 도2의 전장 EG-VEGF 서열 (SEQ ID NO:2)의 분석은 도2에 나타나는 있는 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 증명하며, 이러한 중요 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기한 바 처럼 근접하여 있다. 클론 DNA60621-1516은 1998년 8월 4일에 ATCC에 보관되었고 ATCC 보관 번호 203091로 지정되어 있다.

도2 (SEQ ID NO:2)의 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 사용하는, 데이호프 (Dayhoff) 데이터베이스 (버젼 35.45 SwissProt 35)의 분석은 EG-VEGF 아미노산 서열과 다음 데이호프 서열들 간의 서열 동등성을 증명한다: VRPA_DENPO, LFE4_CHICK, AF034208_1, AF030433_1, A55035, COL_RABIT, CELB0507_9, S67826-1, S34665 및 CRU73817_1.

놀랍게도, EF-VEGF는, 블랙 맘바 스네이크 Dendroaspis polyepis polylepis의 독으로 그 명칭 독성 단백질 A (VPRA) [Joubert and Strydom, Hoppe-Seylers Zeitschrift fur Phys. Chemie, 361:1787-1794 (1980)]으로부터 정제된 비독성 단백질과 높은 수준의 상동성(80%) 및 동등성(63%)을 나타내고, Bombina variegata로 부터 분리된 펩티드로 그 명칭 "Bv8" [Weschellberger et al., FEBS Lett., 462:177-181 (1999)]과 근접하게 관련된 인간 분자에 높은 수준의 상동성(76%) 및 동등성(58%)을 나타낸다. 도15b는 이러한 상동성을 나타낸다. 도15b에서, 박스로 표시된 잔기는 동등성을 나타내고, 인간 EG-VEGF, 스네이크 VPRA 및 인간 BV8 상동성 (Bv8 hom) 아미노산 서열이 나타난다. 주목할만한 점은, EG-VEGF에 대한 시스테인의 숫자와 스페이싱이 완전하게 보존된다는 점이다. 따라서, EG-VEGF는 인간 정향성이 있거나, 또는 VPRA 및 Bv8와 근접하게 관련된 상동성이 있다. 도 15c에서 볼 수 있는 것과 같이, EG-VEGF는 더욱 한정되기는 하지만 Xenopus 헤드 오거나이저 dickkopf, wnt 시그널링 저해제의 시스테인 농후한 카르복실 서열 및 콜리파제에 대해 상당한 상동성을 나타낸다 [Glinka et al., Nature, 391:357-362; Aravind and Koonin, Curr.Biology; 8:477-478 (1998)]. 도 15c는 인간 EG-VEGF, 인간 dickkopf-3 (hdkk 3) [Krupnik et al., Gene, 238:301-313 (1999)], Xenopus dkk-1 (xdkk1) [Ginka et al., Nature, 391:357-362 (1998)] 및 돼지 콜리파제 (col)의 정렬이다. 이 것은 콜리파제 폴드 도메인의 특징적 디설파이드-결합 패턴 을 형성하는 보존 시스테인을 나타낸다 [van Tilbeurgh et al, Nature, 359:159-162 (1992)]. EG-VEGF에서의 이 모티프는 인간 dkk-3의 시스테인 농후한 C-말단 도메인에 37% 동일성이 있고 41% 상동성이 있으며, Xenopus dkk-1 도메인에 32% 동일성이 있고 42% 상동성이 있다. 숫자는 각각의 단백질에서의 아미노산 위치를 나타내고, 박스로 표시된 잔기는 EG-VEGF와 동일하다.

실시예 2

혼성화 프로브로 EG - VEGF 의 사용

다음 방법은 혼성화 프로브로 EG-VEGF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 사용을 기재한다.

전장 또는 성숙 EG-VEGF의 코딩 서열을 포함하는 DNA는, 인간 조직 DNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA(예컨대, EG-VEGF의 자연 발생 변이를 코딩하는 것)의 스크린에 대한 프로브로 사용된다.

라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척은 다음의 매우 엄격한 조건 하에서 행하여진다. 필터의 방사선 표지된 EG-VEGF 유도 프로브의 혼성화는, 42℃에서 20시간 동안, 50% 포름아미드, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산 나트륨, 50 mM 인산 나트륨, pH 6.8, 2x 덴하르트(Denhardt) 용액 및 10% 덱스트란 설페이트의 용액에서 행한다. 필터의 세척은 42℃에서 0.1x SSC 및 0.1% SSD의 수용액에서 행한다.

그 후, 전장 고유 서열 EG-VEGF를 코딩하는 DNA와 목적하는 서열 동등성을 갖는 DNA는 당업계에 알려진 표준 기술을 사용하여 동정할 수 있다.

실시예 3

E. Coli 에서의 EG - VEGF 발현

본 실시예는 E. Coli에서의 재조합 발현에 의한 EG-VEGF의 엉글리코실레이드된(unglycosylated) 형태의 제조를 예시한다.

우선 EG-VEGF를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한다. 프라이머는 선택 발현 벡터의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 포함하고 있어야 한다. 적합한 벡테의 예는, 암피실린 및 테트라시클린 저항성 유전자를 포함하고 있는 pBR322 (E. Coli,에서 유도됨, Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977) 참조]이다. 이 벡터를 제한 효소로 분해하고 탈인산화한다. 그 후 PCR 증폭 서열을 벡터 내로 결합시킨다. 벡타는 바람직하게는 항생제 저항성 유전자, 트립(trip) 프로모터, 폴리히스(polyhis) 리더 (최초 6개의 STII 코톤, 폴리히스 서열 및 엔테로키나아제 절단 부위를 포함), EG-VEGF 코딩 부위, 람다 전사 종결자, 및 argU 유전자에 대한 코딩 서열을 포함할 것이다.

그 후, 삼브룩 등의 상기 문헌에 기재된 방법을 사용하여, 결합 혼합물을 선택된 E. Coli 균주를 전환하는데 사용한다. 전환체를 LB 플레이트에서의 생장 능력으로 동정한 후, 항생 저항 콜로니를 선택한다. 플라즈미드 DNA를 분리하고 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 확인할 수 있다.

선택된 콜로니를 항생제로 보충된 LB 액체 배지와 같은 액체 배지에서 밤새 생장시킬 수 있다. 밤샘 배양은 이어서 대량 규모의 배양을 하는데 사용할 수 있다. 그 후 세포를 발현 프로모터가 나타나는 원하는 광학 밀도로 생장시킨다.

몇 시간 더 배양한 후에 세포를 원심분리하여 수확할 수 있다. 원심분리로 얻은 세포 펠렛은 당업계에 알려진 다양한 시약을 사용하여 용해화할 수 있고, 용해된 EG-VEGF 단백질은, 단백질을 단단하게 결합하게 하는 조건 하에서, 금속 킬레이팅 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다.

EG-VEGF는 다음의 공정을 사용하여, 폴리-히스 표지 형태로 E. Coli에서 발현시킬 수 있다. 우선 EG-VEGF를 코딩하는 DNA를 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰성 있는 번역 개시, 금속 킬레이션 칼럼 상에서의 신속한 정제 및 엔테로키나아제로 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열포함할 것이다. 그 후, 균주 52 (W3110 fuhA(tonA) 이온 galE rpoHts (htpRts), clpP (laclq)를 기초로 E. Coli 숙주를 전환하는데 사용하는, PCR-증폭 폴리-히스 표지 서열을 발현 벡터 내로 결합시킨다. 우선, O.D. 600의 3-5에 도달할 때까지, 30℃에서 교반하면서 50 mg/ml 카르베니실린을 함유하는 LB에서 생장시킨다. 그 후, 배지를 CRAP 배지 (3.57 g (NH₄)₂SO₄, 0.71g 구연산 나트륨 2H20, 1.07g KCl, 5.36 g 디프코(Difco) 효모 추출물, 물 중 5.36 g 쉐필드 히카제 SF, 이외에 10 MPOS, pH 7.3, 0.55%(w/v) 클루코스 및 7 mM MgSO₄를 혼합하여 제조함)로 50-100배 희석하고, 교반과 함께 30℃에서 약 20-30시간 동안 생장시킨다. 샘플을 제거하고, SDS-PAGE 분석으로 발현을 확인하고, 벌크 배양을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 옮긴다. 세포 펠렛을 정제 및 리폴딩 때까지 동결한다.

0.5 내지 1 L 발효물 (6-10g 펠렛)의 E. Coli 페이스트를 7 M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 8 버퍼에서 10배(w/v)로 재현탁하다. 고체 아황산 나트륨 및 테트라티오네이트 나트륨을 첨가하여 각각 0.1 M 및 0.02 M의 최종 농도를 만들고, 용액을 밤새 4℃에서 교반한다. 이 단계는 모든 시스테인 잔기들이 아황산화에 의해 블록된 변성된 단백질을 제공한다. 이 용액을 벡크만 울트라센드리퓨즈 (Beckman Ultracentrifuge) 내에서 40,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 금속 킬레이트 칼럼 버퍼 (6M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 7.4)의 3-5배 분량으로 희석하고, 0.22 마이크론 필터로 여과하여 정제한다. 정제된 추출물을 금속 킬레이트 칼럼 버퍼에서 평형된 5 ml 퀴아겐(Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 칼럼 상에 적재한다. 칼럼을 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4를 포함하는 추가 버퍼로 세척한다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼로 용리한다. 목적 단백질을 포함하는 분류를 모아서 4℃에서 저장한다. 단백질 농도는 아미노산 서열을 기초로 하여 계산된 절멸 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡수도로 평가한다.

20 mM 트리스, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA를 포함하는, 새롭게 제조된 리폴딩 버퍼에 샘플을 천천히 희석화함으로써, 단백질을 리폴드한다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 마이크로그람/ml이 되도록 선택된다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12-38시간 동안 부드럽게 교반한다. 리폴딩 반응은 최종 농도가 0.4% (pH는 약 3)로 되도록 TFA를 첨가함으로써 진정시킨다. 단백질을 더 정제하기에 앞서, 용액을 0.22 미크론 필터로 여과하고 아세토니트릴을 2-10% 최종 농도가 되도록 첨가한다. 리폴드된 단백질을 10 내지 80%의 아세토니트릴 분배의 용리를 갖는 0.1% TFA의 유동성 버퍼를 사용하여 프로스 (Pros) R1/H 역상 칼럼 상에서 크로마토그래피한다. A280의 흡수도를 갖는 분획 부분을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하고 리폴드된 상동성 단백질을 포함하는 분획을 모은다. 일반적으로, 대부분의 단백질 중 적절하게 리폴드된 종류는 역상 수지와의 상호 반응으로부터 은폐되는 소수성 내부 구조로 매우 조밀하기 때문에, 아세토니트릴의 최소 농도에서 용리된다. 응집된 종류는 아세토니트릴 고농도에서 통상 용리된다. 역상 단계는 목적 형태로부터 잘못 폴드된 단백질 형태를 용해하는 것 이외에, 샘플로부터 엔도톡신도 제거한다.

목적하는 폴드된 EG-VEGF 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으고 용액에 대한 질소의 온순한 흐름을 사용하여 아세토니트릴을 제거한다. 단백질을 배합 버퍼에서 평형화되고 무균으로 여과된 G25 슈퍼파인(Superfine) (Pharmacia) 수지를 사용하여 투석 또는 겔 여과를 통해, 염화 나트륨 및 4% 마니톨으로 20 mM 헤페스, pH 6.8로 배합한다.

실시예 4

포유류 세포에서 EG - VEGF 의 발현

본 실시예는 포유류 세포에서 재조합 발현에 의한 EG-VEGF의 잠재적으로 글리코실레이트된 형태의 제조를 예시한다.

벡터 pRK5 (1989년 3월 5일에 공표된 EP 307,247 참조)를 발현 벡타로 사용한다. 선택적으로, 삼브룩 등의 상기 문헌에 기재된 것과 같은 결합 방법을 사용하여 EG-VEGF DNA를 선택 제한 효소로 pRK5 내로 결합하여 EG-VEGF DNA이 삽입되도록 한다. 생성 벡타를 pRK5-EF-VEGF라고 지정한다.

일 실시 태양으로, 선택 숙주 세포는 293개의 세포일 수 있다. 293개의 인간 세포 (ATCC CCL 1573)를 생장시켜 송아지 태아 혈청 및 선택적으로 영양 성분 및/또는 항생제를 보충된 DMEM과 같은 배지의 조직 배양 플레이트에 합류시킨다. 약 10g의 pRK5-EG-VEGF DNA를 VR RNA 유전자를 코딩하는 약 1g의 DNA와 혼합하고 [Thimmappaya 등, Cell, 31-543 (1982)], 500 l의 1 mM 트리스-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.027 M CaCl₂에 용해시킨다. 그 혼합물에 500 l의 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 적가하고, 침전물이 25℃에서 10분동안 형성되도록 한다. 침전물을 현탁하고 293개의 세포에 첨가하고 37℃에서 약 4시간 동안 정치한다. 배양 배지를 흡기하고 PBS 중의 2 ml의 20% 글리세롤을 30초 동안 첨가한다. 293개의 세포를 무혈청 배지로 세척한 후, 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 약 5일 동안 배양한다.

트렌스펙션 약 24시간 후, 배양 배지를 제거하고 배양 배지 (단독) 또는 200 Ci/ml ³⁵S-시스테인 및 200 Ci/ml ³⁵S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 교체한다. 12시간의 배양 후, 조절 배지를 수집하고, 스핀 필터 상에서 농축하고, 15% SDS 겔 상에 적재한다. 진행된 겔을 건조하고 선택된 기간의 시간 동안 필름에 노출하여 EG-VEGF 폴리펩타이드의 존재를 확인한다. 트랜스펙트된 세포를 함유하는 배지를 (무혈청 배지에서) 더 배양하고, 배지를 선택된 생물학적 검정으로 시험한다.

별법의 기술로, 솜파리락(Somparyrac) 등의 문헌 [Proc.Natl.Acad.Sci., 12:7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 설페이트 방법을 사용하여 EG-VEGF를 293개의 세포 내로 일시적으로 도입시킬 수 있다. 293개의 세포를 스피너 플라스크에서 최대 밀도로 생장시키고 700g의 pRK5-EG-VEGF DNA를 첨가한다. 우선 세포를 스피너 플라스크로부터 원심분리하여 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛에서 배양한다. 세포를 90초 동안 20% 글리세롤로 처리하고, 조직 배양 배지로 세척하고, 조직 배양 배지, 5, g/ml의 소 인슐린 및 0.1 g/ml의 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크로 재도입한다. 약 4일 후에, 조절 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 잔해를 제거한다. 그 후, 발현된 EG-VEGF를 함유하는 샘플을 농축하고 투석 및/또는 칼럼 크로마토그래피와 같은 선택된 방법으로 정제한다.

또 다른 실시 태양으로는, EG-VEGF를 CHO 세포 내에서 발현할 수 있다. CaPO₄ 또는 DEAE-덱스트란과 같은 알려진 시약을 사용하여, pRK5-VEGF를 CHO 세포 내로 트랜스펙트할 수 있다. 상기한 바와 같이, 세포 배양을 상온 처리할 수 있고, 배지는 배양 배지 (단독) 또는 ³⁵S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 함유하는 배지로 교체할 수 있다. EG-VEGF 폴리펩티드의 존재를 확인한 후에는, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양을 약 6시간 동안 상온 처리한 후, 조절 배지를 수확한다. 그 후, 발현된 EG-VEGF를 함유하는 배지를 농축하고 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

에피토프 표지 EG-VEGF는 또한 숙주 CHO 세포에서 발현될 수 있다. EG-VEGF는 pRK5 벡터 외부에서 서브클론될 수 있다. 서브클론 삽입체를 PCR을 수행하여 프레임 내에서 폴리-히스 표지와 같은 선택된 에티토프 표지로 바쿨로바이러스 (Baculovirus) 발현 벡타 내로 융합시킬 수 있다. 그 후, 폴리-히스 표지 EG-VEGF 삽입체를 안정된 클론의 선택을 위하여 DHFR과 같은 선택 마커를 함유하는 SV 40 유도 벡터 내로 서브클론할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 SV40 유도 벡테로 (전기한 바와 같이) 트랜스펙트할 수 있다. 상기한 바와 같이 방사선 표지를 하여 발현을 확인할 수 있다. 그 후, 발현된 폴리-히스 표지 EG-VEGF를 함유하는 배양 배지를 농축하고 Ni² ⁺-킬레이트 친화 클로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

EG-VEGF는 또한 일시적 발현 공정에 의한 CHO 및/또는 COS 세포 내에서 발현 될 수 있으며, 또 다른 안정된 발현 공정에 의해 CHO 세포 내에서 발현될 수 있다.

CHO 세포 내에서의 안정된 발현은 다음 공정을 사용하여 행하여 진다. 단백질은, IgG 협착물 (이뮤노아드헤신(immunoadhesin))로 발현되며, 그 협착물 내에는 각각의 단백질의 안정한 형태 (예컨대, 세포외 도메인)에 대한 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 함유하는 IgG1 불변 부위 서열로 융합되어 있고/있거나 폴리-히스 표지 형태이다.

PCR 증폭 후, 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌 [Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 기술을 사용하여, 각각의 DNA를 CHO 발현 벡터 내로 서브클론한다. CHO 발현 벡타는 관심 DNA의 양립성 제한 위치 5' 및 3'을 갖도록 협착되어 cDNA의 편리한 셔틀링을 허용한다. CHO 세포 내의 발현에 사용되는 벡터는, 루카스(Lucas) 등의 문헌 [Nucl.Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같으며, 초기에는 관심 cDNA 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)의 발현을 유도하는 SV40 초기 프로모터/인핸서 (promoter/enhancer)를 사용한다. DHFR 발현은 트랜스펙션이 뒤따르는 플라즈미드의 안정한 유지를 위해 선택되도록 한다.

상업적으로 구입할 수 있는 트렌스펙션 시약인 Superfect^TM (Quiagen), Dosper^TM 또는 Fugene^TM (Boehringer Mannheim)을 사용하여, 목적 플라즈미드 DNA의 12개의 미생물을 약 1000만 개의 CHO 세포로 도입한다. 세포를 루카스 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 생장시킨다. 약 3 x 10⁷개의 세포를 하기하는 바와 같은 생장 및 증식을 위해 앰플 (ampule)로 동결한다.

플라즈미드 DNA를 함유하는 앰플을 수 욕조에 배치하여 해동하고 와동하여 혼합한다. 내용물을 10 mL의 배지를 함유하는 원심분리 튜브로 피펫으로 옮기고 5분동안 1000 rpm으로 원심분리한다. 상청액을 흡기하고 세포를 10 mL의 선택 배지 (5% 0.2 m의 디아필터된 소 태아 혈청으로 0.2 m의 필터된 PS20)에서 재현탁한다. 그 후, 세포를 90 mL의 선택 배지를 함유하는 100 mL의 스피너로 분량한다. 1-2일 후, 세포를 150 mL의 선택 생장 배지로 채워진 250 mL의 스피너로 옮기고, 37℃에서 배양한다. 2-3일 더 지난 후, 250 mL, 500 mL 및 2000 mL의 스피너를 3 x 10⁵ 세포/mL로 시드한다. 세포 배지를 증식 배지에서 원심분리 및 재현탁하여 신선한 배지로 교환하다. 적절한 CHO 배지를 사용할지라도, 1992년 6월 16일에 등록된 미국 특허 제5,122,469호에 기재된 증식 배지를 실제 사용할 수 있다. 3L 증식 스피너를 1.2 x 10⁸ 세포/mL로 시드한다. 0일에 세포 수 pH를 측정한다. 1일에, 스피너를 샘플화 하고 여과 공기를 살포한다. 2일에, 스피너를 샘플화 하고, 온도를 33℃로 이동하고, 30 mL의 500 g/L 글루코스 및 0.6 mL의 10% 기포 제거제 (예컨대, 35% 폴리디메틸실록산 이멀션, 다우 코닝 365 메디칼 그레이드 이멀션)을 취한다. 전체 증식 동안, 필요에 따라 pH는 7.2 정도로 유지되도록 조절한다. 10일 후, 또는 생활력이 70% 미만으로 떨어질 때까지, 세포 배양을 원심분리 및 0.22 m 필터를 통해 여과하여 수확한다. 여과액을 4℃에서 저장하거나, 또는 정제를 위해 컬럼에 즉시 적재한다.

폴리-His 태그(tag) 구조를 갖는 단백질의 경우에는 Ni-NTA 칼럼(Qiagen)을 사용하여 정제한다. 정제 전에, 콘디셔닝된 배지에 이미다졸을 가하여 농도가 5mM이 되게한다. 콘디셔닝된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 20 mM Hepes 완충액내에서 평형화된 6 ml의 Ni-NTA 컬럼에 4 ℃에서 4 - 5 ml/분의 유속으로 펌핑한다. 로딩이 종료된 후, 컬럼을 추가의 평형화 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 함유하는 평형화 완충액으로 용출시킨다. 이어서, 매우 정제된 단백질을 25 ml의 G25 Superfine(Pharmacia) 컬럼을 사용하여 10 mM Hepes, 014 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 pH 6.8의 저장 완충액 내로 탈염시킨 후 -80℃에서 저장한다.

이뮤노아드헤신(Imunoadhesin; Fc 함유) 구조물을 하기와 같이 콘디셔닝된 배지로부터 정제한다. 컨디셔닝된 배지를 pH 6.8의 20 mM Na 포스페이트 완충액내에서 평형화된 5 ml 프로틴 A 컬럼(Pharmacia)로 펌핑한다. 로딩이 종료된 후에, 컬럼을 pH 3.5의 100 mM 구연산으로 용출시키기 전에 평형화 완충액으로 심하게 세척한다. 용출된 단백질을 pH 9의 1M 트리스(Tris) 완충액 275 L를 함유하는 튜브에 1 ml 분획씩 수집하는 방법으로 즉시 중성화한다. 이어서, 매우 정제된 단백질을 상기 기술된 폴리-His 태그 단백질의 경우에서와 같이 저장 용액내로 탈염화시킨다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 및 에드만 데그레데이션(Edman degradation)법을 사용하는 말단 아미노산기 서열화(sequecing)을 통하여 균질도를 평가한다.

실시예 5

효모 내의 EG - VEGF 의 발현

하기 방법은 효모내의 EG-VEGF의 재조합 발현을 기술한다.

우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 EG-VEGF의 세포내 제조 또는 분비를 위하여 효모 발현 벡터를 구축한다. EG-VEGF의 직접적인 세포내 발현에 대한 선택된 플라스미드의 적절한 제한 효소 부위에 EG-VEGF를 암호화하는 DNA 및 프로모터를 삽입한다. 분비의 경우, EG-VEGF의 발현을 위하여 ADH2/GAPDH 프로모터를 암호화하는 DNA, 천연 EG-VEGF 신호 펩티드 또는 다른 포유류 신호 펩티드, 또는, 예를 들면, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더(leader) 서열, 및 링커(linker) 서열(필요한 경우)과 함께 EG-VEGF를 암호화하는 DNA를 선택된 플라스미드에 삽입한다.

이어서, 효모 균주 AB110과 같은 효모 세포를 상기 기술된 발현 플라스미드를 사용하여 형질전환시킨 후 선택된 발효배지에서 배양한다. 형질전환된 효모 상청액은 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 쿠마시에(Coomassie) 블루 염색제로 염색하여 분석할 수 있다.

이어서, 원심분리에 의하여 발효 배지로부터 효모 세포를 제거하고 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시킴에 의하여 재조합 EG-VEGF를 단리시키고 정제시킬 수 있다. EG-VEGF를 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 추가로 농축시킬 수 있다.

실시예 6

바큘로바이러스 -감염된 곤충 세포 내의 EG - VEGF 의 발현

하기 방법은 바큘로바이러스-감염된 세포 내의 EG-VEGF의 재조합 발현을 기술한다.

EG-VEGF에 대한 서열 코딩은 바큘로바이러스 벡터 내에 함유된 에피토프 태그의 융합된 상부서열(upstream)이다. 이러한 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로빈 태그(IgG의 Fc 부위 등)를 포함한다. pVL1393(PharMingen)과 같이 상업적으로 구입할 수 있는 플라스미드로부터 유도된 플라스미드를 포함하는 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 간단히 설명하면, EG-VEGF를 암호화하는 서열, 또는 막투과 단백질의 세포외(extracellular) 도메인을 암호화하는 서열 또는 단백질이 세포외인 경우에 성숙한 단백질을 암호화하는 서열과 같은 EG-VEGF의 코딩 서열의 의도된 부분을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 증폭시킨다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소를 사용하여 절단한 후 발현 벡터내로 서브클로닝시킨다.

예를 들면, 인간 EG-VEGF의 코딩 서열을 PCR로 증폭시킨 후, pBPH.IgG의 Stul 부위 및 EcoRI 내로 서브클로닝시켜 인간 IgG1의 Fc 영역을 갖는 C-말단 융합을 생성시키거나 pBPH.His.c의 Smal 부위 및 EcoRI내로 서브클로닝시켜 C-말단 GHHHHHHHH 태그를 생성시킨다. 벡터 pBPH.IgG 및 pBPH.His.c는 바큘로바이러스 발현 벡터 PVL1393(Pharmingen)의 유도체이다.

재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴(GIBCO-BRL사로부터 구입할 수 있음)을 사용하여 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda; "Sf9")내로 상기 플라스미드 및 BaculoGold^TM 바이러스 DNA(Pharmingen)를 함께 형질감염시켜 생성시킨다. 28℃에서 2 - 4일 인큐베이션시킨 후, 생성된 바이러스를 수거하여 추가의 증폭을 위해 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 오레일리(O'Reilley) 등의 문헌[Baculovirus expression vectors; A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press(1944)]에 논의된 바와 같이 수행한다.

이어서, 발현된 폴리-his-태그 EG-VEGF를 Fc 융합 단백질 용 단백질 A-세파로스 비드(Pharmacia) 또는 His-태그 단백질 용 Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen) 중 하나를 사용하여 정제할 수 있다. His-태그 단백질의 경우, 추출물을 루퍼트(Rupert) 등의 문헌[Nature, 362:175-179(1993)]에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 간단히 설명하면, Sf9 세포를 세척하고, 초음파 처리용 완충액(25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고, 얼음으로 냉각시키면서 20 초간 2회 초음파 처리한다. 초음파 처리 분해물을 원심분리를 통하여 제거하고, 상청액을 로딩 완충액(50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)으로 50배 희석시키고 0.45 m 필터로 여과한다. Ni² ⁺-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen으로부터 구입할 수 있음)을 베드 부피 5 mL로 제조하고, 25 mL의 물로 세척한 후, 로딩 완충액 25 mL로 평형화시켰다. 여과된 세포 여과물을 컬럼에 1분 당 0.5 mL의 유속으로 로딩시킨다. 기준선 A₂₈₀(수집이 개시되는 지점)까지 컬럼을 로딩 완충액으로 세척한다. 이어서, 컬럼을 2차 세척 완충액(50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 세척한다(비특이적으로 결합된 단백질을 용출시킴). 다시 A₂₈₀ 기준선에 이른 후, 제2 세척 완충액 내의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배를 사용하여 컬럼을 전개시켰다. 1 mL 분획들을 수집하고 SDS-PAGE 및 염기성 포스파타제(Qiagen)에 콘쥬게이트인 Ni² ⁺-NTA를 사용하는 웨스턴 블롯 또는 은 염색으로 분석한다. 용출된 His₁₀-태그 EG-VEGF를 함유하는 분획을 수집한 후 로딩 완충액에 대하여 투석한다.

별법으로, IgG 태그(또는 Fc 태그) EG-VEGF의 정제는 예를 들면 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공지된 크로마토그래피 기술을 사용하여 수행할 수 있다.

단백질 발현을 조사하기 위하여, 감수(reducing) 및 비감수 조건(및 이에 이은 염색)하에서의 친화도-정제된 재조합 단백질에 대하여 SDS/PAGE 분석을 수행하였다. 통상적으로 단백질에 대하여 N-말단 서열분석 및 엔도톡신 측정을 수행하였고, 결과는 1 eu/mg 이하였다.

실시예 7

EG - VEGF 에 결합된 항체의 제조

하기 실시예는 EG-VEGF에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조법을 예시한다.

모노클로날 항체를 제조하는 기술은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 전술한 고딩(Goding)의 문헌에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 면역원은 정제된 EG-VEGF, EG-VEGF를 함유하는 융합 단백질, 및 세포 표면에서 재조합 EG-VEGF를 발현하는 세포를 포함한다. 면역원의 선택은 당업자가 과도한 실험없이 제조할 수 있다.

Balb/c와 같은 생쥐(mouse)를 완전 프로인트 애주번트(Freund's adjuvant) 내에서 유화시킨 EG-VEGF 면역원 1 - 100 마이크로그람을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시킨다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 애주번트(리비 이뮤노케미칼 리서치(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)사로부터 구입)내에서 유화시킨 후 생쥐의 뒷 발바닥에 주사한다. 이어서, 면역화된 생쥐를 선택된 애주번트 내에서 유화된 추가의 면역원으로 10 내지 12일 후에 촉진시킨다. 이후 몇 주동안, 생쥐를 추가의 면역화 주사를 사용하여 촉진시킬 수 있다. 혈청 샘플을 생쥐로부터 레트로-오비탈 브리딩(retro-orbital breeding)을 통하여 주기적으로 얻어서 항-EG-VEGF 항체를 관측하기 위한 엘리사(ELISA) 아세이 시험을 수행 할 수 있다.

적절한 항체 역가가 관측된 후에, 항체에 "양성"인 생쥐에 마지막 EG-VEGF 정맥 주사를 행할 수 있다. 3 내지 4일 후에, 생쥐를 치사시킨 후, 지라 세포를 수거한다. 이어서, 지라 세포를 ATCC, No. CRL 1597로부터 입수할 수 있는 P3X63AgU.1과 같은 선택된 쥐 골수종 세포주와 융합시킨다(35% 폴리에틸렌 글리콜 사용). 융합은 하이브리도마 세포를 생성시키고, 생성된 세포를 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 지라 세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포크산틴, 아미토프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 개의 웰 조직 배양 플레이트내에 플레이팅시킬 수 있다.

하이브리도마 세포를 EG-VEGF에 대한 반응성에 관한 엘리사 법으로 스크리닝 할 수 있다. EG-VEGF에 대하여 의도된 모노크로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 본 기술분야의 기술 범위내에 속한다.

양성 하이브리도마 세포를 동유전자 Balb/c 생쥐에 복강내 주사하여 항-EG-VEGF 모노클로날 항체를 함유하는 복수(ascites)를 생성시킬 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 성장시킬 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전에 이어서 겔 배제 크로마토그래피법을 사용하여 수행할 수 있다. 별법으로, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합도를 기준으로하는 친화도 크로마토그래피법을 사용할 수 있다.

실시예 8

특이 항체를 사용하는 EG - VEGF 폴리펩티드의 정제

천연 또는 재조합 EG-VEGF 폴리펩티드를 단백질 정제의 분야의 다양한 표준 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로-EG-VEGF 폴리펩티드, 성숙한 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 프리-EG-VEGF 폴리펩티드를 관심있는 EG-VEGF 폴리펩티드에 대하여 특이적인 항체를 사용하는 면역친화도 크로마토그래피법으로 정제한다. 일반적으로, 면역친화도 컬럼은 활성화된 크로마토그래피 수지에 항-EG-VEGF 폴리펩티드 항체를 공유 결합시켜 구성한다.

폴리클로날 면역글로빈은 황산암모늄으로 침전시키거나 또는 고정화된 단백질 A(파마시아 LKB 바이오테크놀로지(Pharmacia LKB Biotechnology; Piscataway, N.J.)사로부터 구입) 상에서 정제하는 방법에 의하여 면역 혈청으로부터 제조한다. 유사하게, 모노클로날 항체는 황산암모늄으로 침전시키거나 또는 고정화된 단백질 A 상의 크로마토그래피법에 의하여 생쥐의 복수액으로부터 제조한다. 부분적으로 정제된 면역글로빈을 CnBr-활성화 SEPHAROSE^TM(파마시아 LKB 바이오테크놀로지사로부터 구입)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유결합시킨다. 항체를 상기 수지에 결합시키고, 수지를 블록시킨 후, 유도체화된 수지를 제조자 지침에 따라서 세척한다.

용해가능한 형태의 EG-VEGF 폴리펩티드를 함유하는 세포로부터의 분획을 제조하여 EG-VEGF 폴리펩티드의 정제에 상기와 같은 면역친화도 컬럼을 사용한다. 이러한 제조방법은 세척액의 추가에 의하여 분획원심분리법을 통하여 얻어진 부세포 분획 또는 전체 세포의 용해 또는 본 기술분야에 잘 알려진 다른 방법에 의하여 수행된다. 별법으로, 신호 서열을 함유하는 용해성 EG-VEGF 폴리펩티드를 세포가 성장하는 배지내로 유용한 양으로 분비시킬 수 있다.

용해성 EG-VEGF 폴리펩티드 함유 제조물을 면역친화도 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 EG-VEGF 폴리펩티드를 우선적으로 흡수하도록 하는 조건(예를 들면, 세척액 존재하의 고이온력 완충액)하에서 세척한다. 이어서, 컬럼을 항체/EG-VEGF 폴리펩티드 결합을 붕괴시키는 조건(예를 들면, pH 약 2 - 3과 같은 낮은 pH 완충액, 또는 우레아 또는 티오시아네이트 이온과 같은 고농도의 카오트로프(chaotrope))하에서 용출시킨다.

실시예 9

약물 스크리닝

본 발명은 임의의 다양한 약물 스크리닝 기술에서 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 이들의 결합 조각을 사용하여 화합물을 스크리닝하는 데에 특히 유용하다. 상기와 같은 시험에 사용되는 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각은 용액내의 유리된 형태이거나, 고상 지지체에 고정된 형태이거나 세포 표면에 생성된 형태이거나 세포내에 존재하는 형태일 수 있다. 약물을 스크리닝하는 방법 중 한가지는 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각을 발현하는 재조합 핵산을 사용하여 안정하게 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 사용한다. 경쟁 결합 아세이에서 상기와 같은 형질전환된 세포에 대하여 약물을 스크리닝한다. 생육 형태 또는 고정된 형태의 상기 세포를 표준적인 결합 아세이에 사용할 수 있다. 예를 들면, EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각과 시험되는 시약 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, EG-VEGF 폴리펩티드와 시험되는 시약에 기인한 그의 목표 세포 또는 목표 수용체 사이의 복합체 형성도의 감소를 조사할 수 있다.

따라서, 본원발명은 EG-VEGF 폴리펩티드-연관된 질병 또는 질환에 영향을 미칠 수 있는 약물 또는 기타 임의의 시약을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 상기 시약을 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 이들의 조각과 접촉시키고 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 (i) 상기 시약 및 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각사이의 복합체의 존재, 또는 (ii) EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각과 세포사이의 복합체의 존재를 아세이하는 것을 포함한다. 상기와 같은 경쟁 결합 아세이에서, EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각은 통상적으로 표지된다. 적절히 인큐베이션 시킨 후에, 유리 EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조각을 결합된 형태의 것들로부터 분리하고, 유리된 형태이거나 또는 복합체를 이루지 않은 표지의 양을 EG-VEGF 폴리펩티드에 결합하거나 또는 EG-VEGF 폴리펩티드/세포 복합체를 방해하는 특정 시약의 능력의 척도로 삼는다.

약물을 스크리닝하는 또 다른 방법은 폴리펩티드에 대한 적절한 결합 친화도를 갖는 화합물을 높은 스루풋(throughput)으로 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이는 1984년 9월 13일에 공개된 WO 84/03564에 상세히 기술되어 있다. 간단히 설명하면, 다수의 상이한 작은 단백질 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 기타 다른 표면과 같은 고상 기재상에서 합성한다. EG-VEGF 폴리펩티드에 적용함에 따라, 펩티드 시험 화합물은 EG-VEGF 폴리펩티드와 반응하고, 이어서 세척한다. 결합된 EG-VEGF 폴리펩티드를 본 기술분야에 잘 알려진 방법으로 감지한다. 정제된 EG-VEGF 폴리펩티드는 상기 기술한 약물 스크리링 기술에 사용하기 위하여 플레이트위에 직접 코팅할 수도 있다. 또한, 비-중화된 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 고상 지지체 상에 이를 고정시킬 수 있다.

본원발명은 또한 EG-VEGF 폴리펩티드와 결합할 수 있는 중화 항체가 EG-VEGF 폴피펩티드 또는 그의 조각과 결합하기 위한 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁 약물 스크리닝 아세이의 용도를 고려한다. 이러한 방법에서, 항체는 EG-VEGF 폴리펩티드와 1 이상의 항원 결정인자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 감지하기 위하여 사용할 수 있다.

본원발명은 또한 EG-VEGF의 활성을 조절할 수 있는 생활성 시약을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 후보 생활성 시약을 EG-VEGF 샘플에 가하고 EG-VEGF의 생활성에 변화가 초래되었는지 여부를 측정한다. 상기와 같은 변화는 세포 증식을 자극하거나, 주화성을 유도하거나, 맥관형성을 자극하거나, 세포 분화를 유도하거나 또는 ERK1 및 ERK2를 인산화하는 EG-VEGF의 능력에 대한 것이다.

실시예 10

이론적인 약물 디자인

이론적인 약물 디자인의 목표는 관심있는 생활성 폴리펩티드(즉, EG-VEGF 폴리펩티드) 또는 이들과 상호작용하는 작은 분자(예를 들면, 길항제, 작용제, 억제제)의 구조적 유사체를 제조하는 것이다. 이러한 실시예들 중 임의의 방법은 EG-VEGF 폴리펩티드의 더욱 활성이 크고 안정한 형태의 약물을 고안하거나, 또는 생체내 EG-VEGF 폴리펩티드의 기능을 증진 또는 저해하는 약물을 고안하는데 사용될 수 있다(허드슨(Hudgson)의 문헌[Bio/Technology, 9:19-21(1991)] 참조).

한가지 방법에서, EG-VEGF 폴리펩티드 또는 EG-VEGF 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조가 X-선 결정분석법, 컴퓨터 모델링법, 또는 가장 통상적으로 전기 두가지 방법의 조합법에 의하여 측정된다. 구조를 파악하고 분자의 활성부위를 결정하기 위해서 EG-VEGF 폴리펩티드의 형태 및 전하 모두가 반드시 확인되어야 한다. 종종, EG-VEGF 폴피펩티드의 구조에 관련된 유용한 정보가 동형 단백질의 구조를 바탕으로한 모텔링에 의하여 얻어질 수 있다. 전기 두 방법 모두에서, 관련된 구조 정보는 상응하는 EG-VEGF 폴리펩티드-유사 분자를 디자인하거나 또는 효율적인 억제제를 식별하는데 사용된다. 이론적인 약물 디자인의 유용한 예는 브락스톤(Braxton) 및 웰즈(Wells)의 문헌 [Biochemistry, 31:7796-7801(1992)에 기술된 바와 같은 활성 또는 안정성을 향상시킨 분자 또는 아타우다(Athauda)등의 문헌[J. Biochem. 113: 742-746(1993)]에 기재된 바와 같은 천연 펩티드의 억제제, 작용제 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.

상기에 기술된 바와 같이 기능성 아세이를 통하여 선택된 목표-특이적 항체를 단리한 후 그의 결정 구조를 분석하는 것도 가능하다. 원칙적으로 이러한 방법은 후속적인 약물 디자인의 바탕이 될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 제공한다. 기능성의 약리학적 활성 항체에 대한 항-유전자형 항체(항-ids)를 생성시키는 것에 의하여 단백질 결정분석을 우회하는 것이 가능하다. 어떤 거울상의 거울상으로서, 항-ids의 결합 부위는 원래의 수용체의 유사체일 것으로 기대된다. 이어서, 항-ids는 화학적으로 또는 생물학적으로 제조된 펩티드의 집단으로부터 펩티드를 식별하고 단리하는데에 사용될 수 있다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용한다.

본원발명에 의하여, 충분한 양의 EG-VEGF 폴리펩티드가 제조되어 X-선 결정분석법과 같은 분석 연구를 수행하는 것이 가능하다. 또한, 본원에 제공된 EG-VEGF 폴리펩티드 아미도산 서열에 대한 지식은 X-선 결정분석법을 대신하여 또는 이와 함께 컴퓨터 모델링 법을 사용하는 사람들에게 지침을 제공할 수 있다.

실시예 11

노던 블롯 ( Nothern Blot ) 분석법

EG-VEGF의 발현 패턴을 밝혀내기 위하여, 다양한 인간 조직으로부터의 RNA를 사용하는 노던 블롯 분석을 수행하였다. 인간 RNA 블롯을 EG-VEGF cDNA를 기재로하는 ³²P-표지 DNA 프로브에 혼성화시켰다. 인간 다중 조직 폴리A+RNA 어레이 및 인간 폴리A+RNA 다중 조직 노던 블롯을 클론테크(Clontech)사로부터 구입하였다. 사용된 다른 노던 블롯은 인간 태아 RNA 블롯 MTN(클론테크사로부터 구입) 및 인간 성인 RNA 블롯 MTM-II(클론테크사로부터 구입)을 포함하였다.

노던 블롯 분석은 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 수행하였다. 예를 들면, cDNA 프로브는 Redi-Prime II 키트(아머샴(Amersham)사로부터 구입)로 ³²P-dCTP 3000 Ci/mmol(아머샴사로부터 구입)을 사용하여 인간 또는 생쥐 cDNA 30 내지 50 ng을 사용하여 제조하였다. 프로브는 Sephadex G50 스핀 컬럼(파머시아로부터 구입)상에서 정제하였고, 혼성화는 ExpressHyb 혼성화 용액(스트라타젠(Stratagene)사로부터 구입) 중에서 68℃에서 수행하였다. 또 다른 실시예에서, 블롯을 프로브와 함께 혼성화 완충액(5 X SSPE; 2 X 덴하르트(Denhardt) 용액, 100 mg/mL 변성 전단된 연어 정액 DNA; 50% 포름아미드; 2% SDS) 중에서 60 시간 동안 42℃에서 인큐베이션시켰다. 블롯을 실온에서 1 시간 동안 2 X SSC 및 0.05% SDS 중에서 수 회 세척한 후, 50℃ 0.1 X SSC 및 0.1% SDS 중에서 30분간 세척하였다. 블롯을 포스포이미저(phosphorimager) 분석기(후지(Fuji)사로부터 구입)에 의하여 철야 노출후에 현상시켰다. 균등량의 RNA 로딩을 대조 액틴 프로브(control actin probe)를 사용하는 혼성화에 의하여 평가하였다.

EG-VEGF mRNA 전사체를 검출하였다. 도 18은 몇가지 독립적인 실험에서 1.4 kb의 단일 mRNA 종이 강도가 감소하는 순서로 난소, 고환, 부신 및 태반에서 발현되었다는 것을 보여준다. 다른 조직에서는 전혀 발현되지 않았으나, 예외적으로 오랜 노출 (도 18) 후에 전립선에서 매우 약한 신호가 검출되었다. 인간 다중-조직 배열(데이타는 나타내지 않았음)에서의 인시투 혼성화에 의해 유사한 결과를 얻었다. 이러한 결과들은 스테로이드 생성 내분비선이 EG-VEGF mRNA 발현의 중심 사이트라는 것을 나타낸다.

실시예 12

인시투 리간드 결합

EG-VEGF를 발현시키는 세포의 유형을 확인하기 위하여 사람 및 다른 영장류의 일련의 고환 및 난소 시편을 사용하여 인시투 혼성화 연구를 수행하였다. 몇가지 실험 세트를 수행하였으며, 이때 한 실험 세트는 형광을 사용했고, 한 실험 세트는 표지된 프로브를 사용했다.

첫번째 실험 세트에서, OCT에 임베드된 고정되지 않은 신선한 조직을 10 마이크론 단위로 절편하고 -20 ℃에서 4일 동안 건조제 없이 보관하였다. 모든 단계들을 실온에서 수행했는데, 단 고정화 단계는 4 ℃에서 수행하였다. 절편들을 35 mM 아세트산 (pH 3.5), 3 mM CaCl₂, 3 mM MgSO₄, 5 mM KCl, 1 M NaCl 중에서 4 분 동안 배양하였다. 이 슬라이드들을 HEPES 완충 식염수 + 양이온 완충액(25 mM Hepes (pH7/2), 150 mM NaCl, 3 mM CaCl₂, 3 mM MgSO₄, 5 mM KCl 및 32 mM 수크로스)으로 3 회 세척한 후, HBS-C + 단백분해효소 억제제 중의 1.5 % 마우스 혈청(베링거 만하임: Boehringer Manneheim)으로 20 분 동안 블러킹하였다. 아비딘/비오틴 블러킹 키트(벡터 래보러터리즈사: Vector Laboratories)를 사용하여 추가로 블러킹하였다. 초기 실험은 성숙한 래트의 간, 부신 및 난소를 사용하였다. 하기 기술한 바와 같이, 다른 조직들을 분석하였다. 이 절편들은 0~1.5 nM EG-VEGF-Fc의 리간드로 60 분 동안 배양하였다. 과량의 EG-VEGF-his로 태깅된 단백질을 사용하여 치환(displacement)하였다. 절편들을 0.1% BSA를 포함하는 HBS-C로 3 회 세척하고, 이어서 10 분 동안 4 % 파라포름알데히드 중에서 고정하였다. HBS-C 중의 2차 항체, 비오티닐화 염소 항-사람 Fc (잭슨 래버러토리즈: Jackson Laboratories) 및 1.5 % 마우스 혈청의 1:4000 희석액을 30 분 동안 절편들에 가하였다. 세척한 후, 절편들을 파라포름알데히드 중에서 10 분 동안 후고정시켰다. 슬라이드들을 TBS(100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl)로 2 회 세척하고, 이어서 TBS 중의 3% H₂O₂로 10 분 동안 처리하였다. TBS로 세척한 후, 절편들을 듀퐁 TSA 키트 성분들, 증폭 희석액 중 1:1000의 HRP-스트렙타비딘 그리고 1:50의 비오티닐화 티라미드와 반응시켰다. 최종적으로, TBS 중 1:1000 희석액인 FITC-콘쥬게이트된 스트렙타비딘(DAKO)을 30 분 동안 반응시켰다. 0.05 % 트윈(Tween)-20을 포함하는 TBS 중에서 충분히 세척한 후, 커버슬립들을 벡타쉴드(Vectashield) 장착기를 사용하여 적용하였다. 형광 현미경의 FITC 채널을 사용하여 영상을 얻었다. 어떤 경우에는 DAPI(예: 분자 프로브), 핵산 착색을 사용하였다. 수은-아크 램프 또는 알곤-이온 레이저의 UV 라인들을 사용하여 흥분시킬 수 있다. 추가적으로 발현이 예시되는 조직들의 구조를 보여주기 위하여 이전에 기술된 표준 방법에 따라서 헤마톡실린-에오신 착색을 사용하였다.

침팬지 및 원숭이의 난소들에서, 가장 강도가 높은 신호는 1차 난포에서의 과립막 세포, 특히 난모세포에 가장 근접한 세포들 상에서 있었다. 더 약한 신호는 원시 난포 및 난세포 더미(cumulus oophorus)의 과립막 세포 상에 존재하였다. 상당한 신호가 난소 피층, 특히 작은, 감겨있는 황체(시노 원숭이 샘플) 및 잘 정의되지 않은 난소의 혈관 극에서의 세포 클러스터에 존재하였다. 이 결과들을 도 5A~F에 나타내었다(모두 55 마이크론). 도 5A는 헤마톡실린-에오신 착색을 나타내고, 도 5B는 2년생 침팬지의 난소에서 FITC를 사용한 EG-VEGF의, EG-VEGF 발현을 나타낸다. 도 5C는 헤마톡실린-에오신 착색을 나타내고, 도 5D는 시노 원숭이의 난소에서 FITC를 사용한 EG-VEGF 발현을 나타낸다. 도 5E는 헤마톡실린-에오신 착색을 나타내고, 도 5F는 침팬지 스트로마 난소에서 FITC를 사용한 EG-VEGF 발현을 나타낸다.

사람 난소에서, 피질 스트로마에 확산된 중간정도의 발현이 있었다. 상기 신호는 체출혈(corpus hemorrhagicum) 근방의 바깥 난포막에서 강했다. 추가적으로 황체에서 중간 정도의 촛점의 양성 신호가 있었다. 이 결과들을 도 6A~D에 나타냈다. 도 6A는 헤마톡실린-에오신 착색을 나타내고, 도 6B는 FITC를 사용한 EG-VEGF 발현을 나타낸다(25 마이크론). 도 6C는 헤마톡실린-에오신 착색을 나타내고, 도 6D는 FITC를 사용한 EG-VEGF 발현을 나타낸다(115 마이크론).

자궁탈이 있는 46세 여성의 난소에 대해서도 인시투 혼성화 연구를 수행하였다. 이 경우에, 상기 기술한 표준 기술을 사용하여 EG-VEGF를 방사선 표지하였다. EG-VEGF 발현을 나타내는 오토라디오그램을 도 7A에 나타냈다. 도 7B는 동일한 난소의 헤마톡실린-에오신 착색을 나타낸다.

추가적으로, 래트 부신 피질 조직 절편에 대해서 인시투 혼성화 연구를 수행하였다. 도 8A 및 8B는 DAPI를 사용한 EG-VEGF 핵산 동정을 나타내고, 도 8C 및 8D는 FITC를 사용한 EG-VEGF 단백질 동정을 나타낸다.

나아가, 다음 조직들에서 양성 인시투 혼성화 결과가 발견되었다: 난소암, 유두 장액(papillary serous); 난소, 정상 피질; 난소 포낭, 단순 포낭; 고환, 만성 염증; 정상 난소; 난소 종양, 유두 장액; 부신 선종; 정상 고환. 두번째 실험 세트에서, ³³P-UTP-표지된 RNA 프로브를 공지된 방법에 따라 생성하였다. 예를 들어 문헌[Melton, D. A., et al., Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056 (1984)]에 기재된 방법에 따랐다. 인간 EG-VEGF 서열의 뉴클레오티드 219-958에 상응하는 cDNA 프래그먼트로부터 센스 프로브 및 항-센스 프로브를 합성하였다. 상기 인시투 혼성화를 공지된 방법에 따라서 수행하였다. 이 실험 세트의 결과를 도 9에 나타냈다. 패널, A, C, E, G, I, K, M 및 O는 명시야상(bright-field image)이고, B, D, F, H, J, L, N 및 P는 그에 상응하는 암시야상(dark-field image)이다. 화살표는 혈관의 위치를 나타낸다.

강한 혼성화 신호가 고환에서 검출되었다(도 9, 패널 A~E 참조). 도 9, 패널 A~E는 이 신호가 라이디히(Leydig) 세포를 생성하는 테스토스테론에 한정되었다는 것을 보여준다. 고환의 내피가 매우 높은 회전률(turnover)을 갖는 것은 주목할 만 하다: 3 %나 되는 내피세포가 BrdU로 표지되고, 아마도 정자형성 및 스테로이드 형성과 관련된 강한 신진대사 활성과 연관될 것이다(문헌 [Collin and Bergh, Int. J. Androl., 19 : 221-228 (1996)] 참조). 이러한 문맥에서, 라이디히 세포들은 맥관 형성 및 투과성 증진 인자, 예를 들어 VEGF의 소스라고 알려져 있다(문헌 [Collin, supra] 참조). 흥미로운 것은 이 실험들에서 상기 VEGF 혼성화 신호가 EG-VEGF 신호(데이타 제시하지 않음) 보다 상당히 강도가 약하다는 것이다. 난소에서, 강한 EG-VEGF mRNA 발현은 안드로겐을 형성하는 피질 스트로마, 난세포 더미, 전개되는 난포의 난포막 및 과립막에 편중되었다(도 9, 패널 F-P). 난포막(theca) 내부에서의 EG-VEGF mRNA의 강한 발현은 난포 전개(follicular development) 및 스테로이드 호르몬 생성과 관련되는 모세혈관 네트워크의 전개와 부합하며(문헌 [Basset, Am. J. Anat., 73: 251-278 (1943)] 참조), EG-VEGF의 맥관형성 증진(pro-angiogenic) 역할과 일관성이 있다. 이러한 발현 패턴은 본질적으로, 검사된 다른 영장류(게잡이 원숭이 및 침팬지)에서도 유사하다(도 9, 패널 G~I 참조, 데이타는 제시되지 않음). VEGF의 발현이 특화된 스트로마에서 매우 낮으며(문헌 [Ravindranath et al., Endocrinology, 131 : 254-260 (1992)] 참조), EG-VEGF는 대신에 강하게 발현한다(도 9, 패널 F, G). 흥미롭게도, 그러한 스트로마가 강하게 세포증생 및 맥관형성 특성을 가지며, 다낭 난소 신드롬에서 과량의 안드로겐을 생성한다(문헌 [Goldziher and Green, J. Clin. Endocrino. Meta., 22: 325-332 (1962)] 참조). 난세포 더미에서 EG-VEGF의 발현 패턴(도 9, 패널 N~P)은 VEGF와 매우 유사하다(문헌 [Ravindranath et al., supra ; Philips et al., Endocrinology, 127 : 965-967 (1990)] 참조). 상기 황체(CL)에서, EG-VEGF 발현은 이산적인 세포 산란상(discrete nests of cells)에 편중된다(데이타 제시하지 않음). EG-VEGF가 난소 스트로마 및 전개되는 난포 내부에서 많이 발현되는 반면(도 9, 패널 D~I, 데이타 제시하지 않음), VEGF는 CL에서 최상의 수준으로 발현된다 (문헌 [Ravindranath et al., supra] 참조). 설치류에 있어서의 VEGF의 비활성화(문헌 [Ferrara et al., Nat. Med., 4: 336-340 (1998)] 참조) 또는 영장류에 있어서의 비활성화(문헌 [Ryan et al., Toxicol. Pathol., 27: 78-86 (1999); Fraser et al., Endocrinology, 141: 995-1000 (2000)] 참조)는 CL 전개를 극히 억제한다. 그러나, 난포 전개는 거의 손상받지 않으면서 진행되고(공개되지 않은 관찰), 이것은 다른 인자들이 난포 맥관 형성에 기여한다는 것을 나타낸다. EG-VEGF가 그러한 VEGF에 무관한 맥관 형성에 기여할 것이다. 따라서, VEGF 및 EG-VEGF의 상기 부분적으로 상보적인 발현 패턴이 나타내는 것은, 이들 분자들이 난소에서 그리고 잠재적으로 이러한 인자들이 공동 발현되는 다른 조직들에서, 맥관 형성을 촉진하는 대등한 또는 상보적인 방식으로 기능할 수 있다는 것이다.

실시예 13

¹²⁵ I EG - VEGF 세포 결합 분석

EG-VEGF를 이용하여 ¹²⁵I 리간드 결합 연구를 수행하여 여러가지 세포 유형의 수용체 분포를 확인하였다. 특정 경우에, EG-VEGF-태깅된 단백질 500 g을 피어스 (Pierce)의 요도드비드(iodobead) 제조법을 사용하여 0.5 mCi ¹²⁵I로 표지하였다. 상기 표지된 단백질을 50% 아세토니트릴, 0.1% TFA 중의 C18 Sep Pak 상에서 정제하였다. 두번째 실험 세트에서, EG-VEGF를 Na¹²⁵I(Amersham)를 사용하여 락토페록시다제에 의해 요오드화하고, 이어서 미리 충전된 컬럼(SynChropak RP HPLC C4 column: Micra Scientific, Inc.)을 사용한 역상 크로마토그래피에 의해 표지된 단백질을 정제하였다. 상기 분자의 특이 활성은 49~70 Ci/g이었다. Cos 세포들을 포함하는 여러가지 세포 유형들에 대하여 경쟁적 결합 분석을 수행하였다. 세포들을 24-구 접시에서 2~3 일 동안 배양한 후 결합시켰다.

특정 실험 세트에서, 0.2~0.4 nM 표지된 리간드 및 경쟁자로서 표지되지 않은 EG-VEGF-his를 사용하여 분석을 수행하였다. 상기 분석에서 사용된 표지되지 않은 EG-VEGF-his의 최고 농도는 270 nM이었고, 다음 10 개의 경쟁자 농도에 대하여 3 배 희석액 시리즈를 사용하였다. bFGF 및 VEGF도 경쟁자로서 포함되며(500 배 몰 과량), 이때 어떤 리간드도 상기 표지된 EG-VEGF-his를 치환하지 않는다.

다른 실험 세트에서, 270 nM에서 시작하여 12 개의 농도들에 대한 3 배 시리즈 희석액(적어도 한 쌍)의 표지되지 않고, 태깅된 EG-VEGF를 첨가하여 경쟁 분석을 수행하였다. 다른 실험에서, 200 몰 과량으로 bFGF 및 VEGF를 포함하는 관련되지 않은(unrelated) 리간드를 첨가하여 특이적 결합을 확인하였다. 리간드 결합 데이타를 뉴리간드(New Ligand) 프로그램을 사용하여 분석하였다.

상기 경쟁 분석을 통하여 EG-VEGF의 ACE 세포(Kd = 0.9~1.0 nM, ED₅₀= 10 nM)에 대한 높은 친화성, 특이적 결합을 밝혔다(도 10A~C). 유사한 높은 친화성 결합이 MS-1 세포에서 증명되었다. 그러나, 다른 비-반응성 세포들(예: HUVEC)은 낮은 친화성 결합 성분(Kd > 80 nM) 또는 거의 의미없는 결합을 나타내었고, 그리고 겉보기로 비특이적인 낮은 친화성 결합은 단지 경쟁자 농도가 270 nM을 초과하는 경우에 치환되었다(도 11C, 데이타는 제시되지 않음). 유사하게, 분석된 5 개의 다른 비-반응성 세포 유형은 상기 높은 친화성 결합 성분을 나타내지 않았다. 단백질 가교결합 실험 및 막 단백질 인산화 분석은, EG-VEGF 수용체 성분이 특이적 EG-VEGF 반응성 세포에 국한된다는 것을 나타낸다(데이타는 제시하지 않음).

실시예 14

세포 증식 분석

EG-VEGF에 반응하는 세포 유형의 스펙트럼을 확인하기 위하여, 내피세포 유형 및 비-내피세포 유형의 패널을 증식 반응에 대하여 분석하였다. 특정 농도 범위의 Fc-태깅 및 His-태깅된 EG-VEGF 리간드의 존재하에 세포들을 5~8 일 동안 성장시켰다. 상기 분석된 세포 유형들은 소 부신 피질 모세혈관 내피세포(ACE), 소 뇌 모세혈관 내피세포(BBC), 사람 배꼽 동맥 내피세포(HUVEC), 사람 피부 미세혈관 내피세포(HMVEC), 성숙한 소 대동맥 내피세포(ABAE), 소 주연세포, 사람 대동맥 혈관 평활근 세포(HA-VSMC), 신생 햄스터 신장 섬유아세포(BHK-21) 및 사람 신생아 섬유아세포(hFb)를 포함한다. 세포들을 6구 또는 12구 접시에 4000~6000 세포/ml의 밀도로 깔았다. 이렇게 까는 동안, 리간드 없음, 5 ng/ml bFGF (GIBCO BRL), 5 ng/ml VEGF, 또는 EG VEGF-Fc 또는 -His 태깅된 단백질 1~100 nM의 범위를 상기 각 구에 가하였다. 각 세포 유형에 대하여 동일한 2 개(duplicate) 또는 3 개의 샘플을 깔았다. 합류(Confluence) 및 형태를 매일 모니터링하였다. 5~7일의 분석에서, 세포들을 0.01 % 트립신(Gibco BRL) 중에서 트립신화하고, 코울터(Coulter) 계수기를 사용하여 세포 갯수를 세었다. 배지 및 다른 세포 배양 물질들을 라이프 테크놀로지즈(Life Technolgies, Inc.)로부터 입수하였다. HUVEC, HMVEC 및 인간 각질세포들을 클로네틱스(Clonetics)로부터 구입하였다. 소 주연세포 및 사람 신생아 섬유아세포는 엠. 게리트센(M. Gerritsen)으로부터 받았다. 분석의 수행을 위하여 문헌[Aravind and Koonin, Curr. Biol. 8: 477-478 (1998)]을 참조하라.

몇가지 예비 실험 결과를 도 12A~E에 나타냈는데, 이들은 수직 축 상에 구(well) 당 세포들을 나타낸다. 각 그래프는 농도 1 nM, 10 nM 또는 25 nM의 대조군, bFGF, VEGF 또는 EG-VEGF를 사용한 세포의 상대 증식을 나타낸다. 도 12A는 주연세포를 사용한 결과를 보여준다. 도 12B는 사람 대동맥 혈관 평활근 세포(HA-VSMC)를 사용한 결과를 보여준다. 도 12C는 신생 햄스터 신장 섬유아세포(BHK-21)를 사용한 결과를 보여준다. 도 12D는 ACE를 사용한 결과를 보여준다. 도 12E는 소 뇌 모세혈관 내피세포(BBC)를 사용한 결과를 보여준다.

다른 실험들에서 유사한 결과를 얻었고, 도 13에 나타내었다. 이 실험들에서, 기본 배지는 음성 대조군으로 기능하고(Ct), 그리고 bFGF(F) 또는 VEGF(V)는 양성 대조군으로 기능하였다. EG-VEGF를 특정 범위의 농도들에서 시험하였다. 패널에 나타낸 바와 같이, EG-VEGF는 ACE 세포들(ED₅₀ 0.2 nM)의 증식을 자극하였다. 최대 효과는 약 2 nM에서 얻어졌다. 세포 갯수의 배 증가(fold increase)는 VEGF에 의해 야기되는 것과 유사하다. 바쿨로바이러스(baculovirus)에 의해 생산된 his- 및 Fc-태깅된 EG-VEGF 단백질들은 모든 실험에서 매우 유사한 거동을 한다. 분열촉진 기능과 일관되게, EG-VEGF는 ACE 세포에서 MAP 키나제 ERK 1 및 2 그리고 다른 증식 및 생존 신호 분자들의 빠르고 중요한 인산화 과정을 야기한다. EG-VEGF의 분열촉진 활성은 농도 50~100 ng/ml에서 테스트한 VEGF 가용성 수용체(mFlt-IgG)의 투여에 의해 블러킹되지 않으며, 이것은 그러한 효과가 VEGF 방출에 매개되지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 발견들은 더 복잡한 생체 시스템 내부에서 상호 유도성 효과의 가능성을 배제하지 않는다.

EG-VEGF에 반응하여 증식하는 세포 유형의 스펙트럼을 확인하기 위하여, 우리는 여러가지 내피세포 유형 및 비-내피세포 유형을 테스트하였다. 상기 분석된 내피세포 유형들은 사람 배꼽 동맥 내피세포(HUVEC), 사람 피부 미세혈관 내피세포(HMVEC), 소 뇌 모세혈관 내피세포(BBC) 및 성숙한 소 대동맥 내피세포(ABAE)를 포함한다.

도 13, 패널 b에서 알 수 있듯이, BBC 세포들은 VEGF를 사용한 경우 단지 약 10 %의 증식 반응을 나타내며, 다른 내피세포 유형들은 테스트한 전체 농도에서 EG-VEGF 투여에 따른 효과를 전혀 나타내지 못했다. 따라서, EG-VEGF는 그러한 제한된 목표 세포 특이성을 갖는 내피세포 분열촉진제의 첫번째 예라고 믿어진다. VEGF 및 bFGF와 같은 다른 내피세포 분열촉진제는 여러가지 내피세포 유형들에 대하여 의미있는 선택성을 나타내지 않는다(문헌 [Leung et al., Science, 246: 1306-1309 (1989)] 참조).

도 13, 패널 c는 EG-VEGF가 혈관 평활근 세포, 주연세포, 섬유아세포 또는 각질세포의 배양에 있어서 증식성 반응을 전혀 이끌어내지 않았다는 것을 보여준다. 따라서, EG-VEGF는 내피 특이성 분열촉진제일 뿐만 아니라, 정의된 내피세포 유형에 선택적으로 작용하는 분열촉진제이기도 하다.

도 13, 패널 b 및 c에서 수직축 상의 증식 지수는 음성 대조군을 임의적으로 1로 한 것에 대한 상대적인 값이다.

실시예 15

세포 이동(주화성: Chemotaxis ) 분석

맥관 형성 캐스캐이드의 본질적 측면은 주화성이다(문헌 [Zetter, Nature, 285: 41-43 (1980)] 참조). VEGF 또는 bFGF는 화학적으로 끌어당기는 물질로서 작용할 수 있으며 또한 내피세포 이동을 촉진할 수 있다. 주화 활성에 대한 분석(이는 주화성을 야기하거나 방해하는 단백질을 동정할 것이다)은 이전에 기술하였으며, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, Ed by Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Chapter 6.12: 6.12.1-6.12:28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95: 1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS 103: 140-146, 1995; Mueller et al., Eur. J. Immunol. 25: 1744-1748 ; Gruber et al., J Immunol. 152: 5860-5867, 1994; Johnston et al., J. Immunol., 153: 1762-1768, 1994]을 참조하라. EG-VEGF의 생물학적 활성을 정의하기 위하여, ACE 세포들 및 다른 몇가지 세포 유형들이 개량된 보이덴 챔버(Boyden chamber) 분석에서 이 분자에 대하여 주화성 반응을 나타내는지 확인하였다.

구체적으로, ACE 세포, 개코원숭이(baboon) 부신 내피세포(BAEC), MS-1 세포 및 HUVEC를 이동 분석을 위하여 사용하였다. 상기 MS-1 세포 라인은 ATCC로부터이다. 1차 개코원숭이 내피세포를 조산한 개코원숭이 또는 태아상태의 개코원숭이 (R. Clyman, UCSF로부터 얻음)의 부신으로부터 단리하였다. 이조직을 문헌[Mesiano et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76: 968-976, 1993]에 기술된 바와 같이 실질적으로 해리하였다. 간단히 설명하면, 상기 캡슐을 제거하고, 멸균 면도날을 사용하여 상기 잔존 조직을 미세하게 잘라서 약 2 mm³ 크기의 프래그먼트를 만들었다. 이어서 상기 프래그먼트들을 37 ℃에서 30~40 분 동안, 50:50 햄(Ham) F10:DMEM 배지 중의 0.1 % 콜라게나제(Sigma), DNA분해효소 I (Life Technologies, Inc.)를 첨가한 10 % FCS 중에서 배양하였다. 단일 세포 현탁액을 세척하고, 5 % FCS를 포함하는 PBS에서 재현탁시키고, 10⁷ 세포들에 대하여 1 g의 항-KDR 단일클론 항체와 함께 배양하고, 세척하고, 이어서 형광 이소티오시아네이트(Sigma)와 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 항체와 함께 배양하였다. EPICS ELITE 세포 분류기(Coulter Corporation)를 사용하여 상기 KDR-양성 대 음성의 개체군들을 분류하였다. 10 % 혈청 및 성장 인자(Cell Systems, Kirkland, WA)를 함유하는 CSC-배지에서 상기 내피세포 개체수를 유지하였다. 팔콘(Falcon) 8.0 m 필터 삽입물(Falcon 3097)을 1 % 젤라틴으로 코팅하였다. 세포들을 배양하고, 상기 기술한 바와 같이 분석하였다. 세포들을 트립신화하고, 분석을 위하여 0.1 % BSA를 갖는 EBM(내피세포 기본 배지:Endothelial basal media, Clonetics)에 이송하였다. 세포들을 위쪽 챔버 당 1~5×10⁴으로 깔고, 성장 인자들을 아래쪽 챔버에 배치하였다. 상기 분석은 관례적으로 37 ℃에서 16 시간의 분석이다. 완료한 후, 세포들을 폴리우레탄 면봉으로 문질러서 상기 막의 위쪽으로부터 제거하고, 이어서 상기 막의 아래쪽의 잔류 세포들을 메탄올로 고정시켰다. 세포들을 요오드화 프로피디움으로 착색하고, 이미지-프로(Image-Pro) 프로그램을 사용하여 저전력(low power) 하에서 계수하였다. 도 14A, 14B 그리고 도 13, 패널 d의 y-축은 이동 지수를 나타내며, 임의적으로 1로 정한 음성 대조군에 상대적인 것이다.

사전 실험 결과를 도 14A 및 14B에 나타냈다. 각 그래프는 대조군에서, VEGF의 존재 또는 EG-VEGF의 존재하에(농도: 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM 또는 5 nM) 상대적인 내피세포 이동을 나타낸다. 도 14B는 ACE를 사용한 결과를 보여준다.

이러한 관찰들은 도 13, 패널 d에 개시된 추가의 실험 결과에 의해 강화되었다. ACE 배양에서 강하고 재현가능성 있는 주화성 반응을 유도하였으며, 이때 피크 반응은 0.5 nM EG-VEGF에서 나타났다. 상기 효과의 양(magnitude)은 VEGF에 의해 야기된 것과 유사하다. 우리의 결과들을 다른 1차 세포 유형에까지 확장하기 위하여, 우리는 VEGF 수용체-2, 또는 KDR을 인식하는 단일클론 항체를 사용한 형광-활성화 세포 분류에 의해 개코원숭이 부신 피질(BAEC)로부터 내피세포를 정제하였다. BAEC 배양에서, 0.5~5 nM EG-VEGF가 VEGF에 의해 야기된 것과 동일한 양의 주화성 반응을 야기하였다. 나아가, EG-VEGF는 VEGF 보다 훨씬 큰 정도로 MS-1 내피세포의 이동을 야기하였다. 쥐과 동물의 내분비 췌장의 모세혈관으로부터 단리된 상기 MS-1 세포 라인은 매우 차별된 특성, 예를 들어 VEGF 수용체 발현을 보유한다(문헌 [Arbiser et al., Proc. Natl. Acad. SCI. U.S.A., 94: 861-866 (1997)] 참조). 비록 HUVEC가 VEGF에 대해 강한 반응을 나타내기는 하지만, 이 세포로부터는 전혀 반응을 이끌어내지 못했다. 따라서, 그의 분열촉진 활성에 더하여, EG-VEGF는 또한 화학적으로 끌어당기는 물질로서 작용하는데, 단 특정 내피세포 유형에 대해서 그러하다.

이러한 발견들은 실시예 13에 나와 있는 결합 연구와 일치한다. 실시예 13에서 요오드화 EG-VEGF는 ACE 세포에서 높은 친화도와 특이적인 결합을 보였으며 막 단백질과 교차 결합이 가능하였다. 그러나, 반응성이 없는 HUVEC과 같은 세포에서는 높은 친화도를 보이는 결합이 발견되지 않았다.

실시예 16

인산화 분석

인산화 분석은 논문에 나와있는 알려진 방법에 따라 수행하였다. 간략히 정리하면, 부신 피질에서 유래한 모세혈관 내피(ACE) 세포를 FCS에서 14 - 16 시간 동안 혈청을 결핍시킨 후 0.05 % BSA에서 90분간 두었다. 세포들은 최대 반응을 이끌어 내기 위해 2.5 mM VEGF 혹은 20 mM EG-VEGF를 처리한 후 냉각된 0.1 mM 오르쏘바나딘산 나트륨, 5 mM 파라-나이트로 페닐 포스페이트, 10 mM 플로라이드 나트륨, 0.5 mM 오카다익 산과 단백질 분해효소 저해제 칵테일 (Roche MB 1836145) 을 포함한 PBS로 한 번 세척하였다. 인산화된 ERK에 대한 항혈청은 프로메가(Promega)사에서 구입하였다.

EG-VEGF는 ACE 세포내에서 MAP 키나아제 ERK1과 ERK2 (도 15) 그리고 다른 증식과 생존 신호 물질(데이타 제시하지 않음)의 빠르고 의미있는 인산화를 유도 하였으며 이는 분열 촉진 물질로서의 기능과 일치한다. 특히, 도 15에서 20 nM EG-VEGF는 ERK1과 ERK2의 의미있고 빠른 증가를 유도하였다. 아무 인자 없는(ct) 혹은 VEGF(V)에 의한 5분간의 자극을 대조군으로 사용하였고, EG-VEGF 자극에 대한 시간 경과를 레인 위에 표시하였다. 전체 ERK1 와 ERK2의 수준은 면역블롯 아래에 나타냈다. 또한 EG-VEGF의 분열 촉진 활성은 시험에 사용한 50 - 1000 ng/ml 농도 범위의 VEGF의 용해성 수용체 (mFlt-IgG) 투여에 의해 저해되지 않았다. 이는 이러한 효과가 VEGD의 배출에 의해 매개되지 않음을 의미한다.

실시예 17

천공 분석

부신피질의 내피 세포들은 내분비선이나 맥락막총, 위장관, 그리고 많은 종양등을 포함하는 제한적인 부위에서 발견되는 특징적인 천공 형태를 보인다 [Simionescu, supra]. 천공은 형질막에 있는 미세구조 혹은 창으로써 직경이 약 60 nm이며 대개 밀집해 있다.[Palade et al., Acta Physio. Scand. Suppl., 463: 11-32 (1979)]. 이러한 천공은 작은 용질들이나 액체에 대해 매우 침투성이 높으며 스테로이드 생산과 이자 섬과 같은 다른 내분비선에서 일어나는 사이질 액과 원형질 사이의 많은 물질 교환을 촉진하는 것으로 여겨진다. EG-VEGF가 단독으로 혹은 VEGF와 함께 내피 세포의 천공을 유도할 수 있는지 시험하였다.

ECM은 논문에서 알려진 방법대로 준비하였으며 특히 Gospodarowiez 등 (J. Cell. Biol. 99: 947-961, 1984.)에 의해 기술된 방법을 따랐다. 간단히 요약하면, 수송아지의 눈(Pel Freez, Arkansas)에서 각막 내피 세포를 분리하고 이를 15% FCS, penicillinistreptomycin, fungizone을 포함한 50: 50 Ham's F10 : DMEM 배양액에 풀었다. ECM을 입힌 플레이트를 제조하기 위해 한 구당 4 X 10⁴ 개의 세포를 6 구 배양 접시에 깔고 약 10일간 0% FCS, 2.5% 덱스트란 (Sigma 4133) 과 페니실리니스트렙토마이신을 포함한 포도당 농도가 낮은 DMEM 배지에서 배양하였다. 10일 배양 후 0.02 M NH₄0H 수용액에서 세포를 재빨리 파쇄하였고 PBS로 수번 세척한 후 PBS 내에서 항생제와 함께 4℃도에서 보관하였다. ACE 혹은 MS-1 세포들은 1-2 ×10⁵ 의 밀도로 깔고 한 층의 세포가 채워지도록 키웠다. 각각의 구에 2.5 nM VEGF, 10 nM EG-VEGF, 혹은 2.5 nM VEGF 과 10 nM EG-VEGF을 첨가하거나 아무 것도 첨가하지 않았으며, 이들은 최소한 두개 이상 병행하였다. 천공 분석은 3회 반복하였다. 세포들을 PBS로 세척한 후 2% 포름알데하이드, 2.5% 글루타르 알데하이드를 포함한 0.1 M 카코딜레이트 완충용액으로 고정하였다. 세척 후 표본은 1% 오스뮴 수용액으로 두 시간동안 후고정 하고 물로 세척하였으며 순도가 높은 에탄올과 프로필렌 옥사이드로 탈수하였다. 표본은 EPONATE 12 (Ted Pella, Inc., Redding CA) 중에 묻었다. Reichert Ultracut E 미세절제기를 이용해 초박막 절편을 만들고 우라닐 아세테이트와 구연산 납으로 대조염색을 하였다. Philips CM12 투사 전자 현미경을 이용해 표본을 80 kV에서 관찰하고 GATAN 접철식 다중주사 디지털 사진기로 사진을 얻었다. 각 표본 당 최소한 100 개 세포의 프로파일을 검사하였다.

도 13은 이 실험의 대표적인 전자현미경 미세사진이다. 패널 e는 처리하지 않은 ACE 세포이다. 도 13의 패널 f는 VEGF를 처리한 ACE 세포를 보여준다. 도 13의 패널 g는 EF-VEGF를 처리한 ACE 세포들이다. 화살표는 천공의 위치를 나타내며 배율이 표시되어 있다.

주목할 만한 것은 지금까지 VEFG 만이 천공을 시험관 내 혹은 생체 내에서 유도할 수 있는 능력을 보인다고 알려져 왔다는 것이다 [Roberts and Palade, Cancer Res., 57: 765-772 (1997) ; Esser et al., J. Cell. Biol., 140: 947-959 (1998)]. ACE 혹은 MS-1 세포들은 소 각막 내피 세포에 의해 만들어진 세포외 바탕질 위에서 한 층이 꽉 차도록 키웠으며 24-72 시간 동안 리간드를 처리 하였다. 이전의 연구와 마찬가지로 [Esser et al., supra] VEGF는 4.33 1.53 %의 ACE 세포 윤곽에서 (Figure 13, 패널 f). 천공을 유도하였으며 MS-1 배양에서도 VEGF에 반응하여 비슷한 개수의 천공을 얻었다(결과 보이지 않음). EG-VEGF에 의한 효과는 두 세포 모두에서 VECF와 매우 유사하였다 (Figure 13, 패널 g : ACE) 두 인자의 조합은 부가적인 혹은 협력적인 반응을 나타냈으며 ACE 세포윤곽에서 11.1%의 천공을 유도하였다. VEFG나 EG-VEGF 없이는 천공이 관찰되지 않았다. 이 발견은 이러한 인자들이 부신피질이나 난소 같은 환경에서 잔류성 내피 세포의 천공 형태를 유도하도록 생체내에서 상호 협력한다는 가설을 뒷받침한다.

실시예 18

EG - VEGF 의 저산소 조절

A. EG-VEGF 발현의 태크만 (Taqman)분석

저산소는 생리적 혹은 병리적 환경에서 혈관형성의 중요 유도체이다. 저산소 유도 인자 (HIF) 1의 활성화에 의해 낮은 산소 분압은 시스-작용성 조절요소를 통해 적혈구생성인자(Epo)와 어떤 해당효소들과 더불어 VEGF의 발현을 유도한다(Semenza, J. Appl Physiol. 88: 1474-1480 (2000)). 따라서 내피 세포에서 저산소증이 EG-VEGF mRNA의 발현을 조절할 수 있는지 결정하고자 하였다.

발현 분석을 위해 정상산소 대 저산소 노출 SW13 과 H259R 세포들(ATCC에서 구입)의 같은 한 쌍의 표본에서 RNA를 분리하였다. RNA는 Rneasy kit(Quagen)을 이용하여 제조사의 기술대로 준비하였다. 실시간 정량 RT-PCR을 위해 50 ng 의 전체 RNA를 퍼킨 엘머 태크만 키트 (Perkin Elmer Taqman kit) 시약과 ABI 프리즘 (ABI prism) 7700 염기 분석기를 이용해 세 번 반복하여 분석하였다. 사용한 올리고뉴클레오티드와 프로브는 다음과 같다.

정방향 EG - VEGF PCR 프라이머 5'-CCGGCAGCCACAAGGTC-3' (SEQ ID N0 : 9)

역방향 EG - VEGF PCR 프라이머 5'-TGGGCAAGCAAGGACAGG-3' (SEQ ID N0 : 10)

EG - VEGF 프로브 5'-CCTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCAC-3' (SEQ ID N0 : 11)

정방향 VEGF PCR 프라이머 5'-AATGACGAGGGCCTGGAGT-3' (SEQ ID N0 : 12)

역방향 VEGF PCR 프라이머 5'-TTGATCCGcATAATCTGCATG-3' (SEQ ID N0 : 13)

VEGF 프로브 5'-TGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCA-3' (SEQ ID N0 : 14)

음성대조군으로 액틴의 발현분석을 위에 기술된 방법에 따라 제조사가 제공한 프라이머(Perkin-Elmer)로 수행하였다.

도 17A, 패널 A는 인간 부신 악성종양 세포주 SW13 과 H295B의 저산소 환경(2% 산소)으로의 노출이 EG-VEGF mRNA 수준을 정상 산소 시에 비해 각각 275±15% 와 210±12 % 증가시킨다는 발견을 보여주고 있다. VEGF 의 mRNA는 각각 352±30% 와 266±14% 증가하였다. HIF 1의 핵심 결합부위를 찾기 위해 보존된 염기서열(5'TACGTGCGGC-3', 굵은 활자표시는 변이가 없는 염기서열을 표시)을 기준으로 하여 EG-VEGF의 프로모터 염기서열을 분석한 결과 전사시작부위의 처음 2450개 뉴클레오티드 안에 추정되는 요소들이 있음이 밝혀졌다.

B. HRE 루시퍼라아제 활성분석

EG-VEGF의 저산소 조절이 HIF-1에 의해 매개되는지 결정하기 위해 추정되는 EG-VEGF 요소 조절하에 있는 루시퍼라아제 리포터 유전자자의 발현을 분석하였다. 루시퍼라아제 리포터 구조체는 클로닝이 가능한, 상보적으로 붙인 올리고 뉴클레오티드를 pGL3-프로모터 벡터(Promega)의 BglII 부위에 삽입하여 제조하였다.

HRE_보존 (Epo) 센스

5'-AGGCCCTACGTGCGGCCTCACACAGCCTGTTCTGA-3' (SEQ ID N0 : 15)

HRE_돌연변이 (Epo) 센스

5'-AGGCCCTAATTGCGGCCTCACACAGCCTGTTCTGA-3' (SEQ ID N0 : 16)

HRE_EG-VEGF 센스

5'-GCTAAGGACGTGCTATTCATGGGGTGCAGGAAGAT-3' (SEQ ID N0 : 17)

HRE_EG-VEGF 돌연변이 센스

5'-GCTAAGGAATTGCTATTCATGGGGTGCAGGAAGAT-3' (SEQ ID N0 : 18)

루시퍼라아제 리포터 구조체의 HeLa 세포에 대한 일시적인 트랜스펙션은 6 웰 배양접시에서 Effectene 핵산 전달감염 시약 (Qiagen)을 이용하여 수행하였다. 각 웰에서 0.75 g의 정보제공유전자 벡터를 pRL-SV40 대조군 벡터와 함께 트랜스펙션 시켰다. 3회, 쌍으로 동시에 정상산소 대 저산소 배양에서 트랜스펙션을 수행하였다. 배양접시는 저산소상태에서 핵산전달감염 후 24시간 후에 시작하여 18-24 시간동안 노출시켰다. 세포는 파쇄 후 이중-루시퍼라아제 리포터 분석 시스템 (Promega)을 사용하여 분석하였다. 루시퍼라아제 활성은 대조군 벡터에 대해 보정하였으며 대표적인 결과를 도 17B에 나타내었다. 오차막대는 표준편차를 나타낸다.

저산소 조건에서 18-24시간 배양한 후, 추정되는 EG-VEGF 요소를 포함하는 루시퍼라아제 리포터 유전자 구조물의 발현은 정상산소 조건에 비해 약 3.30.8 배 증가하였다. 이러한 증가는 저산소증 유도 요소(HRE) Epo 보존서열에 의한 3.4 - 1.2 배 증가에 필적할 만하였다.(도 17, 패널 b). EG-VEGF의 HRE에 있어 보존염기서열 혹은 추정염기서열의 핵심 염기서열에 돌연변이를 유도할 경우 저산소에 대한 반응이 사라졌으며 이는 반응의 특이성을 확이해 주었다. 다른 부가적인 기작들을 배제할 수는 없으나 이러한 발견은 HIF-1이 EG-VEGF 유전자 발현의 저산소 조절을 매개하는 중요 매개자일 가능성이 유망함을 제시한다.

따라서 염기서열 상동성을 가지고 있지 않음에도 불구하고 EG-VEGF와 VEGF 유전자가 반응성 있는 내피 세포에 대해 유사한 효과를 가질 뿐 아니라, 예를 들어 저산소 유도 발현과 같이 공통의 기작으로 조절 받는다는 것은 인상적이다.

실시예 19

헤파린 결합 분석

bFGF 와 VEGF를 포함하는 혈관형성 인자들은 헤파린 설페이트 프로티오글라이칸과 같은 세포외 바탕질과 상호작용한다. 혈관 형성 인자와 세포외 바탕질 간의 상호작용은 이러한 분자들의 생체이용률 혹은 활성을 조절한다고 제시되었다 ((Klagsburn, Semin CancerBiol. 3 : 81-7 (1992)). 따라서 EG-VEGF가 헤파린에 결합하는지 검사하였다.

15g의 표지하지 않은 단백질을 10 mM 트리스, pH 7.4, 0.1 M 염화나트륨 조건에서 헤파린 세파로오즈 컬럼에 가한후 0.1M부터 2M까지의 직선 농도구배의 염화나트륨으로 용출하였다. 인간 VEGF₁₆₅를 대조구로 사용하였다.

헤파린 세파로오즈 컬럼에 가할 경우 EG-VEGF는 0.5M 염화나트륨에서 용출되었으나, VEGF165는 같은 크로마토그래피 조건에서 0.7 M 염화나트륨에서 용출되었다. 이러한 발견은 EG-VEGF가 헤파린에 결합하는 성장인자이며 생체 내에서 세포외 바탕질에 의해 격리될 수 있음을 제시한다.

실시예 20

생체 내에서 혈관형성 효과에 대한 선택성

A. 랫 각막 주머니 혈관형성 분석

EG-VEGF의 생체내 활성을 이전에 기술된 바와 같이(Gille etal., J. Biol Chem. 276: 3222-3230 (2001)) 성체 랫 각막 주머니 분석을 통해 검증하였다. 200 ng의 VEGF₁₆₅ 또는 500 ng EG-VEGF와 메틸 셀룰로오즈, 알루미늄 수크랄페이트를 포함한 하이드론 막 펠릿을 각막 주머니의 기저에 삽입하였다.(n=6) 대조군 펠릿은 500 ng의 CD4-IgG를 포함하고 있다. 6일 후 실험동물들을 안락사 시킨 후 맥관구조를 조영하기 위해 고분자량 FITC-덱스트란을 주사하였다. 각막 전체 융기에서 에서 신생혈관 부위의 측정은 컴퓨터에 의한 영상 분석을 통해 측정하였다 (Image-Pro Plus).

랫 각막 분석에서 VEGF는 예상되는 혈관형성 효과를 보였으나(도 19, 패널 a-c) 정제된 EG-VEGF는 모든 시험한 눈에서 의미있는 반응을 보이지 못했다. 유사한 결과가 토끼 각막에서도 관찰되었다. VEGF 단백질은 매우 강한 혈관형성 반응을 유도하나 EG-VEGF는 본질적으로 효과가 없었다.

B. 부위 지정 EG-VEGF의 아데노바이러스 주입에 의한 혈관형성 효과

생체 내에서의 EG-VEGF의 생체내 활성을 좀더 연구하기 위해 EG-VEGF의 지속적 그리고 국지적인 전달의 효과를 검증하였다. EG-VEGF의 국지적이고 지속적인 전달을 얻기 위해 아데노바이러스(av) 벡터를 제조하고 누드 랫 또는 생쥐의 다양한 부위에 주사하였다. VEGF나 lacZ를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 대조군으로 사용하였다.

이소플루오란을 이용해 누드 랫을 마취시킨 후 왼쪽 등 부위에 2-2.5 cm 의 절개부위를 만들었다. 비외상 겸자를 이용해 난소를 들어내어 고정하였다. 5-10 l 의 염수에 있는 10⁸ 혹은 5×10⁸ pfu 분량을 3G 바늘 (Hamilton)이 장착된 기체가 없는 해밀톤 주사기로 주입하였다. 모든 작업은 BSL2 실행에 따라 생물학적 안전상자내에서 수행하였다. 골격근의 경우(왼쪽 장딴지) 혹은 귀 피하주사의 경우, 누드 마우스 또는 랫을 이소플루오란으로 마취하고 부위를 청결하게 하고 부위 당 50 l 부피의 5×10⁸ pfu 분량의 바이러스를 주사하였다. 모든 아데노바이러스 연구에 있어 동물들은 아데노 바이러스 투여 후 한 주 후에 안락사시켰다. 사체 해부시 조직들은 조직학적 분석을 위해 해부하여 냉동시키거나 또는 고정하였다.

누드 랫의 골격근에 주사할 경우 lacZ 아데노 바이러스와 EG-VEGF 아데노 바이러스의 효과는 최소한의 염증성 침윤 및 혈관 형성의 부재와 아울러 많은 유사분열 내피 세포, 부종, 육아조직 등에 있어서 본질적으로 구분할 수 없었다(도 19 패널 d-f). 같은 아데노 바이러스 벡터를 생쥐의 귀에 주사한 경우에도 매우 유사한 결과를 얻었다 (도 19, 패널 g 및 h). 또한, VEGF 아데노 바이러스는 EG-VEGF 아데노 바이스를 주사했을 때 보이지 않는 강한 혈관형성 반응을 나타내었다. 그러나 EG-VEGF 혹은 VEFG의 난소내 전달은 한 주 내에 출혈 부위와 더불어 크고 뚜렷한 혈관을 포함한 주사한 난소의 극적인 확대를 나타냈다 (도 19, 패널 i). 대표적인 실험에 있어서 누드 랫의 난소의 습시료 중량은 LacZ 군의 경우 33±3mg, EG-VEGF 군의 경우 489±30 mg, VEGF 군의 경우 191±91 mg 이었다(n=4). 주사하지 않은 난소의 중량(337mg)은 LacZ 군과 다르지 않았다. VEGF 군에 비해 EG-VEGF 군에서 중량이 무거워지는 경향을 보였으나 조직학적 형태는 매우 유사했다. 양쪽 경우에 모두 체액 혹은 혈액으로 채워진 난소 구조를 파괴하는 큰 낭종이 존재하였다 (도 19, 패널 m-n). LacZ를 투여한 난소의 형태는 정상이었다. 따라서 VEGF와 EG-VEGF는 반응 부위에 있어 혈관 형성 외에도 체액 유출을 유도하는 일련의 사건을 유도한다.

물질의 기탁

아래의 물질을 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 대로 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁하였다:

물질물질기탁 번호기탁일

DNA60621-1516 203091 8월 4일, 1998

이 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 이루어졌다 (부다페스트 협정). 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생육가능한 배양물의 유지를 보증한다. 기탁물은 부다페스트 조약 하에서 ATCC로부터 입수할 수 있을 것이고, 관련 미국 특허의 등록 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 후, 어느 것이 먼저이든 기탁 배양물의 자손들의 영구적이고 비제한적인 입수가능성을 보증하는 제넨테크와 ATCC와의 계약에 따를 것이며, 35 USC 122조에 따라 부여된 미국 특허 및 상표청장의 권한 및 이에 따른 특허청장 고시 (37 CFR 1.14를 포함하여 886 OG38를 참조)에 따라 측정되도록 그 자손의 입수가능성을 보증한다.

본 특허 출원의 양도인은 적합한 조건 하에서 배양되었을 때 기탁된 배양 물질이 죽거나 소실되거나 또는 파괴되었을 때 즉시 동일한 다른 것으로 교체하면서 공지할 것에 동의한다. 기탁 물질의 입수가능성은 어떠한 정부 당국에서 그 특허 법에 따라 승인된 권리를 위반하여 본 발명을 실시할 수 있는 허가로 해석되어서는 안된다.

상기 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는 데 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 구조에 의해 그 범위가 제한되지 않는데, 이는 기탁된 실시태양이 본 발명의 특정 양태의 한 예를 나타내는 것이고, 기능적으로 동등한 임의의 구조체가 본 발명의 범위 내에 있기 때문이다. 본원에서 기탁된 물질은 본원의 상세한 성명이 본 발명의 최선의 실시태양을 포함하여 본 발명의 임의의 양태의 실시를 가능하게 하는 데 부적당한 것이라는 것을 자인하는 것이 아니며, 이것이 나타내는 특정 예에 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 상기 기술로부터 본원에서 제시되고 기술된 것들과 아울러 본 발명의 다양한 변형이 당업자들에게 명백할 것이고, 첨부된 청구범위 내에 들어갈 것이다.

도 1 은 본래의 서열 EG-VEGF을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 91-405)을 포함하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 : 1)를 보여주며, 여기서, 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 : 1)은 본원에서 cDNA60621-1516"으로 지정된 클론이다. 또한 굵은 폰트 및 밑줄로 표시된 것은 각각 출발 및 정지 코돈의 위치를 나타낸다.

도 2 는 서열 ID 번호: 1 의 코팅 서열로부터 유도된 본래의 서열 EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 ID 번호 : 2)을 보여준다. 또한, 다양한 다른 중요한 폴리펩티드 도메인의 대략적 위치를 보여준다.

도 3A-D 는 ALIGN-2 서열 비교 프로그램을 사용하여 % 아미노산 서열 동일성 (도 3A-B) 및 % 핵산 서열 동일성 (도 3C-D)을 측정하는 방법을 사용한 가정적 예시를 보여주며, 여기서 "PRO"는 관심의 대상이 되는 가정의 EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 비교되는 관심의 대상이 되는 "PRO"폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "PRO-DNA"는 관심의 대상이 되는 가정의 EG-VEGF-인코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 비교되는 관심의 대상이 되는 "PRO-DNA" 핵산분자에 대한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, "X", "Y" 및 "Z" 각각은 다른 가정적 아미노산 잔기를 나타내고, "N", "L" 및 "V"는 각각 다른 가정적 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 4 는 본원에서 DNA56748 (서열 번호 : 3)로 지정된 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

도 5A-5F 는 난소에서 EG-ECGF의 현장 발현을 보여준다. 도 5A 및 5B는 2년된 침팬치 난소를 나타내며, 여기서 도 5A는 헤마톡실린-에오신 염색된 것을 보여주고, 도 5B는 FITC을 사용한 발현을 보여준다. 도 5C 및 5D는 시노 원숭이 난소를 보여주며, 여기서 도 5C는 헤마톡실린-에오신 염색된 것을 보여주고, 도 5D는 FITC를 사용한 EG-ECGF 발현을 보여준다. 도 5E 및 도 5F는 침팬치 스트로말 난소를 보여주며, 도 5E는 헤마톡실린-에오신 염색된 것을 보여주고 도 5F 는 FITC를 사용한 EG-ECGF 발현을 보여준다.

도 6A-D은 냉동되고 파라핀으로 채워진 인간 난소에서의 액틴 및 EG-ECGF의 현장 발현을 보여준다. 도 6A은 헤마톡실린-에오신 염색된 것을 보여주고, 도 6B는 FITC을 사용한 EG-ECGF 발현을 보여준다. 도 6C는 헤마톡실린-에오신 염색된 것을 보여주고, 도 6D는 FITC을 사용한 EG-ECGF 발현을 보여준다.

도 7A 자궁 탈출이 있는 46세된 여자의 난소에서 현장 발현되는 EG-ECGF의 방사능 사진을 보여주고, 도 7B은 같은 난소의 헤마톡실린-에오신 염색된 것을 보여준다.

도 8A-D은 부신에서 현장 발현되는 EG-ECGF를 보여준다. 도 8A 및 8B는 DAPI를 사용한 핵산 확인(identification)을 보여주고, 도 8C 및 8D는 FITC를 이용한 단백질 확인을 보여준다.

도 9 제자리 부합화(in situ hybridization)연구는 인간 고환에서, EG-VEGF 전사가 테스토스테론을 만드는 데이디히 세포(패널 A-D)에 제한되는 것을 밝혔다. E, F) EG-VEGF 신호는 혈관주위(perivasular)로 설명될 수 있는 세포 중 인간 난소 스트로마에 널리 퍼졌다(K,L). 유사한 패턴이 침팬지 난소에서도 입증되었다 (데이타는 제시되지 않음). G, H) 강한 신호가 인간 코르푸스 헤모하기쿰(corpus hemmorhagicum)에서 감지되었다. 낭이 발생한 인간 (I, J) 및 침팬치 (M, N, O, P)에서, EG-VEGF RNA는 막 및 과립세포- 스테로이드제닉 세포 타입 및 난포세포더미(cumulus oorphous) 모두에서 발현되었다. A, C, E, G, I, K, M, O 는 밝은 쪽 이미지이고, B, D, F, H, J, L, N, P 는 대응하는 어두운 쪽 이미지이다. 화살표는 혈관의 경로를 나타낸다.

도 10A-C는 소 부신 피질 모세관 내피 세포 (ACE)에서의 ¹²⁵I-EG-VEGF-his 리간드 결합 분석을 각각 나타내는 디스플레이스먼트 플롯 및 스캐챠들 플롯이다.

도 11A-B는 내분비 췌장으로부터 유도되는 생쥐 내피 세포라인, MS-1에서 ¹²⁵I-EG-VEGF-his 리간드 결합 분석을 각각 나타내는 디스플레이스먼트 플롯 및 스캐챠들 플롯이다. 도 11C는 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 EG VEGF-his 리간드 결합분석을 보여준다.

도 12A-E는 1 nM, 10 nM 또는 25 nM 농도에서 대조군, bFGF, VEGF, 또는 EG-VEGF 중 어느 하나를 사용한 세포의 상대적 증식을 나타낸 막대 그래프를 보여준다. 도 12A는 혈관주위세포(pericyte)를 이용한 결과를 보여준다. 도 12B는 인간 대동맥 혈관 민무늬 근육 세포 (HA-VSMC)를 이용한 결과를 보여준다. 도 12C는 아기 햄스터 신장 섬유모세포(BHK21)를 이용한 결과를 보여준다. 도 12D는 ACE를 이용한 결과를 보여준다. 도 12E는 보빈 뇌 모세관 내피 세포(BBC)를 이용한 결과를 보여준다.

도 13은 특정의 내피 세포에 대해 EG-VEGF이 미토겐 및 화학물질임을 보여준다. 패널 a는 ACE조직에서 EG-VEGF이 0.2 nM의 ED₅₀이 포함된 2nM에서의 최대 미토겐 응답을 유도했음을 보여준다. 판넬 b는 몇몇의 내피 세포 유형(HUVEC, HMVEC, BBC, ABAE)에 대한 증식 분석의 결과를 보여준다. 판넬 c는 비-내피 세포 유형(VSMC, 페리사이트, BHK21, hFb 및 케라티노사이트)에 대한 증식 분석 결과를 보여준다. 바잘(Basal) 배지를 네가티브 대조군 (Ct)으로 사용하고; bFGF (F), EGF (E), 또는 VEGF (V)에 각각 5.5 및 10 ng'ml 첨가하여 포지티브 대조군으로 사용했다. EG-VEGF를 1, 10, 및 100 nM에서 실험했다. 패널 d 는 ACE세포, 프라이머리 바분(baboon) 부신 내피 세포 (BAEC) 및 MS-1에서 EG-VEGF가 화학 주성 응답을 유도했으나, HUVEC에서는 그렇지 않았음을 보여준다. 각 그래프는 대표적인 실험이다. 데이타는 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 표시된 평균값이고, 증식 또는 이동 지수는 임의적으로 1의 값에 맞춘 네가티브 대조군에 대한 상대값이다. 패널 e-g는 EG-VEGF이 부신 피질에서 유도된 모세관 내피 세포에 페네스트레이션을 유도하는 것을 설명한다. ECM상에서 꽉 차게 성장시킨(growth to confluence) ACE를 2.5 nM VEGF, 10 nM EG-VEGF, 또는 두 인자의 복합으로 처리했다. 미처리된 ACE세포의 전자현미경사진(판넬 e), VEGF로 처리된 전자현미경사진 (panel f), EG-VEGF로 처리된 전자현미경사진 (panel g)은 두 분자 모두가 투과(fenestrae)를 유도할 수 있다는 것을 밝혔다. 화살표 방향은 창의 위치를 나타낸다. 배율이 표 시되어있다 (e 및 f ㎛ ; g nm).

도 14A 및 14B는 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM 또는 5 nM 농도의 EG-VEGF 또는 VEGF를 포함하는 대조군내 상대적 내피 세포 이동을 보여준다.

도 15는 EG-VEGF에 노출시킨 후 MAP키나아제 Erk1 및 Erk2의 인산화를 보여준다.

도 16 A-C는 EG-VEGF cDNA 및 아미노산 서열 및 상동 단백질의 정렬을 나타낸다. 도 16A는 1.4kb 인간 EG-VEGF cDNA 서열을 나타낸다. 1.4kb 인간 EG-VEGF cDNA는 19개의 아미노산(밑줄침)의 통상적 신호 서열을 갖는 105 개의 아미노산의 단백질 및 86 개의 아미노산의 성숙 단백질을 코딩한다. 초기 단백질 구조의 괄목할 만한 특징은 5 개의 이황화물 브릿지를 잠재적으로 형성하는 시스테인 함유 10 잔기이다. 도 16B는 인간 EG-VEGF, 인간 Bv8 상동(서열 번호 4) 및 뱀 VPRA(서열 번호 5)의 서열의 정렬을 나타낸다. 박스로 표시된 잔기는 동일성을 나타낸다. 도 16C는 인간 EG-VEGF, 인간 dickkopf-3(hdkk3, 서열 번호 6), 제노푸스 dkk-1(xdkk1, 서열 번호 7) 및 포르신 콜리파세(porcine colipase)(col, 서열 번호:8)의 정렬을 나타낸다. 정렬은 이 단백질 도메인의 특징적인 이황화-결합 형태, 콜립스 폴드(fold)를 형성하는 보존적인 시스테인을 설명한다. EG-VEGF중의 이 모티프는 인간 dkk-3의 시스테인-풍부 C 말단 도메인과 37% 동일하고, 47% 상동성이 있고, 제노푸스 dkk-1 도메인에 32% 동일하고, 42% 상동성이 있다. 숫자는 각 단백질중에서의 위치를 나타내고, 보즈드(bozed) 잔기는 EG-VEGF와 동일하다.

도 17A-B는 EG-VEGF의 저산소성 조절을 설명한다. 도 17A는 보통산소성(22% O₂) 대 저산소성(2% O₂) 조건에 노출된 SW 13(닫힌 박스) 및 H295 (열린 박스) 부신 암세포로부터 RNA의 타크만(Taqman) 분석이 EG-VEGF 전사가 정상 산소성 대조군에 대한 VEGF에서 350% 및 252% 증가함에 비해 SW 13 및 H295R에서 275% 및 210% 증가했다는 것을 나타내었다는 것을 보여준다. VEGF 및 EG-VEGF 데이타는 액틴(actin)으로 표준화되었다. 도 17B는 정상 산소성(열린 박스) 대 저산소성(닫힌 박스) 조건에서 HRE 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 루시퍼라제 리포터 및 벡터의 활성은 동시 감염된 레닐라(Renilla) 루시퍼라제로 표준화되었다. Epo 콘센서스 및 EG-VEGF 콘스트럭트 둘다 이들 각각 정상 산소성 대조군보다 저산소성에서 대략 3, 4배 유도되었다. Epo변이체 및 EG-VEGF변이체중의 중심 서열의 변이가 저산소성의 조건에 대한 반응을 막아서, 벡터 대조군과 유사한 활성을 유도한다.

도 18은 EG-VEGF 발현의 노턴(northern) 블롯 분석을 나타낸다. 인간 RNA 샘플의 노턴 블롯 분석은 대략 1.4kb의 단일 전사를 나타낸다. 발현은 부신 및 태반에 이어 난소 및 정소에서가 가장 높다. 명백히 보다 긴 발현 후, 덜 풍부한 신호는 전립선에서 존재한다. 동등한 RNA 로딩은 대조군 액틴 프로브(데이타는 나타내지 않음)와 잡종화에 의해 평가되었다. 레인의 함유물은 블롯위에 나타내고, 크기(kb)는 오른쪽에 나타냈다.

도 19는 EG-VEGF의 생채내 혈관생성 효과의 선택성을 설명한다. 패널 a-c는 래트 각막 포켓 분석의 결과를 나타낸다. 강한 혈관생성 반응이 VEGF 단백질에 의해 유도되는 반면, EG-VEGF는 실제적으로 아무런 효과가 없음을 주목시킨다. 패널 d-f는 누드 래트의 골격 근육(sm)중에 adCMV-lacZ, AdCMV-VEGF₁₈₄ 또는 AdCMV-EG-VEGF(5x10⁸ pfu)를 주입함으로써 얻어진 결과를 나타낸다. 화살표촉은 주입 부위를 표시하는 마이크로스피어를 가리키고, 화살은 새로운 혈관을 나타낸다. lac Z 및 EG-VEGF Av는 둘다 아무런 인지할만한 효과가 없는 반면, VEGF에 의해 유도되는 풍부한 새로운 혈관 형성을 수반하는 혈관생성 반응을 주목시킨다. 패널 g-h는 마우스 귀에 VEGF 및 EG-VEGF Av 주입한 결과를 보여준다. 또한, VEGF Av는 강한 혈관생성 반응을 초래하는데, EG-VEGF Av로 주입한 동물에서는 이러한 반응이 나타나지 않았다(스케일 기준: d-h=100㎛). 패널 i는 LacZ(ct) VEGF 또는 EG-VEGF Av의 주입 후 7일후 난소(ov)의 전체 형상을 보여준다(스케일 기준=0.5cm). VEGF 및 EG-VEGF 군 모두에서 훨씬 더 큰 질량이 존재하는 외관상의 혈관 및 출혈성 부위에 부가되었다는 것을 주목시킨다. 패널 j-n은 나타낸 바와 같이 Av 벡터(5x10⁸ pfu)로 주입한 난소의 마이크로그래프이다. j의 lac Z 난소의 정상적인 구조 및 형태를 주목시킨다. 코포라 루테아(Corpora lutea)(CL)를 나타내었다. 반대로, VEGF(k) 및 EG-VEGF(l) 군은 큰 액체-담긴 또는 출혈성 낭성 부분(*)을 갖는 매우 유사한 변화를 나타낸다(스케일 기준: j-l=1mm). 패널 m-n은 각각 k 및 l 중의 박스친 부분의 강력 마이크로그래프이다(스케일 기준=33㎛). 강한 혈관생성의 부위는 낭성 병변의 표면에서 분명하다. 화살표는 혈관을 가리킨다.

도 20 A-Q는 얼라인(ALIGN-2) 서열 비교 컴퓨터 프로그램에 대한 완전한 소스 코드를 제공한다. 이 소스 코드는 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공 하기 위해 유닉스(UNIX) 작동 시스템상에서 통상적으로 컴파일될 수 있다.

<110> Genentech, Inc. <120> EG-VEGF NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE <130> GENENT.1516QPC <150> 60/130,978 <151> 2000-09-07 <150> 60/213,637 <151> 2000-06-23 <150> PCT/US00/32678 <151> 2000-12-01 <150> PCT/US00/08439 <151> 2000-03-30 <150> PCT/US00/04914 <151> 2000-02-24 <150> PCT/US00/00219 <151> 2000-01-02 <160> 18 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1415 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <400> 1 tggcctcccc agcttgccag gcacaaggct gagcgggagg aagcgagagg catctaagca 60 ggcagtgttt tgccttcacc ccaagtgacc atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg 120 ctcctcctag taactgtgtc tgactgtgct gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc 180 cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc agcctgtggc ttcgagggct gcggatgtgc 240 accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc caccccggca gccacaaggt ccccttcttc 300 aggaaacgca agcaccacac ctgtccttgc ttgcccaacc tgctgtgctc caggttcccg 360 gacggcaggt accgctgctc catggacttg aagaacatca atttttaggc gcttgcctgg 420 tctcaggata cccaccatcc ttttcctgag cacagcctgg atttttattt ctgccatgaa 480 acccagctcc catgactctc ccagtcccta cactgactac cctgatctct cttgtctagt 540 acgcacatat gcacacaggc agacatacct cccatcatga catggtcccc aggctggcct 600 gaggatgtca cagcttgagg ctgtggtgtg aaaggtggcc agcctggttc tcttccctgc 660 tcaggctgcc agagaggtgg taaatggcag aaaggacatt ccccctcccc tccccaggtg 720 acctgctctc tttcctgggc cctgcccctc tccccacatg tatccctcgg tctgaattag 780 acattcctgg gcacaggctc ttgggtgcat tgctcagagt cccaggtcct ggcctgaccc 840 tcaggccctt cacgtgaggt ctgtgaggac caatttgtgg gtagttcatc ttccctcgat 900 tggttaactc cttagtttca gaccacagac tcaagattgg ctcttcccag agggcagcag 960 acagtcaccc caaggcaggt gtagggagcc cagggaggcc aatcagcccc ctgaagactc 1020 tggtcccagt cagcctgtgg cttgtggcct gtgacctgtg accttctgcc agaattgtca 1080 tgcctctgag gccccctctt accacacttt accagttaac cactgaagcc cccaattccc 1140 acagcttttc cattaaaatg caaatggtgg tggttcaatc taatctgata ttgacatatt 1200 agaaggcaat tagggtgttt ccttaaacaa ctcctttcca aggatcagcc ctgagagcag 1260 gttggtgact ttgaggaggg cagtcctctg tccagattgg ggtgggagca agggacaggg 1320 agcagggcag gggctgaaag gggcactgat tcagaccagg gaggcaacta cacaccaaca 1380 tgctggcttt agaataaaag caccaactga aaaaa 1415 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <400> 2 Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser Ile Met Leu Leu Leu Val Thr Val 1 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile Asn Phe 100 105 <210> 3 <211> 374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> unsure <222> (0)...(0) <223> n = A, T, C or G <400> 3 tggctcccca gcttgccagg cacaaggctg agctggagga agcgagangc atctaagcag 60 gcagtgtttt gccttcaccc caagtgacca tgagaggtgc cacgcgagtc tcaatcatgc 120 tcctcctagt aactgtgtct gactgtgctg tgatcacagg ggcctgtgag cgggatgtcc 180 agtgtggggc aggcacctgc 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Ser Gly Gln Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Ala Pro Asn 50 55 60 Leu Ala Cys Val Gly Thr Pro Lys Lys Phe Lys Cys Leu Ser Lys 65 70 75 <210> 6 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln 1 5 10 15 Arg Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu 20 25 30 Leu Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu 35 40 45 Leu Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu 50 55 60 Leu Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr 65 70 75 80 Phe Val Gly <210> 7 <211> 79 <212> PRT <213> Xenopus <400> 7 Cys Leu Arg Ser Thr Asp Cys Ala Pro Gly Leu Cys Cys Ala Arg His 1 5 10 15 Phe Trp Ser Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu Asp Glu Gly Gln Val Cys 20 25 30 Thr Lys His Arg Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg 35 40 45 Cys His Cys Gly Ala Gly Leu Ser Cys Arg Leu Gln Lys Gly Glu Phe 50 55 60 Thr Thr Val Pro Lys Thr Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His 65 70 75 <210> 8 <211> 79 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21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence = synthetic oligonucleotide <400> 13 ttgatccgca taatctgcat g 21 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence = synthetic oligonucleotide <400> 14 tgtgcccact gaggagtcca acatca 26 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence = synthetic oligonucleotide <400> 15 aggccctacg tgcggcctca cacagcctgt tctga 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence = synthetic oligonucleotide <400> 16 aggccctaat tgcggcctca cacagcctgt tctga 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence = synthetic oligonucleotide <400> 17 gctaaggacg tgctattcat ggggtgcagg aagat 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence = synthetic oligonucleotide <400> 18 gctaaggaat tgctattcat ggggtgcagg aagat 35 5 1 1 1

Claims

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내분비선-유래 혈관 내피 성장 인자(Endocrine Gland-derived Vascular Endothelial Growth Factor, EG-VEGF)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 EG-VEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 안티센스 분자를 포함하며, 여기서 상기 EG-VEGF의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 20 내지 105와 90％ 이상의 동일성을 갖는 서열이고, 부신 피질 모세관 내피(ACE) 세포의 증식 또는 화학주성은 유도하지만 인간 제정맥 내피(HUVEC) 세포의 증식 또는 화학주성은 유도하지 않는 것인, 내분비 조직에서의 혈관생성을 선택적으로 억제하기 위한 조성물.
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제4항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 조성물.
제9항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 인간화된 것인 조성물.
제9항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv 단편인 조성물.
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제4항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 내분비 조직이 스테로이드 생성 조직인 조성물.
제4항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 내분비 조직이 난소, 고환, 자궁, 자궁경부, 전립선, 부신 또는 췌장의 조직인 조성물.
제4항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열이 천연 EG-VEGF의 아미노산 서열인 조성물.
제4항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 2의 잔기 20 내지 105로 이루어진 것인 조성물.
제4항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물.
제4항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드가 서열번호 1의 뉴클레오티드 91 내지 405의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 조성물.
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(a) 후보 화합물을 내분비선-유래 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF)와 접촉시키는 단계이며, 여기서 상기 EG-VEGF의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 20 내지 105와 90％ 이상의 동일성을 갖고, 부신 피질 모세관 내피(ACE) 세포의 증식 또는 화학주성은 유도하지만 인간 제정맥 내피(HUVEC) 세포의 증식 또는 화학주성은 유도하지 않는 것인 단계;

(b) 내분비 조직에서의 혈관생성을 유도하는 EG-VEGF의 능력에 있어서의 변화를 측정하는 단계; 및

(c) 내분비 조직에서의 혈관생성을 유도하는 EG-VEGF의 능력을 억제하는 후보 화합물을 EG-VEGF의 길항제로서 동정하는 단계

를 포함하며, 여기서 상기 후보 화합물은 항체, 항체 단편 또는 소분자인, 혈관생성을 유도하는 EG-VEGF의 능력을 억제하는 화합물의 시험관내 동정 방법.
(a) 내분비선-유래 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF)를 발현하는 단리된 내분비 조직을 후보 화합물과 접촉시키는 단계이며, 여기서 상기 EG-VEGF의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 20 내지 105와 90％ 이상의 동일성을 갖고, 부신 피질 모세관 내피(ACE) 세포의 증식 또는 화학주성은 유도하지만 인간 제정맥 내피(HUVEC) 세포의 증식 또는 화학주성은 유도하지 않는 것인 단계;

(b) 내분비 조직에서의 혈관생성을 유도하는 EG-VEGF의 능력에 있어서의 변화를 측정하는 단계; 및

(c) 내분비 조직에서의 혈관생성을 유도하는 EG-VEGF의 능력을 억제하는 후보 화합물을 EG-VEGF의 길항제로서 동정하는 단계

를 포함하며, 여기서 상기 후보 화합물은 항체, 항체 단편, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 삼중 나선 DNA 또는 소분자인, 혈관생성을 유도하는 EG-VEGF의 능력을 억제하는 화합물의 시험관내 동정 방법.
제30항에 있어서, 내분비 조직이 난소, 고환, 자궁, 자궁경부, 전립선, 부신 또는 췌장의 조직인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 인간화된 것인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv 단편인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열이 천연 EG-VEGF의 아미노산 서열인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 2의 잔기 20 내지 105로 이루어진 것인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, EG-VEGF 폴리펩티드가 서열번호 1의 뉴클레오티드 91 내지 405의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.